Ten protokół został opracowany w celu przesiewania dużej kolekcji plazmy zarodkowej liściastej sałaty warzywnej (Lactuca sativa L.) pod kątem tolerancji na suszę, w celu zidentyfikowania małej puli kandydatów do wykorzystania w badaniach fizjologicznych, molekularnych i genetycznych w celu zidentyfikowania podstawowych cech tolerancji na suszę wraz z programami hodowlanymi.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Półwysokoprzepustowe badania przesiewowe pod kątem potencjalnej tolerancji na suszę w kolekcjach plazmy zarodkowej sałaty (Lactuca sativa)
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Ten protokół opisuje metodę, za pomocą której duża kolekcja zielonej sałaty warzywnej liściastej (Lactuca sativa L.) została przebadana pod kątem prawdopodobnych cech tolerancji na suszę. Dostępność słodkiej wody do użytku rolniczego jest coraz większym problemem w Stanach Zjednoczonych, a także w wielu regionach świata. Krótkotrwałe susze wraz z interwencją regulacyjną w zakresie regulacji dostępności wody w połączeniu z nadciągającym zagrożeniem długoterminowymi zmianami klimatycznymi, które mogą prowadzić do zmniejszenia opadów w wielu ważnych regionach rolniczych, zwiększyły potrzebę przyspieszenia rozwoju upraw dostosowanych do poprawy efektywności wykorzystania wody w celu utrzymania lub zwiększenia produkcji w nadchodzących latach. Protokół ten nie ma być przewodnikiem krok po kroku, jak zidentyfikować na poziomie fizjologicznym lub molekularnym cechy tolerancji na suszę w sałacie, ale raczej jest metodą opracowaną i udoskonaloną poprzez badanie przesiewowe tysięcy różnych odmian sałaty. Charakter tego ekranu opiera się częściowo na uproszczonych pomiarach skupiających się tylko na trzech wskaźnikach stresu wodnego: względnej zawartości wody w liściach, więdnięciu i zróżnicowanym wzroście roślin po stresie związanym z suszą. Celem szybkiego badania przesiewowego dużej kolekcji plazmy zarodkowej jest zawężenie puli kandydatów do punktu, w którym można zastosować bardziej intensywne metody fizjologiczne, molekularne i genetyczne w celu zidentyfikowania określonych cech odpornych na suszę zarówno w laboratorium, jak i w terenie. Kandydaci mogą być również bezpośrednio włączeni do programów hodowlanych jako źródło cech tolerancji na suszę.
Wprowadzenie
Dostępność wody do nawadniania była problemem w większości Stanów Zjednoczonych i na całym świecie od dziesięcioleci, ale badania nad reakcją na stres związany z suszą, wraz z innymi stresami abiotycznymi, pozostają w tyle za pracami w dziedzinie odporności na choroby i owady, na poziomie przemysłowym, akademickim i rządowym, głównie z powodu braku funduszy. Dostępność wody dla rolnictwa była historycznie tylko kwestią drugorzędną na poziomie decydentów politycznych. Ostatnio, z powodu kilku dotkliwych susz w ważnych regionach produkcji rolnej zarówno w Stanach Zjednoczonych, jak i w Australii1,2 dostępność słodkiej wody znalazła się w centrum uwagi zarówno na poziomie krajowym, jak i międzynarodowym, co doprowadziło do skierowania znacznie większej ilości zasobów na badania nad rozwojem odpornych na suszę odmian głównych roślin zbożowych. Chociaż to przesunięcie nacisku na rozwój głównych upraw odpornych na suszę jest korzystne, podobnie jak w przypadku wielu obszarów badań nad roślinami, uprawy specjalistyczne zostały w dużej mierze pozostawione w tyle.
Dotkliwa susza obecnie ogranicza produkcję warzyw w Kalifornii, największym regionie produkcji sałaty (Lactuca sativa L.) w Stanach Zjednoczonych3. Te krótkoterminowe wzorce pogodowe w połączeniu z działaniami legislacyjnymi i sądowymi wraz z długoterminowymi zmianami klimatycznymi4,5 doprowadziły do zmniejszenia ilości wody dostępnej dla rolnictwa w wielu najbardziej produktywnych regionach Kalifornii. Produkcja sałaty w Kalifornii stanowi przemysł o wartości 1,5 miliarda dolarów, co stanowi prawie 80% produkcji sałaty w Stanach Zjednoczonych3. Warzywa liściaste mają wysoką zawartość wody w liściach, a sałata w szczególności ma płytki system korzeniowy6,7, co sprawia, że rośliny są podatne na stres wodny. W przypadku sałaty, podobnie jak we wszystkich innych uprawach, rozwój odmian odpornych na suszę będzie coraz ważniejszy, ponieważ zasoby słodkiej wody do nawadniania stają się coraz bardziej ograniczone8.
