Artykuł metodologiczny

Podejścia spektrometrii mas do badania struktury i interakcji białek w liofilizowanych proszkach

DOI:

10.3791/52503

⸱

14 kwietnia 2015

 ,  , 
1Department of Industrial and Physical Pharmacy, Purdue University

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj prezentujemy szczegółowe protokoły dla spektrometrii mas z wymianą amidu i deuteru w stanie stałym (ssHDX-MS) oraz spektrometrii mas znakowania fotolitycznego w stanie stałym (ssPL-MS) dla białek w stałych proszkach. Metody te dostarczają informacji o wysokiej rozdzielczości na temat konformacji i oddziaływań białek w amorficznym stanie stałym, które mogą być przydatne w projektowaniu preparatów.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Amidowa wymiana wodoru/deuteru (ssHDX-MS) i znakowanie fotolityczne w łańcuchu bocznym (ssPL-MS), a następnie analiza spektrometryczna mas, mogą być cenne dla scharakteryzowania liofilizowanych preparatów leków białkowych. Znakowanie, a następnie odpowiednie trawienie proteolityczne pozwala na mapowanie struktury białka i interakcji z rozdzielczością na poziomie peptydów. Ponieważ elementy strukturalne białka są stabilizowane przez sieć wiązań chemicznych z łańcuchów głównych i bocznych aminokwasów, specyficzne znakowanie atomów w resztach aminokwasowych zapewnia wgląd w strukturę i konformację białka. W przeciwieństwie do rutynowych metod stosowanych do badania białek w liofilizowanych ciałach stałych (np. FTIR), ssHDX-MS i ssPL-MS dostarczają informacji ilościowych i specyficznych dla danego miejsca. Stopień inkorporacji deuteru i parametry kinetyczne mogą być związane z szybką i wolno wymianą pul amidowych (Nszybko, Nwolno) i bezpośrednio odzwierciedlają stopień fałdowania i struktury białek w preparatach liofilizowanych. Stabilne znakowanie fotolityczne nie ulega wymianie zwrotnej, co stanowi przewagę nad ssHDX-MS. W tym miejscu przedstawiamy szczegółowe protokoły zarówno dla ssHDX-MS, jak i ssPL-MS, wykorzystując mioglobinę (Mb) jako białko modelowe w liofilizowanych preparatach zawierających trehalozę lub sorbitol.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Leki białkowe są najszybciej rozwijającym się sektorem przemysłu biofarmaceutycznego i oferują obiecujące nowe metody leczenia wcześniej nieuleczalnych chorób, w tym zaburzeń hormonalnych, nowotworów i chorób autoimmunologicznych1. W 2012r. globalny rynek bioterapeutyków osiągnął wartość 138 mld USD i oczekuje się, że do 2018 r. osiągnie wartość 179 mld USD. Białka są większe i bardziej kruche niż konwencjonalne leki małocząsteczkowe, a zatem są bardziej podatne na wiele rodzajów degradacji3. Aby zapewnić odpowiedni okres trwałości i stabilność, leki białkowe są często formułowane jako liofilizowane (tj. liofilizowane) stałe proszki. Białko może jednak nadal ulegać degradacji w stanie stałym, zwłaszcza jeśli jego natywna struktura nie zostanie zachowana w procesie liofilizacji4,5. Zapewnienie, że struktura została zachowana, jest możliwe tylko wtedy, gdy istnieją metody analityczne, które mogą badać konformację białka w stanie stałym z wystarczającą rozdzielczością.

