Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Ocena inwazji bakteryjnej komórek serca w hodowli i kolonizacji serca u zakażonych myszy przy użyciu Listeria monocytogenes

4.7K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/52497

⸱

27 maja 2015

 , 
1Department of Microbiology and Immunology, College of Medicine, University of Illinois at Chicago

W tym artykule

Podsumowanie

Listeria monocytogenes powoduje infekcje płodu u kobiet w ciąży i zapalenie opon mózgowych w populacjach podatnych. Subpopulacje bakterii mogą kolonizować tkankę serca, powodując zapalenie mięśnia sercowego u pacjentów i zwierząt laboratoryjnych. W tym miejscu przedstawiamy protokół, który opisuje, jak ocenić inwazję komórek serca L. monocytogenes in vitro i kolonizację serca u zakażonych zwierząt.

Streszczenie

Listeria monocytogenes to Gram-dodatni fakultatywny patogen wewnątrzkomórkowy, który jest zdolny do wywoływania poważnych infekcji inwazyjnych u pacjentów z obniżoną odpornością, osób starszych i kobiet w ciąży. Najczęstsze objawy listeriozy u ludzi to zapalenie opon mózgowych, zapalenie mózgu i poronienia płodu. Znaczące, ale znacznie mniej udokumentowane następstwa inwazyjnego zakażenia L. monocytogenes dotyczą serca. Śmiertelność z powodu chorób serca może wynosić do 35% pomimo leczenia, jednak bardzo niewiele wiadomo na temat kolonizacji tkanki serca przez L. monocytogenes i wynikających z niej patologii. Ponadto ostatnio okazało się, że subpopulacje L. monocytogenes mają zwiększoną zdolność do inwazji i wzrostu w tkance serca. Protokół ten szczegółowo opisuje metody in vitro i in vivo, które mogą być stosowane do oceny kardiotropizmu izolatów L. monocytogenes. Przedstawiono metody zakażenia mioblastów serca szczura H9c2 w hodowli tkankowej, a także do oznaczania kolonizacji bakteryjnej serc zakażonych myszy. Metody te są przydatne nie tylko do identyfikacji szczepów o potencjale kolonizacji tkanki serca u zakażonych zwierząt, ale mogą również ułatwić identyfikację produktów genów bakteryjnych, które służą do zwiększenia inwazji komórek serca i / lub napędzania zmian w patologii serca. Metody te umożliwiają również bezpośrednie porównanie kardiotropizmu między wieloma szczepami L. monocytogenes.

Wprowadzenie

Listeria monocytogenes to wewnątrzkomórkowy patogen Gram-dodatni, zdolny do wywoływania ciężkiej choroby w populacjach podatnych, w tym u osób starszych, kobiet w ciąży, osób z HIV/AIDS i osób otrzymujących chemioterapię1. Zakażenie w tych populacjach jest często wynikiem spożycia skażonych produktów spożywczych, a większość zakażeń jest związana z wybuchami epidemii przenoszonych przez żywność na dużą skalę2,3. U ludzi i innych ssaków L. monocytogenes jest zdolny do przemieszczania się przez granicę nabłonkową jelita cienkiego, a następnie jest transportowany do wątroby4,5. Modele zwierzęce sugerują, że spożyte bakterie replikują się w kosmkach jelitowych i przechodzą do wątroby przez żyłę wrotną lub rozprzestrzeniają się przez węzły chłonne krezkowe do krwiobiegu, prowadząc do rozsiewu krwiotwórczego do wątroby i śledziony6,7. W wątrobie i śledzionie bakteria jest zdolna do pośredniczenia w wychwytywaniu zarówno do profesjonalnych fagocytów, jak i rezydentnych komórek miąższowych i szybko tworzy infekcje w tych narządach. Wraz ze wzrostem obciążenia bakteryjnego liczne bakterie są rozpraszane z powrotem do krwi, gdzie są zdolne do dalszej kolonizacji wrażliwych tkanek, w tym ośrodkowego układu nerwowego i łożyska (jeśli są obecne). Kolonizacja tych miejsc wyklucza najczęstsze objawy listeriozy u ludzi, w tym zapalenie opon mózgowych, zapalenie mózgu i poronienia płodu2.

Ostatnio wykazano, że wybrane subpopulacje L. monocytogenes mają zwiększoną zdolność do inwazji i replikacji w tkance serca8. Objawy zajęcia serca są zróżnicowane i wahają się od zapalenia wsierdzia i zapalenia osierdzia do piorunującego zapalenia mięśnia sercowego wraz z nieprawidłowościami przewodzenia9-13. Ogólna liczba przypadków sercowych L. monocytogenes w ciągu roku jest niska, ale może być niedoszacowana, ponieważ ten aspekt infekcji nie jest ogólnie dobrze rozpoznany. Kolonizacja serca przez patogeny często wymaga predyspozycji gospodarza, takich jak istniejące wcześniej uszkodzenia zastawek lub sztuczne zastawki serca. Istnieją jednak zidentyfikowane izolaty L. monocytogenes, które wyróżniają się zdolnością do kolonizacji serc zakażonych zwierząt przy braku jakiegokolwiek uszkodzenia serca i/lub nieprawidłowości8.

