Artykuł metodologiczny

Technika oczyszczania białek pozwalająca na wykrycie sumoilacji i ubikwitynacji pączkujących białek kinetochoru drożdży Ndc10 i Ndc80

DOI:

10.3791/52482

⸱

3 maja 2015

 ,  , 
1Genetics Branch, Center for Cancer Research, National Cancer Institute, National Institute of Health

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten manuskrypt opisuje wykrycie sumoilacji i ubikwitynacji białek kinetochorowych, Ndc10 i Ndc80, u pączkujących drożdży Saccharomyces cerevisiae.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Modyfikacje potranslacyjne (PTM), takie jak fosforylacja, metylacja, acetylacja, ubikwitynacja i sumoilacja, regulują funkcję komórkową wielu białek. PTM białek kinetochorowych, które wiążą się z centromerowym DNA, pośredniczą w wiernej segregacji chromosomów w celu utrzymania stabilności genomu. Podejścia biochemiczne, takie jak spektrometria mas i analiza western blot, są najczęściej stosowane do identyfikacji PTM. W tym miejscu opisano metodę oczyszczania białek, która pozwala na wykrycie zarówno sumoilacji, jak i ubikwitynacji białek kinetochorowych, Ndc10 i Ndc80, w Saccharomyces cerevisiae. Szczep, który wykazuje ekspresję Smt3 znakowanego polihistydyną (HF-Smt3) i Ndc10 lub Ndc80 znakowanego Myc, został skonstruowany i wykorzystany w naszych badaniach. W celu wykrycia sumoilacji opracowaliśmy protokół oczyszczania powinowactwa z białek sumoilowanych znakowanych przez Hisa za pomocą kulek niklowych i zastosowaliśmy analizę western blot z przeciwciałem anty-Myc w celu wykrycia sumoilowanych Ndc10 i Ndc80. W celu wykrycia ubikwitynacji opracowaliśmy protokół immunoprecypitacji białek znakowanych Myc i zastosowaliśmy analizę western blot z przeciwciałem anty-Ub, aby wykazać, że Ndc10 i Ndc80 są ubikwitynowane. Nasze wyniki pokazują, że białko znakowane epitopem będące przedmiotem zainteresowania w szczepie Smt3 znakowanym His-Flag ułatwia wykrywanie wielu PTM. Przyszłe badania powinny pozwolić na wykorzystanie tej techniki do identyfikacji i scharakteryzowania interakcji białkowych, które są zależne od określonego PTM.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ubikwitynacja i sumoilacja pozwalają na koniugację ubikwityny i małego modyfikatora podobnego do ubikwityny (SUMO; Smt3 w S. cerevisiae 1) odpowiednio do białka docelowego. PTM białek kinetochorowych wpływają na ich poziomy komórkowe i interakcje białko-białko podczas różnych faz cyklu komórkowego, aby zapewnić wierną segregację chromosomów. Na przykład poziomy komórkowe Cse4/CENP-A i zewnętrznego białka kinetochorowego Dsn1 są regulowane przez proteolizę za pośrednictwem ubikwityny w celu zapewnienia stabilności genomu 2-5. Destabilizacja nieprawidłowych przyłączeń kinetochor-mikrotubula wymaga kinazy Ipl1/Aurora B, która fosforyluje kompleksy Dam1 i Ndc80, które bezpośrednio oddziałują z mikrotubulami 6-8. Pomimo zidentyfikowania ponad siedemdziesięciu białek kinetochorowych, istnieje bardzo niewiele badań, które badają modyfikacje tych białek za pomocą PTM, np. ubikwityny i SUMO. Głównym ograniczeniem jest zdolność do zachowania PTM podczas oczyszczania i niedostatek niestandardowych przeciwciał do wykrywania PTM, takich jak sumoilacja, fosforylacja, metylacja i inne. Charakterystyka sumoilowanych białek kinetochoru Ndc10, Cep3, Bir1 i Ndc80 wykorzystała niestandardowe przeciwciało 9. Ponadto Ndc10 został uznany za substrat dla ubikwitynacji 10. Ludzki Hec1 (Ndc80 w S. cerevisiae) jest również substratem ubikwitynacji, regulowanym przez ligazę APC/C-hCdh1 E3 11. Dlatego Ndc10 i Ndc80 są dobrymi kandydatami do optymalizacji protokołu w celu wykrywania zarówno sumoilacji, jak i ubikwitynacji u S. cerevisiae.