Spektroskopia NMR6 i krystalografia rentgenowska7 są powszechnie stosowanymi metodami o wysokiej rozdzielczości do oceny struktury białek w roztworze i krystalicznych ciałach stałych8. Ze względu na charakter substancji pomocniczych i stosowane metody przetwarzania, liofilizowane preparaty białkowe są zwykle amorficzne, a nie krystaliczne9. Brak jednorodności i porządku mikroskopowego sprawia, że wyżej wymienione techniki są niepraktyczne w przypadku białek w amorficznych ciałach stałych. Spektroskopia w podczerwieni z transformacją Fouriera (FTIR)10, spektroskopia Ramana11 i spektroskopia bliskiej podczerwieni (NIR)12 są regularnie wykorzystywane przez przemysł biofarmaceutyczny do porównywania struktury drugorzędowej białek w liofilizowanych proszkach z natywną strukturą stanu roztworu. Metody te mają jednak niską rozdzielczość i mogą dostarczyć jedynie informacji o globalnych zmianach w strukturze drugorzędowej. Charakterystyka strukturalna ciała stałego przy użyciu FTIR wykazała słabą korelację13,14 lubsłabą 15 z długoterminową stabilnością przechowywania. Ograniczenia te podkreślają potrzebę stosowania odpowiednich metod o wysokiej rozdzielczości w celu identyfikacji zaburzeń strukturalnych białek w stanie stałym.

Etykietowanie chemiczne w połączeniu z proteolizą i analizą spektrometryczną mas stało się skutecznym podejściem do monitorowania struktury białek i interakcji molekularnych w roztworze wodnym. W rozwoju farmaceutycznym HDX-MS wykorzystano do mapowania epitopów w interakcjach antygen-przeciwciało16,17, do mapowania interakcji receptor-lek18, do monitorowania wpływu modyfikacji potranslacyjnych na konformację leków białkowych19 oraz do porównywania zmienności między partiami w opracowywaniu leków biopodobnych20. Podobnie, fotoaktywowane ligandy zostały wykorzystane do identyfikacji celów leków oraz do określenia powinowactwa wiązania i swoistości interakcji lek-receptor21,22. Aby rozszerzyć zastosowanie tych metod na preparaty liofilizowane, nasza grupa opracowała spektrometrię mas wymiany wodorowo-deuterowej w stanie stałym (ssHDX-MS) i spektrometrię mas znakowania fotolitycznego w stanie stałym (ssPL-MS) w celu badania konformacji białek i interakcji substancji pomocniczych w liofilizowanych próbkach z wysoką rozdzielczością.

Zarówno w ssHDX-MS jak i ssPL-MS, białko jest znakowane w idealnych warunkach reakcji w liofilizowanych ciałach stałych, a próbki są następnie odtwarzane i analizowane za pomocą spektrometrii mas z lub bez trawienia proteolitycznego. ssHDX-MS dostarcza informacji o ekspozycji łańcucha głównego na opary deuteru, podczas gdy ssPL-MS dostarcza informacji o środowisku łańcuchów bocznych (Rysunek 1). Obie metody mogą zatem dostarczyć uzupełniających się informacji na temat konformacji białek w stanie stałym. W tym miejscu przedstawiamy ogólny protokół badania białek w liofilizowanych ciałach stałych przy użyciu ssHDX-MS i ssPL-MS (ryc. 2), przy użyciu Mb jako białka modelowego. Pokazujemy zdolność obu metod do rozróżniania różnic w preparatach z dwiema różnymi substancjami pomocniczymi.

Proces fałdowania białek z wykorzystaniem deuteracji i znakowania UV; Schemat przedstawiający kroki rozkładania i składania.
Rysunek 1: ssHDX i ssPL mierzą strukturę białek w liofilizowanych ciałach stałych za pomocą różnych mechanizmów znakowania. (A) W HDX wodory amidowe w szkielecie wymieniają się z deuterem w funkcji struktury białka i dostępnościD2O. W stanie stałym szybkość i zakres wymiany deuteru zależą od poziomu sorpcjiD2O, ruchliwości białek (zdarzenia rozwijania i ponownego fałdowania) oraz charakteru substancji pomocniczych obecnych w osnowie stałej. (B) W PL promieniowanie UV o długości fali 365 nm inicjuje tworzenie reaktywnego produktu pośredniego karbenu z diacyrynowej grupy funkcyjnej pLeu i jest wprowadzane niespecyficznie do dowolnego wiązania X-H (X = dowolny atom) lub dodawane w poprzek wiązania C = C w jego bezpośrednim sąsiedztwie. W stanie stałym szybkość i zakres znakowania zależą od lokalnego stężenia środka znakującego, czasu napromieniania, struktury białka i charakteru substancji pomocniczych obecnych w matrycy stałej. Panele A i B pokazują maksymalne teoretyczne znakowanie, które może wystąpić odpowiednio na szkielecie i łańcuchach bocznych w białku.