Tutaj opisano metody in vitro i in vivo do oceny bakteryjnej kolonizacji tkanki serca u zakażonych zwierząt za pomocą testów inwazyjnych w hodowli tkankowej, jak również infekcji żywych zwierząt. Metody te okazały się przydatne nie tylko w identyfikacji szczepów mogących kolonizować tkankę serca u zakażonych zwierząt, ale powinny być również przydatne w identyfikacji produktów genów bakteryjnych, które służą do zwiększenia inwazji komórek serca i / lub powodują zmiany w patologii serca. Metody te ułatwiają porównanie kardiotropizmu między wieloma szczepami. W opisanych tutaj metodach L. monocytogenes 10403S jest używany jako dobrze przebadany przedstawiciel szczepu niekardiotropowego, a izolat kliniczny 07PF0776 jest używany jako reprezentatywny przykład szczepu kardiotropowego. Te dwa szczepy zostały wybrane w celu porównania inwazji bakteryjnej komórek serca in vitro i kolonizacji serc zakażonych myszy in vivo. Izolat 07PF0776 jest izolatem klinicznym wyleczonym z ropnia międzykomorowego, który spowodował śmiertelną arytmię u pacjenta z HIV+8. Izolaty L. monocytogenes mogą różnić się pod względem potencjału wirulencji, a biorąc pod uwagę skłonność Listerii do zakażania osób z immunosupresją i kobiet w ciąży, osoby w tych populacjach powinny zachować ostrożność podczas oceny różnych izolatów klinicznych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Warunki przechowywania i hodowli szczepów L. monocytogenes

  1. Przygotować pożywkę stałą przez autoklawowanie agaru infuzyjnego mózg-serce (BHI) i wlanie stopionej pożywki na płytki Petriego. Pozostawić płytki do wyschnięcia na noc w temperaturze pokojowej, a następnie ponownie na noc w temperaturze 37 °C.
  2. Używając sterylnej pętli, uzyskać małą próbkę L. monocytogenes z uprzednio przygotowanych wywarów zamrażalniczych (bakterie zawieszone w 20% glicerolu w płynnym podłożu BHI, przechowywanych w temperaturze -80 °C) lub z płytki agarowej zawierającej kolonie uprzednio wybite do izolacji.
  3. Stosując technikę aseptyczną, przetrzyj próbkę w celu wyizolowania pojedynczej kolonii. Pamiętaj, aby wysterylizować pętlę między smugami krzyżowymi, aby zapobiec nadmiernemu przenoszeniu i zapewnić izolację poszczególnych kolonii ocenianego szczepu. Inkubować płytkę (płytki) przez noc w temperaturze 37 °C.
  4. Za pomocą sterylnej pętli usunąć jedną kolonię izolatu i zaszczepić 2 ml bulionu BHI (bez agaru) w probówce polistyrenowej o pojemności 14 ml.
  5. W przypadku testów i zakażeń inkubować kulturę bulionu statycznie (bez wstrząsania) przez noc w inkubatorze o temperaturze 37 °C. W przypadku przechowywania w hodowli izolatów należy inkubować kulturę bulionową w temperaturze 37 °C z wytrząsaniem z prędkością 180–200 obr./min przez noc. Kultury można przechowywać, dodając glicerol do końcowego stężenia 20% i przechowując zamknięte probówki w temperaturze -80 °C przez czas nieokreślony.

