Artykuł metodologiczny

Podejścia spektrometrii mas do badania struktury i interakcji białek w liofilizowanych proszkach

19K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/52503

⸱

14 kwietnia 2015

 ,  , 
1Department of Industrial and Physical Pharmacy, Purdue University

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj prezentujemy szczegółowe protokoły dla spektrometrii mas z wymianą amidu i deuteru w stanie stałym (ssHDX-MS) oraz spektrometrii mas znakowania fotolitycznego w stanie stałym (ssPL-MS) dla białek w stałych proszkach. Metody te dostarczają informacji o wysokiej rozdzielczości na temat konformacji i oddziaływań białek w amorficznym stanie stałym, które mogą być przydatne w projektowaniu preparatów.

Streszczenie

Amidowa wymiana wodoru/deuteru (ssHDX-MS) i znakowanie fotolityczne w łańcuchu bocznym (ssPL-MS), a następnie analiza spektrometryczna mas, mogą być cenne dla scharakteryzowania liofilizowanych preparatów leków białkowych. Znakowanie, a następnie odpowiednie trawienie proteolityczne pozwala na mapowanie struktury białka i interakcji z rozdzielczością na poziomie peptydów. Ponieważ elementy strukturalne białka są stabilizowane przez sieć wiązań chemicznych z łańcuchów głównych i bocznych aminokwasów, specyficzne znakowanie atomów w resztach aminokwasowych zapewnia wgląd w strukturę i konformację białka. W przeciwieństwie do rutynowych metod stosowanych do badania białek w liofilizowanych ciałach stałych (np. FTIR), ssHDX-MS i ssPL-MS dostarczają informacji ilościowych i specyficznych dla danego miejsca. Stopień inkorporacji deuteru i parametry kinetyczne mogą być związane z szybką i wolno wymianą pul amidowych (Nszybko, Nwolno) i bezpośrednio odzwierciedlają stopień fałdowania i struktury białek w preparatach liofilizowanych. Stabilne znakowanie fotolityczne nie ulega wymianie zwrotnej, co stanowi przewagę nad ssHDX-MS. W tym miejscu przedstawiamy szczegółowe protokoły zarówno dla ssHDX-MS, jak i ssPL-MS, wykorzystując mioglobinę (Mb) jako białko modelowe w liofilizowanych preparatach zawierających trehalozę lub sorbitol.

Wprowadzenie

Leki białkowe stanowią najszybciej rozwijający się sektor przemysłu biofarmaceutycznego i oferują obiecujące nowe metody leczenia chorób wcześniej uznawanych za nieuleczalne, w tym zaburzeń hormonalnych, nowotworów i chorób autoimmunologicznych1. W 2012 roku globalny rynek bioterapeutyków osiągnął wartość 138 miliardów dolarów i przewiduje się, że do 2018 roku wzrośnie on do 179 miliardów dolarów2. Białka są większe i bardziej nietrwałe niż konwencjonalne leki małocząsteczkowe, przez co są bardziej podatne na wiele rodzajów degradacji3. Aby zapewnić odpowiedni okres trwałości i stabilność, leki białkowe są często formulowane jako liofilizowane (t.j. suszone mrozem) proszki stałe. Niemniej jednak białko może nadal ulegać degradacji w stanie stałym, szczególnie jeśli jego struktura natywna nie zostanie zachowana podczas procesu liofilizacji4,5. Potwierdzenie zachowania tej struktury jest możliwe tylko wtedy, gdy dostępne są metody analityczne pozwalające badać konformację białka w stanie stałym z odpowiednią rozdzielczością.

Spektroskopia NMR6 oraz krystalografia rentgenowska7 są powszechnie stosowanymi metodami o wysokiej rozdzielczości służącymi do oceny struktury białek w roztworach i ciałach stałych w formie krystalicznej8. Ze względu na charakter substancji pomocniczych oraz stosowane metody przetwarzania, liofilizowane formulacje białek są zazwyczaj amorficzne, a nie krystaliczne9. Brak homogeniczności i porządku mikroskopowego sprawia, że wspomniane techniki są niepraktyczne w przypadku białek w ciałach stałych amorficznych. Spektroskopia w podczerwieni z transformacją Fouriera (FTIR)10, spektroskopia Ramanowska11 oraz spektroskopia w bliskiej podczerwieni (NIR)12 są regularnie wykorzystywane przez przemysł biofarmaceutyczny do porównywania struktury drugorzędowej białek w proszkach liofilizowanych z ich natywną strukturą w stanie roztworu. Jednakże metody te mają niską rozdzielczość i mogą dostarczać informacji jedynie o globalnych zmianach w strukturze drugorzędowej. Charakterystyka strukturalna w stanie stałym z wykorzystaniem FTIR wykazała albo słabą13,14, albo niską15 korelację ze stabilnością podczas długoterminowego przechowywania. Ograniczenia te podkreślają potrzebę zastosowania odpowiednich metod o wysokiej rozdzielczości do identyfikacji perturbacji strukturalnych białek w stanie stałym.

Znakowanie chemiczne w połączeniu z proteolizą i analizą spektrometrią mas stało się potężnym podejściem do monitorowania struktury białek i oddziaływań molekularnych w roztworach wodnych. W rozwoju farmaceutyków metodę HDX-MS stosowano do mapowania epitopów w oddziaływaniach antygen-przeciwciało16,17, mapowania oddziaływań receptor-lek18, monitorowania wpływu modyfikacji potranslacyjnych na konformację leków białkowych19 oraz do porównywania zmienności między partiami podczas opracowywania leków biosymilarnych20. Podobnie, ligandy fotoaktywowalne były wykorzystywane do identyfikacji celów terapeutycznych oraz do określania powinowactwa i specyficzności wiązania w oddziaływaniach lek-receptor21,22. Aby rozszerzyć zastosowanie tych metod na formulacje liofilizowane, nasza grupa opracowała spektrometrię mas z wymianą wodoru na deuter w stanie stałym (ssHDX-MS) oraz spektrometrię mas z fotolitycznym znakowaniem w stanie stałym (ssPL-MS) w celu wysokorozdzielczego badania konformacji białek i oddziaływań z substancjami pomocniczymi w próbkach liofilizowanych.

Zarówno w metodzie ssHDX-MS, jak i ssPL-MS białko jest znakowane w idealnych warunkach reakcyjnych w postaci liofilizowanych ciał stałych, a następnie próbki są rekonstytuowane i analizowane za pomocą spektrometrii mas, z trawieniem proteolitycznym lub bez niego. ssHDX-MS dostarcza informacji o ekspozycji głównego łańcucha na opary deuteru, podczas gdy ssPL-MS dostarcza informacji o środowisku łańcuchów bocznych (Rysunek 1). Obie metody mogą zatem dostarczać uzupełniających informacji o konformacji białka w stanie stałym. Przedstawiamy tutaj ogólny protokół badania białek w liofilizowanych ciałach stałych z wykorzystaniem ssHDX-MS i ssPL-MS (Rysunek 2), stosując Mb jako białko modelowe. Wykazujemy zdolność obu metod do rozróżnienia różnic w formulacjach z dwoma różnymi substancjami pomocniczymi.

