Eksplantaty keratocytów danio pręgowanego w celu zbadania zbiorowej migracji komórek i reepitelializacji w gojeniu się ran skórnych

Podsumowanie

Keratocyty danio pręgowanego migrują w arkuszach komórkowych z eksplantatów i dostarczają modelu in vitro do badania mechanizmów zbiorowej migracji komórek w kontekście gojenia się ran nabłonkowych. Protokoły te szczegółowo opisują skuteczny sposób ustanawiania pierwotnych kultur eksplantatów do wykorzystania w zbiorczych testach migracji komórek.

Streszczenie

Ze względu na swoje unikalne właściwości ruchliwe, keratocyty ryb oddzielone od kultur eksplantatów od dawna są wykorzystywane do badania mechanizmów migracji pojedynczych komórek. Jednakże, gdy eksplantaty są już ustabilizowane, komórki te również poruszają się kolektywnie, zachowując wiele cech, które sprawiają, że poszczególne keratocyty są atrakcyjnym modelem do badania migracji: szybkie tempo ruchliwości, rozległe blaszki bogate w aktynę z prostopadłym aktynowym oraz stosunkowo stała prędkość i kierunek migracji. We wczesnych eksplantatach szybka interkonwersja komórek migrujących indywidualnie z tymi migrującymi zbiorowo pozwala na badanie roli adhezji komórka-komórka w określaniu trybu migracji i podkreśla powiązania molekularne między tymi dwoma sposobami migracji. Komórki w późniejszych eksplantatach tracą zdolność do szybkiej i zbiorowej migracji, gdy zachodzi przejście nabłonkowe do mezenchymalnego, a geny związane z gojeniem się ran i stanem zapalnym ulegają zróżnicowanej ekspresji. W ten sposób eksplantaty keratocytów mogą służyć jako model in vitro dla reepitelializacji, która zachodzi podczas gojenia się ran skórnych i mogą stanowić unikalny system do badania mechanizmów zbiorowej migracji komórek w kontekście zdefiniowanego programu zmian ekspresji genów. Dostępnych jest wiele zmutowanych i transgenicznych linii danio pręgowanego, co pozwala na tworzenie eksplantatów z ryb o różnym pochodzeniu genetycznym. Pozwala to na jednoznaczne określenie roli różnych białek w tych procesach. Przedstawione tutaj protokoły opisują łatwą i skuteczną metodę ustanawiania tych kultur eksplantatów do wykorzystania w różnych testach związanych ze zbiorową migracją komórek.

Wprowadzenie

Badania nad ruchliwością komórek tradycyjnie koncentrowały się na pojedynczych migrujących komórkach. Keratocyty hodowane z eksplantatów ryb i okazały się potężnym systemem modelowym do badania mechanizmów ruchliwości komórek przy użyciu zarówno eksperymentalnych, jak i matematycznych podejść modelowania^1-6. Prace eksperymentalne na indywidualnie migrujących komórkach są wspomagane przez szybki, płynny ruch ślizgowy komórek, przy zachowaniu jednolitego kształtu, prędkości i kierunku. Jednak in vivo komórki często poruszają się zbiorowo, zachowując połączenia komórka-komórka, szczególnie podczas embriogenezy, gojenia się ran i przerzutów. W związku z tym zbiorowa migracja komórek jest rosnącym i coraz bardziej znaczącym obszarem badań w dziedzinie migracji komórek. Kolektywna migracja tych komórek została niedawno opisana⁷ i ma wiele unikalnych cech, które sprawiają, że jest to potężny system do badania zbiorowej migracji komórek w modelu gojenia się ran.

