Method Article

Samoorganizacja złożonych dwuwymiarowych kształtów z jednoniciowych płytek DNA

DOI:

10.3791/52486

⸱

May 8th, 2015

 ,  ,  , 
1Tsinghua-Peking Center for Life Sciences, School of Life Sciences, Tsinghua University, 2Wyss Institute for Biologically Inspired Engineering, Harvard University, 3Department of Systems Biology, Harvard Medical School

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kafelkowanie DNA jest skutecznym podejściem do tworzenia programowalnych nanostruktur. Opisujemy protokoły konstruowania złożonych dwuwymiarowych kształtów poprzez samoorganizację jednoniciowych płytek DNA.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Obecne metody w nano-architekturze DNA z powodzeniem zaprojektowały różnorodne struktury 2D i 3D przy użyciu zasad samoorganizacji. W tym artykule opisujemy szczegółowe protokoły wytwarzania wyrafinowanych kształtów 2D poprzez samoorganizację unikalnie adresowalnych jednoniciowych płytek DNA, które działają jak piksele molekularne na molekularnym płótnie. Każda jednoniciowa płytka (SST) to 42-nukleotydowa nić DNA złożona z czterech połączonych domen modułowych, które wiążą się z czterema sąsiadami podczas samoorganizacji. Płótno molekularne to prostokątna struktura samoskładająca się z SST. Określony złożony kształt 2D jest tworzony przez wybranie składowych pikseli molekularnych (SST) z 310-pikselowego płótna molekularnego, a następnie poddanie odpowiednich pasm wyżarzaniu w jednym garnku. Ze względu na modułowy charakter podejścia SST pokazujemy skalowalność, wszechstronność i solidność tej metody. W porównaniu z metodami alternatywnymi, metoda SST umożliwia szerszy wybór polimerów i sekwencji informacyjnych dzięki zastosowaniu zaprojektowanych i zsyntetyzowanych de novo krótkich nici DNA.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Poprzednie prace nad samomontażem kwasów nukleinowych1-25 doprowadziły do udanej budowy różnych złożonych struktur, w tym DNA2–5,8,10–13,17,23 lub RNA7,22 okresowego3,4,7,22 i algorytmicznego5 dwuwymiarowych sieci, wstęg10,12 i rurek4,12,13, kryształów 3D17, wielościanów11 i skończonych, kształtów 2D7,8. Szczególnie skuteczną metodą jest origami DNA na rusztowaniu, w którym pojedyncza nić rusztowania jest składana przez wiele krótkich pomocniczych nici zszywek, tworząc złożony kształt9,14–16,18–21,25.

Niedawno opisaliśmy metodę konstruowania dyskretnych nanostruktur o zalecanych kształtach 2D przy użyciu jednoniciowych płytek (SST) i pokazaliśmy struktury o złożoności porównywalnej do DNA origami26. Ten artykuł jest adaptacją naszej wcześniejszej pracy26 i opisuje szczegółowe protokoły układania indywidualnie adresowalnych SST w wyrafinowane, skończone kształty 2D o precyzyjnie określonych wymiarach (szerokościach i długościach) i morfologiach. Jedną z kluczowych zalet metody SST jest jej modułowość. Każdy komponent SST konstrukcji służy jako modułowa jednostka konstrukcyjna w zespole, a różne podzbiory tych SST tworzą różne kształty. W ten sposób stworzyliśmy ogólną platformę do konstruowania nanostruktur o określonych rozmiarach i kształtach z krótkich, syntetycznych nici DNA.

SST zawierają cztery domeny, każda o długości 10 lub 11 nukleotydów (Rysunek 1A). SST wiążą się w taki sposób, że ich równoległe helisy tworzą sieć DNA utrzymywaną razem przez wiązania krzyżowe. Każde skrzyżowanie jest fosforanem między domenami 2 i 3. Fosforan jest sztucznie rozciągnięty na schematach w celu uzyskania przejrzystości wizualnej. Zwrotnice są oddalone od siebie o dwa spiralne zwoje (21 podstaw) (rysunek 1B). Prostokąty kompozytowe są określane przez ich wymiary w liczbie helis i spiralnych zwojów. Na przykład prostokąt o szerokości sześciu helis i długości ośmiu spiralnych zwojów jest określany jako prostokąt o wymiarach 6H × 8T. Powierzchnie SST można pominąć, dodać lub w inny sposób przegrupować w celu utworzenia struktur o dowolnych kształtach i rozmiarach (rysunek 1C). Na przykład prostokątną konstrukcję można zwinąć w rurkę o żądanej długości i promieniu (rysunek 1D).

