Artykuł metodologiczny

Wytwarzanie ludzkich komórek macierzystych tkanki tłuszczowej poprzez dedyferencjację dojrzałych adipocytów w hodowlach sufitowych

11.6K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/52485

⸱

7 marca 2015

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1IUCPQ Research Center, 2CHU de Québec Research Center, 3Laval University

W tym artykule

Podsumowanie

Dojrzałe adipocyty mogą stanowić obfite źródło komórek macierzystych poprzez dedyferencjację, co prowadzi do jednorodnej populacji komórek podobnych do fibroblastów. Trawienie kolagenazą służy do izolowania dojrzałych adipocytów z ludzkiego tłuszczu. Celem naszego protokołu jest uzyskanie multipotencjalnych, odróżnicowanych komórek tłuszczowych z ludzkich dojrzałych adipocytów.

Streszczenie

>jove_contentin vitro za pomocą techniki zwanej hodowlą sufitową. Dojrzałe adipocyty można również wyizolować ze świeżej tkanki tłuszczowej w celu specyficznej dla depotów charakterystyki ich funkcji i właściwości metabolicznych. W tym miejscu opisujemy sprawdzony protokół izolacji dojrzałych adipocytów z tkanek tłuszczowych za pomocą trawienia kolagenazy oraz kolejne kroki do wykonania hodowli sufitowych. Krótko mówiąc, tkanki tłuszczowe są inkubowane w buforze Krebsa-Ringera-Henseleita zawierającym kolagenazę w celu rozerwania macierzy tkankowej. Pływające dojrzałe adipocyty są zbierane na górnej powierzchni buforu. Dojrzałe komórki umieszcza się w kolbie T25 całkowicie wypełnionej pożywką i inkubuje do góry nogami przez tydzień. Alternatywne podejście do hodowli na płytkach 6-dołkowych pozwala na scharakteryzowanie adipocytów ulegających dedyferencjacji. Morfologia adipocytów drastycznie zmienia się w czasie hodowli. Immunofluorescencję można łatwo przeprowadzić na szkiełkach hodowanych na płytkach 6-dołkowych, jak wykazano za pomocą barwienia immunofluorescencyjnego FABP4. Białko FABP4 jest obecne w dojrzałych adipocytach, ale jest regulowane w dół poprzez dedyferencjację komórek tłuszczowych. Dedyferencjacja dojrzałych adipocytów może stanowić nową drogę dla terapii komórkowej i inżynierii tkankowej.

Wprowadzenie

In vitro dedyferencjacja dojrzałych adipocytów osiągana jest za pomocą techniki zwanej hodowlą sufitową1. Ze względu na ich naturalną tendencję do unoszenia się w roztworach wodnych, izolowane dojrzałe adipocyty przylegają do powierzchni odwróconej kolby całkowicie wypełnionej pożywką hodowlaną. W ciągu kilku dni komórki modyfikują swoją sferyczną morfologię i stają się komórkami podobnymi do fibroblastów. Powstałe komórki, zwane komórkami odróżnicowanego tłuszczu (DFAT), są multipotencjalne2. Artykuły naukowe na temat dedyferencjacji adipocytów, zwłaszcza na komórkach ludzkich, są ograniczone. Jednak dostarczyli już interesujących informacji na temat multipotencji, fenotypu komórek i zdolności replikacyjnych komórek DFAT2. Udało się odróżnicować dojrzałe adipocyty pochodzące z różnych przedziałów tłuszczowych, w tym pochodzące z ludzkiej trzewnej i podskórnej tkanki tłuszczowej2-4. Oprócz tych magazynów, Kishimoto i współpracownicy pobrali próbki tkanki tłuszczowej z policzkowych poduszek tłuszczowych i zdedyferencjowali adipocyty do komórek DFAT5. Matsumoto i współpracownicy z powodzeniem wygenerowali podskórne komórki DFAT od pacjentów w różnym wieku, a większość komórek miała wysoki wskaźnik proliferacji i mniej niż 6% starzenia się nawet po 10 pasażach w hodowli2.

Komórki DFAT zostały pomyślnie ponownie zróżnicowane w kilka linii, w tym linie adipogenne, osteogenne, chondrogenne i neurogenne2,3,6. Komórki te wykazują ekspresję kilku markerów embrionalnych komórek macierzystych, takich jak Nanog i cztery zidentyfikowane czynniki pluripotencjalne: Oct4, c-myc, Klf4 i Sox23. Wyrażają również markery specyficzne dla każdego z trzech listków zarodkowych7. Ponadto komórki DFAT są podobne do mezenchymalnych komórek macierzystych pochodzących ze szpiku kostnego (MSC pochodzących z BM) w oparciu o ich sygnaturę epigenetyczną3. Wykorzystując zdolność komórek macierzystych DFAT, wiele grup badało ich potencjał w leczeniu lub ulepszaniu różnych chorób8,9. Poprawę stanów patologicznych, takich jak infraklityczna tkanka serca, uraz rdzenia kręgowego i dysfunkcja zwieracza cewki moczowej, zaobserwowano po wstrzyknięciach komórek DFAT w szczurzych modelach choroby10-12.