Analiza białek w stanie stałym; HDX w eksykatorze, znakowanie fotolityczne w komorze UV, spektrometria mas.
Rysunek 2: Schemat przedstawiający HDX-MS (A) i PL-MS (B) w stanie stałym dla białka w postaci liofilizowanej.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Przygotowanie próbki i liofilizacja

  1. Przeprowadzić dializę wymaganej objętości roztworu podstawowego Mb w stosunku do odpowiedniego buforu i przefiltrować przez sterylny filtr 0,22 μm.
  2. Przygotować wymaganą objętość substancji pomocniczych i roztworów podstawowych fotoleucyny (kwasu L-2-amino-4,4-azypentanowego; pLeu) w odpowiednim buforze. Przefiltrować roztwory podstawowe przez sterylny filtr 0,22 μm.
  3. Przygotować preparaty przedstawione w Tabeli 1, używając roztworów podstawowych białka, substancji pomocniczych, pLeu i buforu.
  4. Przefiltruj próbki przez sterylny filtr 0,22 μm, aby usunąć wszelkie cząstki powstałe w kroku 1.3. Próbki należy napełniać oddzielnie w objętości 0,2 ml do szklanych fiolek o pojemności 2 ml. Należy używać szklanych fiolek, które są przezroczyste dla światła UV (365 nm) w celu aktywacji pLeu w badaniach ssPL-MS.
  5. Załaduj fiolki do liofilizatora i rozpocznij liofilizację, projektując odpowiedni cykl liofilizacji.
    1. W tym przypadku próbki należy zamrozić w temperaturze -40 °C, a następnie wstępnie wysuszyć w próżni (70 mTorr) w temperaturze -35 °C przez 12 godzin i suszyć wtórnie w temperaturze 25 °C przez 12 godzin. Można również stosować inne cykle liofilizacji i metody suszenia (np. suszenie rozpyłowe).
  6. Napełnić fiolki zawierające liofilizowane próbki azotem przed zamknięciem.
FormułySkład (mg/ml) przed liofilacją
Mb TrehalozasorbitolpLeu cPotas, fosforan, pH 7,4
MbT aPytanie 1.73.4--0,4
MbS aPytanie 1.7-3.4-0,4
MbT + pLeu bPytanie 1.73.4-14,3 x 10-3 do 1,430,4
MbS + pLeu bPytanie 1.7-3.414,3 x 10-3 do 1,430,4

Tabela 1: Skład liofilizowanych preparatów Mb. a Preparaty użyte w badaniu ssHDX-MS. b Preparaty użyte w badaniu ssPL-MS. c Kwas L-2-amino-4,4-azypentanowy lub fotoleucyna (pLeu). pLeu w pięciu różnych stężeniach (14,3 x 10-3 do 1,43 mg/ml) odpowiadających 1x, 10x, 20x, 50x i 100x nadmiarowi molowemu w stosunku do Mb poddano koliofilizacji preparatami MbT i MbS.