Gdy łuski są zrywane ze znieczulonego dorosłego danio pręgowanego, część tkanki nabłonkowej pozostaje przyczepiona do spodniej strony łuski. Po dodaniu pożywki do hodowli komórkowej te komórki nabłonkowe lub keratocyty szybko migrują jako jednostka zbiorowa z wagi. Hodowla eksplantatów może być postrzegana jako nabłonkowy model gojenia się ran, w którym komórki migrują z eksplantatu, tak jak w przypadku prowizorycznej macierzy łożyska rany, aby przywrócić nienaruszony nabłonek. Najnowsze dane sugerują, że ta hodowla ex vivo naśladuje wiele cech gojenia się ran in vivo u dorosłych danio pręgowanych. Wskaźniki zamykania się ran⁸ przekładają się na szybkość migracji podobną do obserwowanej w systemie ex vivo ⁷. Ponadto, w modelu gojenia się ran in vivo, leczenie warfaryną sugeruje, że hemostaza nie ma wpływu na szybkość gojenia, podczas gdy leczenie hydrokortyzonem w celu zmniejszenia odpowiedzi immunologicznej nie opóźnia reepitelializacji⁸. Ponieważ danio pręgowany nie krwawi po usunięciu łuski ze zwierzęcia, hemostaza nie jest głównym graczem. Chociaż znaleźliśmy komórki odpornościowe w eksplantatach, nie badaliśmy wpływu, jaki mogą one mieć na zbiorową migrację komórek.

Przedstawiony tutaj protokół opisuje, jak stworzyć hodowle eksplantatów keratocytów danio pręgowanego, które zapewniają spójność i powtarzalność do wykorzystania w wielu testach biologicznych. Te hodowle eksplantatów są szczególnie przekonującym modelem in vitro dla zbiorowej migracji komórek z kilku powodów. Po pierwsze, keratocyty danio pręgowanego są komórkami pierwotnymi wykorzystywanymi w ciągu kilku godzin od założenia kultur eksplantatów. W związku z tym komórki te nie uległy zmianom morfologicznym i ekspresji genów związanym z pasażem komórek pierwotnych^9-13. Po drugie, system ten stanowi model do badania reepitelializacji w odpowiedzi na zranienie¹⁴ i, w ramach odpowiedzi na zranienie, inicjowany jest proces przejścia nabłonkowego do mezenchymalnego (EMT), o czym świadczą zmiany w ekspresji genów i rearanżacje cytoszkieletu^14,15. W ten sposób scharakteryzowano zmiany tła w ekspresji i ruchliwości genów, które zachodzą w komórkach nieleczonych i zapewniają kontekst do interpretacji zmian związanych z leczeniem. Ponadto keratocyt rybi i keratynocyt ludzki są funkcjonalnie równoważne; Obie są pierwotnymi komórkami nabłonkowymi swojego gatunku i odgrywają kluczową rolę w gojeniu się ran nabłonkowych. Po trzecie, dorosłe rybo pręgowane zyskują uznanie jako system modelowy dla różnych chorób człowieka^16-18, w tym czerniaka i innych nowotworów^19-21, gojenia się ran skórnych^8,14 i regeneracji tkanek^22-24.

Zalety techniczne tego systemu są równie przekonujące. Rosnąca liczba zmutowanych i transgenicznych linii jest dostępna w scentralizowanych placówkach non-profit. W szczególności projekt Zebrafish Mutation Project (ZMP) w Wellcome Trust Sanger Institute ma na celu stworzenie allelu nokautującego w każdym genie kodującym białko w genomie danio pręgowanego. Obecnie zmutowali 11 892 geny, czyli około 45% genomu, w których scharakteryzowano 24 088 alleli. Ponadto ZMP przyjmuje propozycje i bezpłatnie generuje nokauty. Najnowsze metody knockdownu genów u larw i dorosłych ryb danio pręgowanego^25-28 zapewniają elastyczność w badaniu funkcji genów ważnych dla rozwoju, dla których podejścia transgeniczne są problematyczne lub niepraktyczne.

Ze względu na ich niezwykle szybkie tempo ruchliwości wynoszące ~145 μm/h krótko po założeniu kultur²⁹, testy mogą być zakończone szybko (zwykle w ciągu 24 godzin lub mniej). Ponieważ eksperymenty można szybko przeprowadzić, a kultury dobrze rosną w RT, unika się kilku przeszkód technicznych związanych z testami migracji komórek ssaków z wykorzystaniem mikroskopii wideo. Ponadto w dobie napiętych budżetów badawczych danio pręgowany jest łatwy i niedrogi w utrzymaniu.