Oprócz właściwości komórek macierzystych DFAT, mogą one stanowić nowy model komórkowy do badań nad fizjologią adipocytów. Linia komórkowa 3T3-L1 jest często wykorzystywana do tego celu, ponieważ komórki te różnicują się w przylegające, magazynujące lipidy adipocyty pod wpływem stymulacji adipogennej13. Jednak komórki te pochodzą z tkanki zarodkowej myszy13. Za pomocą tego modelu nie można również zbadać specyficzności dla depotów i może on nie odzwierciedlać w pełni fizjologii ludzkich adipocytów14. Inne laboratoria pracują z wyizolowanymi komórkami tłuszczowymi z mysich magazynów tłuszczu, ale dystrybucja tłuszczu nie jest dymorficzna u myszy, a anatomiczna konfiguracja jamy brzusznej gryzonia uniemożliwia ekstrapolację bezpośrednio naludzi15. W celu zbadania adipocytów w kontekście fizjopatologii otyłości u człowieka niezbędne stało się uwzględnienie rozmieszczenia tkanki tłuszczowej i różnic specyficznych dla magazynu tłuszczu16. Pewne ograniczenia pierwotnych hodowli preadipocytów, w tym ilości komórek uzyskanych z próbek biopsji tkanki tłuszczowej i ich starzenie się po kilku pasażkach w hodowli, stworzyły potrzebę alternatywnych modeli. Perrini i współpracownicy zbadali specyficzność depotową w ekspresji genów komórek DFAT pochodzących z trzewnej i podskórnej tkanki tłuszczowej i porównali je z komórkami macierzystymi pochodzącymi z tkanki tłuszczowej (ASC) z tego samego magazynu tłuszczu. Wykazali, że różnice w ekspresji i funkcji genów występują głównie między magazynami niż między typami komórek, co sugeruje, że komórki DFAT są fizjologicznie zbliżone do ASC z tego samego magazynu. Komórki DFAT mogą stanowić interesującą alternatywę dla dostępnych modeli do badań nad dystrybucją tłuszczu w patofizjologii otyłości człowieka. Co więcej, hodowla sufitowa jest obiecującą metodą pozyskiwania dorosłych komórek macierzystych do celów inżynierii tkankowej.

Tutaj opisujemy trawienie kolagenazą, szeroko stosowaną technikę izolowania dojrzałych adipocytów z podskórnych i/lub trzewnych próbek tłuszczu17, oraz kolejne kroki w celu przeprowadzenia hodowli sufitowej i deróżnicowania tych komórek na multipotencjalne komórki podobne do fibroblastów.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Oświadczenie etyczne: Projekt został zatwierdzony przez Komisję Etyki Badań IUCPQ przed rekrutacją pacjentów. Na potrzeby tego artykułu/filmu uzyskaliśmy tkanki od 2 pacjentów: 1) 62-letniego mężczyzny z BMI 50,7 kg/m2 oraz 2) 35-letniej pacjentki z BMI 57 kg/m2. Eksperymenty można przeprowadzić z obydwoma przedziałami tłuszczu, ale na potrzeby tego filmu zostały ograniczone do jednej komory tłuszczowej. Techniczne aspekty filmu przeprowadzono z pacjentem 1, a immunofluorescencję FABP4 przeprowadzono na odróżnicowanych komórkach od pacjenta 2.