2. Warunki przechowywania i hodowli komórek podobnych do mioblastów serca H9c2

  1. Kup lub uzyskaj zamrożony zapas komórek H9c2, a także zmodyfikowaną pożywkę Eagle's Medium (DMEM) firmy Dubelco zawierającą wysoką zawartość glukozy i pirogronianu, płodową surowicę bydlęcą (FBS), L-glutaminę (Glut) oraz mieszaniny penicyliny, streptomycyny i glutaminy (PSG). FBS, Glut i PSG należy przechowywać w temperaturze -20 °C, podczas gdy DMEM można przechowywać w temperaturze 4 °C. Pomocne jest przelanie FBS do stożkowych probówek o pojemności 50 ml przed zamrożeniem.
  2. W okapie z przepływem laminarnym rozmrozić dwie porcje FBS. Dodać jedną porcję do jednej butelki DMEM o pojemności 500 ml, tworząc 10% mieszaninę FBS/DMEM. Do tego dodać 6 ml Glut i umieścić otrzymany roztwór w temperaturze 4 °C. To rozwiązanie może być oznaczone jako "DMEM bez antybiotyków". (DMEM –Ab)
  3. Do drugiej butelki DMEM o pojemności 500 ml dodać drugą 50 ml porcji FBS. Do tego roztworu dodać 6 ml PSG i wywarować w temperaturze 4 °C. To rozwiązanie może być oznaczone jako "DMEM z antybiotykami". (DMEM + Ab)
  4. Znajdując się w kapturze laminarnym, usunąć 10 ml DMEM +Ab i umieścić w kolbie do hodowli tkankowej o pojemności 25 ml.
  5. Pozostawiając kolbę w kapturze laminarnym, wyjąć zamrożoną porcję komórek H9c2 z magazynu w ciekłym azocie i szybko umieścić probówkę w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C, aż kultura się rozmrozi.
  6. Spryskaj rurkę 70% etanolem w celu odkażenia, a następnie wróć do okapu. Pracując szybko, aby zminimalizować czas komórek w skoncentrowanym DMSO, dodaj pełną porcję komórek do 10 ml DMEM +Ab. To rozcieńcza DMSO wystarczająco, aby komórki mogły przetrwać przez noc i przylegać.
  7. Umieścić kolbę w inkubatorze do hodowli tkankowych w temperaturze 37 °C, 5% C02 i wilgotności 95% na noc.
  8. Następnego ranka sprawdź warstwę komórek, aby upewnić się, że przylega. Do tego czasu komórki prawdopodobnie będą zlewać się w 80-100%.
  9. Z okapu do hodowli tkankowej usunąć pożywkę zawartą w kolbie za pomocą próżni, pozostawiając tylko komórki w kolbie.
  10. Dodaj około 2 ml 0,25% trypsyny-EDTA do komórek i delikatnie kołysz przez około 3 sekundy.
  11. Odwrócić kolbę w taki sposób, aby roztwór trypsyny nie stykał się już z monowarstwą i usunąć trypsynę za pomocą próżni
    12. .
  12. Dodać do komórek drugą porcję 2 ml trypsyny i przenieść kolbę do mikroskopu odwróconego. Obserwuj komórki, delikatnie kołysząc kolbą, aby upewnić się, że monowarstwa się rozproszy.
  13. Po rozproszeniu monowarstwy natychmiast wróć do okapu do hodowli tkankowej i dodaj 4 ml DMEM +Ab do zawiesiny komórek.
  14. Pobrać 2 ml porcję zawiesiny komórkowej i dodać ją do 50 ml kolby do hodowli tkankowej zawierającej 23 ml DMEM +Ab. Delikatnie rozkołysać kolbę, a następnie umieścić ją w inkubatorze do hodowli tkankowych w warunkach wymienionych w kroku 2.5.
  15. Sprawdzaj komórki codziennie, aż osiągną około 80% konfluencji (około 2,0-4,0 x 105 komórek na ml). Bardzo ważne jest, aby komórki nie stawały się zbyt zlewne, ponieważ mogą różnicować się w mięśnie mięśni szkieletowych, gdy są pozbawione FBS przez dłuższyczas14, a to różnicowanie może zmienić inwazję bakterii. Uważnie monitoruj komórki i zacznij od nowej probówki komórek, jeśli kultura stanie się zlewająca.
  16. Gdy komórki osiągną 80% konfluencji, można je albo przejść do innej kolby o pojemności 50 ml, jak właśnie opisano, albo przygotować do testu inwazji.

3. Przygotowanie komórek H9c2 do testu inwazyjnego

  1. W kapturze do hodowli tkankowej usuń pożywkę z kolby o pojemności 50 ml komórek H9c2, które osiągnęły 80% konfluencji, za pomocą aspiracji próżniowej.
  2. Dodać 4 ml 0,25% roztworu trypsyny-EDTA do monowarstwy i natychmiast usunąć za pomocą aspiracji próżniowej.
  3. Dodać kolejną porcję 4 ml 0,25% trypsyny-EDTA do kolby i przenieść kolbę do odwróconego mikroskopu, aby obserwować dyspersję monowarstwy.
  4. Gdy komórki się rozprozą, wróć do kaptura i dodaj 4 ml DMEM –Ab do komórek. Pipetowanie roztworu w górę i w dół zapewnia całkowite usunięcie komórek z dna kolby.
  5. Po ponownym zawieszeniu monowarstwy należy usunąć całą zawiesinę i umieścić ją w stożkowej probówce o pojemności 50 ml.
  6. Usuń 20 ul porcję tej zawiesiny i policz liczbę komórek na mililitr za pomocą hemocytometru.
  7. Po ustaleniu stężenia komórek w roztworze dostosować stężenie do 2,25 x 104 komórek/ml, dodając odpowiednią objętość roztworu komórkowego do świeżego DMEM –Ab. Całkowita objętość dostosowanego roztworu powinna wynosić 25 ml.
  8. Będąc w kapturze, sterylizuj szklane szkiełka nakrywkowe, zanurzając je w 90% etanolu i na krótko przepuszczając każde szkiełko nakrywkowe przez płomień. Dodaj każde szkiełko nakrywkowe do indywidualnego dołka na 24-dołkowej płytce poddanej działaniu kultur tkankowych bezpośrednio po jej wysterylizowaniu.
  9. Po tym, jak wszystkie studzienki mają indywidualne szkiełko nakrywkowe, użyj pipety o pojemności 25 ml, aby dodać 1 ml rozcieńczonego roztworu komórkowego do każdego z dołków w płytce i wepchnij każde szkiełko nakrywkowe w dół sterylną igłą.
  10. Sprawdź każdą studzienkę za pomocą odwróconego mikroskopu, aby upewnić się, że w każdej studzience znajduje się podobna ilość komórek. Umieścić 24-dołkową płytkę w inkubatorze do hodowli tkankowych na noc w temperaturze 37 °C przy 5% CO2 i wilgotności 95%.
  11. Następnego ranka należy obejrzeć każdą studzienkę, aby upewnić się, że szkiełka nakrywkowe mają porównywalną ilość przylegających mioblastów i że szkiełka nakrywkowe nie unoszą się w studni.