2. ssHDX-MS dla nienaruszonego białka

  1. Dodać nasyconą ilość (~440 g)K2CO3 do 200 ml D2O uprzednio umieszczonego w dolnej komorze eksykatora. Szczelnie uszczelnić eksykator i pozostawić do zrównoważenia w temperaturze 5 °C, aż do osiągnięcia stabilnej wilgotności względnej (RH) wynoszącej ~43%. Inne interesujące wartości wilgotności względnej można uzyskać, wybierając różne nasycone roztwory soli23,24.
  2. Zainicjować reakcje ssHDX, umieszczając niezakorkowane fiolki zawierające liofilizowane białko w górnej komorze eksykatora. Uszczelnić eksykator hermetycznie i inkubować w temperaturze 5 °C, aby umożliwić wystąpienie HDX (rysunek 2A).
  3. Zbierz próbki ssHDX w różnych momentach w trzech egzemplarzach. W przypadku preparatów Mb próbki należy pobierać w dziewięciu punktach czasowych 1, 2, 4, 8, 16, 32, 56, 92 i 144 godzinach.
  4. Zakryć fiolki natychmiast po wyjęciu z eksykatora i wygasić reakcje poprzez błyskawiczne zamrożenie fiolek w ciekłym azocie. Przechowywać fiolki w temperaturze -80 °C do czasu analizy spektrometrii mas.
  5. Analizować próbki przy użyciu odpowiedniej metody chromatografii cieczowej ze spektrometrią mas o wysokiej rozdzielczości (LC-MS). Zaprojektuj lub zakupuj odpowiedni chłodzony system LC, aby zminimalizować wymianę wsteczną podczas analizy próbki. Użyj konfiguracji kolumnowego agregatu chłodniczego i metody LC-MS wcześniej zgłoszonej25.
    UWAGA: Ponieważ szybkość wymiany protonów amidowych zależy od pH i temperatury, deuterony zawarte w białku mogą wymieniać się z wodorem obecnym w fazie ruchomej ("wymiana wsteczna"), powodując utratę informacji. Chociaż kwaśne pH (pH 2,5) buforu hartowniczego i rozpuszczalników HPLC może w dużym stopniu zminimalizować wymianę wsteczną, obniżenie temperatury (≤0 °C) za pomocą odpowiedniego systemu chłodzenia kolumnowego może dodatkowo chronić białko przed wymianą wsteczną.
  6. Podłącz pętlę próbki i pułapkę białkową do zaworu, który automatycznie steruje procesem odsalania i elucji. Skalibruj spektrometr masowy, wstrzykując do spektrometru masowego mieszaninę strojeniową o niskim stężeniu TOF w zakresie m/z 200-3,200. Unieruchomiona kolumna pepsyny i kolumna analityczna nie są wymagane do analizy nienaruszonych białek.
  7. Ustaw temperaturę w układzie chłodniczym na ≤0 °C i poczekaj, aż system osiągnie stabilną temperaturę roboczą ~0 °C.
  8. Szybkie przenoszenie próbek z temperatury -80 °C do ciekłego azotu w celu przeprowadzenia analizy spektrometrycznej mas. Za pomocą kleszczyków ostrożnie wyjąć każdą fiolkę z ciekłego azotu i rozpuść próbkę, dodając do fiolki określoną objętość lodowatego buforu hartującego zawierającego 0,2% kwasu mrówkowego (FA) (pH 2,5) i 5% metanolu w wodzie.
  9. Zaprogramować odpowiednią metodę HPLC i spektrometrii mas za pomocą oprogramowania sterującego. W przypadku preparatów Mb odsalać próbkę zawierającą 20 pmol Mb w pułapce białkowej przez 1,7 minuty za pomocą 5% acetonitrylu, 95% wody i 0,1% kwasu mrówkowego (FA) i eluować przy użyciu gradientu zwiększonego do 80% acetonitrylu, 20% wody i 0,1% FA w 3,3 min. Zbieraj widma masowe w zakresie m/z 200-3,200.
  10. W celu określenia masy nienaruszonego białka należy uzyskać dane dla próbki białka niedeuterowanego (tj. białka niepoddanego działaniu ssHDX) w roztworze wodnym, stosując metodę opisaną w kroku 2.9.
  11. Uzyskaj masy próbek niedeuterowanych i deuterowanych, dekonwoluując surowe widma za pomocą oprogramowania do analizy danych. Tutaj ustaw zakres masy na 15 000-18 000 Da, rozdzielczość masy na 1,0 Da, a wysokość piku na 90%, aby obliczyć masę Mb.
  12. Oblicz liczbę deuteronów zawartych w nienaruszonym białku (tutaj Mb), odejmując masę białka niezdeuterowanego od masy białka deuterowanego w każdym punkcie czasowym wymiany.
  13. Obliczyć procentowy absorpcję deuteru w stosunku do maksimum teoretycznego, stosując następujące równanie (równanie 1)
    Wzór obliczeniowy na absorpcję deuteru, % deuteru wymienionego na amidy.
    gdzie całkowita liczba wymiennych amidów = całkowita liczba aminokwasów – liczba reszt proliny – 2 ("2" odpowiada za N-końcową grupę aminową i wodór amidowy, które ulegają szybkiej wymianie zwrotnej).
  14. Dopasuj dane kinetyczne ssHDX za pomocą odpowiedniego równania wykładniczego. Równanie dwuwykładnicze (równanie 2) jest zwykle najprostsze, które zapewnia rozsądne dopasowanie do danych ssHDX. W tym badaniu, dla MbT i MbS, dopasuj dane do modelu dwuwykładniczego, który przypisuje deuterony do "szybkich" i "wolnych" pul wymiany.
    Wzór na wychwyt deuteru, równania, analiza kinetyki, znakowanie białek, szybkości reakcji.
    gdzie Nszybkie i Nwolne to liczba wymiennych amidów w "szybkich" i "wolnych" pulach wymiany, odpowiednio, a kszybkie i kwolne są stałymi szybkości pierwszego rzędu skojarzonymi z tymi dwiema pulami.