Struktura i zachowanie eksplantu jest złożone. Ponieważ ryby nie krwawią po usunięciu łuski, jest mało prawdopodobne, aby łuska usunęła znacznie więcej niż powierzchowne warstwy naskórka. Keratocyty wydają się być dominującym typem komórek w eksplantacie, gdy łuski są początkowo usuwane z ryby, ponieważ zdecydowana większość komórek wydaje się barwić przeciwciałem anty-E-kadheryny¹⁴. Co więcej, nie ma dowodów na obecność fibroblastów w początkowej hodowli, co ocenia się na podstawie braku barwienia wimentyną przez immunofluorescencję¹⁴. Jednak przy wielokrotnym usuwaniu łuski wydaje się, że w eksplantacie znajdują się liczne neutrofile (patrz wideo 1). Zidentyfikowaliśmy te komórki jako neutrofile na podstawie obserwacji morfologicznych ich wielkości, szybkiej ruchliwości i migracji z arkusza komórkowego po wystawieniu na LPS (dane nie pokazane). Ponadto komórki te barwią się jasno przeciwciałem przeciwko cytozolowi neutrofilowemu, a także różnymi drugorzędowymi przeciwciałami IgG, co wskazuje, że mają obfite FcR na swojej powierzchni (dane nie pokazane). W eksplantacie znajduje się wiele warstw komórek. Mikroskopia konfokalna ujawnia obecność pojedynczej warstwy w pobliżu krawędzi natarcia do więcej niż dwóch warstw keratocytów w pobliżu skali z neutrofilami widocznymi powyżej, poniżej i między arkuszami keratocytów komórkowych.

We wczesnych punktach czasowych komórki na skraju wielowarstwowego eksplantatu polaryzują się, inicjując zbiorową migrację keratocytów z eksplantatu z początkową szybkością ~145 μm/h. Powierzchnia pokryta eksplantatem gwałtownie się zwiększa, co prowadzi do rozprzestrzeniania się komórek, naprężenia w arkuszu i zmniejszenia szybkości posuwania się krawędzi natarcia. Szybkie wzajemne konwersje między komórkami prowadzącymi i naśladującymi obserwuje się na krawędzi natarcia podczas tworzenia i zamykania spontanicznie powstałych otworów w arkuszu⁷. W miarę kontynuowania procesu EMT zainicjowanego eksplantatem fragmenty arkusza i keratocyty tracą swoją wyspecjalizowaną, szybką ruchliwość. Ekspresja genów i zmiany morfologiczne zgodne z EMT, gojeniem się ran i reakcjami zapalnymi zachodzą w ciągu 7 dni od hodowli, przy czym eksplantaty uważa się za żywotne przez około 10 dni¹⁴.

Protokół

Ten protokół jest zgodny z Zasadami Dobrostanu Zwierząt AVMA dotyczącymi opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych i został zatwierdzony przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) na Uniwersytecie Środkowo-Zachodnim.

1. Przygotowanie znieczulenia, sprzętu i mediów

1. Odchloruj około 1,5 l wody z kranu za pomocą dostępnego w handlu środka odchlorowującego (dostępnego w sklepach zoologicznych) lub odstawiając wodę na 24 godziny. Zaopatrz się w trzy zlewki o pojemności 1 l i napełnij każdą z nich 500 ml odchlorowanej wody. Oznacz jedną do trzymania ryb przed jakimkolwiek zabiegiem, a drugą do rekonwalescencji. Do trzeciej zlewki dodać 100 μg/ml metanosulfonianu trikainy; Staje się to zlewką, w której ryby zostaną znieczulone.
2. Napełnij płytką tacę lodem, podgrzej pożywkę hodowlaną (RPMI 1640, 10% FBS (płodowa surowica bydlęca), 50 μg/ml gentamycyny, 100 μg/ml kanamycyny, 25 mM HEPES) do RT i zbierz czystą pęsetę jubilerską. Wyczyść pęsetę, zanurzając końcówki w 70% etanolu i przepuść przez palnik Bunsena, pozwalając etanolowi się spalić.
3. Zdecyduj, czy zabieg zostanie wykonany bez powiększenia, przy użyciu komercyjnego, stołowego podświetlanego szkła powiększającego o powiększeniu 2 - 10x, czy mikroskopu preparacyjnego (całkowicie w zależności od osobistych preferencji).