Alternatywnie, prostokątna siatka SST może być postrzegana jako molekularne płótno składające się z pikseli SST, każdy 3 nm na 7 nm. W tym badaniu używamy molekularnego płótna składającego się z 310 wewnętrznych SST o pełnej długości, 24 SST o pełnej długości tworzących lewą i prawą granicę oraz 28 SST o połowie długości tworzących górną i dolną granicę. Płótno ma 24 podwójne helisy połączone skrzyżowaniami, a każda helisa zawiera 28 spiralnych zwojów (294 podstawy) i dlatego jest określana jako prostokątne płótno 24H × 28T. Płótno 24H × 28T ma masę cząsteczkową podobną do struktury origami DNA utworzonej z rusztowania fagowego M13.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Projekt sekwencji DNA

  1. Użyj oprogramowania UNIQUIMER27, aby zaprojektować skończoną strukturę SST, określając liczbę podwójnych helis, długości górnej i dolnej helisy dla każdej podwójnej helisy oraz wzór zwrotnicy, aby utworzyć płótno 24H × 28T. Po zdefiniowaniu tych parametrów, ogólna architektura (skład pasm i układ komplementarności) jest zilustrowana graficznie w programie.
  2. Wygeneruj sekwencje dla nici określonej struktury, aby spełnić układ komplementarności i dodatkowe wymagania (jeśli występują). Projektuj sekwencje DNA, minimalizując symetrię sekwencji28 (dla większości struktur).
    1. Generuj nukleotydy (A, C, G i T) losowo jeden po drugim.
    2. Dopasuj nukleotydy komplementarne do tych wygenerowanych zgodnie z regułą parowania zasad: od A do T i odwrotnie; C do G i odwrotnie.
    3. Nie używaj powtarzających się segmentów powyżej ośmiu lub dziewięciu nukleotydów. Gdy takie powtarzające się segmenty pojawią się podczas projektowania, należy zmutować ostatnio wygenerowane nukleotydy, aż zostanie spełnione wymaganie dotyczące powtarzających się segmentów.
    4. Nie używaj czterech kolejnych podstaw A, C, G lub T.
    5. Użyj wstępnie określonych nukleotydów w jednoniciowych punktach wiązania (na przykład T i G jako odpowiednio dwudzieste pierwsze i dwudzieste drugie nukleotydy dla większości nici), aby uniknąć przesuwania zasad wokół punktów wiązania (np. jeśli zarówno dwudziesty pierwszy, jak i dwudziesty drugi nukleotyd to T, możliwe było, że dwudziesty pierwszy nukleotyd zwiąże się z nukleotydem, z którym ma się związać dwudziesty drugi nukleotyd).
  3. Ręczna modyfikacja sekwencji DNA w celu znakowania streptawidyny, przekształcania prostokątów w probówki, tworzenia różnych prostokątów i probówek w różnych skalach oraz zapobiegania agregacji spowodowanej przez odsłonięte domeny na SST.
    1. Zastąp odsłonięte domeny na granicy płótna molekularnego traktami poli-T.
    2. W przypadku etykietowania streptawidyną należy zaprojektować segmenty uchwytu (dodatkowy segment dołączony do pasma składowego, który może wiązać się z komplementarnym odpowiednikiem, takim jak splot zapobiegający uchwytowi) tak, aby mogły pomieścić pasmo zapobiegające uchwytowi z modyfikacją biotyny 3'.
    3. Aby przekształcić prostokąt w rurkę, usuń górny i dolny rząd z prostokąta i wstaw nowy wiersz, którego SST mają określoną komplementarność z odpowiednimi płytkami w drugim do górnego rzędzie i od drugiego do dolnego rzędu.
    4. W przypadku odsłoniętej domeny jednoniciowej o różnych kształtach zastąp ją segmentami poli-T o długości 10-11 nukleotydów lub przykryj ochraniaczami krawędzi, które są komplementarne do odsłoniętej domeny i zakończ się długimi segmentami poli-T o długości 10-11 nukleotydów.