Schemat fałdowania białka przedstawiający procesy deuterowania i znakowania UV w wodzie deuterowanej.
Rycina 1: ssHDX i ssPL mierzą strukturę białka w liofilizowanych ciałach stałych za pomocą różnych mechanizmów znakowania. (A) W HDX wodory amidowe szkieletu wymieniają się z deuterem w zależności od struktury białka i dostępności D2O. W stanie stałym szybkość i zakres wymiany deuteru zależą od poziomu sorpcji D2O, mobilności białka (zdarzeń rozfałdowania i ponownego fałdowania) oraz charakteru substancji pomocniczych obecnych w matrycy stałej. (B) W PL naświetlanie UV przy 365 nm inicjuje tworzenie reaktywnego produktu pośredniego w postaci karbenu z grupy funkcyjnej diaziryny pLeu, który jest wstawiany niespecyficznie w każdą wiąź X-H (X = dowolny atom) lub przyłącza się do wiązania C=C w bezpośrednim sąsiedztwie. W stanie stałym szybkość i zakres znakowania zależą od lokalnego stężenia czynnika znakującego, czasu naświetlania, struktury białka i charakteru substancji pomocniczych obecnych w matrycy stałej. Panele A i B pokazują maksymalne teoretyczne znakowanie, które może wystąpić odpowiednio w szkieletcie i łańcuchach bocznych białka.

Schemat HDX w stanie stałym i znakowania fotolitycznego; liofilizowane białka, analiza spektrometrią mas.
Rysunek 2: Schemat obrazujący HDX-MS w stanie stałym (A) oraz PL-MS (B) dla białka w formie liofilizowanej.

Protokół

1. Przygotowanie próbek i liofilizacja

  1. Przeprowadzić dializę wymaganej objętości roztworu zapasowego Mb przeciwko odpowiedniemu buforowi i przefiltrować przez sterylny filtr 0,22 µm.
  2. Przygotować wymagane objętości roztworów zapasowych substancji pomocniczych oraz foto-leucyny (kwas L-2-amino-4,4-azi-pentanowy; pLeu) w odpowiednim buforze. Przefiltrować roztwory zapasowe przez sterylny filtr 0,22 µm.
  3. Przygotować formulacje zgodnie z Tabelą 1 , wykorzystując roztwory zapasowe białka, substancji pomocniczych, pLeu oraz buforu.
  4. Przefiltrować próbki przez sterylny filtr 0,22 µm, aby usunąć wszelkie cząsteczki powstałe w kroku 1.3. Rozlać próbki osobno po 0,2 ml do szklanych fiolek o pojemności 2 ml. Należy użyć fiolek szklanych przezroczystych dla światła UV (365 nm), aby aktywować pLeu w badaniach ssPL-MS.
  5. Umieścić fiolki w liofilizatorze i rozpocząć liofilizację, projektując odpowiedni cykl liofilizacji.
    1. W tym przypadku zamrozić próbki w temperaturze -40 °C, następnie przeprowadzić suszenie pierwotne pod próżnią (70 mTorr) w temperaturze -35 °C przez 12 hr oraz suszenie wtórne w temperaturze 25 °C przez 12 hr. Można również stosować inne cykle liofilizacji i metody suszenia (np. suszenie rozpyłowe).
  6. Przed zakorkowaniem wypełnić fiolki zawierające liofilizowane próbki azotem.
FormulacjeSkład (mg/ml) przed liofilizacją
MbTrehalozaSorbitolpLeu cFosforan potasu, pH 7.4
MbT a1.73.4--0.4
MbS a1.7-3.4-0.4
MbT + pLeu b1.73.4-14.3 x 10-3 do 1.430.4
MbS + pLeu b1.7-3.414.3 x 10-3 do 1.430.4

Tabela 1: Skład liofilizowanych preparatów Mb. a Preparaty wykorzystane w badaniu ssHDX-MS. b Preparaty wykorzystane w badaniu ssPL-MS. c Kwas L-2-amino-4,4-azipentanowy lub fotoleucyna (pLeu). pLeu w pięciu różnych stężeniach (14,3 x 10-3 do 1,43 mg/ml), odpowiadających 1x, 10x, 20x, 50x i 100x nadmiarowi molowemu względem Mb, poddano wspólnej liofilizacji z preparatami MbT i MbS.

2. ssHDX-MS dla nienaruszonego białka

  1. Do 200 ml D2O, wcześniej umieszczonych w dolnej komorze eksykatora, dodać nasycającą ilość (~440 g) K2CO3. Szczelnie zamknąć eksykator i pozostawić do wyrównania temperatury w 5 °C, aż zostanie osiągnięta stabilna wilgotność względna (RH) na poziomie ~43%. Inne interesujące wartości RH można uzyskać, wybierając różne nasycone roztwory soli23,24.
  2. Rozpocząć reakcje ssHDX, umieszczając niezakorkowane fiolki zawierające liofilizowane białko w górnej komorze eksykatora. Szczelnie zamknąć eksykator i inkubować w 5 °C, aby umożliwić zajście procesu HDX (Rysunek 2A).
  3. Zbierać próbki ssHDX w różnych odstępach czasu w trzech powtórzeniach. Dla formulacji Mb próbki należy pobierać w dziewięciu punktach czasowych: 1, 2, 4, 8, 16, 32, 56, 92 i 144 h.
  4. Zakorkować fiolki natychmiast po wyjęciu z eksykatora i zatrzymać reakcje poprzez błyskawiczne zamrożenie fiolek w ciekłym azocie. Przechowywać fiolki w -80 °C do czasu analizy spektrometrycznej.
  5. Próbki analizować przy użyciu odpowiedniej metody wysokorozdzielczej chromatografii cieczowej sprzężonej ze spektrometrią mas (LC-MS). Zaprojektować lub zakupić odpowiedni chłodzony system LC, aby zminimalizować wymianę zwrotną podczas analizy próbek. Zastosować konfigurację jednostki chłodzącej kolumnę oraz metodę LC-MS opisaną wcześniej25.
    UWAGA: Ponieważ szybkość wymiany protonów amidowych zależy od pH i temperatury, deuterony wbudowane w białko mogą wymieniać się z wodorem obecnym w fazie ruchomej („wymiana zwrotna”), co prowadzi do utraty informacji. Choć kwaśne pH (pH 2,5) buforu zatrzymującego i rozpuszczalników HPLC może w znacznym stopniu zminimalizować wymianę zwrotną, obniżenie temperatury (≤0 °C) za pomocą odpowiedniego systemu chłodzenia kolumny może dodatkowo chronić białko przed wymianą zwrotną.
  6. Podłączyć pętlę próbkową i pułapkę białkową do zaworu, który automatycznie steruje procesem odsalania i elucji. Skalibrować spektrometr mas, wstrzykując do niego mieszaninę strojącą TOF o niskim stężeniu w zakresie m/z 200-3200. Kolumna z unieruchomioną pepsyną oraz kolumna analityczna nie są wymagane do analizy nienaruszonego białka.
  7. Ustawić temperaturę w systemie chłodzenia na ≤0 °C i poczekać, aż system osiągnie stabilną temperaturę roboczą ~0 °C.
  8. Szybko przenieść próbki z -80 °C do ciekłego azotu w celu analizy spektrometrycznej. Używając pęsety, ostrożnie wyjąć każdą fiolkę z ciekłego azotu i zrekonstytuować próbkę, dodając do fiolki określoną objętość lodowatego buforu zatrzymującego zawierającego 0,2% kwasu mrówkowego (FA) (pH 2,5) i 5% metanolu w wodzie.
  9. Zaprogramować odpowiednią metodę HPLC i spektrometrii mas za pomocą oprogramowania sterującego. Dla formulacji Mb odsolić próbkę zawierającą 20 pmol Mb w pułapce białkowej przez 1,7 min przy użyciu 5% acetonitrylu, 95% wody i 0,1% kwasu mrówkowego (FA), a następnie eluować, zwiększając gradient do 80% acetonitrylu, 20% wody i 0,1% FA w ciągu 3,3 min. Zbierać widma mas w zakresie m/z 200-3200.
  10. Aby określić masę nienaruszonego białka, zebrać dane dla nieudeuterowanej próbki białka (tzn. białka niepoddanego ssHDX) w roztworze wodnym, stosując metodę z kroku 2.9.
  11. Wyznaczyć masy próbek nieudeuterowanych i udeuterowanych poprzez dekonwolucję surowych widm przy użyciu oprogramowania do analizy danych. W tym przypadku ustawić zakres masy na 15 000-18 000 Da, rozdzielczość masy na 1,0 Da i wysokość piku na 90% w celu obliczenia masy Mb.
  12. Obliczyć liczbę deuteronów wbudowanych w nienaruszone białko (tutaj Mb), odejmując masę białka nieudeuterowanego od masy białka udeuterowanego dla każdego punktu czasowego wymiany.
  13. Obliczyć procentowy stopień wbudowania deuteru w stosunku do teoretycznego maksimum, korzystając z poniższego równania (Równanie 1)
    Równanie wbudowania deuteru; formuła pokazuje % wymienionych deuteronów w analizie amidów białek.
    gdzie całkowita liczba wymiennych amidów = całkowita liczba aminokwasów – liczba reszt proliny – 2 („2” uwzględnia N-terminalną grupę aminową i wodór amidowy, które ulegają szybkiej wymianie zwrotnej).
  14. Dopasować kinetyczne dane ssHDX przy użyciu odpowiedniego równania wykładniczego. Równanie bieksponecjalne (Równanie 2) jest zazwyczaj najprostszym rozwiązaniem zapewniającym rozsądne dopasowanie do danych ssHDX. W niniejszym badaniu dla MbT i MbS dane dopasowano do modelu bieksponecjalnego, który przypisuje deuterony do pul „szybkiej” i „wolnej” wymiany.
    Równanie wbudowania deuteru; N_fast, N_slow, wyrażenia wykładnicze; kinetyka, analiza białek.
    gdzie Nfast i Nslow to liczba wymiennych amidów odpowiednio w pulach „szybkiej” i „wolnej” wymiany, a kfast i kslow to stałe szybkości pierwszego rzędu powiązane z tymi dwiema pulami.