4. Przygotowanie szczepów L. monocytogenes do testów inwazyjnych

UWAGA: Wszystkie prace laboratoryjne są wykonywane zgodnie z wytycznymi CDC dla bezpieczeństwa biologicznego poziomu 2.

  1. Po przygotowaniu 24-dołkowej płytki do oznaczenia, należy użyć wysterylizowanej pętli do usunięcia pojedynczych kolonii szczepów, które mają być badane pod kątem inwazji bakteryjnej i zaszczepić każdą z nich w oddzielnych 14 ml probówkach zawierających 2 ml bulionu BHI.
  2. Umieścić zaszczepione probówki w inkubatorze o temperaturze 37 °C nachylonym pod kątem 45° i inkubować statycznie (bez wstrząsania) przez noc.
  3. Następnego ranka wyjmij probówkę hodowlaną z inkubatora i krótko przeprowadź wirowanie, aby zapewnić równomierne zawieszenie bakterii.
  4. Zmierzyć gęstość optyczną kultury za pomocą spektrofotometru o długości fali 600 nm. Pamiętaj, aby wyzerować spektrofotometr za pomocą sterylnego bulionu BHI przed odczytaniem gęstości optycznej.
  5. W przypadku L. monocytogenes gęstość optyczna jest bezpośrednio związana ze stężeniem bakterii na ml, tak że gęstość 1,000 = 1,0 x 10,9 jtk/ml.
  6. Oblicz ilość kultury potrzebną do zakażenia 2,25 x 104 komórek o wymiarach 2,25 x 106 (MOI = 100).
  7. Usuń potrzebną ilość kultury i umieść ją w probówce wirówkowej o pojemności 1,5 ml.
  8. Obracać kulturę w temperaturze 19 000 x g przez 3 minuty, a następnie wyrzucić supernatant. Postukaj otwartym końcem rurki o ręcznik papierowy, aby usunąć nadmiar nośnika przyklejonego do krawędzi tuby.
  9. Zawiesić bakterie w 1 ml sterylnego PBS i przemieszać, aby zapewnić wystarczające wymieszanie. Ta mieszanina powinna zawierać około 2,25 x 106 CFU na 20 ul (1,125 x 108 CFU/ml).