2. Przygotowanie Płótna Molekularnego

  1. Otrzymać nici składowe DNA określonych sekwencji rozpuszczonych w wodzie wolnej od RNaz od producenta oligonukleotydów na 96-dołkowych płytkach z dnem V z oligonukleotydami zsyntetyzowanymi w skali 10 nmol ze standardowym odsalaniem. Odwirować 96-dołkowe płytki z niciami DNA przez około 10 s przy 600 x g.
    1. Odpipetować 1 μl z każdej z 362 studzienek z niciami DNA dla prostokąta 24H × 28T (ryc. 3A) przy 100 μM na nić (specyfikacja producenta) do probówki o pojemności 2 ml. Dodać 138 μl destylowanegodejonizowanego H2Odo probówki o pojemności 2 ml w celu sporządzenia roztworu podstawowego mieszaniny pasm o stężeniu 200 nM na nić.
  2. Dodać 50 μl roztworu podstawowego mieszaniny nici o stężeniu 200 nM, 10 μl 10-krotnego buforu A do wyżarzania (50 mM Tris, pH 7,9, 10 mM EDTA, 250 mM MgCl2) i 40 μl destylowanego dejonizowanegoH2Odo 0,2 ml probówki do PCR. W ten sposób powstaje 100 μl próbki płótna molekularnego w buforze A do wyżarzania 1X (5 mM Tris, pH 7,9, 1 mM EDTA, 25 mM MgCl2).
  3. Wyżarzać próbkę przez 17 godzin w termocyklerze, schładzając z 90 °C do 25 °C. Zaprogramować termocykler w następujący sposób: zmniejszyć temperaturę z 90 °C do 61 °C ze stałą prędkością 5 minut na °C; zmniejszyć temperaturę z 60 °C do 25 °C ze stałą prędkością 20 minut na °C; i inkubować w temperaturze 4 °C do momentu, gdy próbka będzie mogła należy wyjąć z termocyklera.
  4. Przygotuj natywny żel 2% agarozowy.
    1. Odmierz 2,4 g agarozy do zlewki o pojemności 600 ml. Dodać 120 ml 0,5-krotnego buforu TBE (44,5 mM tris-boranu, pH 8,3, 1 mM EDTA) i 30 ml destylowanej wody dejonizowanej do zlewki.
    2. Kuchenka mikrofalowa przez 3 minuty (lub 40 - 60 sekund więcej po ugotowaniu). Uzupełnij wodę utraconą podczas parowania poprzez dodanie 30 ml wody, co pomaga utrzymać stężenie agarozy w żelu na poziomie 2%.
    3. Obracać zawartość zlewki przez 1 minutę w zimnej kąpieli wodnej. Dodać 1 ml 1,2 M MgCl2 (aby uzyskać stężenie 10 mM MgCl2 w żelu) i wstępnie zabarwić żel 6 μl barwnika SYBR Safe (1:20 000).
    4. Wlej roztwór żelu do suchego pudełka żelowego i włóż 1,5 mm gruby 12-dołkowy grzebień do elektroforezy żelowej. Pozwól roztworowi zestalać się przez 15 - 30 minut na równej platformie.
    5. Wlać żelowy bufor do biegania (44,5 mM Tris-Boranu, pH 8,3, 1 mM EDTA i 10 mM MgCl2) do pudełka z żelem. Załadować 2 - 3 μl drabinki DNA o pojemności 1 kb do studzienki z żelem agarozowym. Zmieszać 4 μl 6X niebieskiego barwnika bromofenolowego (0,25% błękitu bromofenolowego, 5 mM Tris, 1 mM EDTA, 10 mM MgCl2 i 30% glicerolu) z 20 μl próbki z płótna molekularnego i załadować roztwór do innego dołka żelu agarozowego.
  5. Uruchom natywną 2% agarozę przez 2 godziny przy 100 V w lodowatej kąpieli wodnej (błękit bromofenolowy, pokazany na niebiesko, działa szybciej niż pasma składników, więc może służyć jako wskaźnik, czy odpowiedni jest 2-godzinny czas pracy).
  6. Zobrazuj żel za pomocą skanera żelowego z filtrem odpowiednim dla bezpiecznej plamy SYBR (rysunek 2B).
  7. Na transiluminatorze światła niebieskiego wyciąć pasmo dominujące o ruchliwości podobnej ruchliwości do pasma 1500 par zasad drabiny DNA o długości 1 kb za pomocą ostrej, czystej żyletki. Umieść żądane kawałki żelu w kolumnie wirowej, a następnie zmiażdż żel na drobne kawałki za pomocą tłuczka do mikroprobówek. Wirować przy 438 x g przez 3 minuty w temperaturze 4 °C.
  8. Zmierzyć stężenie DNA za pomocą spektrofotometru ultrafioletowego o długości fali 260 nm.
    1. Użyj 2 μl ultraczystej wody destylowanej wolnej od DNaz/RNaz jako ślepej próby do kalibracji urządzenia.
    2. Użyj równoważnej objętości pobranej próbki z kolumny wirowej, aby uzyskać oszacowanie stężenia DNA. Zmierzona wartość stężenia ("a" = ng/μl) uzyskana przy absorpcji UV 260 nm pomoże określić współczynnik rozcieńczenia dla obrazowania AFM i TEM.
    3. Przelicz zmierzone stężenie z "a" (ng/μl) na "b" (nM) zgodnie z b = a × 106 / (330 × liczba nukleotydów).
      UWAGA: Masa cząsteczkowa nukleotydu wynosi 330 g/mol. Obliczona wartość stężenia molowego określi współczynnik rozcieńczenia dla obrazowania AFM i TEM. Jeśli chodzi o prostokąt 24H × 28T, typowy pomiar dla oczyszczonej próbki wynosi około 10 - 60 ng/μl. Ponieważ liczba nukleotydów dla takiej struktury wynosi 14616 Da, stężenie molowe wynosi około 2 - 12 nM. Końcowe stężenie określa się na podstawie wydajności zbierania (~20 - 50%) z odwirowania i objętości wyciętej opaski żelowej (im większa objętość, tym bardziej rozcieńczona jest oczyszczona próbka).