3. ssHDX-MS dla białek na poziomie peptydów

  1. Przeprowadź ssHDX, postępując zgodnie z krokami od 2.1 do 2.8, z następującymi modyfikacjami w kroku 2.6. Podłącz kolumnę z unieruchomioną pepsyną oraz kolumnę analityczną do zaworu zgodnie z wcześniejszymi opisami25 i zastąp pułapkę białkową podłączoną do zaworu pułapką peptydową. Skalibruj spektrometr mas, ustawiając zakres stosunku masy do ładunku od 100 do 1 700.
    UWAGA: Podczas etapu rekonstytucji (krok 2.8) w buforze gaszącym można zastosować środek redukujący i czynnik denaturujący, aby ułatwić trawienie pepsyną białek z mostkami disiarczkowymi (np. przeciwciała monoklonalne).
  2. Zaprogramuj odpowiednią metodę HPLC i spektrometrii mas za pomocą oprogramowania sterującego. Dla formulacji Mb trawij próbki zawierające 20 pmol Mb online przy użyciu 0,1% FA, a następnie wychwytuj i odsalaj peptydy przez 1,7 min w pułapce peptydowej, stosując 10% acetonitrylu, 90% wody i 0,1% FA. Eluuj fragmenty na kolumnę analityczną przy gradientowym wzroście do 60% acetonitrylu, 40% wody i 0,1% FA w czasie 4,0 min. Rejestruj widma mas w zakresie m/z 100−1 700.
  3. Zidentyfikuj fragmenty peptydowe za pomocą analizy MS/MS próbki białka nieduterylowanego. Użyj oprogramowania do spektrometrii mas, aby porównać eksperymentalne masy jonów fragmentów peptydowych z przewidywanymi masami fragmentów peptydowych w niestandardowej bazie danych. Ustaw punkt odcięcia masy (np. 10 ppm), aby zidentyfikować masy z niskim błędem. Dla dopasowanych peptydów przygotuj listę zawierającą (i) sekwencję peptydową, (ii) stan ładunku oraz (iii) czas retencji.
  4. Użyj listy wygenerowanej w kroku 3.3, aby zmapować i określić średnią liczbę wbudowanych deuteronów dla każdego fragmentu trawienia pepsyną. Można to osiągnąć, stosując odpowiednie oprogramowanie do analizy danych HDX-MS24.
  5. Aby obliczyć procentowy przyrost deuteru i dopasować kinetyczne dane ssHDX dla każdego z fragmentów peptydowych, wykonaj kroki 2.13 i 2.14. W niniejszym badaniu dane kinetyczne HDX dla każdego z sześciu nieredundantnych fragmentów trawienia pepsyną z formulacji MbT i MbS dopasowano do bieksponecjalnego modelu asocjacji (Równanie 2).

4. ssPL-MS dla nienaruszonych białek

  1. Aby rozpocząć reakcję znakowania fotolitycznego, najpierw włącz urządzenie do sieciowania UV i pozwól lampom rozgrzać się przez 5 min. Upewnij się, że źródło UV jest wyposażone w lampy o długości fali 365 nm, aby aktywować grupę diazirynową pLeu.
    OSTROŻNIE: Nigdy nie otwieraj drzwiczek urządzenia do sieciowania UV, gdy lampy są włączone. Chroń oczy i skórę przed ekspozycją na światło UV, jeśli źródło nie jest osłonięte szklanymi drzwiczkami z ochroną przed promieniowaniem UV.
  2. Wyłącz urządzenie do sieciowania UV przed otwarciem drzwiczek. Po wyłączeniu lamp odkręć nakrętki z fiolek zawierających liofilizowany preparat i umieść je w komorze urządzenia do sieciowania UV, zgodnie z Rysunkiem 2B. Naświetlaj próbki światłem UV przez 40 min.
  3. Przeprowadź doświadczenia kontrolne, postępując zgodnie z krokami 4.1 do 4.3 dla (i) próbek liofilizowanych bez pLeu oraz (ii) próbek liofilizowanych z pLeu zrekonstytuowanym w wodzie.
  4. Zakręć fiolki i przechowuj je w temperaturze -20 °C do czasu analizy spektrometrycznej.
  5. Zrekonstytuuj stałe próbki, dodając odpowiednią objętość wody destylowanej klasy do spektrometrii mas, aby osiągnąć stężenie 2 µM.
  6. Aby rozpocząć analizę próbek, postępuj zgodnie z krokami 2.6 i 2.9.
    UWAGA: Ponieważ w przypadku znakowania kowalencyjnego wymiana wsteczna nie stanowi problemu, ssPL-MS nie wymaga specjalnego chłodzonego systemu LC.
  7. Aby wyznaczyć masę natywną białka, uzyskaj dane dla próbki białka, która nie była poddawana ssPL, postępując zgodnie z krokiem 2.9. Wyznacz masy próbek nieznakowanych i znakowanych poprzez dekonwolucję surowych widm, zgodnie z wyjaśnieniem w kroku 2.11.
  8. Oblicz liczbę wbudowanych pLeu, korzystając z następującego wzoru:
    Wzór na liczbę wbudowanych pLeu \(M_L-M_N/115\); równanie dla analizy syntezy białek.
    gdzie ML to masa znakowanego białka, MN to masa natywnego białka, a 115 to średnia masa (Da) dodana do białka natywnego po wbudowaniu pojedynczego pLeu. Należy pamiętać, że reakcja znakowania zachodzi z wydzieleniem N2 (28 Da). Masa monizotopowa pLeu wynosi 143,07.
  9. Oblicz procentowy udział populacji białek z różną liczbą znaczników, korzystając z wysokości pików z wyekstrahowanych chromatogramów jonowych.
    Równanie obliczania procentowego, %Lᵢ = (PHᵢ/(PHᵢ + PHᵤ)) x 100, reprezentacja wzoru.
    gdzie „i” oznacza liczbę znaczników, PHi oznacza wysokość piku dla białka znakowanego Li, a PHu oznacza wysokość piku białka nieznakowanego, zgodnie z obserwacjami w spektrometrii mas.