2. Zakładanie kultur eksplantatów

1. Złap żądaną liczbę ryb i umieść w zlewce do przechowywania. Przenieś pojedynczą rybę do zlewki anestezjologicznej; Najlepiej jest znieczulać ryby indywidualnie.
2. Monitoruj efekty znieczulenia, obserwując pływanie i ruch skrzeli ryb. W miarę postępu znieczulenia ruch skrzeli zwalnia, a ryby będą pływać nieregularnie i często do góry nogami; Rozważ znieczulenie ryb, gdy tylko ustanie ruch skrzeli. Nie pozostawiaj ryb na dłuższy czas w kąpieli anestezjologicznej, ponieważ może to spowodować śmierć ryby.
3. Wyjmij rybę ze zlewki znieczulającej i przenieś do lodu, układając rybę poziomo z ogonem skierowanym w stronę ręki trzymającej pęsetę. Jeśli masz doświadczenie w tej technice i jeśli do przygotowania eksplantatów ma być użytych wiele ryb, rozważ umieszczenie następnej ryby w zlewce anestezjologicznej w tym czasie.
4. Aby usunąć łuski, ustaw pęsetę równolegle do ryby, z końcówką na krawędzi łuski. Lekko wciśnij płaską stronę pęsety w bok ryby, aby łuska uniosła się z ciała ryby. Chwyć łuskę pęsetą, zerwij i umieść (bez odwrócenia) w naczyniu do hodowli tkankowej. Powtórz procedurę, usuwając maksymalnie 12 łusek od dużego dorosłego osobnika (po 6 z każdej strony), unikając okolicy skrzeli, linii bocznej i płetw.
5. Umieść rybę w zlewce regeneracyjnej i monitoruj, aby upewnić się, że dochodzi do siebie po znieczuleniu. W tym czasie ryby można przenieść z powrotem do indywidualnego zbiornika. Pozwól rybie dojść do siebie przez co najmniej 21 dni, aby umożliwić pełną regenerację łusek.
6. W zależności od projektu eksperymentalnego, umieścić do 20 łusek na plastikowym naczyniu poddanym kulturze tkankowej o średnicy 35 mm lub 4 - 6 łusek na naczynie ze szklanym dnem. Pozwól, aby łuski przylegały do naczynia przed delikatnym dodaniem podłoża, aby nie odrywały się od naczynia.
   UWAGA: Wraz z doświadczeniem wiele ryb można przetworzyć przed dodaniem pożywki do pierwszego dania.
7. Dodać 1,2 ml kompletnej pożywki (patrz ppkt 1.2 powyżej) do każdej płytki o średnicy 35 mm.
8. Zaleca się inkubację kultur eksplantatów w temperaturze 28 °C w 5% CO₂ przez pożądany okres czasu, z dodatkowym traktowaniem lub bez. Alternatywnie, inkubować kultury na podgrzewanym stoliku mikroskopowym lub w komorze do hodowli żywych komórek w celu mikroskopii wideo.

3. Mikroskopia Brightfield i Wideo

1. Umieść naczynia zawierające arkusze komórek na stoliku mikroskopu i początkowo ustaw ostrość za pomocą soczewki obiektywowej 4X.
   UWAGA: W zależności od eksperymentu można zastosować większe powiększenia. Oznaczenie położenia każdego arkusza komórek i/lub orientacji naczynia na stole ułatwi robienie zdjęć w czasie z arkuszami w mniej więcej tej samej orientacji.
2. Wyjmij szalki z inkubatora i sfotografuj w różnych punktach czasowych, zgodnie z każdym protokołem eksperymentalnym, i umieść z powrotem w inkubatorze, jeśli potrzebne są tylko nieruchome obrazy w czasie eksperymentu.
3. Podczas wykonywania wideomikroskopii należy zwrócić uwagę na następujące kwestie:
   1. Umieść arkusz skali/wyłaniającej się komórki w polu view w taki sposób, aby migrujący arkusz komórek pozostał w polu widzenia przez cały czas trwania filmu.
      UWAGA: Może to wymagać pewnego doświadczenia w obserwowaniu, jak komórki migrują spod spodu wagi. W przypadku krótkich filmów jest to mniejszy problem niż w przypadku dłuższych filmów.
   2. W przypadku krótszych ram czasowych inkubuj w RT. W przypadku dłuższych ram czasowych (18+ godzin) należy użyć podgrzewanego etapu lub komory inkubacyjnej, aby utrzymać temperaturę, równowagę pH i zminimalizować parowanie pożywki.