1. Przetwarzanie próbek

  1. Poproś chirurgów o pobranie tkanki tłuszczowej z przedziałów tłuszczowych omentalnych i podskórnych w czasie laparoskopowej operacji bariatrycznej.
  2. Szybko przynieś próbki tłuszczu do laboratorium w RT i natychmiast przetwórz.
  3. Trawienie należy przeprowadzać w laboratorium, w niesterylnej atmosferze. Komórki zostaną ostatecznie przeniesione do pomieszczenia hodowlanego i hodowane w sterylnych warunkach. Aby uniknąć zanieczyszczenia, należy przygotować bufor KRH z wodą destylowaną i przefiltrowaną, a następnie przeprowadzić filtrację (filtr 0,22 μM) przed mineralizacją. Dokładnie oczyścić probówki z etanolem przed przeniesieniem do okapu do hodowli komórkowych w celu przygotowania kolby i płytki.
  4. Umieść tkankę tłuszczową na wstępnie zważonym naczyniu i zapisz wagę. Umieścić mały kawałek każdej próbki tkanki (mniej niż 1cm2) w 10% buforze formaliny w temperaturze pokojowej przez co najmniej 24 godziny przed zatopieniem parafiny. Użyj tej osadzonej próbki do eksperymentów immunohistochemicznych (technika nie pokazana).
  5. Umieścić kolejny kawałek w probówce o pojemności 50 ml i błyskawicznie zamrozić w ciekłym azocie przed przechowywaniem w temperaturze -80 °C w celu dalszych badań na całych tkankach tłuszczowych (np. ekspresja genów - technika nie pokazana).

2. Trawienie kolagenazy

  1. Umieść pozostały kawałek tkanki tłuszczowej w probówce o pojemności 50 ml w celu strawienia.
  2. Dodać 4 ml KRH-WB uzupełnionego kolagenazą (350 j./ml) na gram próbki w probówce do wytrawiania.
  3. Tkankę tłuszczową rozdrobnić nożyczkami.
  4. Zawiesinę mielonej tkanki tłuszczowej umieścić w shakerze o temperaturze 37 °C, maksymalnie 90 obr./min, na 45-minutową inkubację (maksymalnie 1 godz.).

3. Oczyszczanie adipocytów i preadipocytów

  1. Wlej półprzezroczysty roztwór z kilkoma kawałkami tłuszczu przez nylonową siatkę o grubości 400 μM do plastikowej zlewki.
  2. Pęsetą wetrzeć preparat komórkowy w nylonową siatkę i zmyć 5 ml KRH-WB.
  3. Delikatnie przenieś przefiltrowaną zawiesinę komórkową do probówki o pojemności 50 ml z plastikową rurką i strzykawką o pojemności 60 ml przymocowaną na końcu rurki.
  4. Pozostaw zawiesinę z dojrzałymi adipocytami na około 10 minut, pozwalając komórkom dotrzeć do górnej części buforu przez flotację.
  5. Powoli zasysaj bufor na dnie probówki za pomocą ssania strzykawki o pojemności 60 cm3.
  6. Dodaj 20 ml KRH-WB do umycia. Powtórz od kroku 3.4 dla 2 dodatkowych prań.
  7. Zebrać bufor, aby doprowadzić zawiesinę adipocytów do końcowej objętości 5 lub 10 ml, w zależności od ilości komórek. Postępuj zgodnie z krokami opisanymi w sekcji 5.
  8. Odzyskać frakcję zrębowo-naczyniową z buforu zebranego za pomocą strzykawki o pojemności 60 cm3 przez odwirowanie (3 000 obr./min, RT, 5 min) w celu dalszej pierwotnej hodowli komórek, jeśli jest to pożądane (technika nie pokazana).

4. Liczba dojrzałych komórek adipocytów

  1. Załadować 10 μl delikatnie wstrząśniętej zawiesiny adipocytów do komory zliczającej (hemocytometru). Wykonaj zliczanie komórek w poczwórnym stopniu.
  2. Oblicz liczbę izolowanych dojrzałych komórek.

5. Dedyferencjacja dojrzałych adipocytów do kolby T-25

  1. Napełnij kolbę do hodowli tkankowych o długości 25 cmdo 3/4 objętości surowicą cielęcą DMEM/F12-20%.
  2. W zależności od liczby komórek wlej 500 000 dojrzałych komórek do kolby.
  3. Napełnić kolbę całkowicie za pomocą probówki o pojemności 50 ml z podłożem i usunąć jak najwięcej pęcherzyków.
  4. Nakręcić niewentylowaną nakrętkę na kolbie.
  5. Oczyścić kolbę etanolem przed inkubacją, aby uniknąć zanieczyszczenia.
  6. Inkubować kolbę do góry dnem przez tydzień, nie dotykając jej, aby uniknąć ruchów w kulturze, które mogą zakłócić przyleganie komórek.
  7. Przed odwróceniem kolby po 7 dniach odwróconej hodowli, delikatnie manipulować kolbą i usunąć całe podłoże z kolby przez aspirację, unikając gwałtownych ruchów.
  8. Dodać 12 ml DMEM-F12-20% surowicy cielęcej i hodować komórki standardowymi technikami. Do kolby można dodać filtrowany, wentylowany korek.