5. ssPL-MS dla białek na poziomie peptydów

  1. Przeprowadź ssPL, postępując zgodnie z krokami od 4.1 do 4.4.
  2. W celu analizy na poziomie peptydów rozpuść próbki stałe w buforze wodorowęglanu amonu (100 mM, pH 8.0).
  3. Po rozpuszczeniu zmieszaj roztwór znakowanego białka z trypsyną w stosunku molowym białka do trypsyny 10:1 i inkubuj w temperaturze 60 °C przez 16 hr.
  4. Zatrzymaj reakcję, dodając do próbki 0.1% FA w wodzie, aby uzyskać końcowe stężenie białka 2 µM.
  5. Podłącz pętlę do próbki, pułapkę peptydową i kolumnę analityczną do zaworu połączonego z systemem HPLC.
  6. Zaprogramuj odpowiednią metodę HPLC i spektrometrii mas za pomocą oprogramowania sterującego. W przypadku formulacji Mb wstrzyknij 20 pmol strawionego białka do pętli do próbki, a następnie odsol peptydy w pułapce peptydowej przez 1.5 min przy użyciu 5% acetonitrylu, 95% wody i 0.1% FA, po czym przeprowadź elucję w kolumnie analitycznej z gradientem wzrostowym do 55% acetonitrylu, 45% wody i 0.1% FA w ciągu 22 min. Zbierz widma mas w zakresie m/z 100-1,700.
  7. Przygotuj listę teoretycznych mas dla adduktów peptyd-pLeu, korzystając z narzędzia online, takiego jak ExPASy26, z liczbą pLeu obliczoną wcześniej na podstawie analizy nienaruszonego białka. Uwzględnij co najmniej 4 pominięte cięcia. Należy pamiętać, że reakcja znakowania zachodzi z utratą N2. Zatem masa adduktu peptyd-pLeu = masa nieznakowanego peptydu tryptycznego + n (masa pLeu) – n (masa N2), gdzie „n” to liczba wbudowanych pLeu.
    UWAGA: Jeśli analiza masy nienaruszonego białka wykazała do trzech znakowanych populacji białka, rozważ do trzech możliwych znaczników pLeu na peptyd. Dla peptydu o masie 1,000 Da teoretyczna masa adduktu peptyd-pLeu z wbudowaniem 1 pLeu wynosiłaby 1,000 + 1(143) - 1(28) = 1,115 Da. Podobnie teoretyczne masy adduktów peptyd-pLeu z 2 pLeu, 3 pLeu, itp. wynosiłyby odpowiednio 1,230 Da, 1,345 Da, itp..
  8. Użyj oprogramowania do analizy masy, aby dopasować teoretyczną listę mas wygenerowaną w kroku 5.7 do mas zaobserwowanych eksperymentalnie. Ustaw punkt odcięcia masy (np. 50 ppm), aby zidentyfikować masy o niskim błędzie.
  9. Dla dopasowanych peptydów określ rzeczywistą liczbę wbudowanych pLeu, korzystając ze wzoru w kroku 4.8 (Równanie 3), gdzie ML i MN to odpowiednio masy peptydu znakowanego i natywnego.

Wyniki

W niniejszej pracy metody ssHDX-MS oraz ssPL-MS zostały wykorzystane do zbadania wpływu substancji pomocniczych na konformację i oddziaływania w stanie stałym liofilizowanych formacji Mb. Stężenia białka i substancji pomocniczych użytych w tym badaniu podano w Tabeli 1. Przedstawiono reprezentatywne wyniki analizy ssHDX-MS i ssPL-MS liofilizowanej Mb otrzymanej zgodnie z powyższymi protokołami.

Wchłanianie deuteru na poziomie nienaruszonego białka

Metoda ssHDX-MS pozwala na rozróżnienie formulacji Mb na poziomie całych cząsteczek. Zdekonwolucyjne widma mas całych cząsteczek Mb po 144 hr ssHDX w formulacji MbS wykazały większy przyrost deuteru niż w formulacji MbT (Rysunek 3A). Średnio w przypadku MbS przyrost deuteru był o 46% większy niż w MbT (Tabela 2).

Dane spektrometrii mas; dekonwolucja analizy masy, wykres przebiegu czasowego poboru deuteru.
Rysunek 3: ssHDX-MS dla nienaruszonego Mb: (A) Dekonwolucyjne widma mas deuterowanego nienaruszonego Mb z formulacji MbT (linia ciągła) i MbS (linia przerywana) po 144 hr ssHDX. Przedstawiono również dekonwolucyjne widmo mas niedeuterowanego nienaruszonego Mb (linia kropkowana). (B) Kinetyka ssHDX dla nienaruszonego Mb w formulacjach MbT (linia ciągła) i MbS (linia przerywana). Przebieg czasowy ssHDX dopasowano do równania dwufazowej asocjacji wykładniczej przy użyciu oprogramowania Graph Pad Prism w wersji 5 (n = 3, ± SD).

Kinetyka deuterowania dla nienaruszonych MbS i MbT jest podobna w wczesnych punktach czasowych (1-4 hr), jednak MbS wykazała zwiększoną wymianę deuteru wraz z upływem czasu (8-144 hr) (Rysunek 3B). Sugeruje to znaczenie wyboru dłuższych punktów czasowych dla ssHDX przy niższej wilgotności względnej (RH) i niższych temperaturach. Ponadto proces sorpcji i dyfuzji D2O może wpływać na szybkość ssHDX w wczesnych punktach czasowych. Nasze poprzednie badania wykazały, że sorpcja wilgoci w ssHDX kończy się w ciągu kilku godzin i ma minimalny wpływ na kinetykę wymiany po tym czasie. Obserwowana szybkość i zakres wymiany nie są zatem jedynie miarami adsorpcji D2O27,28. Małe słupki błędów na Rysunku 3B, wskazujące odchylenia standardowe z trzech niezależnych próbek ssHDX-MS, pokazują, że eksperyment jest wysoce powtarzalny.

Wchłanianie deuteru (%) bNfast ckfast cNslow ckslow c
MbT a15.9 ± 0.513.1 (0.8)0.43 (0.03)11.0 (0.9)0.019 (0.001)
MbS a23.2 ± 0.515.4 (0.7)0.49 (0.04)19.2 (0.6)0.024 (0.002)
% zmiany d46%18%14%75%26%

Tabela 2: Ilościowe pomiary wychwytu deuteru w badaniach ssHDX formulacji Mb. a Skład przedstawiono w Tabeli 1. b Procent wychwytu deuteru w stosunku do teoretycznego maksimum dla nienaruszonego Mb po 144 h HDX w temperaturze 5 °C i wilgotności względnej 43% RH (n = 3, średnia ± SD). c Parametry wyznaczone za pomocą nieliniowej regresji danych kinetycznych ssHDX-MS. Przebieg czasowy wymiany deuteru dla nienaruszonego Mb dopasowano do bieksponecjalnego modelu asocjacji (równ. 2). Wartości w nawiasach to błędy standardowe parametrów regresji. d Procentowa zmiana pomiarów została obliczona jako 100 x [(wartość dla MbS – wartość dla MbT) / (wartość dla MbT)].