5. Przeprowadzanie testu inwazji

  1. Dzień przed testem inwazji należy przygotować 24-dołkowe płytki z komórkami H9c2, jak opisano w sekcji 3, a także zaszczepić sterylny bulion BHI pożądanym szczepem (szczepami) Listeria, jak opisano w sekcji 4.
  2. Korzystając z protokołu w sekcji 4, należy przygotować zawieszone w PBS kultury szczepów, które mają być ocenione pod kątem inwazji. Uwaga: Miano zakaźne można ocenić w tym momencie, rozcieńczając każdą próbkę na pożywkach stałych i licząc kolonie po całonocnej inkubacji.
  3. Załaduj co najmniej 20 ul roztworu bakterii PBS do poszczególnych dołków 24-dołkowej płytki. Należy pamiętać, że dla każdego szczepu potrzebne są co najmniej trzy indywidualne dołki, aby uzyskać wyniki w trzech powtórzeniach, więc można ocenić do 8 szczepów jednocześnie.
  4. Po załadowaniu studzienek bakteriami delikatnie kołysz płytką, aby zapewnić jednorodne rozprowadzanie każdej próbki w studzince, a następnie umieść 24-dołkową płytkę z powrotem w inkubatorze na 45 minut inkubacji w temperaturze 37 °C i wilgotności 95%, przy 5% CO2 .
  5. Podczas tej inkubacji należy przygotować porcję DMEM – Ab (sekcja 2), po prostu usuwając 25 ml DMEM –Ab i umieszczając ją w 50 ml probówce sokoła (lub równoważnej).
  6. Dodać gentamycynę do 25 ml DMEM –Ab podwielokrotność o stężeniu 15 ug/ml (7,5 ul z 50 mg/ml roztworu podstawowego). Umieścić roztwór DMEM –Ab + Gent w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C na czas 45 minut inkubacji.
  7. Porcję 25 ml PBS przelać do probówki sokoła o pojemności 50 ml i umieścić w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C podczas 45-minutowej inkubacji.
  8. Po zakończeniu 45-minutowej inkubacji wyjąć płytkę 24-dołkową i umieścić ją w kapturze. Usuń pożywkę zawierającą bakterie z każdej studzienki przez aspirację próżniową, zmieniając szklane końcówki pipet między różnymi szczepami.
  9. Dodać około 1 ml PBS do każdej studzienki w celu zmycia luźno przylegających bakterii z powierzchni komórek, a następnie usunąć PBS za pomocą aspiracji próżniowej.
  10. Po całkowitym usunięciu PBS dodać 1 ml DMEM –Ab + Gent do każdej studzienki. Gentamycyna zabije tylko te bakterie, które pozostają poza komórkami, więc te, które są wewnątrzkomórkowe, pozostaną żywotne.
  11. Umieścić 24-dołkową płytkę z powrotem w inkubatorze i pozostawić do inkubacji na dodatkową godzinę.
  12. Podczas godzinnej inkubacji przygotować 14 ml probówek polipropylenowych, dodając 1 ml sterylnego ddH20 do każdej probówki. Na każde szkiełko nakrywkowe potrzebna będzie jedna tubka, więc na jedną płytkę 24-dołkową przygotuj łącznie 24 probówki.
  13. Po godzinnej inkubacji wyjąć 24-dołkową płytkę z inkubatora i umieścić ją w kapturze wraz z probówkami przygotowanymi w kroku 5.12.
  14. Za pomocą sterylnej pęsety wyjmij każde szkiełko nakrywkowe z odpowiedniego dołka i natychmiast umieść je w osobnej tubce. Pamiętaj, aby zanurzyć pęsetę w etanolu i podpalić ją między każdym szkiełkiem nakrywkowym, aby zapobiec zanieczyszczeniu.
  15. Po usunięciu wszystkich szkiełek nakrywkowych i umieszczeniu ich w pojedynczych probówkach, należy wyrzucić płytkę 24-dołkową.
  16. Wróć na ławkę i wiruj każdą rurkę przez 5-10 sekund.
  17. Wyjąć porcję z każdej probówki i umieścić każdą próbkę w osobnym dołku na 96-dołkowej płytce, a następnie seryjnie rozcieńczyć każdą próbkę, używając rozcieńczeń 1:10 do rozcieńczenia 1:1,000.
  18. Używając wstępnie podgrzanych i suchych płytek LB, nałóż punktowo każdą z serii rozcieńczeń na płytki agarowe. Pipeta wielokanałowa może być używana do powlekania 5-10 μl plamek z każdej serii rozcieńczeń próbki.
  19. Usunąć również 20 μl próbek z każdej nierozcieńczonej studzienki i umieścić tę ilość bezpośrednio na agarze LB na oddzielnej płytce z serii rozcieńczeń. (Ta większa objętość może być wykorzystana do wyliczenia słabo inwazyjnych szczepów).
  20. Po pokryciu wszystkich próbek powłoką punktową należy wyrzucić probówki o pojemności 14 ml zawierające szkiełka nakrywkowe. Sfoliować 96-dołkową płytkę i umieścić ją w zamrażarce w temperaturze -80 °C w celu ponownego powlekania, jeśli to konieczne.
  21. Pozostaw plamy do całkowitego wyschnięcia. Proces ten jest znacznie przyspieszony poprzez umieszczenie talerzy w okapie i zdjęcie pokrywek.
  22. Po wyschnięciu plam umieścić płytki na noc w inkubatorze o temperaturze 37 °C.
  23. Następnego ranka policz liczbę kolonii w każdym miejscu serii rozcieńczeń, dla których można łatwo ocenić liczbę kolonii (od około 5 do 50 kolonii) (ryc. 1) i użyj serii do obliczenia liczby bakterii na szkiełko nakrywkowe dla każdego ocenianego szczepu.

6. Przygotowanie szczepów L. monocytogenes do infekcji myszy

  1. W noc poprzedzającą zakażenie użyj wysterylizowanej pętli, aby usunąć pojedyncze kolonie pożądanych szczepów i zaszczepić każdą z nich w pojedynczych 14 ml probówkach zawierających 2 ml bulionu BHI.
  2. Umieścić zaszczepione probówki w inkubatorze o temperaturze 37 °C nachylonym pod kątem 45° i inkubować statycznie (bez wstrząsania) przez noc.
  3. Następnego ranka wyjmij probówkę hodowlaną z inkubatora i krótko przeprowadź wirowanie, aby zapewnić równomierne zawieszenie bakterii.
  4. Zmierzyć gęstość optyczną kultury za pomocą spektrofotometru o długości fali 600 nm. Pamiętaj, aby wyzerować spektrofotometr za pomocą sterylnego bulionu BHI przed odczytaniem gęstości optycznej. (W przypadku L. monocytogenes gęstość optyczna jest bezpośrednio związana ze stężeniem bakterii na ml, tak że gęstość 1,000 = 1,0 x 10,9 jtk/ml)
  5. Oblicz ilość kultury potrzebną do zarażenia każdego zwierzęcia. Zastrzyki zazwyczaj zawierają 200 μl PBS z 10 000 CFU pojedynczego szczepu, co przekłada się na pożądane stężenie 5,00 x 104 CFU/ml.
  6. Usunąć 5 μl podwielokrotności z każdego końcowego rozcieńczenia i rozprowadzić ją bezpośrednio na agarze LB. Inkubować przez noc w temperaturze 37 °C w celu potwierdzenia stężenia użytego do inokulacji.
  7. Wstrzyknąć każdą zawiesinę CFU w ciągu 1 godziny od rozcieńczenia (patrz poniżej).