3. ssHDX-MS dla białka na poziomie peptydu

  1. Wykonaj ssHDX, wykonując kroki od 2.1 do 2.8, z następującymi modyfikacjami w kroku 2.6. Podłączyć unieruchomioną kolumnę pepsyny i kolumnę analityczną do zaworu, jak podano wcześniej25 i zastąpić pułapkę białkową połączoną z zaworem pułapką peptydową. Skalibruj spektrometr masowy, ustawiając stosunek masy do ładunku w zakresie od 100 do 1 700,
    UWAGA: Podczas etapu rozpuszczania (etap 2.8) do buforu wygaszającego można dodać środek redukujący i denaturujący w celu ułatwienia trawienia pepsynami białek z wiązaniami dwusiarczkowymi (np. przeciwciał monoklonalnych).
  2. Zaprogramować odpowiednią metodę HPLC i spektrometrii mas za pomocą oprogramowania sterującego. W przypadku preparatów Mb należy trawić próbki zawierające 20 pmol Mb online z 0,1% FA, pułapką i peptydami odsalającymi przez 1,7 minuty z 10% acetonitrylu, 90% wodą i 0,1% FA w pułapce peptydowej. Eluować fragmenty na kolumnie analitycznej ze wzrostem gradientu do 60% acetonitrylu, 40% wody i 0,1% FA w ciągu 4,0 min. Uzyskaj widma masowe w zakresie m/z 100−1,700.
  3. Zidentyfikuj fragmenty trawienne za pomocą analizy MS/MS próbki białka niedeuterowanego. Użyj oprogramowania do spektrometrii mas, aby porównać eksperymentalne masy jonów fragmentów peptydów z przewidywanymi masami fragmentów peptydów w niestandardowej bazie danych. Ustaw punkt odcięcia masy (np. 10 ppm), aby zidentyfikować masy o niskim błędzie. W przypadku dopasowanych peptydów należy przygotować listę składającą się z (i) sekwencji peptydów, (ii) stanu naładowania i (iii) czasu retencji.
  4. Skorzystaj z listy wygenerowanej w kroku 3.3, aby zmapować i określić średnią liczbę deuteronów zawartych w każdym fragmencie trawienia pepsyny. Można to osiągnąć poprzez zastosowanie odpowiedniego oprogramowania do analizy danych HDX-MS24.
  5. Aby obliczyć procentowy wychwyt deuteru i dopasować dane kinetyczne ssHDX dla każdego z fragmentów trawiennych, wykonaj kroki 2.13 i 2.14. W tym badaniu dane kinetyczne HDX dla każdego z sześciu nieredundantnych fragmentów trawienia pepsyny z preparatów MbT i MbS dopasowano do dwuwykładniczego modelu asocjacyjnego (równanie 2).