Parametry regresji (Nfast, Nslow, kfast i kslow) dla kinetyki pobierania deuteru dla MbT i MbS podano w Tabeli 2. Choć wartości Nfast i Nslow są większe dla MbS niż dla MbT, różnice w wartościach Nslow były większe niż różnice w wartościach Nfast. Konkretnie, wartość Nfast jest jedynie o 18% większa w MbS niż w MbT, podczas gdy wartość Nslow jest o 75% większa w MbS niż w MbT. Sugeruje to, że mniejsze wartości Nslow w MbT mogą wynikać z lepszego zachowania struktury Mb lub ochrony grup amidowych przez substancje pomocnicze, które w przypadku MbS są wystawione na działanie D2O. Niemniej jednak szczegółowe mechanizmy nie są w pełni wyjaśnione. Stałe szybkości (kfast i kslow) dla obu formulacji są bardzo podobne.

Wchłanianie deuteru na poziomie peptydów

Po trawieniu pepsyną zidentyfikowano łącznie 52 peptydy. Do analizy przedstawionej w niniejszej pracy wykorzystano sześć niepowtarzalnych fragmentów odpowiadających 100% sekwencji Mb. Dodatkowe informacje można uzyskać, stosując fragmenty nakładające się, co zostało wcześniej opisane przez naszą grupę24. Obliczono procentowy stopień wbudowania deuteru dla każdego peptydu i przedstawiono wyniki z próbek pobranych po 144 hr (Rysunek 4A). Kinetyka HDX dla sześciu fragmentów pepsynowych wykazała zachowanie bieksponecjajne (Rysunek 4B), co jest zgodne z istnieniem subpopulacji wodorów amidowych ulegających wymianie „szybkiej” i „wolnej”.

Analiza poboru deuteru, fragmenty peptyczne Mb; wykresy, pobór zależny od czasu, kinetyka badania.
Rycina 4: ssHDX-MS dla Mb na poziomie peptydów: (A) Procentowy pobór deuteru dla 6 nieredundantnych fragmentów peptycznych Mb w formulacjach MbT (szary) i MbS (biały) po 144 h HDX. (B) Kinetyka ssHDX dla sześciu nieredundantnych fragmentów peptycznych Mb w formulacjach MbT (linia ciągła) i MbS (linia przerywana). Przebieg czasowy ssHDX dopasowano do równania dwufazowego wykładniczego wiązania przy użyciu oprogramowania Graph Pad Prism w wersji 5 (n = 3, ± SD).

Parametry regresji dla niepowtarzających się peptydów przedstawiono na Rysunku 5. Ponieważ dopasowane stałe szybkości dla fragmentów peptydowych nie stanowią średniej stałej szybkości dla poszczególnych amidów, obserwowane stałe szybkości dla fragmentów peptydowych nie mogą być powiązane liniowo z tymi dla nienaruszonego białka. Wartości Nfast dla większości fragmentów peptydowych (z wyjątkiem fragmentu 56-69) w formulacjach MbS były nieco wyższe niż w MbT (Rysunek 5A). Podobnie, wartości kfast zazwyczaj wykazywały niewielkie różnice między formulacjami i w różnych regionach cząsteczki Mb (Rysunek 5B). Jednak wartości Nslow oraz kslow dla MbS są istotnie wyższe we wszystkich fragmentach niż dla MbT (Rysunek 5C i 5D). Znaczny wzrost Nslow i kslow dla MbS może odzwierciedlać większą mobilność grup amidowych w pulach wymiany „wolnej”.

Wykres porównujący kinetykę fragmentów peptycznych Mb; wyniki analizy danych Nfast, Kfast, Nslow, Kslow.
Rycina 5: Parametry kinetyczne ssHDX dla peptydów peptycznych Mb: wartości Nfast (A), kfast (B), Nslow (C) oraz kslow (D) uzyskane z nieliniowej regresji danych kinetycznych ssHDX-MS dla sześciu nieredundantnych peptydów peptycznych Mb w formulacjach MbT (szary) i MbS (biały) (n = 3, ± SE).

Znakowanie fotolityczne na poziomie nienaruszonych białek

Mb naświetlana w obecności 20-krotnego nadmiaru pLeu utworzyła liczne addukty Mb-pLeu, co wykryto za pomocą LC-MS (Rysunek 6A). Zdekonwolucjonowane widma dla MbT naświetlanej przez 40 min z 20-krotnym nadmiarem pLeu wykazały do 3 etykiet z przyrostem masy o +115, +230 i +345 Da w stosunku do masy nieetykietowanego Mb. MbS naświetlana w analogiczny sposób z 20-krotnym nadmiarem pLeu wykazała mniejszy stopień przyłączenia pLeu na poziomie nienaruszonego białka, przy czym za pomocą LC-MS wykryto do 2 populacji etykietowanych.

Analiza spektrometrii mas z dekonwolucją widm mas i % znakowania w funkcji czasu naświetlania, [pLeu].
Rysunek 6: ssPL-MS dla nienaruszonego Mb: (A) Dekonwolucja widm mas dla MbT (linia ciągła) i MbS (linia przerywana) znakowanych 20-krotnym nadmiarem (5% w/w) pLeu. Dekonwolucja widma mas natywnego Mb (Mb liofilizowanego i naświetlanego w obecności pLeu) przedstawiona jest jako linia kropkowana. U oznacza populację białka, która pozostaje nieznakowana po naświetlaniu. Populacje białka z 1, 2 i 3 znacznikami pLeu są reprezentowane odpowiednio jako 1L, 2L i 3L. (B) Kinetyka ssPL-MS dla nienaruszonego Mb w formulacjach MbT (pełne koła) i MbS (puste koła) w funkcji stężenia pLeu. Wszystkie próbki naświetlano przez 40 min. Słupki błędów mieszczą się w obrębie symboli. (C) Kinetyka ssPL-MS dla nienaruszonego Mb w formulacjach MbT (pełne koła) i MbS (puste koła) liofilizowanych i naświetlanych w obecności 100-krotnego nadmiaru pLeu (20,7% w/w) w funkcji czasu naświetlania. Słupki błędów mieszczą się w obrębie symboli.

W badaniach kinetycznych procent znakowanego białka wzrastał wykładniczo zarówno dla MbT, jak i MbS wraz z wydłużeniem czasu naświetlania (Rycina 6B). MbS wykazywało mniejsze pobieranie pLeu niż MbT w każdym punkcie czasowym naświetlania. Obie formulacje zdawały się osiągać plateau po 40 min. Zatem badanie kinetyczne może być przydatne do określenia czasu naświetlania niezbędnego do uzyskania pełnej aktywacji pLeu. Kinetykę znakowania badano również w zależności od stężenia pLeu (Rycina 6C). Procent znakowanego białka wzrastał wraz ze stężeniem pLeu zarówno dla MbT, jak i MbS. Jednak przy 20,7% w/w pLeu w przypadku MbT zaobserwowano spadek pobierania pLeu. Może to wynikać z wykluczenia pLeu z powierzchni białka przy wysokim stężeniu pLeu. W związku z tym należy przeprowadzić badanie z różnymi stężeniami pLeu, aby dobrać odpowiednie stężenie pLeu, które pozwoli na wystarczające znakowanie powierzchni białka bez efektu wykluczenia powierzchniowego. W niniejszym badaniu do dalszych analiz na poziomie peptydów wybrano 20-krotny nadmiar pLeu.

Ogólny spadek znakowania zaobserwowany dla MbS sugeruje słabą dostępność łańcuchów bocznych do macierzy zawierającej pLeu. Jest to zgodne ze zmianą konformacyjną w obecności sorbitolu, która skutkuje zmniejszonym znakowaniem.