Aby ułatwić identyfikację sumoilacji, skonstruowaliśmy szczepy, które wyrażają HF-Smt3 i Ndc10 lub Ndc80 oznaczone Myc. Zastosowanie znaczników epitopowych (HF: His6-Flag) minimalizuje tło ze względu na reaktywność krzyżową, która jest często obserwowana w surowicy poliklonalnej podniesionej przeciwko białku kandydującemu. Opracowaliśmy protokół oczyszczania koniugatów HF-Smt3 z powinowactwem, a następnie użyliśmy komercyjnych przeciwciał anty-Flag i anty-Myc do wykrycia obecności sumoliowanych Ndc10 i Ndc80 w oczyszczonym preparacie Smt3. W celu ubikwitynacji opracowaliśmy zmodyfikowany protokół immunoprecypitacji, który zachowuje ubikwitynację białek kinetochorowych znakowanych Myc i przeprowadziliśmy analizę western blot z komercyjnym przeciwciałem anty-Ub w celu wykrycia ubikwitynacji Ndc10 i Ndc80.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Wzrost komórek drożdży

  1. Zaszczepić komórki drożdży w 30 ml YPD (Tabela 1) w małej kolbie. Inkubować w temperaturze 30 °C przez noc, wstrząsając.
  2. Rozcieńczyć komórki do gęstości optycznej 0,2 przy 600 nm (OD600 = 0,2) w 50 ml YPD i inkubować w temperaturze 30 °C z wytrząsaniem.
  3. Hoduj kulturę do gęstości optycznej 1,0 przy 600 nm (OD600 = 1,0).
  4. Odwirowywać komórki przez 5 minut przy 2 000 x g i odrzucić supernatant.
  5. Zawiesić osad komórkowy w 40 ml sterylnej wody i wirować przez 5 minut przy 2 000 x g w celu umycia komórek. Odrzucić supernatant i przechowywać osad komórkowy w temperaturze -20 °C.

2. Ekstrakcja białek

  1. Ponownie zawiesić komórki w 0,5 ml lodowatego buforu guanidyny (Tabela 1) w celu przeprowadzenia testu ściągającego przy użyciu kulek przelewowych Ni-NTA lub buforu A (Tabela 1) do immunoprecypitacji. Trzymaj probówki na lodzie przez cały czas.
  2. Przenieść do probówki z nakrętką o pojemności 2 ml.
  3. Dodaj taką samą objętość szklanych koralików (Tabela materiałów).
  4. Ubijaj komórki w mini ubijaku do koralików (tabela materiałów) przez 2 minuty w temperaturze pokojowej, a następnie umieść na lodzie na 2-3 minuty. Powtórz to trzy razy.
  5. Wirować na wysokich obrotach w temperaturze 4 °C przez 30-60 min. Sprawdź komórki poprzez wizualizację pod mikroskopem, aby upewnić się, że komórki są zmielone.
    Uwaga: Zlizowane komórki będą wyświetlane jako ciemne duchy i nie będą miały obwiedni ani zdefiniowanego kształtu. Optymalnie co najmniej 80% komórek powinno być poddanych lizie.
  6. Nakłuć otwór w dnie probówki za pomocą pinezki i umieścić w stożkowej tubce o pojemności 15 ml (nakrętka powinna być luźna).
  7. Wirować przy 1 000 x g przez 1 minutę w celu zebrania lizatu.
  8. Przenieś lizat do mikroprobówki wirówkowej.
  9. Wirować przy 15 000 x g przez 30 minut w temperaturze 4 °C w celu zebrania wyekstrahowanych białek.
  10. Zmierz stężenie wyekstrahowanych białek za pomocą zestawu do oznaczania białek (tabela materiałów) i znormalizuj wszystkie ekstrakty, aby zawierały taką samą ilość białka. Doprowadzić całkowitą objętość do 1 ml za pomocą odpowiedniego buforu.
    Uwaga: Około 5 mg białka całkowitego uzyskuje się z 50 OD600 komórek.
  11. Zaoszczędź 50 μl (250 μg białka, jeśli całkowita zawartość białka wyekstrahowana z kroku 2.10 wynosi 5 mg) jako ekstrakt z całych komórek (WCE). Dodać 50 μl 2x bufor do próbek Laemmli (tabela 1) i inkubować w temperaturze 100 °C w bloku grzewczym przez 3-5 minut. Załadować 10 μl każdej próbki do żelu SDS-PAGE do analizy Western Blot (Sekcja 5: Analiza Western blot).