4. ssPL-MS dla nienaruszonego białka

  1. Aby rozpocząć reakcję znakowania fotolitycznego, najpierw włącz środek sieciujący UV i pozwól lampom rozgrzać się przez 5 minut. Upewnij się, że źródło UV jest wyposażone w lampy o długości fali 365 nm, aby aktywować grupę diazyrynową pLeu.
    UWAGA: Nigdy nie otwieraj drzwi środka sieciującego UV, gdy lamps są włączone. Chroń oczy i skórę przed ekspozycją na światło UV, jeśli źródło nie jest zamknięte szklanymi drzwiami chroniącymi przed promieniowaniem UV.
  2. Wyłącz sieciownik UV przed otwarciem drzwi. Po wyłączeniu lamp odkręć fiolki zawierające liofilizowany preparat i umieść je w komorze sieciującej UV, jak pokazano na rysunku 2B. Naświetlać próbki światłem UV przez 40 minut.
  3. Przeprowadzić eksperymenty kontrolne, wykonując kroki od 4.1 do 4.3 dla (i) próbek liofilizowanych bez pLeu i (ii) próbek liofilizowanych z pLeu rozpuszczonych w wodzie.
  4. Zakryć i przechowywać fiolki w temperaturze -20 °C do czasu analizy spektrometrii mas.
  5. Odtworzyć próbki stałe, dodając odpowiednią objętość wody destylowanej o spektrometrii mas w celu doprowadzenia stężenia do 2 μM.
  6. Aby rozpocząć analizę próbki, wykonaj kroki 2.6 i 2.9.
    UWAGA: Ponieważ wymiana zwrotna nie stanowi problemu w przypadku etykietowania kowalencyjnego, ssPL-MS nie wymaga specjalnego chłodzonego systemu LC.
  7. Aby określić masę natywną białka, należy uzyskać dane dla próbki białka, która nie została poddana działaniu ssPL, wykonując krok 2.9. Uzyskać masy nieznakowanych i znakowanych próbek, dekonwoluując surowe widma, jak wyjaśniono w kroku 2.11.
  8. Obliczyć liczbę włączonych pLeu, korzystając z następującego wzoru:
    Równanie inkorporacji leucyny: \( M_L-M_N/115 \).
    gdzie ML jest masą znakowanego białka, MN jest masą białka natywnego, a 115 jest średnią masą (Da) dodaną do białka natywnego po włączeniu pojedynczego pLeu. Należy zauważyć, że reakcja znakowania zachodzi przy utracieN2 (28 Da). Masa monoizotopowa pLeu wynosi 143.07.
  9. Obliczyć procentową zawartość populacji białek o różnej liczbie znaczników, korzystając z wysokości pików z ekstrahowanych chromatogramów jonowych.
    Obliczanie procentu lipidów, formuła %Li; Analiza współczynnika pH, badanie biochemiczne, równanie.
    gdzie "i" oznacza liczbę znaczników, PHi oznacza wysokość piku dla znakowanego białka Li, a PHu oznacza wysokość piku nieznakowanego białka obserwowaną za pomocą spektrometrii mas.