Znakowanie fotolityczne na poziomie peptydów

Na podstawie badań znakowania nienaruszonych białek wybrano 20-krotny nadmiar pLeu do porównania MbT i MbS na poziomie peptydów. Znakowane próbki poddano trawieniu trypsyną, a następnie analizowano za pomocą LC-MS. W próbkach MbT i MbS wykryto łącznie 40 peptydów odpowiadających 100% sekwencji Mb. W niektórych przypadkach trawienie trypsyną może zapewnić ograniczony stopień pokrycia sekwencji białka, jeśli reszty Lys i/lub Arg są silnie znakowane. Aby zwiększyć pokrycie sekwencji, do trawienia znakowanego białka można zastosować mieszaninę trypsyny i chymotrypsyny.

Schemat struktury białka pokazujący regiony helikalne; oznaczone segmenty 32-42, 134-139, 146-153.
Rysunek 7: ssPL-MS dla Mb na poziomie peptydów: Reprezentacja schematyczna Mb znakowanej 20-krotnym nadmiarem pLeu (5% w/w) w obecności trehalozy (A) i sorbitolu (B). Znakowane białko poddano trawieniu trypsyną, a następnie zmapowano znakowane peptydy na strukturę krystaliczną Mb (PDB ID 1WLA). Regiony znakowane i nieznakowane zaznaczono odpowiednio kolorem magenta i zielonym.

Metoda ssPL-MS z trawieniem trypsyną dostarcza informacji jakościowych na temat znakowanych peptydów. Biorąc pod uwagę różne populacje znakowane na poziomie nienaruszonym, niespecyficzny mechanizm znakowania pLeu oraz różnice w wydajności jonizacji peptydów znakowanych i nieznakowanych, trudno jest uzyskać wskaźniki ilościowe dla ssPL-MS po trawieniu. Niemniej jednak informacje jakościowe mogą nadal dostarczyć wglądu w zmiany konformacyjne białek na poziomie peptydowym. W niniejszym badaniu obie formulacje, MbT i MbS, wykazały pobieranie pLeu w większości powierzchni białka. W porównaniu do MbS, fragmenty peptydowe 32-42, 134-139 i 146-153 z MbT wykazały znakowanie pLeu (Rycina 7). Sugeruje to, że łańcuchy boczne tych aminokwasów są wystawione na działanie pLeu, ponieważ helisy w tych regionach pozostają nienaruszone w matrycy MbT. Z kolei ochrona przed znakowaniem pLeu w matrycy MbS jest zgodna z zaburzeniami strukturalnymi w tych obszarach.

Ogólnie rzecz biorąc, wyniki uzyskane metodami ssHDX-MS i ssPL-MS sugerują, że metody te mogą dostarczać komplementarnych informacji o wysokiej rozdzielczości na poziomie peptydów dotyczących ekspozycji szkieletu białkowego (ssHDX-MS) i łańcuchów bocznych (ssPL-MS) oraz wpływu substancji pomocniczych w liofilizowanych formulacjach białek.

Dyskusja

Kilka badań sugerowało, że lokalne środowisko w liofilizowanych próbkach wpływa na degradację białek5,29,30. Jednak ustalenie bezpośredniego związku między strukturą białka a stabilnością w stanie stałym nie było możliwe ze względu na brak metod analitycznych o wysokiej rozdzielczości. Zastosowanie istniejących metod o wysokiej rozdzielczości, takich jak HDX i PL, do liofilizowanych proszków wymaga modyfikacji protokołów roztworów i starannej interpretacji danych. HDX-MS i PL-MS są sukcesywnie wdrażane do monitorowania konformacji białek w stanie stałym. Wyniki przedstawione tutaj i gdzie indziej27,28,31-33 wykazały zdolność tych metod do monitorowania konformacji białek z wysoką rozdzielczością w środowisku stałym. Chociaż krytyczne etapy analizy danych nie różnią się od etykietowania w roztworze34-36, w przypadku etykietowania substancji chemicznych w stanie stałym wymagane są ważne względy podczas konfiguracji eksperymentu i interpretacji danych.

Wybór odczynnika do etykietowania musi opierać się na rozmiarze i mechanizmie etykietowania. Mały rozmiar deuteru pozwala na łatwe sondowanie szkieletu peptydowego, podczas gdy stosunkowo większy rozmiar pLeu ogranicza znakowanie do łańcuchów bocznych. Zarówno ssHDX, jak i ssPL nie wykazują preferencji dla żadnego aminokwasu, więc znakowanie zależy tylko od ekspozycji szkieletu i łańcucha bocznego na matrycę. Aby skutecznie badać konformacje białek w stanie stałym, czynniki zewnętrzne wpływające na proces znakowania muszą być dokładnie kontrolowane. Całkowita ilość i rozkład przestrzenny środka znakującego w liofilizowanych ciałach stałych różni się od roztworów wodnych.

W ssHDX ilość D2O w matrycy stałej może wpływać na szybkość rozwijania się białka (lub częściowego rozwijania), ponownego fałdowania i wymiany deuteru. Inaczej jest w przypadku roztworu HDX, w którym próbka białka jest zwykle rozcieńczana dużą objętościąD2O. Staranne badanie przesiewowe wpływu hydratacji na szybkość ssHDX może pomóc w wyborze idealnych warunków wilgotności względnej. W celu kontrolowania szybkości sorpcji wilgoci i uniknięcia zapadania się proszku w preparatach zawierających higroskopijne substancje pomocnicze (np. sacharozę i trehalozę), ssHDX można przeprowadzać w warunkach chłodniczych (2-8 °C). Nasze poprzednie badanie dotyczące efektów nawodnienia wykazało zwiększoną szybkość i zakres wymiany wraz ze wzrostem zawartości wilgoci, zgodnie z oczekiwaniami. W większości naszych prac pośrednia wilgotność względna wynosząca 43% w temperaturze 5 °C okazała się idealna do rozróżniania preparatów w rozsądnym czasie24. Reakcja jest zwykle przeprowadzana do momentu osiągnięcia plateau. Gwarantuje to, że sorpcja i dyfuzja wilgoci do ciała stałego nie kontrolują szybkości HDX. Zastosowanie próbek o małych rozmiarach ciał stałych o objętości wstępnej liofilizacji wynoszącej ≤2 ml pomaga również zapewnić, że sorpcja parD2Ojest zasadniczo zakończona na wczesnym etapie wymiany. Chociaż ssHDX-MS dostarcza ilościowych informacji na temat konformacji białka w stanie stałym, istnieją pewne warunki, w których interpretacja danych nie może być całkowicie oparta na samym badaniu ssHDX. Możliwe jest, że zmniejszony wychwyt deuteru obserwowany w próbce (w porównaniu z kontrolą) może być spowodowany większą retencją struktury białka lub znaczną ilością agregatów białkowych obecnych w próbce. W takim przypadku interpretacja danych ssHDX wymaga wyników z innych metod uzupełniających. Poszerzenie pików w deuterowanych widmach masowych zaobserwowano dla kilku preparatów Mb27,28. Może to być spowodowane różnymi czynnikami, takimi jak obecność częściowo sfałdowanej populacji białka, niejednorodność przestrzenna w próbce lub gradienty przestrzenne w stężeniuD2O. Jednak czynniki te nie zostały wyróżnione w ssHDX-MS i wymagają dalszych badań.