7. Inokulacja L. monocytogenes u myszy poprzez iniekcję do żyły ogonowej i ocena obciążenia bakteryjnego w wątrobie, śledzionie i sercu

Uwaga: Wszystkie prace na zwierzętach są wykonywane zgodnie z wytycznymi CDC dotyczącymi poziomu bezpieczeństwa biologicznego 2. Myszy są zazwyczaj zamawiane z tygodniowym wyprzedzeniem i umieszczane w klatkach razem z 5 zwierzętami w klatce. Myszy mogą zaaklimatyzować się w nowym środowisku laboratoryjnym przez cztery dni przed wstrzyknięciem. W eksperymentach tych wykorzystano 6-8 tygodniowe samice myszy szwajcarsko-Webster, które trzymano po 5 sztuk w klatce w środowisku barierowym i karmiono dietą bez ograniczeń.

  1. Przygotuj jedną klatkę myszy na raz, zdejmując pokrywę i pojemniki na żywność/wodę, a następnie umieszczając klatkę pod lampą grzewczą na pięć minut. Proces ten pozwala na rozszerzenie żył ogonowych, co ułatwia wykonywanie iniekcji.
  2. Należy usunąć jedno zwierzę i umieścić je w uprzęży (lub rurce sokoła z odciętym końcem) w celu przytrzymania zwierzęcia podczas wstrzyknięcia.
  3. Oczyścić miejsce wstrzyknięcia wacikiem nasączonym alkoholem i pozostawić alkohol do odparowania. To nie tylko oczyszcza miejsce, ale także dodatkowo rozszerza żyłę ogonową.
  4. Za pomocą strzykawki o pojemności 1 ml wyposażonej w igłę o rozmiarze 27,5 delikatnie wstrzyknij myszy 200 μl pożądanej kultury do żyły ogonowej.
  5. Użyć gazy, aby zatamować krwawienie, które może wystąpić w wyniku wstrzyknięcia, i umieścić zwierzę w nowej klatce.
  6. Powtórz ten proces dla pozostałych zwierząt i szczepów. Pamiętaj, aby oznaczyć każdą klatkę zwierząt szczepem, który otrzymały.
  7. Sprawdzaj zwierzęta codziennie, usuwając i składając w ofierze wszystkie zwierzęta, które wydają się być chore. Jeśli żadne zwierzę nie wykazuje objawów choroby, pozwól infekcji postępować przez 72 godziny przed złożeniem wszystkich zwierząt w ofierze.
  8. Aby złożyć ofiarę, użyj znieczulenia CO2 ze źródła w butelce, aż wszystkie oddechy ustaną do zatrzymania, a następnie użyj zwichnięcia szyjki macicy, aby upewnić się, że zwierzę jest martwe.
  9. Po złożeniu w ofierze przenieś zwierzęta do kaptura do hodowli tkankowej w celu sekcji.
  10. Za pomocą klocka preparacyjnego przypnij każdą nogę zwierzęcia igłami o dużej średnicy i spryskaj zwierzę 70% etanolem, aż będzie nasycone.
  11. Przetnij skórę brzucha i klatki piersiowej do tyłu za pomocą nacięcia w kształcie litery Y, które rozciąga się od otworu pochwy do wyrostka mieczykowatego, a następnie postępuje w górę do pachy każdego ramienia.
  12. Odciągnij skórę i usuń igły z każdej nogi, aby utrzymać rozwarstwienie otwarte.
  13. Delikatnie przeciąć otrzewną, odsłaniając jelita, żołądek, wątrobę i śledzionę.
  14. Najpierw przecinając żyłę wątrobową i więzadło koronalne w górnej części wątroby, zacznij usuwać wątrobę. Dodatkowe więzadła do usunięcia znajdują się pod wątrobą, łącząc ją z pierwszym odcinkiem jelita cienkiego, a także z mięśniami pleców.
  15. Umieścić wątrobę w 5 ml sterylnego ddH20 w 50 ml probówce sokoła.
  16. Następnie usuń śledzionę, izolując ją i delikatnie odcinając naczynia krwionośne i więzadła. Śledziona zostanie usunięta łatwiej niż wątroba. Umieścić śledzionę w oddzielnej probówce sokoła zawierającej 5 ml sterylnego ddH20.
  17. Zlokalizuj przeponę i delikatnie przetnij wzdłuż klatki piersiowej, aby uwidocznić klatkę piersiową. Przeciąć wyrostek mieczykowaty i mostek do poziomu szyi, aby otworzyć klatkę piersiową, odsłaniając serce i płuca.
  18. Za pomocą kleszczy chwyć delikatnie serce za jego wierzchołek i unieś je tak, aby aorta i naczynia płucne były napięte. Przetnij te naczynia, aby uwolnić serce.
  19. Umieścić serce w 50 ml probówce sokoła zawierającej 5 ml sterylnego ddH20.
  20. Odrzucić tuszę myszy i powtórzyć ten proces dla każdego zwierzęcia, używając czystych probówek sokoła zawierających 5 ml sterylnego ddH20 na każdy usunięty narząd.
  21. Po usunięciu wszystkich narządów wyczyść stanowisko pracy i wróć na ławkę.
  22. Przygotuj zestaw 5 probówek do użycia do czyszczenia i sterylizacji homogenizatora dla każdego zestawu narządów od pięciu myszy (tj. jeden zestaw 5 probówek na 5 wątrób, 5 probówek na 5 śledzion i 5 probówek na 5 serc). Cztery z każdej probówki należy napełnić 30 ml sterylnego ddH20, a jedną należy napełnić 30 ml 90% EtOH.
  23. Za pomocą homogenizatora TissueMaster (lub równoważnego) zanurz homogenizator (podczas pracy) w probówkach przygotowanych w kroku 7.21 w następujący sposób, aby wyczyścić sondę:
  24. Rurka 1 (ddH2O)
    5 s w rurze 2 (ddH2O)
    5 sekund w probówce 3 (EtOH)
    5 sekund w rurze 4 (ddH2O)
    5 sekund w rurze 5 (ddH2O)
  25. Homogenizować jedną wątrobę za pomocą homogenizatora przez co najmniej 2 minuty lub do momentu, gdy nie pozostaną żadne widoczne części narządu. Użyj pęsety, aby usunąć wszelkie duże zanieczyszczenia z sondy.
  26. Powtórz proces czyszczenia opisany w kroku 7.22
  27. Powtórz proces homogenizacji dla pozostałych wątrób, upewniając się, że sonda została umyta między każdą wątrobą zgodnie z procesem opisanym w kroku 7.22.
  28. Po całkowitej homogenizacji wszystkich wątróbek wyrzuć rurki do płukania (1-5) dla wątroby.
  29. Powtórz proces homogenizacji/czyszczenia zarówno dla śledziony, jak i serca, upewniając się, że używasz nowego zestawu rurek do płukania dla każdej serii narządów. Jeśli w dowolnym momencie rurki myjące staną się mętne, wyrzuć je i zastąp nowymi rurkami, aby zakończyć serię.
  30. Po homogenizacji wszystkich narządów wykonaj ostatni cykl czyszczenia homogenizatora i dobrze go wysusz do przechowywania.
  31. Umieść około 200 μl każdego narządu w osobnym dołku na 96-dołkowej płytce.
  32. Wykonać seryjne rozcieńczenia próbek narządów, rozcieńczając 1:10 w serii do rozcieńczenia 1:10 000 (wątroba i śledziona) lub do rozcieńczenia 1:1 000 (serce).
  33. Punktową płytkę serii rozcieńczeń na wstępnie podgrzanym agarze LB. Usuń również 20 ul z każdego nierozcieńczonego narządu i płytki na osobne płytki agarowe LB w celu wyliczenia CFU ze słabo skolonizowanych narządów.
  34. Odrzucić probówki sokoła zawierające homogenizowane organy i owinąć 96-dołkowe płytki zawierające serię rozcieńczeń parafilmem i umieścić je w zamrażarce w temperaturze -80 °C.
  35. Pozostaw plamy do wyschnięcia. Proces ten przyspiesza się poprzez umieszczenie talerzy w okapie i zdjęcie pokrywek.
  36. Po wyschnięciu plam umieścić płytki na noc w inkubatorze o temperaturze 37 °C.
  37. Policz liczbę kolonii w każdym miejscu następnego ranka i użyj serii rozcieńczeń, aby obliczyć całkowitą liczbę bakterii w narządzie.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Wybrane izolaty L. monocytogenes wykazują zwiększoną inwazyjność do komórek serca w hodowlach komórkowych oraz w mysich modelach infekcji. Rycina 1 przedstawia przykład wyglądu kolonii bakteryjnych po metodzie spot platingu zawiesin na pożywkach agarowych. Metoda ta pozwala na dokładną ocenę CFU w próbce bez konieczności wykorzystywania dużej liczby szalek z agarem. Rycina 2 przedstawia przykład testu opartego na hodowli tkankowej, porównującego zdolność szczepu 10403S do inwazj...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