Ten protokół przedstawia metodę, za pomocą której przeprowadzono wstępne badanie przesiewowe na dużej kolekcji plazmy zarodkowej sałaty w celu zidentyfikowania puli potencjalnie odpornych na suszę linii kandydujących do wykorzystania w badaniach fizjologicznych, molekularnych i genetycznych w celu zidentyfikowania konkretnych cech tolerancji na suszę. Kandydaci ci mogą być również wykorzystywani bezpośrednio jako źródła tolerancji na suszę w programach hodowlanych w celu poprawy efektywności wykorzystania wody w odmianach komercyjnych. Protokół ten został opracowany specjalnie w celu sprostania wyzwaniom, które pojawiają się w trakcie każdego badania przesiewowego obszernej kolekcji plazmy zarodkowej, w szczególności kwestii dostępności przestrzeni i pracy. Ponadto, przedstawiony protokół został opracowany do stosowania w sałacie, ale został z powodzeniem zaadaptowany do stosowania w badaniach przesiewowych kolekcji plazmy zarodkowej szpinaku (Spinacia oleracea) pod kątem potencjalnej tolerancji na suszę i może być zmodyfikowany po prostu w celu przesiewania dowolnej uprawy warzyw liściastych.
Ważnym czynnikiem przed rozpoczęciem badania tolerancji na suszę jest zrozumienie, czym jest ta metoda, a czym nie jest. Protokół ten ma na celu przedstawienie szybkiej metody, dzięki której duża pula plazmy zarodkowej może być szybko i skutecznie zawężona do możliwej do opanowania liczby potencjalnych plazm zarodkowych do wykorzystania w bardziej ukierunkowanych i dokładnych badaniach w celu identyfikacji indywidualnych cech tolerancji. Protokół ten poddaje rośliny szybko wywołanemu silnemu stresowi wodnemu, w przeciwieństwie do bardziej naturalnego, wolno indukowanego, umiarkowanego, ciągłego stresu suszy, który można zaobserwować w warunkach polowych. Rodzaj reakcji wywołanej w roślinie podczas tych dwóch rodzajów zdarzeń związanych z deficytem wody (szybkie odwodnienie kontra naturalna susza) nie jest identyczny9, co może prowadzić do wykluczenia niektórych materiałów z przyszłych badań. Te dwa zdarzenia stresowe nie pokrywają się jednakze sobą 10, a niniejszy protokół powinien służyć jako skuteczny sposób identyfikacji potencjalnie odpornej na suszę plazmy zarodkowej zawartej w dużej kolekcji. Sam ten protokół nie powinien być uważany za wystarczający do zidentyfikowania z dużą dozą pewności plazmy zarodkowej, która zawiera trwałą tolerancję na suszę w warunkach stresu wodnego na polu, ale stanowi znaczący krok naprzód w szybkim badaniu przesiewowym zielonych warzyw liściastych pod kątem potencjalnych cech tolerancji na suszę.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
1. Sadzenie
- Napełnij tacki na korki (128 komórek; 28 x 54 cm z komórkami 3 cm kwadratowymi i 5 cm głębokości) mieszanką gleby korkowej. Aby pomóc w równomiernym wypełnieniu komórek, skompresuj ziemię w każdej tacy, używając pustej tacki z korkiem.
- Posadź nasiona sałaty na głębokość 1/4 cala, 2-3 nasiona na komórkę. Posadź wszystkie linie eksperymentalne na zreplikowanych tacach, aby zapewnić zarówno tace narażone na suszę, jak i kontrolne do próby suszy.
- Umieść tacki wtykowe w tacce dolnej bez otworów.
- Tacki na wodę i przykryj odwróconą tacą lub plastikową kopułą. Kiełkowanie następuje zwykle w ciągu 48-72 godzin. Po wykiełkowaniu zdejmij pokrywę i przenieś tace do szklarni.
UWAGA: Protokół ten można również wykonać w komorach wzrostowych.
2. Wzrost i pielęgnacja roślin
- Tace na wodę w razie potrzeby od 1-4 tygodni po wykiełkowaniu, zwykle jest to 2-3 razy w tygodniu, wypełniając dolną tacę i pozwalając glebie na nasycenie promieni (~ 1 godzina), aby mogły przebywać w wodzie przez dłuższy czas, ponieważ może to negatywnie wpłynąć na zdrowie roślin i rozwój korzeni oraz może wpłynąć na ekran suszy.