3. Obrazowanie mikroskopowe sił atomowych

  1. Oderwij mikę przymocowaną do metalowego krążka próbki za pomocą taśmy klejącej, aby uzyskać płaską powierzchnię i umieść krążek próbki na stoliku do obrazowania.
  2. Dodać 40 μl 1X buforu do wyżarzania A, a następnie 5 μl (2 - 5 nM) oczyszczonej próbki prostokąta 24H × 28T do świeżo rozszczepionej powierzchni miki. Pozostaw mieszaninę na około 2 minuty, aby się osadziła.
  3. Zamontuj chip wspornikowy z azotku krzemu AFM na uchwycie wspornika. Do obrazowania należy użyć końcówki trójkątnej C (częstotliwość rezonansowa, f0 = 40 - 75 kHz; stała sprężystości, k = 0,24 Nm-1).
  4. Zobrazuj próbkę w trybie nakłuwania płynów. Do skanowania należy użyć następujących parametrów obrazowania: rozmiar skanowania 2 μm, 1024 linie dla rozdzielczości i częstotliwość skanowania 0,5–1 Hz (rysunek 2C).
  5. W razie potrzeby dodać 10 μl lub więcej 10 mM roztworu NiCl2 w celu zwiększenia siły wiązania DNA-mika29.

4. Przygotowanie próbki do etykietowania streptawidyny

  1. Ręcznie zaprojektuj prostokąt 24H × 28T w taki sposób, aby pasma uchwytu w określonych miejscach były włączone tak, aby uzupełniały pasma zapobiegające uchwytom z modyfikacją biotyny, które z kolei są w stanie wiązać się ze streptawidyną.
    1. Zmodyfikuj płótno molekularne, dołączając segment 3' 17-nukleotydowy, który składa się z sekwencji dwunukleotydowej (TT) jako przekładki i uchwytu 15-nukleotydowego (GGAAGGGATGGAGGA) do 14 płytek w górnym rzędzie i 14 płytek w dolnym rzędzie prostokąta (rysunek 3A), aby oznaczyć granicę. Sekwencja ta jest komplementarna do nici antyrączkowej modyfikowanej biotyną 3' (TCCTCCATCCCTTCC-biotyna).
  2. W celu etykietowania wewnętrznego przymocuj segment nukleotydowy 3' 17 do 8 płytek wewnętrznych i 6 płytek granicznych prostokąta (Rysunek 4A).
    1. Wymieszaj 28 pasm z uchwytami (etykietowanie graniczne) z pozostałymi pasmami składowymi prostokąta 24H × 28T (334 pasma), aby uzyskać roztwór podstawowy 200 nM. Wymieszaj 14 pasm z uchwytami (etykietowanie wewnętrzne) z pozostałymi pasmami składowymi prostokąta 24H × 28T (348 pasm), aby uzyskać roztwór podstawowy o stężeniu 200 nM.
  3. W celu oznakowania granic dodaj 50 μl roztworu podstawowego 200 nM z pasm, 6 μl 100 μM zmodyfikowanych biotyną nici zapobiegających uchwytom, 10 μl 10X buforu do wyżarzania A i 34 μl destylowanej wody dejonizowanej do probówki o pojemności 0,1 - 0,2 ml. Końcowe stężenie nici składowej wynosi 100 nM, a końcowe stężenie nici modyfikowanej biotyną zapobiegającą klamce wynosi 6 000 nM. Należy pamiętać, że 28 cząsteczek nici zmodyfikowanej biotyną przeciw uchwytowi wiąże się z prostokątem 24H × 28T, więc nić zmodyfikowana biotyną przeciwko uchwytowi przekracza 100%, aby wiązanie było korzystne.
  4. Do etykietowania wewnętrznego dodać 50 μl roztworu podstawowego 200 nM z pasm, 3 μl wewnętrznej nici modyfikowanej biotyną zapobiegającą powstawaniu klamek przy 100 μM, 10 μl buforu A do wyżarzania 10X, 37 μl destylowanej wody dejonizowanej do probówki o pojemności 0,1 - 0,2 ml. Końcowe stężenie nici składowej wynosi 100 nM, a końcowe stężenie nici modyfikowanej biotyną zapobiegającą klamce wynosi 3 000 nM. Należy pamiętać, że 14 cząsteczek nici zmodyfikowanej biotyną przeciw uchwytowi wiąże się z prostokątem 24H × 28T, więc nić zmodyfikowana biotyną przeciwko uchwytowi przekracza 100%, aby wiązanie było korzystne.
  5. Wyżarzać obie próbki w termocyklerze przez 17 godzin, wykonując czynności opisane w ppkt 2.3.
  6. Przygotuj natywny żel 2% agarozowy zgodnie z opisem w krokach 2.4.
  7. Oczyść obie próbki zgodnie z opisem w krokach 2.5.
  8. Zmierz stężenia pożądanych struktur DNA zgodnie z opisem w krokach 2.6.