6. Dedyferencjacja dojrzałych adipocytów do płytki 6-dołkowej

  1. Umieść szkiełko nakrywkowe na dnie każdego dołka płytki 6-dołkowej
  2. Dodaj plastikową tuleję 1/2" na wierzchu każdego szkiełka nakrywkowego.
  3. Napełnij studzienki 8 ml 20% surowicy cielęcej-pożywki DMEM.
  4. Umieść szkiełko nakrywkowe na każdej plastikowej tulei.
  5. Włożyć końcówkę pipety między szkiełko podstawowe a rurkę, aby wstrzyknąć komórki znajdujące się pod szkiełkiem podstawowym (50 000 komórek na dołek).
  6. Inkubować płytki w standardowym inkubatorze do hodowli komórkowych w temperaturze 37 °C z 5% CO2 przez tydzień.
  7. Odwrócony szkiełko nakrywkowe z dołączonymi komórkami do każdej studzienki zawierającej 2 ml pożywki uzupełnionej 20% surowicą cielęcą i kontynuować hodowlę.
  8. Użyj szkiełka nakrywkowego z komórkami przechodzącymi dedyferencjację do kilku celów, w tym immunofluorescencji (technika nie pokazana).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Podczas dedyferencjacji w dojrzałych adipocytach zachodzą znaczące zmiany morfologiczne (Rysunek 1). Jak pokazano na Rysunku 2, komórki podlegające dedyferencjacji zostały zabarwione przeciwciałem anty-FABP4 w celu analizy fluorescencyjnej. Komórki o okrągłej morfologii wykazywały ekspresję białka FABP4, podczas gdy większość komórek fibroblastopodobnych nie wykazywała takiej ekspresji. Po dedyferencjacji komórki DFAT mogą być hodowane z zastosowaniem standardowych procedur przez kilka p...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Dedyferencjacja dojrzałych adipocytów za pomocą techniki hodowli sufitowej to nowe podejście do pozyskiwania komórek macierzystych tkanki tłuszczowej z niewielkiej próbki natywnej tkanki tłuszczowej. Opierając się na naszym doświadczeniu i doświadczeniach innych2, jeden gram tkanki wystarcza do pokrycia kolby o średnicy 25cm2 i uzyskania populacji komórek DFAT, dla których jednorodność została wykazana przez Poloni i współpracowników3. Dedyferencjacja adipocytów wydaje się możliwa w przyp...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Podziękowania

To badanie było wspierane przez Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada Discovery Grant (371697-2011, AT). Autorzy pragną podziękować za pomoc chirurgom bariatrycznym, dr S. Biron, F-S. Hould, S. Lebel, O. Lescelleur, P. Marceau, a także Christine Racine i Caroline Gagnon z Banku Tkanek IUCPQ. Dziękujemy panu Jacques'owi Cadorette'owi z działu audiowizualnego IUCPQ za nakręcenie i montaż filmów.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Albumina surowicy bydlęcejSigmaA7906
AdenozynaSigmaA4036
Kwas askorbinowySigmaA0278
NaClMożna użyć dowolnej marki
KClMożna użyć dowolnej marki
CaCl < sub> 2< / sub>użyć
dowolnej markiMgCl 2< / sub>Można użyć dowolnej marki
KH2PO4Można użyć dowolnej marki
HEPESMożna użyć dowolnej marki
GlukozaMożna użyć dowolnej marki
kolagenazy typu IWorthington Biochemical CorpLS-004196
DMEM/F-12, HEPES, bez czerwieni fenolowejGibco-Life Technologies11039-021Dodaj do podłoża: 20% surowicy cielęcej, gentamycyna (50 &mikro; g/ml) i fungizone (2,5 &mikro; g / ml)
Surowica cielęca, uzupełniona żelazem, od cieląt karmionych mieszanką modyfikowanąSigmaC8056-500 ml
1/2 W plastikowej tuleiIberville2704-CPSKU:1000120918 (Home Depot)
Ciekły azotLinde
Formalin soluton, neutralnie buforowany, 10%SIGMAHT501128
Sterylna pęseta
Sterylne nożyczki
Strzykawki 60 ccStrzykawka
Rurka
Bufor zapasowy Krebs-Ringer-Henseleit (KRH)Przygotuj bufor zapasowy w następujący sposób: 25 mM HEPES pH 7,6, 125 mM NaCl, 3,73 mM KCl, 5 mM CaCl2,2H2O, 2,5 mM MgCl2,6H2O, 1 mM K2HPO4. Dostosuj pH do 7,4.
Bufor roboczy Krebsa-Ringera-Henseleita (KRH-WB)Do buforu KRH dodać świeżo następujące składniki: 4% albuminę surowicy bydlęcej, 5 mM glukozy, 0,1 i mikro; M adenozyna, 560 i mikro; M kwas askorbinowy
KRH-WB uzupełniony kolagenaząDodać 350 j./ml kolagenazy typu I
T25 bez wentylowanej nasadki kolby do hodowli tkankowychSarsted lub innej marki
6-dołkowa płytka do hodowli tkankowychBD Falcon lub innej marki
Szkło pokrywowe mikroskopu 22x22Fisherbrand12-542-B
Sterylne zlewki
Można BDz tworzywa sztucznego typu I