- Tace nawozić raz w tygodniu dostępnym w handlu rozpuszczalnym nawozem 20-20-20 zmieszanym w ilości 1,5 łyżeczki/gal.
- Cienkie tace na jedną roślinę na komórkę 1-2 tygodnie po wykiełkowaniu.
3. Inicjowanie stresu związanego z suszą
- Gdy rośliny osiągną wiek czterech tygodni, podziel tace na 2 grupy. Poddaj jedną grupę silnemu stresowi wodnemu. Użyj innych tac, a także nawodnionych elementów sterujących. Podlewaj grupę kontrolną jak w kroku 2.1 przez cały czas trwania eksperymentu. Na początku stresu suszy należy zawiesić nawożenie wszystkich tacek do końca eksperymentu.
- Eksperymentalny okres suszy trwa jeden tydzień. W pierwszym dniu próby stresu suszy (dzień 0) napełnij wszystkie dolne tace wodą i pozwól, aby gleba w tacach korkowych całkowicie się nasyciła, a następnie spuść wodę z tac. Nasycenie gleby bezpośrednio przed rozpoczęciem okresu stresu pomoże zminimalizować wszelkie różnice w wilgotności gleby między poszczególnymi komórkami w tacach korkowych.
4. Przeprowadzanie podstawowego badania przesiewowego stresu suszy z parametrami do zmierzenia
UWAGA: Poniższe kroki opisują, jak zebrać trzy pomiary fizjologiczne, które zostaną zarejestrowane w trakcie badania suszy, podczas gdy Tabela 1 przedstawia harmonogram pomiarów wykonywanych w każdym dniu okresu próbnego suszy i stresu.
- Zmierz względną zawartość wody w liściach (RWC) w dniach 0, 2, 4 badania.
- Przytnij sałatę z tacy i usuń 2 liście.
- Przebij 3 krążki z każdego liścia za pomocą świdra korkowego #9 (średnica ~ 1,6 cm). Połącz stemple liściowe jako jedną próbkę.
- Zważ krążki liściowe, jest to wartość świeżej masy (FW) używana do obliczenia RWC, a następnie umieść krążki na płytce Petriego.
- Dodaj tylko tyle wody destylowanej do talerza, aby wszystkie krążki liści mogły unosić się na wodzie. Ma to na celu pełne nawodnienie krążków liściowych w celu zebrania jędrnych mas do analizy RWC. Pozwól talerzom liściowym unosić się na wodzie przez 24 godziny w temperaturze pokojowej.
- Wyjmij teraz w pełni nawodnione krążki liściowe z talerzy i delikatnie osusz zewnętrzną stronę krążków liściowych ręcznikami papierowymi przed zważeniem krążków. Zapisz te masy jako masę jędrności (TW) do obliczenia RWC.
- Umieść krążki liściowe na papierowej chusteczce laboratoryjnej lub bibułowym krążku filtracyjnym na otwartej szalce Petriego i susz w inkubatorze w temperaturze 55 °C przez 24 godziny
UWAGA: Papier zapobiega przywieraniu krążków liściowych do szalki Petriego podczas suszenia. - Zważyć suche talerze liściowe i zapisać jako suchą masę (DW) w celu obliczenia RWC.
- Obliczać RWC za pomocą wzoru Weatherleya, zgodnie z opisem Smarta i Binghama11,12.
RWC=(FW-DW/TW-DW)*100
FW = świeża masa, TW = jędrna masa, DW = sucha masa - Powtórzyć krok 4.1 dla każdej plazmy zarodkowej i leczenia w badaniu.
- Rejestruj więdnięcie roślin raz dziennie, począwszy od 1 dnia próby stresu związanego z suszą, a kończąc na zwiędnięciu 100% roślin, zwykle w 4 lub 5 dniu.
- Faza rekonwalescencji i różnica wzrostu
- W 6 dniu zakończ okres stresu suszy, a zestresowane rośliny wejdą w fazę regeneracji próby. Napełnij dolne tace wodą i pozwól tacom narażonym na suszę moczyć się przez 24 godziny przed wznowieniem standardowego harmonogramu podlewania, krok 2.1, tak jak tace kontrolne.
- Pozwól wszystkim roślinom zregenerować się przez 10 dni.
