Ocena inwazji bakteryjnej komórek serca w hodowli i kolonizacji serca u zakażonych myszy przy użyciu Listeria monocytogenes

Podsumowanie

Listeria monocytogenes powoduje infekcje płodu u kobiet w ciąży i zapalenie opon mózgowych w populacjach podatnych. Subpopulacje bakterii mogą kolonizować tkankę serca, powodując zapalenie mięśnia sercowego u pacjentów i zwierząt laboratoryjnych. W tym miejscu przedstawiamy protokół, który opisuje, jak ocenić inwazję komórek serca L. monocytogenes in vitro i kolonizację serca u zakażonych zwierząt.

Streszczenie

Listeria monocytogenes to Gram-dodatni fakultatywny patogen wewnątrzkomórkowy, który jest zdolny do wywoływania poważnych infekcji inwazyjnych u pacjentów z obniżoną odpornością, osób starszych i kobiet w ciąży. Najczęstsze objawy listeriozy u ludzi to zapalenie opon mózgowych, zapalenie mózgu i poronienia płodu. Znaczące, ale znacznie mniej udokumentowane następstwa inwazyjnego zakażenia L. monocytogenes dotyczą serca. Śmiertelność z powodu chorób serca może wynosić do 35% pomimo leczenia, jednak bardzo niewiele wiadomo na temat kolonizacji tkanki serca przez L. monocytogenes i wynikających z niej patologii. Ponadto ostatnio okazało się, że subpopulacje L. monocytogenes mają zwiększoną zdolność do inwazji i wzrostu w tkance serca. Protokół ten szczegółowo opisuje metody in vitro i in vivo, które mogą być stosowane do oceny kardiotropizmu izolatów L. monocytogenes. Przedstawiono metody zakażenia mioblastów serca szczura H9c2 w hodowli tkankowej, a także do oznaczania kolonizacji bakteryjnej serc zakażonych myszy. Metody te są przydatne nie tylko do identyfikacji szczepów o potencjale kolonizacji tkanki serca u zakażonych zwierząt, ale mogą również ułatwić identyfikację produktów genów bakteryjnych, które służą do zwiększenia inwazji komórek serca i / lub napędzania zmian w patologii serca. Metody te umożliwiają również bezpośrednie porównanie kardiotropizmu między wieloma szczepami L. monocytogenes.

Wprowadzenie

Listeria monocytogenes to wewnątrzkomórkowy patogen Gram-dodatni, zdolny do wywoływania ciężkiej choroby w populacjach podatnych, w tym u osób starszych, kobiet w ciąży, osób z HIV/AIDS i osób otrzymujących chemioterapię¹. Zakażenie w tych populacjach jest często wynikiem spożycia skażonych produktów spożywczych, a większość zakażeń jest związana z wybuchami epidemii przenoszonych przez żywność na dużą skalę^2,3. U ludzi i innych ssaków L. monocytogenes jest zdolny do przemieszczania się przez granicę nabłonkową jelita cienkiego, a następnie jest transportowany do wątroby^4,5. Modele zwierzęce sugerują, że spożyte bakte....

Protokół

1. Warunki przechowywania i hodowli szczepów L. monocytogenes

1. Przygotować pożywkę stałą przez autoklawowanie agaru infuzyjnego mózg-serce (BHI) i wlanie stopionej pożywki na płytki Petriego. Pozostawić płytki do wyschnięcia na noc w temperaturze pokojowej, a następnie ponownie na noc w temperaturze 37 °C.
2. Używając sterylnej pętli, uzyskać małą próbkę L. monocytogenes z uprzednio przygotowanych wywarów zamrażalniczych (bakterie zawieszone w 20% glicerolu w płynnym podłożu BHI, przechowywanych w temperaturze -80 °C) lub z płytki agarowej zawierającej kolonie uprzednio wybite do izolacji.
3. Stosując technikę aseptyczną, pr....

Wyniki

Wybrane izolaty L. monocytogenes wykazują zwiększoną inwazyjność do komórek serca w hodowlach komórkowych oraz w mysich modelach infekcji. Rycina 1 przedstawia przykład wyglądu kolonii bakteryjnych po metodzie spot platingu zawiesin na pożywkach agarowych. Metoda ta pozwala na dokładną ocenę CFU w próbce bez konieczności wykorzystywania dużej liczby szalek z agarem. Rycina 2 przedstawia przykład testu opartego na hodowli tkankowej, porównującego zdolność szczepu 10403S do inwazj.......

Dyskusja

L. monocytogenes jest szeroko rozpowszechnionym i dobrze scharakteryzowanym ludzkim patogenem, zdolnym do wywoływania wielu różnych objawów chorobowych¹⁵. Bakteria została wcześniej opisana ze względu na jej zdolność do przemieszczania się przez bariery, takie jak bariera krew-mózg i bariera łożyskowo-płodowa, w celu dotarcia i skolonizowania ośrodkowego układu nerwowego i rozwijającego się płodu. Zdolność organizmu do kolonizacji tych tkanek in vivo jest często uzupełniana zdolnością in .......

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Difco	BHI Bulion Base	237200	2 kg proszku do naparu z Brain Heart (bez agaru)
Difco	Agar	214510	2 kg agaru granulowanego
Difco	BHI Agar	241810	2 kg Brain Heart Infusion Powder z 7,5% Agarem
in vitrogen	LB Bulion Base	12975-084	2 kg Luria Bulion Base Powder (bez agaru)
Fisher	Glass Szkiełka nakrywkowe	12-545-80	Szkiełka nakrywkowe szklane 12 mm
Falcon	24-dołkowa płytka do hodowli tkankowej	35-3047	24-dołkowa, płytka do hodowli tkankowej poddawana działaniu osocza
Falcon	14 ml Probówka polistyrenowa	352051	14 ml Probówki polistyrenowe
Falcon	96-dołkowa płytka dolna	35-3077	Płytka 96-dołkowa poddana hodowli nietkankowej
Corning	0,05% trypsyna, 0,53 mM EDTA (1X)	25-052-CI	Podstawowy roztwór trypsyny EDTA do hodowli tkankowej
Corning	DMEM (wysoka glukoza, wysoka pirogronian)	15-013-CU	Pożywka DMEM bez FBS, glutaminy i antybiotyków
	Corning Pen/Strep/Glut Solution	30-009-CI	Podstawowa mieszanina penicyliny, streptomycyny i L-glutaminy do hodowli tkankowej
Corning	Gentamycyna	30-005-CR	50 mg/ml Roztwór podstawowy gentamycyny do hodowli tkankowej
Cellgro (Corning)	L-Glutamina	25005197	Zapas Roztwór L-glutaminy bez antybiotyków
Kolba Denville	75cm^2	T1225	75 cm2 Kolba poddana kulturze tkankowej
Denville	1,5 ml probówki do mikrowirówek	2013004	1,5 ml probówki do mikrowirówek
ATCC	H9c2 Cardiac Mioblasty	CRL-1446	Mioblasty serca szczura
Hyklon	Płodowa surowica bydlęca	SH30070.63	Płodowa surowica bydlęca

Falcon Kolba