5. ssPL-MS dla białka na poziomie peptydu

  1. Wykonaj ssPL, wykonując kroki od 4.1 do 4.4.
  2. W celu analizy poziomu peptydów należy rozpuścić próbki stałe w buforze wodorowęglanu amonu (100 mM, pH 8,0).
  3. Po rozpuszczeniu zmieszać znakowany roztwór białka z trypsyną w stosunku molowym białka do trypsyny 10:1 i inkubować w temperaturze 60 °C przez 16 godzin.
  4. Ugasić reakcję, dodając 0,1% FA w wodzie do próbki, aby uzyskać końcowe stężenie do 2 μM białka.
  5. Podłączyć pętlę próbki, pułapkę peptydową i kolumnę analityczną do zaworu połączonego z systemem HPLC.
  6. Zaprogramować odpowiednią metodę HPLC i spektrometrii mas za pomocą oprogramowania sterującego. W przypadku preparatów Mb wstrzyknąć 20 pmol strawionego białka do pętli próbki i odsalać peptydy w pułapce peptydowej przez 1,5 minuty z 5% acetonitrylem, 95% wodą i 0,1% FA, a następnie elucję w kolumnie analitycznej ze wzrostem gradientu do 55% acetonitrylu, 45% wody i 0,1% FA w ciągu 22 minut. Zbieraj widma masowe w zakresie m/z 100-1,700.
  7. Przygotuj teoretyczną listę mas dla adduktów peptyd-pLeu za pomocą narzędzia online, takiego jak ExPASy26, z liczbami pLEU obliczonymi wcześniej na podstawie analizy nienaruszonego białka. Uwzględnij co najmniej 4 pominięte dekolty. Należy zauważyć, że reakcja znakowania zachodzi przy utracieN2. Dlatego masa adduktu peptyd-pLeu = masa nieznakowanego peptydu tryptycznego + n (masa pLeu) – n (masa N2), gdzie "n" to liczba zawartych pLeu.
    UWAGA: Jeśli analiza masy nienaruszonego białka wykazała do trzech znakowanych populacji białka, należy wziąć pod uwagę do trzech możliwych znaczników pLeu na peptyd. Dla peptydu o masie 1,000 Da, teoretyczna masa adduktu peptyd-pLeu z inkorporacją 1 pLeu wynosiłaby 1,000 + 1(143) - 1(28) = 1,115 Da. Podobnie, teoretyczne masy adduktów peptyd-pLeu z 2 pLeu, 3 pLeu itd. wynosiłyby odpowiednio 1,230 Da, 1,345 Da itd.
  8. Użyj oprogramowania do analizy masy, aby dopasować teoretyczną listę mas wygenerowaną w kroku 5.7 do mas zaobserwowanych doświadczalnie. Ustaw punkt odcięcia masy (np. 50 ppm), aby zidentyfikować masy o niskim błędzie.
  9. W przypadku dopasowanych peptydów należy określić rzeczywistą liczbę włączonych pLeu, korzystając ze wzoru w kroku 4.8 (równanie 3), gdzie ML iM N są masami odpowiednio znakowanego i natywnego peptydu.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj ssHDX-MS i ssPL-MS zostały użyte do zbadania wpływu substancji pomocniczych na konformację i interakcje w stanie stałym liofilizowanych formacji Mb. Stężenia białka i substancji pomocniczych użytych w tym badaniu podano w Tabeli 1. Przedstawiono reprezentatywne wyniki analizy liofilizowanego Mb za pomocą ssHDX-MS i ssPL-MS uzyskane zgodnie z powyższymi protokołami.

Wychwyt deuteru na nienaruszonym poziomie białka

ssHDX-MS jest w stanie rozróżnić formuły Mb na nienaruszonym poziomie. Zdekonwolucyjne widma masowe nienaruszonego Mb po 144 godzinach ssHDX z preparatu MbS wykazały większy wychwyt deuteru niż preparat MbT (ryc. 3A). Średnio MbS wykazywał o 46% większy wychwyt deuteru niż MbT (Tabela 2).