- Po 10 dniach od wystąpienia suszy należy zebrać całą nadziemną część każdej rośliny i zarejestrować świeżą masę.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Podczas przeprowadzania szerokiego przesiewu w celu wyodrębnienia populacji o pożądanej cechą eksperymentalnej, w przypadku niniejszego protokołu – odpowiedzią na stres suszy – generowane dane będą odpowiednio zróżnicowane: od bardzo podatnych na stres po prawdopodobnie tolerancyjne na suszę, oraz wszystkie wartości pośrednie. Rysunek 1 zawiera wykresy przedstawiające typ wyników, jakich można oczekiwać po zastosowaniu tego protokołu. W przedstawionych danych uwzględniono reprezentatywne odmiany trzech r...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Rozważania dotyczące numeru próbki dla ekranu.
Liczba potrzebnych próbek powinna być oparta na pożądanym wykorzystaniu danych z tego ekranu. Jeśli pożądane są wyniki o jakości publikacji, zaleca się zebranie 3 pojedynczych roślin (3 kontrprób biologicznych) z każdej linii i przeprowadzenie co najmniej 2 powtórzeń doświadczalnych w celu uzyskania odpowiednich punktów do wysokiej jakości analizy statystycznej. Jeśli pożądanym rezultatem jest po prostu szybkie zawężenie dużej pul...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.
Podziękowania
Autorzy chcieliby podziękować Kalifornijskiemu Departamentowi Żywności i Rolnictwa za finansowanie projektu, który doprowadził do opracowania tego protokołu. CDFA SCB11019.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Tacka na wtyczki 128 | T.O. Plastics Hummert International | 11-8595-1 | Tacka na wtyczki dowolnej marki będzie działać, ale używaj tego samego stylu tacek do wszystkich prób. |
| dolna taca (taca ekspozycyjna) | T.O. Plastics Hummert International | 11-3305-1 | |
| wtyczka / mieszanka do sadzenia (Sunshine Mix #5) | Sunshine Hummert International | 10-0467-1 | W przypadku dostosowania tego protokołu do innej uprawy może być konieczne zastąpienie innej mieszanki. Sunshine mix #4 został użyty w próbach szpinaku. |
| Nawóz (20-20-20) | Jack's: Profesjonalny nawóz rozpuszczalny w wodzie Hummert International | 07-5915-1 | Można stosować dowolny nawóz, dostosuj rodzaj w razie potrzeby, aby dostosować ten protokół do konkretnych potrzeb upraw. |
Bibliografia
- Dijk, A. I. J. M., et al. The Millennium Drought in southeast Australia (2001–2009): Natural and human causes and implications for water resources, ecosystems, economy, and society. Water Resour. Res. 49, (2013).
- Aghakouchak, A., Feldman, D., Stewardson, M. J., Saphores, J., Grant, S., Sanders, B. Australia’s Drought: Lessons for California. Science. 343, 1430(2014).
- Tolomeo, V. California Agricultural Statistics 2012 Crop Year. USDA National Agricultural Statistics Service Pacific Regional Office-California. , http://www.nass.usda.gov/Statistics_by_State/California/Publications/California_Ag_Statistics/Reports/2012cas-all.pdf (2013).
- Cavagnaro, T., et al. Climate Change: Challenges and Solutions for California Agricultural Landscapes. White paper CEC-500-2005-189-SF. California Climate Change Center. , Available from: http://www.energy.ca.gov/2005publications/CEC-500-2005-189/CEC-500-2005-189-SF.PDF (2005).
- Lobell, D. B., Gourdji, S. M. The Influence of Climate Change on Global Crop Productivity. Plant Physiol. 160, 1686-1697 (2012).
- Jackson, L. E., Stivers, L. J. Root distribution of lettuce under commercial production: implications for crop uptake of nitrogen. Biological Agriculture and Horticulture. 9, 273-293 (1993).
- Jackson, L. E. Root architecture in cultivated and wild lettuce (Lactuca spp). Plant. Cell and Environment. 18, 885-897 (1995).
- Malcom, S., Marshall, E., Aillery, M., Heisey, P., Livingston, M., Day-Rubenstein, K. Agricultural Adaptation to a Changing Climate: Economic and Environmental Implications Vary by U.S Region. USDA Economic Research Service. Economic Research Report Number. 136, Available from: http://www.ers.usda.gov/media/848748/err136.pdf (2012).
- Chaves, M. M., Maroco, J. P., Pereira, J. S. Understanding plant responses to drought- from genes to the whole plant. Funct. Plant Biol. 30, 239-264 (2003).
- Ingram, J., Bartels, D. The Molecular Basis of Dehydration Tolerance in Plants. Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 47, 377-403 (1996).
- Weatherley, P. E. Studies in the water relations of the cotton plant. I. The field measurement of water deficits in leaves. New Phlytol. 49, 81-97 (1950).
- Smart, R. E., Bingham, G. E. Rapid Estimates of Relative Water Content. Plant Physiol. 53, 258-260 (1974).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