L. monocytogenes jest szeroko rozpowszechnionym i dobrze scharakteryzowanym ludzkim patogenem, zdolnym do wywoływania wielu różnych objawów chorobowych15. Bakteria została wcześniej opisana ze względu na jej zdolność do przemieszczania się przez bariery, takie jak bariera krew-mózg i bariera łożyskowo-płodowa, w celu dotarcia i skolonizowania ośrodkowego układu nerwowego i rozwijającego się płodu. Zdolność organizmu do kolonizacji tych tkanek in vivo jest często uzupełniana zdolnością in ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie informują o żadnych sprzecznych interesach finansowych.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez granty Publicznej Służby Zdrowia AI41816 i AI099339 (N.E.F.) oraz przez F31AI094886-01 (P.D.M.) od NIAID. Wyłączną odpowiedzialność za ich treść ponoszą autorzy i nie muszą one odzwierciedlać oficjalnych poglądów źródeł finansowania.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
DifcoBHI Bulion Base2372002 kg proszku do naparu z Brain Heart (bez agaru)
DifcoAgar2145102 kg agaru granulowanego
DifcoBHI Agar2418102 kg Brain Heart Infusion Powder z 7,5% Agarem
in vitrogenLB Bulion Base12975-0842 kg Luria Bulion Base Powder (bez agaru)
FisherGlass Szkiełka nakrywkowe12-545-80Szkiełka nakrywkowe szklane 12 mm
Falcon24-dołkowa płytka do hodowli tkankowej35-304724-dołkowa, płytka do hodowli tkankowej poddawana działaniu osocza
Falcon14 ml Probówka polistyrenowa35205114 ml Probówki polistyrenowe
Falcon96-dołkowa płytka dolna35-3077Płytka 96-dołkowa poddana hodowli nietkankowej
Corning0,05% trypsyna, 0,53 mM EDTA (1X)25-052-CIPodstawowy roztwór trypsyny EDTA do hodowli tkankowej
CorningDMEM (wysoka glukoza, wysoka pirogronian)15-013-CUPożywka DMEM bez FBS, glutaminy i antybiotyków
Corning Pen/Strep/Glut Solution30-009-CIPodstawowa mieszanina penicyliny, streptomycyny i L-glutaminy do hodowli tkankowej
CorningGentamycyna30-005-CR50 mg/ml Roztwór podstawowy gentamycyny do hodowli tkankowej
Cellgro (Corning)L-Glutamina25005197Zapas Roztwór L-glutaminy bez antybiotyków
Kolba Denville75cm^2T122575 cm2 Kolba poddana kulturze tkankowej
Denville1,5 ml probówki do mikrowirówek20130041,5 ml probówki do mikrowirówek
ATCCH9c2 Cardiac MioblastyCRL-1446Mioblasty serca szczura
HyklonPłodowa surowica bydlęcaSH30070.63Płodowa surowica bydlęca
Falcon Kolba