4. Utrwalenie do mikroskopii immunofluorescencyjnej

1. Przygotować i wstępnie ogrzać wszystkie roztwory do temperatury 28 °C. Aby wyświetlić keratocyty pod wpływem fluorescencji, hoduj kultury eksplantatów, jak opisano powyżej, używając naczyń do hodowli tkankowych o średnicy 35 mm ze szklanym dnem. Alternatywnie można zastosować szkiełka ze szklaną komorą.
2. Dodaj 0,8 ml 4% paraformaldehydu w 1,1x PBS do każdego naczynia. Nie usuwaj najpierw pożywki hodowlanej. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 minut, a następnie odsysać w celu usunięcia roztworu.
3. Dodaj 0,8 ml 4% paraformaldehydu w 1,1x PBS do każdego naczynia. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 minut, a następnie odsysać w celu usunięcia roztworu.
4. O ile nie używasz zewnętrznych ligandów lub zewnętrznych epitopów, przepuszczalność komórek przez dodanie 0,5 ml 0,2% Triton X-100 w 1X PBS. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 minut, a następnie odsysać w celu usunięcia roztworu.
5. Dodać 0,5 ml 1% BSA do 1x PBS i inkubować przez 1 godzinę (w temperaturze pokojowej) lub O/N (w temperaturze 4 °C).
   UWAGA: W zależności od warunków eksperymentalnych, na tym etapie można dodać falloidynę.
6. Po inkubacji zaaspirować, aby usunąć roztwór i przystąpić do barwienia przeciwciałami. Alternatywnie, należy przechowywać szalki hodowlane, dodając co najmniej 1 - 2 ml 1% BSA w 1x PBS przez 3 - 4 tygodnie w temperaturze 4 °C.