3. Oczyszczanie koniugatów HF-Smt3

  1. Otrzymać kulki przepływowe Ni-NTA (Tabela materiałów) niezbędne do eksperymentów (100 μl kulek na próbkę) przez wirowanie z niską prędkością (800-1 500 x g) przez 1 min. Usunąć supernatant.
  2. Umyj kulki 5x 1 ml PBS (Tabela Materiałów): Odwróć góra nad dołem, aż kulki zostaną ponownie zawieszone, zbierz kulki przez wirowanie na niskiej prędkości i usuń supernatant.
  3. Zawiesić kulki w 1 ml buforu guanidynowego (tabela 1) i podzielić je na liczbę probówek odpowiadającą próbkom, które mają być przetworzone. Zebrać kulki przez wirowanie z niską prędkością i usunąć supernatant. Dobrze wymieszaj koraliki, odwracając góra na dół.
    Uwaga: Dobrze wymieszaj koraliki, odwracając górę na dół.
  4. Do każdej próbki dodać 950 μl pozostałego WCE (z Kroku 2.11: Ekstrakcja białek) do 100 μl kulek przepływowych Ni-NTA.
  5. Inkubować na platformie kołyszącej w temperaturze 4 °C przez co najmniej 4 godziny lub przez noc.
  6. Wirować przy 800-1 500 x g przez 1 minutę w temperaturze 4 °C.
  7. Zaoszczędź 50 μl jako supernatant (SUP). Dodać 50 μl 2x buforu do próbek Laemmli i inkubować w temperaturze 100 °C w bloku grzewczym przez 3-5 minut. Załadować 10 μl każdej próbki do żelu SDS-PAGE do analizy Western Blot (Sekcja 5: Analiza Western blot).
  8. Płukać kulki jednorazowo 1 ml buforu guanidyny przez 5-10 min na bujanej platformie.
  9. Płukać koraliki 5x 1 ml buforu łamiącego (Tabela 1) przez 5-10 min na bujanej platformie.
  10. Zawiesić kulki w 90 μl 2x bufora do próbek Laemmli.
  11. Dodać 10 μl 1 M imidazolu.
    Uwaga: Imidazol pomaga oddzielić białko znakowane Hisem od kulek Ni-NTA ze względu na konkurencyjną interakcję między imidazolem a kulkami.
  12. Inkubować w temperaturze 100 °C w bloku grzewczym przez 3-5 minut.
  13. Wirować, a następnie odwirowywać przy 13 000 x g przez 30 sekund. Przenieść supernatant do świeżej probówki.
  14. Załadować 10-20 μl każdej próbki do żelu SDS-PAGE do analizy Western Blot (Sekcja 5: Analiza Western blot).
    Uwaga: 10-20 μl odpowiada 0,5-1,0 mg wkładu, jeśli stosuje się 5 mg WCE.

4. Immunoprecypitacja białek kinetochorowych znakowanych Myc

  1. Otrzymać przeciwciało w żelu o powinowactwie do agarozy anty-c-Myc (tabela materiałów) niezbędne do eksperymentów (25 μl żywicy na próbkę) przez odwirowanie na niskiej prędkości (800-1,500 x g). Usunąć supernatant.
  2. Przemyć żywicę 5x 1 ml buforu A: Odwrócić od góry do dołu, aż żywica zostanie ponownie zawieszona, zebrać żywicę przez odwirowanie na niskiej prędkości i usunąć supernatant.
  3. Zawiesić żywicę w 1 ml buforu A i podzielić je na liczbę probówek odpowiadającą próbkom, które mają być przetworzone. Zebrać żywicę przez wirowanie z niską prędkością i usunąć supernatant.
    Uwaga: Dobrze wymieszaj żywicę, odwracając górę nad dołem.
  4. Dodać 950 μl pozostałego WCE (z Kroku 2.11: Ekstrakcja białek) do 25 μl żywicy.
  5. Inkubować na platformie bujanej w temperaturze 4 °C przez noc.
  6. Wirować przy 800-1 500 x g przez 1 minutę w temperaturze 4 °C.
  7. Zaoszczędź 50 μl jako supernatant (SUP). Dodać 50 μl 2x buforu do próbek Laemmli i inkubować w temperaturze 100 °C w bloku grzewczym przez 3-5 minut. Załadować 10 μl każdej próbki do żelu SDS-PAGE do analizy Western Blot (Sekcja 5: Analiza Western blot).
  8. Przemyć żywicę 5x 1 ml buforu A: Odwrócić od góry do dołu, aż żywica zostanie ponownie zawieszona, zebrać żywicę przez odwirowanie na niskiej prędkości i usunąć supernatant.
  9. Zawiesić żywicę w 100 μl buforu do próbek SUMEB (tabela 1).
    Uwaga: Bufor do próbek SUMEB zawiera 8 M mocznika i 1 % SDS (silne warunki denaturacji).
  10. Inkubować w temperaturze 100 °C w bloku grzewczym przez 3-5 minut.
  11. Wirować, a następnie odwirowywać przy 13 000 x g przez 30 sekund. Przenieść supernatant do świeżej probówki.
  12. Załadować 10-20 μl każdej próbki do żelu SDS-PAGE do analizy Western Blot (Sekcja 5: Analiza Western blot).
    Uwaga: 10-20 μl odpowiada 0,5-1,0 mg wkładu, jeśli stosuje się 5 mg WCE.