Bibliografia

  1. Freitag, N. E. From hot dogs to host cells: how the bacterial pathogen Listeria monocytogenes regulates virulence gene expression. Future Microbiol. 1, 89-101 (2006).
  2. Drevets, D. A., Bronze, M. S. Listeria monocytogenes: epidemiology, human disease, and mechanisms of brain invasion. FEMS Immunol Med Microbiol. 53, 151-165 (2008).
  3. Farber, J. M., Peterkin, P. I. Listeria monocytogenes. a food-borne pathogen. Microbiol. Rev. 55, 476-511 (1991).
  4. Lecuit, M. Understanding how Listeria monocytogenes targets and crosses host barriers. Clin Microbiol Infect. 11, 430-436 (2005).
  5. Lecuit, M. Human listeriosis and animal models. Microbes Infect. 9, 1216-1225 (2007).
  6. Bou Ghanem, E. N., et al. InlA promotes dissemination of Listeria monocytogenes to the mesenteric lymph nodes during food borne infection of mice. PLoS Pathog. 8, e1003015(2012).
  7. Melton-Witt, J. A., Rafelski, S. M., Portnoy, D. A., Bakardjiev, A. I. Oral infection with signature-tagged Listeria monocytogenes reveals organ-specific growth and dissemination routes in guinea pigs. Infect Immun. 80, 720-732 (2012).
  8. Alonzo, F. 3rd, Bobo, L. D., Skiest, D. J., Freitag, N. E. Evidence for subpopulations of Listeria monocytogenes with enhanced invasion of cardiac cells. J Med Microbiol. , (2011).
  9. Adler, A., et al. Inflammatory pseudotumor of the heart caused by Listeria monocytogenes infection. J Infect. 58, 161-163 (2009).
  10. Antolin, J., Gutierrez, A., Segoviano, R., Lopez, R., Ciguenza, R. Endocarditis due to Listeria: description of two cases and review of the literature. Eur J Intern Med. 19, 295-296 (2008).
  11. Brouqui, P., Raoult, D. Endocarditis due to rare and fastidious bacteria. Clin Microbiol Rev. 14, 177-207 (2001).
  12. Brusch, J. L. Cardiac infections in the immunosuppressed patient. Infect Dis Clin North Am. 15, 613-638 (2001).
  13. McCue, M. J., Moore, E. E. Myocarditis with microabscess formation caused by Listeria monocytogenes associated with myocardial infarct. Hum Pathol. 10, 469-472 (1979).
  14. Menard, C., et al. Modulation of L-type calcium channel expression during retinoic acid-induced differentiation of H9C2 cardiac cells. J Biol Chem. 274, 29063-29070 (1999).
  15. Czuprynski, C. J. Listeria monocytogenes: silage, sandwiches and science. Anim Health Res Rev. 6, 211-217 (2005).
  16. Grundler, T., et al. The surface proteins InlA and InlB are interdependently required for polar basolateral invasion by Listeria monocytogenes in a human model of the blood-cerebrospinal fluid barrier. Microbes Infect. 15, 291-301 (2013).
  17. Zeldovich, V. B., Robbins, J. R., Kapidzic, M., Lauer, P., Bakardjiev, A. I. Invasive extravillous trophoblasts restrict intracellular growth and spread of Listeria monocytogenes. PLoS Pathog. 7, e1002005(2011).
  18. Kimes, B. W., Brandt, B. L. Properties of a clonal muscle cell line from rat heart. Experimental cell research. 98, 367-381 (1976).
  19. McMullen, P. D., et al. Genome sequence of Listeria monocytogenes 07PF0776, a cardiotropic serovar 4b strain. J Bacteriol. 194, 3552(2012).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Hodowla tkankowamodel mysitest ochrony gentamycynąmetoda posiewu punktowegowstrzykiwanie do żyły ogonowejhomogenizacja organów
Ocena inwazji bakteryjnej komórek serca w hodowli i kolonizacji serca u zakażonych myszy przy użyciu Listeria monocytogenes
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.