5. Mikroskopia sił atomowych do oznaczania streptawidyny

  1. Zobrazuj każdą próbkę za pomocą AFM zgodnie z opisem w kroku 3 (rysunki 3B i 4B).
  2. Po pierwszej rundzie obrazowania dodać do próbki 40 μl buforu A do wyżarzania 1X, a następnie 1 μl streptawidyny w stężeniu 10 mg/ml do próbki. Pozostawić mieszaninę do osiadania przez około 2 minuty przed ponownym obrazowaniem (rysunki 3C i 4C).

6. Zamiana prostokąta na rurkę

  1. Aby zaprojektować rurę na podstawie prostokąta, należy zachować wszystkie składowe SST na miejscu, z wyjątkiem górnego i dolnego rzędu. Wprowadź nowy wiersz, którego SST są zaprojektowane przez połączenie górnych i dolnych półkafelków odpowiednich kolumn w celu cyklicznego przekształcania oryginalnego prostokąta w konformację rury (Rysunek 5A).
  2. Zmieszać nowy rząd pasm (14 pasm) z pasmami składowymi prostokąta 24H × 28T, z wyłączeniem górnego i dolnego rzędu (336 pasm), aby uzyskać roztwór podstawowy o stężeniu 200 nM.
  3. Postępuj zgodnie z krokami oczyszczania żelu 2.2 - 2.7 (Rysunek 5B).

7. Obrazowanie za pomocą transmisyjnego mikroskopu elektronowego

  1. Odważyć 0,06 g mrówczanu uranylu w 3 ml wody destylowanej, aby przygotować 2% wodny roztwór barwników mrówczanu uranylu. Przefiltrować 2% wodny roztwór barwienia mrówczanu uranylu za pomocą filtra 0,2 μm dołączonego do strzykawki.
    1. Dodać 5 μl 5 N NaOH do 1 ml przefiltrowanego roztworu barwienia. Krótko przemieszać roztwór i odwirować przy 20 000 x g.
  2. Żar rozładowuje siatki pokryte węglem (powlekana strona do góry) z następującymi ustawieniami: 25 mA, 45 s, 0.1 mBar i ujemną polaryzacją wysokiego napięcia.
  3. Użyj kleszczy samozamykających, aby chwycić siatkę pokrytą rozładowaniem żarzenia od krawędzi.
  4. Odpipetować 3,5 μl próbki na siatkę przez 4 minuty. Użyj kawałka bibuły filtracyjnej, aby odsunąć próbkę, doprowadzając bibułę filtracyjną do kratki z boku.
  5. Natychmiast dodać 3,5 μl roztworu bejcy na siatkę na 1 minutę.
  6. Odsiąć plamę jak w 7.4 i przytrzymać bibułę filtracyjną przy siatce przez 1 - 2 minuty.
  7. Przenieś siatkę do uchwytu próbki TEM i obraz za pomocą JEOL JEM-1400 pracującego pod napięciem 80 kV z powiększeniem w zakresie od 10 K do 80 K (rysunek 5C).