5. Analiza Western Blot

  1. Załaduj ekstrakty białkowe na 4-12% żele Bis-Tris (Tabela materiałów) i wykonuj elektroforezę pod napięciem 120 V przez 90 minut (Bieżący bufor: Tabela materiałów).
  2. Przenieść białka z żelu do membrany nitrocelulozowej (tabela materiałów) za pomocą aparatu transferowego pod napięciem 30 V przez 90 minut (Bufor transferowy: tabela materiałów).
  3. Zablokuj membranę w 5% mleku/1x TBST (Tabela 1) na 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
  4. Inkubować błonę z przeciwciałem pierwszorzędowym (tabela materiałów) w 5% mleku/1x TBST przez noc w temperaturze 4 °C. W przypadku przeciwciał pierwszorzędowych należy użyć rozcieńczenia 1:1,000 (przeciwciała anty-Flag i anty-Ub) lub 1:5,000 (przeciwciało anty-Myc).
  5. Umyj membranę 3x po 10 minut za pomocą 1x TBST.
  6. Inkubować błonę z przeciwciałem drugorzędowym (tabela materiałów) w 5% mleku/1x TBST przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Stosować rozcieńczenie przeciwciał drugorzędowe w stosunku 1:5 000.
  7. Umyj membranę 3x po 10 minut za pomocą 1x TBST.
  8. Inkubować błonę z roztworem roboczym ECL (tabela materiałów) przez 5 minut.
  9. Wystaw membranę na działanie wrażliwej na kolor niebieski filmu rentgenowskiego (tabela materiałów) i wywołaj za pomocą automatycznego wywoływacza (tabela materiałów).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aby wykryć sumoilację białek kinetochorowych Ndc80 i Ndc10, skonstruowano szczepy z HF-Smt3 i białkami kinetochorowymi znakowanymi Myc (Ndc80 lub Ndc10) (Tabela 2), jak wcześniej opisano 9,12. Koniugaty HF-Smt3 oczyszczono pod względem powinowactwa za pomocą kulek Ni-NTA. Analiza Western blot oczyszczonego HF-Smt3 z przeciwciałem anty-Flag pozwoliła na wykrycie sumoilowanych form substratów SUMO, które były nieobecne w szczepie kontrolnym bez HF-Smt3 (Figura 1A i 1B

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Znaczniki epitopów, takie jak HA, Myc, Flag i GST, są szeroko stosowane do analizy biochemicznej białek. Budowa szczepów z białkami kinetochorowymi znakowanymi HF-Smt3 i Myc, takimi jak Ndc10 i Ndc80, ułatwia wykrywanie PTM, takich jak sumoilacja i ubikwitynacja. Test ściągania HF-Smt3 umożliwia wykrycie sumoilowanych białek kinetochorowych, Ndc10 i Ndc80 (ryc. 1). Protokół oczyszczania powinowactwa i analiza western blot przy użyciu przeciwciała anty-Flag ustalają specyficzność interakcji między HF-Smt3...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy Dr. Oliverowi Kerscherowi za wsparcie i rady oraz członkom laboratorium Basrai za wsparcie i komentarze do artykułu. Prace te były wspierane przez National Institutes of Health Intramural Research Program.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Koraliki szklaneProdukty BioSpec11079105średnicy 0,5 mm
Mini bijak do koralikówBioSpec Products#6938-komórkowy zakłócacz
Ni-NTA superflowQiagen30430100 ml
Koktajl inhibitorów proteazySigma-AldrichP82151 ml
Anti-c-Myc żel powinowactwa do agarozy produkowany w królikuSigma-AldrichA74701 ml
Przeciwciało monoklonalne anty-Flag M2 wytwarzane u myszySigma-AldrichF1804Przeciwciało pierwszorzędowe, rozcieńczenie 1:1,000
Przeciwciało c-Myc (A-14)Santa Cruz Biotechnologysc-789Przeciwciało pierwszorzędowe, rozcieńczenie 1:5,000
Oczyszczone przeciwciało mysie monoklonalne 9E10CovanceMMS-150PPrzeciwciało pierwszorzędowe, rozcieńczenie 1:5,000
Ubikwityna (P4G7) przeciwciało monoklonalneCovanceMMS-258RPrzeciwciało pierwszorzędowe, rozcieńczenie 1:1,000
ECL IgG królika, całe Ab GE sprzężone z HRPHealthcare Life SciencesNA934VPrzeciwciało drugorzędowe, rozcieńczenie 1:5,000
ECL Mysie IgG, całe Ab sprzężone z HRPGE Healthcare Life SciencesNA931VPrzeciwciało drugorzędowe, rozcieńczenie 1:5,000
Test białka DCBio-Rad500-0116
Membrana nitrocelulozowaNovexLC20010,45 mm wielkość porów
NuPAGE 4-12% Bis-Tris Żele białkoweNovexNP0321BOX1,0 mm, 10 dołków
NuPAGE MES SDS Running BufferNovexNP000220x
Bufor transferowy NuPAGENovexNP0006-120x
SuperSignal West Pico Podłoże chemiluminescencyjneThermo Scientific34078
10x PBS pH7.4GIBCO70011-044
Niebieska wrażliwa folia rentgenowskaDbioDBOF30003
Automatyczny wywoływaczKodakM35AX-OMAT
NocodazoleSigma-AldrichM140450 mg
MG-132Selleck ChemicalsS261925 mg