5. Protokół immunofluorescencji

1. Przygotować roztwory przeciwciał pierwszorzędowych i drugorzędowych zgodnie z zaleceniami producenta.
   UWAGA: Jeśli zalecenia producenta nie są dostępne, dobre początkowe rozcieńczenie przeciwciał pierwszorzędowych (w 1% BSA w 1x PBS) wynosi 1:500 dla przeciwciał poliklonalnych i 1:1,000 dla przeciwciał monoklonalnych; Dobrym początkowym rozcieńczeniem dla przeciwciał drugorzędowych jest 1:1,000. Dostosuj te rozcieńczenia oryginalnego materiału uzyskanego od producenta wyżej, jeśli sygnał jest słaby, niższe, jeśli sygnał jest silny, a tło stanowi problem.
2. Odessać 1% BSA w roztworze 1x PBS. Dodać 0,5 ml roztworu przeciwciała pierwszorzędowego i inkubować przez 1 godzinę (w temperaturze pokojowej) lub O/N (w temperaturze 4 °C).
3. Usunąć pierwszorzędowy roztwór przeciwciała, umieścić w czystej i oznakowanej probówce mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml i zamrozić w temperaturze -20 °C.
   UWAGA: Pozwala to na ponowne użycie przeciwciała pierwszorzędowego, jeśli zajdzie taka potrzeba.
4. Umyj naczynie 3 - 5 razy za pomocą 1x PBS, wyjmując i wyrzucając PBS po każdym myciu.
5. Dodać 0,5 ml roztworu przeciwciał drugorzędowych. W razie potrzeby dodaj znakowaną fluorescencyjnie falloidynę (zgodnie ze stężeniem zalecanym przez producenta) na tym etapie. Inkubować przez 1 godzinę (w temperaturze pokojowej) lub O/N (w temperaturze 4 °C).
   UWAGA: Zastosowanie znakowanej fluorescencyjnie falloidyny pozwala na wizualizację filamentów aktynowych; Odkryliśmy, że falloidyna znakowana 488 działa najlepiej w naszych keratocytach danio pręgowanego, ale można użyć innych fluoroforów.
6. Usunąć i wyrzucić roztwór przeciwciał drugorzędowych.
7. Umyj naczynie 3 - 5 razy za pomocą 1x PBS, wyjmując i wyrzucając PBS po każdym myciu.
   UWAGA: Naczynie można przechowywać pod przykryciem przed światłem w temperaturze 4 °C, jeśli nie można go natychmiast view; upewnij się, że 1x PBS został dodany do naczynia przed przechowywaniem, aby upewnić się, że komórki nie wyschną, ale ogrzeją się do RT (20 - 30 min), a następnie usuń PBS tuż przed przejściem do następnego kroku.
8. Gdy będziesz gotowy do obserwacji, dodaj 2-3 krople podłoża montażowego, z DAPI lub bez, w zależności od potrzeb eksperymentalnych, do naczynia i pozostaw na 10 minut w temperaturze RT.
   UWAGA: Używamy dostępnego na rynku podłoża montażowego na bazie glicerolu z DAPI, ale można użyć innych mediów montażowych. Pozostawienie 10 minut, aby podłoże montażowe znalazło się w naczyniu, ułatwia łatwe wyjęcie szklanego szkiełka nakrywkowego z dna naczynia.
9. Po inkubacji delikatnie ściśnij boki naczynia, aby je poluzować i usuń szkiełko nakrywkowe. Dodaj dodatkową kroplę nośnika montażowego na szklane szkiełko podstawowe i umieść szkiełko nakrywkowe komórkami w dół na szkiełku.
   UWAGA: Rozważ uszczelnienie szkiełka nakrywkowego do szkiełka za pomocą przezroczystego lakieru do paznokci, jeśli szkiełko musi być przechowywane dłużej niż 1-2 dni.
10. Obserwuj szkiełko pod mikroskopem fluorescencyjnym.
    UWAGA: Większość naszych zdjęć została wykonana przy użyciu obiektywu 40X lub 63X w zanurzeniu w oleju, ale konkretna użyta soczewka obiektywowa będzie zależeć od protokołu eksperymentalnego.

Wyniki

Jak pokazano na rysunku 1, arkusze keratocytów można zaobserwować migrujące spod skali w ciągu kilku godzin od założenia hodowli eksplantatów. Czasami można zaobserwować indywidualnie migrujący keratocyt, który oderwał się od zbiorczo migrującego arkusza. Ponadto, ponieważ eksplant został założony z ryby, która została wcześniej oskubana, przez arkusz migrują obfite neutrofile. Przy dłuższych okresach hodowli arkusz keratocytów rozpada się, gdy komórki przechodzą EMT¹⁴.

Dyskusja

Najważniejszym krokiem dla powodzenia hodowli eksplantatów keratocytów jest pozostawienie wagi na przyleganiu do naczynia hodowlanego przez około 2 - 3 minuty przed dodaniem pożywki. Około 75% łusek będzie przylegać i wyrastać z arkuszy (liczba kultur ustalonych dla każdego eksperymentu będzie musiała zostać odpowiednio dostosowana). Arkusze keratocytów nie tworzą się wokół każdej łuski usuniętej z ryby i umieszczonej w kulturze z kilku powodów. Po pierwsze, barwienie eksplantatów DAPI ujawnia, że niektóre łuski mają prz...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Naczynia hodowlane ze szklanym dnem o średnicy 35 mm (pokryte lizyną Poly-D)	MatTek	P35GC-1.5-14-C	Grubość 1.5 mm jest najlepsza do usuwania szkiełka nakrywkowego. Średnica 14 mm zapewnia większą powierzchnię hodowli.
Kleszcze Swiss Jewelers Style, Integra, Miltex 17-303	VWR	21909-460	Uważamy, że wąskie, cienkie kleszcze najlepiej sprawdzają się w usuwaniu kamienia.