8. Konstruowanie dowolnych kształtów za pomocą molekularnego płótna

  1. Zidentyfikuj kształt i wybierz pasma, które odpowiadają kształtowi na płótnie molekularnym. Na przykład w przypadku kształtu trójkąta wybierz 206 z 362 pasm dla płótna molekularnego.
  2. Zastąp odsłoniętą domenę (to znaczy wzdłuż przeciwprostokątnej trójkąta) segmentem poli-T o długości 10 - 11 nukleotydów (wzór 1 na rysunku 6A) lub dodaj osłonę krawędzi, która jest komplementarna do odsłoniętej domeny i zakończ ją segmentem poli-T o długości 10 - 11 nukleotydów (projekt 2 na rysunku 6A), aby zapobiec agregacji.
    UWAGA: Proste wyżarzanie SST, które odpowiadają pikselom trójkąta (bez użycia pasm ochronnych) doprowadzi do agregacji i braku wyraźnego tworzenia się pasm produktu na żelu. Użyj konstrukcji ochraniacza krawędzi dla różnych kształtów, ponieważ jest ona bardziej zasobooszczędna; wymaga tylko czterech dodatkowych zestawów pasm (rysunek 6C) w porównaniu z 14 dodatkowymi zestawami w wersji zamiennej (rysunek 6B).
  3. Utwórz bibliotekę nici dla 310-pikselowego płótna molekularnego, która zawiera zestaw podstawowy (płótno SST 362), Zestaw 1* (ochraniacze krawędzi, które wiążą się z domeną 1 SST), Zestaw 2* (ochraniacze krawędzi, które wiążą się z domeną 2 SST), Zestaw 3* (ochraniacze krawędzi, które wiążą się z domeną 3 SST), i Zestaw 4* (ochraniacze krawędzi, które wiążą się z domeną 4 SST), co daje łącznie 1344 ochraniacze krawędzi.
  4. Odwirować 96-dołkowe płytki dla różnych zestawów przez około 10 s. Odpipetować pożądane pasma z płytek, aby uzyskać roztwór podstawowy o określonym kształcie.
    1. Aby uzyskać kształt trójkąta z ochraniaczami krawędzi, odpipetować 1 μl 206 nitek z zestawu rdzeniowego, 0 z zestawu 1*, 0 z zestawu 2*, 0 z zestawu 3* i 24 pasma z zestawu 4* do probówki wirówkowej o pojemności 2 ml. Dodaj 20 μl destylowanej wody dejonizowanej do probówki, aby uzyskać roztwór podstawowy nici DNA o sile 400 nM.
  5. Dodać 50 μl roztworu podstawowego nici DNA o stężeniu 400 nM, 10 μl 10-krotnego buforu do wyżarzania B (50 mM Tris, pH 7,9, 10 mM EDTA, 125 mM MgCl2) roztworu podstawowego i 40 μl destylowanego dejonizowanegoH2Odo 0,2 ml probówki do PCR. W ten sposób powstaje 100 μl próbki trójkąta w buforze do wyżarzania 1X B (5 mM Tris, pH 7,9, 1 mM EDTA, 12,5 mM MgCl2) z pasmami o stężeniu około 200 nM na nić.
  6. Wyżarzać mieszaninę w termocyklerze przez 17 godzin, jak opisano w kroku 2.3.
  7. Przygotuj natywny żel 2% agarozowy zgodnie z opisem w kroku 2.4.
  8. Oczyść próbkę zgodnie z opisem w kroku 2.5.
  9. Zmierzyć stężenie DNA zgodnie z opisem w kroku 2.6.
  10. Zobrazuj próbkę w AFM zgodnie z opisem w kroku 3 (Rysunek 7C i 7D).
  11. Wybierz i wymieszaj pasma dla różnych kształtów, korzystając z tej samej biblioteki pasm. Wyżarzaj różne roztwory i łącz oczyszczone próbki o różnych kształtach, aby zaoszczędzić czas podczas obrazowania AFM.

9. Opcjonalnie: Automatyzacja robota do projektowania kształtów i mieszania cieczy

  1. Użyj niestandardowego programu MATLAB, aby pomóc w projektowaniu złożonych kształtów.
  2. Za pomocą oprogramowania można dostarczać instrukcje w postaci sekwencji pipetowania do robota zajmującego się obsługą cieczy. Użyj robota do obsługi cieczy, aby wybrać i wymieszać pasma, które tworzą docelowy kształt.
    UWAGA: Projektowanie kształtów i mieszanie pasm zostało zautomatyzowane, aby zmniejszyć błąd ludzki i sprawić, że konstrukcja będzie mniej pracochłonna.