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Johnson, P. R., Hochstrasser, M. SUMO-1: Ubiquitin gains weight. Trends Cell Biol. 7, 408-413 (1997).
  2. Hewawasam, G., et al. Psh1 is an E3 ubiquitin ligase that targets the centromeric histone variant Cse4. Mol Cell. 40, 444-454 (2010).
  3. Ranjitkar, P., et al. An E3 ubiquitin ligase prevents ectopic localization of the centromeric histone H3 variant via the centromere targeting domain. Mol Cell. 40, 455-464 (2010).
  4. Au, W. C., et al. A novel role of the N terminus of budding yeast histone H3 variant Cse4 in ubiquitin-mediated proteolysis. Genetics. 194, 513-518 (2013).
  5. Akiyoshi, B., et al. The Mub1/Ubr2 ubiquitin ligase complex regulates the conserved Dsn1 kinetochore protein. PLoS Genet. 9, e1003216(2013).
  6. Biggins, S., et al. The conserved protein kinase Ipl1 regulates microtubule binding to kinetochores in budding yeast. Genes Dev. 13, 532-544 (1999).
  7. Cheeseman, I. M., et al. Phospho-regulation of kinetochore-microtubule attachments by the Aurora kinase Ipl1p. Cell. 111, 163-172 (2002).
  8. Liu, D., Lampson, M. A. Regulation of kinetochore-microtubule attachments by Aurora B kinase. Biochem Soc Trans. 37, 976-980 (2009).
  9. Montpetit, B., Hazbun, T. R., Fields, S., Hieter, P. Sumoylation of the budding yeast kinetochore protein Ndc10 is required for Ndc10 spindle localization and regulation of anaphase spindle elongation. J Cell Biol. 174, 653-663 (2006).
  10. Furth, N., et al. Exposure of bipartite hydrophobic signal triggers nuclear quality control of Ndc10 at the endoplasmic reticulum/nuclear envelope. Mol Biol Cell. 22, 4726-4739 (2011).
  11. Li, L., et al. Anaphase-promoting complex/cyclosome controls HEC1 stability. Cell Prolif. 44, 1-9 (2011).
  12. Takahashi, Y., Yong-Gonzalez, V., Kikuchi, Y., Strunnikov, A. SIZ1/SIZ2 control of chromosome transmission fidelity is mediated by the sumoylation of topoisomerase II. Genetics. 172, 783-794 (2006).
  13. Liu, C., Apodaca, J., Davis, L. E., Rao, H. Proteasome inhibition in wild-type yeast Saccharomyces cerevisiae cells. Biotechniques. 42, 158(2007).
  14. Kitamura, E., Tanaka, K., Kitamura, Y., Tanaka, T. U. Kinetochore microtubule interaction during S phase in Saccharomyces cerevisiae. Genes Dev. 21, 3319-3330 (2007).
  15. Gascoigne, K. E., Cheeseman, I. M. Kinetochore assembly: if you build it, they will come. Curr Opin Cell Biol. 23, 102-108 (2011).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Wykrywanie sumulacjiwykrywanie ubikwitynacjiNdc10 Ndc80oczyszczanie za pomoc kulek niklowychmetoda immunoprecypitacjianaliza Western blotSaccharomyces cerevisiaeznakowanie epitopowe

Powiązane artykuły