Ponieważ ssPL-MS jest stosunkowo nowy w porównaniu z innymi metodami, wymagane jest ciągłe poznawanie jego zastosowań i ograniczeń. W ssPL foto-sieciownik jest liofilizowany z białkiem. Brak wilgoci ogranicza ruchliwość komponentów w osnowie stałej, a częściowe rozluźnienie strukturalne, które może wystąpić przy sorpcji wilgoci w ssHDX, nie jest zjawiskiem w ssPL. Ogranicza to znakowanie w ssPL do bezpośredniego sąsiedztwa foto-sieciownika. Jednak w przeciwieństwie do HDX-MS, analiza MS/MS kowalencyjnie znakowanego białka może dostarczyć informacji strukturalnych na poziomie reszt. Ponieważ znakowanie ssPL jest kowalencyjne i nieodwracalne, nie dochodzi do wymiany zwrotnej, a próbki mogą być przygotowywane i analizowane bez obawy o utratę etykiety. Aby ułatwić dyfuzję środka etykietującego i poprawić wydajność etykietowania w matrycy stałej, ssPL może być wykonywany z rosnącym % wilgotności względnej. Wychwyt pLeu można również poprawić poprzez zwiększenie stężenia czynnika fotoreaktywnego. Stosunek molowy białka do pLeu można dowolnie zmieniać. Ogólnie rzecz biorąc, 100-krotny molowy nadmiar pLeu w stosunku do białka zapewni odpowiednie znakowanie. Jednak wysokie stężenie pLeu może powodować utratę trzeciorzędowej struktury białka w matrycy stałej. W związku z tym, oprócz kinetyki znakowania i składu preparatu, wybór stężenia pLeu musi również opierać się na utrzymaniu integralności strukturalnej białka. Ponieważ pLeu nieselektywnie znakuje grupę X-H (gdzie X = C, N, O), możliwe jest, że substancje pomocnicze o podobnych miejscach znakowania mogą znacznie wpływać na poziom znakowania białka. Wpływ substancji pomocniczych na dostępność pLeu do znakowania białek nie został jeszcze scharakteryzowany. Wiadomo, że karben powstający w wyniku aktywacji diazyryny nie jest specyficzny dla reszt, jednak jedno z badań wskazuje na stronniczość w kierunku Asp i Glu36. Chociaż dobrze jest dowiedzieć się o interakcjach specyficznych dla pozostałości, informacje na poziomie peptydów są również przydatne i mogą być wykorzystane do projektowania substancji pomocniczych do blokowania regionów o wysokiej ekspozycji na matrycę w stanie stałym. ssPL-MS dostarcza szczegółowych informacji jakościowych, jednak konieczne jest uzyskanie danych ilościowych i opracowanie solidnych wskaźników w celu analizy różnic w recepturach w różnych systemach liofilizowanych.

Zastosowanie znacznika specyficznego dla reszty w połączeniu z analizą MS/MS może jeszcze bardziej zwiększyć rozdzielczość do poziomu aminokwasów. Odczynniki do znakowania, takie jak 2,3-butanodion do znakowania Arg, pochodne N-hydroksysukcynimidu dla Lys i pochodne N-alkilomaleimidu dla Cys, mogą być stosowane do precyzyjnego mapowania interakcji molekularnych w liofilizowanym proszku. Jednak odczynniki te są zależne od pH, a reakcje mogą nie być tak dobrze kontrolowane, jak znakowanie fotolityczne w stanie stałym. Alternatywnym podejściem jest włączenie foto-sieciera do sekwencji białka za pomocą auksotroficznych linii komórkowych, mutagenezy ukierunkowanej na miejsce lub derywatyzacji łańcucha bocznego.

Nasze poprzednie badania ssHDX-MS i ssPL-MS wykazały, że znakowanie białka zależy od charakteru i ilości użytych substancji pomocniczych24,27,28,31-33,37,38. ssHDX-MS Mb koliofilizowany chlorowodorkiem guanidyny (Gdn.HCl) wykazywał większy wychwyt deuteru niż Mb koliofilizowany z cukrami o niskiej masie cząsteczkowej32. W oddzielnym badaniu ssPL-MS Mb koliofilizowany z Gdn.HCl wykazał większą ochronę przed znakowaniem fotolitycznym niż Mb z sacharozą33. Co więcej, pomiary ilościowe z ssHDX-MS były silnie skorelowane ze stabilnością białka podczas długotrwałego przechowywania28. Badania te sugerują, że ssHDX lub ssPL białka odzwierciedla zakres strukturalnej retencji białka w liofilizowanym proszku. Uważamy, że zachowanie struktury drugorzędowej w liofilizowanych proszkach zapewnia korzystne środowisko do znakowania łańcucha bocznego za pomocą pLeu i ochrony wodoru amidowego przed wymianą deuteru. Jednak w przyszłości konieczne jest szczegółowe porównanie treści informacyjnych z tych metod. Chociaż ustalenie użyteczności ssHDX-MS i ssPL-MS jako narzędzia do badań przesiewowych preparatów będzie ostatecznie wymagało zastosowania ich do wielu białek, wyniki naszych ostatnich badań potwierdzają ich szersze zastosowanie. Oczekuje się, że wraz z dalszym rozwojem metody te będą szeroko przydatne do charakteryzowania preparatów białek w stanie stałym w przemyśle biofarmaceutycznym.

Oświadczenia

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

Autorzy dziękują za wsparcie finansowe od NIH R01 GM085293 (PI: E. M. Topp) oraz od College of Pharmacy na Purdue University.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Mioglobina koniSigma-AldrichM0630-5G
D-(+)-trehaloza dwuwodnaSigma Aldrich#T9531
D-SorbitolSigma Aldrich#240850
L-Photo-leucineThermo Scientific#22610
Fosforan potasu jednozasadowySigma-Aldrich#P0662
Potas dwuzasadowy fosforanSigma-Aldrich#P3786
Tlenek deuteruCambridge Isotope Laboratories#DLM-4-PKAlternatywa (Kat. Nr: 151882, Sigma-Aldrich)
Immobilizowana pepsynaApplied Biosystems#2-3132-00
TrypsynaPromega#V511AChymotrypsyna (Kat. Nr: #V1062, Promega) może być dodatkowo stosowany
Woda, klasa Optima LC/MSFisher Chemical#7732-18-5
AcetonitrylSigma-Aldrich#34998
Kwas mrówkowyThermo Scientific#28905
ESI-TOF CalibrantAgilent Technologies#G1969-85000Wysoce łatwopalna ciecz
Mikropułapka białkowaMichrom BioresourcesTR1/25108/03
Mikropułapka peptydowaMichrom BioresourcesTR1/25109/02
Kolumnaanalityczna Agilent TechnologiesZorbax 300SB-C18
LiofilizatorVirTis AdVantage Plus
Stratalinker wyposażony w pięć lamp 365 nmStratagene Corp.Stratalinker 2400
HPLCAgilent Technologies1200 series LCChłodzony system LC dla HDX-MS
ESI-qTOF MSAgilent Technologies6520 qTOF
HDExaminer (oprogramowanie do analizy danych HDX-MS)Sierra Analyticshttp://www.massspec.com/HDExaminer.html