10. Prostokąty i rurki w różnych skalach

  1. Skonstruuj prostokąty o różnych rozmiarach (Rysunek 10), po prostu zmieniając liczbę równoległych helis (H) i liczbę spiralnych zwojów (T).
  2. Wykonaj krok 3, aby uzyskać prostokąt o określonym rozmiarze.
  3. Wykonaj krok 6 dla rurki o określonym rozmiarze.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Samodzielna organizacja SST (Rysunek 1) da prostokąt 24H × 28T, jak pokazano na rysunku 2. Sekwencje DNA dla różnych SST mogą być modyfikowane/optymalizowane, aby umożliwić znakowanie streptawidyną (Figura 3 i 4), przekształcenie prostokąta w rurkę (Figura 5), programowalny samomontaż SST w celu utworzenia rurek i prostokątów o różnych rozmiarach (Rysunek 10) oraz konstrukcję dowolnych kształtów 2D przy użyciu płótna mol...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Na etapie tworzenia struktury ważne jest utrzymanie odpowiedniego stężenia kationów magnezu (np. 15 mM) w mieszaninie nici DNA, aby samoorganizować nanostruktury DNA. Podobnie, na etapie charakteryzacji/oczyszczania żelu agarozowego, ważne jest utrzymanie odpowiedniego stężenia kationów magnezu (np. 10 mM) w żelu i buforze do pracy żelu, aby zachować nanostruktury DNA podczas elektroforezy. W przypadku struktury prostokątnej 24H×28T przetestowaliśmy wyżarzanie w różnych stężeniach Mg++ i stwi...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy deklarują konkurencyjne interesy finansowe.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca została sfinansowana przez Office of Naval Research Young Investigator Program Award N000141110914, Office of Naval Research Grant N000141010827, NSF CAREER Award CCF1054898, NIH Director's New Innovator Award 1DP2OD007292 oraz Wyss Institute for Biologically Inspired Engineering Faculty Startup Fund (do P.Y.) oraz Tsinghua-Peking Center for Life Sciences Startup Fund (do B. W.).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Nici DNA Zintegrowana technologiaSekcja 3.1
SYBR Bezpieczne barwienie żelem DNAInvitrogenS33102Sekcja 3.4.2
Kolumny wirujące do ekstrakcji żelu DNA Freeze'NSqueeze BIO-RAD731-6166Sekcja 3.6
Ostre sondy dźwigniowe azotkowe firmy BrukerSondy AFM BrukerSNL10Sekcja 4.3
Bezpieczny obrazownik 2.0 Nadajnik światła niebieskiegoInvitrogenG6600Sekcja 3.6
Wirówka 5430REppendorf5428 000.414Sekcja 3.6
Transmisyjny mikroskop elektronowy JeolJem 1400Sekcja 7.4
Wielomodowy 8VeecoSekcja 4
Skaner laserowy Typhoon FLA 9000GE Heathcare Life Sciences28-9558-08Sekcja 3.5
Ultraczysta woda destylowanaInvitrogen10977-023Sekcja 3.7.1
Zapasy dysku mikiSPI12001-26-2Sekcja 4.1
Stalowa tarcza montażowaTed Pella, Inc.16218Sekcja 4.1
siatka miedziana powlekana węglem do TEMMikroskopia elektronowa SciencesFCF400-CuPęseta sekcja 7.2
Dumont0203-N5AC-POsekcja 7.31
system wyładowań jarzeniowychQuorum TechnologiesK100XSekcja 7.2
Silnik DNA Tetrad 2 Peltier Thermal CyclerBIO-RADPTC– 0240GSekcja 3.3
Owl Easycast B2 Mini żelowe systemy elektroforezyThermoScientificB2Sekcja 3.4.3
Seekam LE Agaroza 500GLonza50004Sekcja 3.4.1
GeneRuler 1kb Plus Drabinka DNA, gotowa do użycia 75-20000bpThermoScientificSM1333Sekcja 3.4.4
Spektrofotometr UV-vis Nanodrop 2000cThermoScientificSekcja 3.7
Filtr 0,2 umCorning Inc.431219Sekcja 7.1.2
DNA