Bibliografia

  1. Zhang, H. H., Kumar, S., Barnett, A. H., Eggo, M. C. Ceiling culture of mature human adipocytes: use in studies of adipocyte functions. J Endocrinol. 164 (2), 119-128 (2000).
  2. Matsumoto, T., et al. Mature adipocyte-derived dedifferentiated fat cells exhibit multilineage potential. J Cell Physiol. 215 (1), 210-222 (2008).
  3. Poloni, A., et al. Human dedifferentiated adipocytes show similar properties to bone marrow-derived mesenchymal stem cells. Stem Cells. 30 (5), 965-974 (2012).
  4. Perrini, S., et al. Differences in gene expression and cytokine release profiles highlight the heterogeneity of distinct subsets of adipose tissue-derived stem cells in the subcutaneous and visceral adipose tissue in humans. PLoS One. 8 (3), e57892(2013).
  5. Kishimoto, N., et al. The osteoblastic differentiation ability of human dedifferentiated fat cells is higher than that of adipose stem cells from the buccal fat pad. Clin Oral Investig. , (2013).
  6. Kou, L., et al. The phenotype and tissue-specific nature of multipotent cells derived from human mature adipocytes. Biochem Biophys Res Commun. 444 (4), 543-548 (2014).
  7. Jumabay, M., et al. Pluripotent stem cells derived from mouse and human white mature adipocytes. Stem Cells Transl Med. 3 (2), 161-171 (2014).
  8. Sugawara, A., Sato, S. Application of dedifferentiated fat cells for periodontal tissue regeneration. Hum Cell. 27 (1), 12-21 (2014).
  9. Kikuta, S., et al. Osteogenic effects of dedifferentiated fat cell transplantation in rabbit models of bone defect and ovariectomy-induced osteoporosis. Tissue Eng Part A. 19 (15-16), 1792-1802 (2013).
  10. Obinata, D., et al. Transplantation of mature adipocyte-derived dedifferentiated fat (DFAT) cells improves urethral sphincter contractility in a rat model. Int J Urol. 18 (12), 827-834 (2011).
  11. Jumabay, M., et al. Dedifferentiated fat cells convert to cardiomyocyte phenotype and repair infarcted cardiac tissue in rats. J Mol Cell Cardiol. 47 (5), 565-575 (2009).
  12. Ohta, Y., et al. Mature adipocyte-derived cells, dedifferentiated fat cells (DFAT), promoted functional recovery from spinal cord injury-induced motor dysfunction in rats. Cell Transplant. 17 (8), 877-886 (2008).
  13. Moreno-Navarrete, J. M. F. -r Ch. 2. Adipose Tissue Biology. Symonds, M. E. , Springer. 17-38 (2012).
  14. Poulos, S. P., Dodson, M. V., Hausman, G. J. Cell line models for differentiation: preadipocytes and adipocytes. Exp Biol Med (Maywood. 235 (10), 1185-1193 (2010).
  15. Casteilla, L., Penicaud, L., Cousin, B., Calise, D. Choosing an adipose tissue depot for sampling: factors in selection and depot specificity). Methods Mol Biol. 456, 23-38 (2008).
  16. Tchernof, A., Despres, J. P. Pathophysiology of human visceral obesity: an update. Physiol Rev. 93 (1), 359-404 (2013).
  17. Rodbell, M. Metabolism of Isolated Fat Cells. I. Effects of Hormones on Glucose Metabolism and Lipolysis. J Biol Chem. 239, 375-380 (1964).
  18. Watson, J. E., et al. Comparison of Markers and Functional Attributes of Human Adipose-Derived Stem Cells and Dedifferentiated Adipocyte Cells from Subcutaneous Fat of an Obese Diabetic Donor. Adv Wound Care. 3 (3), 219-228 (2014).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

hodowla przy ciennatrawienie kolagenazizolacja tkankiproces dedyferencjacjiimmunofluorescencja FABP4morfologia kom rekin ynieria tkankowaterapia kom rkowa

Powiązane artykuły