Bibliografia

  1. Lawrence, S. Billion dollar babies--biotech drugs as blockbusters. Nat. Biotechnol. 25 (4), 380-382 (2007).
  2. Global Markets and Manufacturing Technologies for Protein Drugs. , BCC Research. BIO021D(2013).
  3. Lai, M. C., Topp, E. M. Solid-state chemical stability of proteins and peptides. J. Pharm. Sci. 88 (5), 489-500 (1999).
  4. Carpenter, J. F., Pikal, M. J., Chang, B. S., Randolph, T. W. Rational design of stable lyophilized protein formulations: some practical advice. Pharm. Res. 14 (8), 969-975 (1997).
  5. Carpenter, J. F., Chang, B. S., Garzon-Rodriguez, W., Randolph, T. W. Rational design of stable lyophilized protein formulations: theory and practice. Pharm. Biotechnol. 13, 109-133 (2002).
  6. Wüthrich, K. Protein structure determination in solution by NMR spectroscopy. J. Biol. Chem. 265 (36), 22059-22062 (1990).
  7. Ilari, A., Savino, C. Protein structure determination by x-ray crystallography. Methods. Mol. Biol. 452, 63-87 (2008).
  8. Brunger, A. T. X-ray crystallography and NMR reveal complementary views of structure and dynamics. Nat. Struct. Biol. 4, 862-865 (1997).
  9. Yu, L. Amorphous pharmaceutical solids: preparation, characterization and stabilization. Adv Drug. Deliv. Rev. 48 (1), 27-42 (2001).
  10. Manning, M. C. Use of infrared spectroscopy to monitor protein structure and stability. Expert. Rev. Proteomics. 2 (5), 731-743 (2005).
  11. Grohganz, H., Gildemyn, D., Skibsted, E., Flink, J. M., Rantanen, J. Rapid solid-state analysis of freeze-dried protein formulations using NIR and Raman spectroscopies. J. Pharm. Sci. 100 (7), 2871-2875 (2011).
  12. Bai, S., Nayar, R., Carpenter, J. F., Manning, M. C. Noninvasive determination of protein conformation in the solid state using near infrared (NIR) spectroscopy. J. Pharm. Sci. 94 (9), 2030-2038 (2005).
  13. Pikal, M. J., et al. Solid state chemistry of proteins: II. The correlation of storage stability of freeze-dried human growth hormone (hGH) with structure and dynamics in the glassy solid. J. Pharm. Sci. 97 (12), 5106-5121 (2008).
  14. Wang, B., Tchessalov, S., Cicerone, M. T., Warne, N. W., Pikal, M. J. Impact of sucrose level on storage stability of proteins in freeze-dried solids: II. Correlation of aggregation rate with protein structure and molecular mobility. J. Pharm. Sci. 98 (9), 3145-3166 (2009).
  15. Schule, S., Friess, W., Bechtold-Peters, K., Garidel, P. Conformational analysis of protein secondary structure during spray-drying of antibody/mannitol formulations. Eur. J. Pharm. Biopharm. 65 (1), 1-9 (2007).
  16. Baerga-Ortiz, A., Hughes, C. A., Mandell, J. G., Komives, E. A. Epitope mapping of a monoclonal antibody against human thrombin by H/D-exchange mass spectrometry reveals selection of a diverse sequence in a highly conserved protein. Protein. Sci. 11 (6), 1300-1308 (2002).
  17. Coales, S. J., Tuske, S. J., Tomasso, J. C., Hamuro, Y. Epitope mapping by amide hydrogen/deuterium exchange coupled with immobilization of antibody, on-line proteolysis, liquid chromatography and mass spectrometry. Rapid. Commun. Mass. Spectrom. 23 (5), 639-647 (2009).
  18. Pacholarz, K. J., Garlish, R. A., Taylor, R. J., Barran, P. E. Mass spectrometry based tools to investigate protein-ligand interactions for drug discovery. Chem. Soc. Rev. 41 (11), 4335-4355 (2012).
  19. Houde, D., Peng, Y., Berkowitz, S. A., Engen, J. R. Post-translational modifications differentially affect IgG1 conformation and receptor binding. Mol. Cell. Proteomics. 9 (8), 1716-1728 (2010).
  20. Houde, D., Berkowitz, S. A., Engen, J. R. The utility of hydrogen/deuterium exchange mass spectrometry in biopharmaceutical comparability studies. J. Pharm. Sci. 100 (6), 2071-2086 (2011).
  21. Dorman, G., Prestwich, G. D. Using photolabile ligands in drug discovery and development. Trends. Biotechnol. 18 (2), 64-77 (2000).
  22. Robinette, D., Neamati, N., Tomer, K. B., Borchers, C. H. Photoaffinity labeling combined with mass spectrometric approaches as a tool for structural proteomics. Expert. Rev. Proteomics. 3 (4), 399-408 (2006).
  23. Greenspan, L. Humidity fixed points of binary saturated aqueous solutions. Journal of Research of the National Bureau of Standards. 81A (1), 8(1977).
  24. Sophocleous, A. M., Zhang, J., Topp, E. M. Localized hydration in lyophilized myoglobin by hydrogen-deuterium exchange mass spectrometry. 1. Exchange mapping. Mol. Pharm. 9 (4), 718-726 (2012).
  25. Keppel, T. R., Jacques, M. E., Young, R. W., Ratzlaff, K. L., Weis, D. D. An efficient and inexpensive refrigerated LC system for H/D exchange mass spectrometry. J. Am. Soc. Mass. Spectrom. 22 (8), 1472-1476 (2011).
  26. Gasteiger, E., et al. ExPASy: The proteomics server for in-depth protein knowledge and analysis. Nucleic. Acids. Res. 31 (13), 3784-3788 (2003).
  27. Sophocleous, A. M., Topp, E. M. Localized hydration in lyophilized myoglobin by hydrogen-deuterium exchange mass spectrometry. 2. Exchange kinetics. Mol. Pharm. 9 (4), 727-733 (2012).
  28. Moorthy, B. S., Schultz, S. G., Kim, S. G., Topp, E. M. Predicting Protein Aggregation during Storage in Lyophilized Solids Using Solid State Amide Hydrogen/Deuterium Exchange with Mass Spectrometric Analysis (ssHDX-MS). Mol. Pharm. 11 (6), 1869-1879 (2014).
  29. Wang, W. Lyophilization and development of solid protein pharmaceuticals. Int. J. Pharm. 203 (1-2), 1-60 (2000).
  30. Sarciaux, J. M., Mansour, S., Hageman, M. J., Nail, S. L. Effects of buffer composition and processing conditions on aggregation of bovine IgG during freeze-drying. J. Pharm. Sci. 88 (12), 1354-1361 (1999).
  31. Li, Y., Williams, T. D., Schowen, R. L., Topp, E. M. Characterizing protein structure in amorphous solids using hydrogen/deuterium exchange with mass spectrometry. Anal. Biochem. 366 (1), 18-28 (2007).
  32. Sinha, S., Li, Y., Williams, T. D., Topp, E. M. Protein conformation in amorphous solids by FTIR and by hydrogen/deuterium exchange with mass spectrometry. Biophys. J. 95 (12), 5951-5961 (2008).
  33. Iyer, L. K., Moorthy, B. S., Topp, E. M. Photolytic labeling to probe molecular interactions in lyophilized powders. Mol. Pharm. 10 (12), 4629-4639 (2013).
  34. Hentze, N., Mayer, M. P. Analyzing protein dynamics using hydrogen exchange mass spectrometry. J. Vis. Exp. (81), e50839(2013).
  35. Kaltashov, I. A., Bobst, C. E., Abzalimov, R. R. H/D exchange and mass spectrometry in the studies of protein conformation and dynamics: is there a need for a top-down approach. Anal. Chem. 81 (19), 7892-7899 (2009).
  36. Jumper, C. C., Schriemer, D. C. Mass spectrometry of laser-initiated carbene reactions for protein topographic analysis. Anal. Chem. 83 (8), 2913-2920 (2011).
  37. Li, Y., Williams, T. D., Topp, E. M. Effects of excipients on protein conformation in lyophilized solids by hydrogen/deuterium exchange mass spectrometry. Pharm. Res. 25 (2), 259-267 (2008).
  38. Li, Y., Williams, T. D., Schowen, R. L., Topp, E. M. Trehalose and calcium exert site-specific effects on calmodulin conformation in amorphous solids. Biotechnol. Bioeng. 97 (6), 1650-1653 (2007).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Spektrometria maswymiana wodoru na deuterznakowanie fotolityczneliofilizowane białkoanaliza struktury białekHDX w stanie stałymznakowanie łańcuchów bocznychrozdzielczość na poziomie peptydówformulacja mioglobinywpływ substancji pomocniczych
Podejścia spektrometrii mas do badania struktury i interakcji białek w liofilizowanych proszkach
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.