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Seeman, N. C. Nucleic acid junctions and lattices. J. Theor. Biol. 99 (2), 237-247 (1982).
  2. Fu, T. J., Seeman, N. C. DNA double-crossover molecules. Biochemistry. 32 (13), 3211-3220 (1993).
  3. Winfree, E., Liu, F., Wenzler, L. A., Seeman, N. C. Design and self-assembly of two-dimensional DNA crystals. Nature. 394 (6693), 539-544 (1998).
  4. Yan, H., Park, S. H., Finkelstein, G., Reif, J. H., LaBean, T. H. DNA-templated self-assembly of protein arrays and highly conductive nanowires. Science. 301 (5641), 1882-1884 (2003).
  5. Rothemund, P. W. K., Papadakis, N., Winfree, E. Algorithmic self-assembly of DNA Sierpinski triangles. PLoS Biol. 2 (12), e424(2004).
  6. Shih, W., Quispe, J., Joyce, G. A 1.7-kilobase single-stranded DNA that folds into a nanoscale octahedron. Nature. 427 (6975), 618-621 (2004).
  7. Chworos, A., et al. Building programmable jigsaw puzzles with RNA. Science. 306 (5704), 2068-2072 (2004).
  8. Park, S. H., et al. Finite-size, fully-addressable DNA tile lattices formed by hierarchical assembly procedures. Angew. Chem. Int. Ed. 45 (5), 735-739 (2006).
  9. Rothemund, P. W. K. Folding DNA to create nanoscale shapes and patterns. Nature. 440 (7082), 297-302 (2006).
  10. Schulman, R., Winfree, E. Synthesis of crystals with a programmable kinetic barrier to nucleation. Proc. Natl Acad. Sci. USA. 104 (39), 15236-15241 (2007).
  11. He, Y., et al. Hierarchical self-assembly of DNA into symmetric supramolecular polyhedra. Nature. 452 (7184), 198-201 (2008).
  12. Yin, P., et al. Programming DNA tube circumferences. Science. 321 (5890), 824-826 (2008).
  13. Sharma, J., et al. Control of self-assembly of DNA tubules through integration of gold nanoparticles. Science. 323 (5910), 112-116 (2009).
  14. Douglas, S. M., Dietz, H., Liedl, T., Högberg, B., Graf, F., Shih, W. M. Self-assembly of DNA into nanoscale three-dimensional shapes. Nature. 459 (7245), 414-418 (2009).
  15. Andersen, E. S., et al. Self-assembly of a nanoscale DNA box with a controllable lid. Nature. 459 (7243), 73-76 (2009).
  16. Dietz, H., Douglas, S. M., Shih, W. M. Folding DNA into twisted and curved nanoscale shapes. Science. 325 (5941), 725-730 (2009).
  17. Zheng, J. P., et al. From molecular to macroscopic via the rational design of self-assembled 3D. DNA crystal. Nature. 461 (7260), 74-77 (2009).
  18. Han, D., et al. DNA origami with complex curvatures in three-dimensional space. Science. 332 (6024), 342-346 (2011).
  19. Liu, W., Zhong, H., Wang, R., Seeman, N. C. Crystalline two-dimensional DNA origami arrays. Angew. Chem. Int. Ed. 50 (1), 264-267 (2011).
  20. Zhao, Z., Liu, Y., Yan, H. Organizing DNA origami tiles into larger structures using preformed scaffold frames. Nano Lett. 11 (7), 2997-3002 (2011).
  21. Woo, S., Rothemund, P. Programmable molecular recognition based on the geometry of DNA nanostructures. Nat. Chem. 3 (8), 620-627 (2011).
  22. Delebecque, C. J., Lindner, A. B., Silver, P. A., Aldaye, F. A. Organization of intracellular reactions with rationally designed RNA assemblies. Science. 333 (6041), 470-474 (2011).
  23. Lin, C., Liu, Y., Rinker, S., Yan, H. DNA tile based self-assembly: building complex nanoarchitectures. ChemPhysChem. 7 (8), 1641-1647 (2006).
  24. Seeman, N. C. Nanomaterials based on DNA. Annu. Rev. Biochem. 79 (1), 65-87 (2010).
  25. Voigt, N. V., Nangreave, J., Yan, H., Gothelf, K. V. DNA origami: a quantum leap for self-assembly of complex structures. Chem. Soc. Rev. 40 (12), 5636-5646 (2011).
  26. Wei, B., Dai, M., Yin, P. Complex Shapes self-assembled from single stranded DNA tiles. Nature. 485 (7400), 623-626 (2012).
  27. Wei, B., Wang, Z., Mi, Y. Uniquimer: software of de novo DNA sequence generation for DNA self-assembly: an introduction and the related applications in DNA self-assembly. J. Comput. Theor. Nanosci. 4 (1), 133-141 (2007).
  28. Seeman, N. C. De novo design of sequences for nucleic acid structural engineering. J. Biomol. Struct. Dyn. 8 (3), 573-581 (1990).
  29. Hansma, H. G., Laney, D. E. DNA binding to mica correlates with cationic radius: assay by atomic force microscopy. Biophys. J. 70 (4), 1933-1939 (1996).
  30. Seelig, G., Soloveichik, D., Zhang, D. Y., Winfree, E. Enzyme-free nucleic acid logic circuits. Science. 314 (5805), 1585-1588 (2006).
  31. Yin, P., Choi, H. M. T., Calvert, C. R., Pierce, N. A. Programming biomolecular self-assembly pathways. Nature. 451 (7176), 318-322 (2008).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Single stranded DNA TilesDNA Nanostructure Self assemblyMolecular Canvas AssemblyNative Agarose Gel ElectrophoresisAtomic Force Microscopy ImagingDNA Strand PurificationThermal Cycler AnnealingEdge Protector DesignDomain Substitution MethodDNA Concentration Measurement

Related Articles