Spektrometria mas, analiza wychwytu deuteru; Wykresy pokazują zdekonwoluowaną masę, absorpcję w czasie.
Rysunek 3: ssHDX-MS dla nienaruszonego Mb: (A) Zdekonwolucyjne widma masowe deuterowanego nienaruszonego Mb z preparatów MbT (linia ciągła) i MbS (linia przerywana) po 144 godzinach ssHDX. Pokazane jest również zdekonwolucyjne widmo masowe niezdeuterowanego nienaruszonego Mb (linia przerywana). (B) kinetyka ssHDX dla nienaruszonego Mb w formulacjach MbT (linia ciągła) i MbS (linia przerywana). Przebieg czasowy ssHDX dopasowano do równania dwufazowej asocjacji wykładniczej za pomocą oprogramowania Graph Pad Prism w wersji 5 (n = 3, ± SD).

Kinetyka deuteracji dla nienaruszonych MbS i MbT jest podobna we wczesnych punktach czasowych (1-4 godziny), ale MbS wykazywał zwiększoną wymianę deuteru wraz ze wzrostem czasu (8-144 godziny) (Rysunek 3B). Sugeruje to, jak ważne jest wybieranie dłuższych punktów czasowych dla ssHDX w niższych warunkach wilgotności względnej i temperatury. Również proces sorpcji i dyfuzjiD2Omoże wpływać na szybkość ssHDX we wczesnych punktach czasowych. Nasze wcześniejsze badania wykazały, że sorpcja wilgoci w ssHDX jest zakończona w ciągu kilku godzin i ma minimalny wpływ na kinetykę wymiany po upływie tego czasu. Obserwowana szybkość i zakres wymiany nie są zatem jedynie miarami adsorpcji D2O27,28. Małe słupki błędów na rysunku 3B, wskazujące odchylenia standardowe od trzech niezależnych próbek ssHDX-MS, pokazują, że eksperyment jest wysoce powtarzalny.

Wychwyt deuteru (%) bNszybko ckszybko cNwolno ckwolno c
MbT a15,9 ± 0,513,1 (0,8)0,43 (0,03)11,0 (0,9)0,019 (0,001)
MbS a23,2 ± 0,515,4 (0,7)0,49 (0,04)19,2 (0,6)0,024 (0,002)
% zmiany d46%18%14%75%26%

Tabela 2: Ilościowe miary absorpcji deuteru w badaniach ssHDX preparatów Mb. a Patrz tabela 1, aby zapoznać się ze składem. b Procentowy absorpcja deuteru w stosunku do teoretycznego maksimum przez nienaruszone Mb po 144 godzinach HDX w temperaturze 5 °C, 43% wilgotności względnej (n = 3, średnia ± SD). c Parametry wyznaczone za pomocą regresji nieliniowej danych kinetycznych ssHDX-MS. Przebieg czasowy wymiany deuteru dla nienaruszonego Mb został dopasowany do modelu asocjacji dwuwykładniczej (równanie 2). Wartości w nawiasach są standardowymi błędami parametrów regresji. d Procentowa zmiana pomiarów została obliczona jako 100 x [(wartość z MbS – wartość z MbT) / (wartość z MbT)].

Parametry regresji (Nszybkie, Nwolne, kszybkie i kwolne) dla kinetyki absorpcji deuteru dla MbT i MbS są podane w Tabeli 2. Chociaż wartości Nszybkich i Nwolnych są większe dla MbS niż MbT, różnice w wartościach Nwolnych były większe niż różnice w Nszybkich wartościach. W szczególności wartośćN fast jest tylko o 18% wyższa w MbS niż w MbT, podczas gdy wartośćN slow jest o 75% wyższa w MbS niż w MbT. Sugeruje to, że mniejszepowolne wartości N w MbT mogą być spowodowane większą retencją struktury Mb lub ochroną grup amidowych przez substancje pomocnicze, które są narażone na D2O w MbS. Szczegółowe mechanizmy nie są jednak do końca zrozumiałe. Stałe szybkości (kszybkie i kwolne) dla obu preparatów są bardzo podobne.

Wychwyt deuteru na poziomie peptydu

Po trawieniu pepsyny, zidentyfikowano łącznie 52 peptydy. Do przedstawionej tutaj analizy wykorzystano sześć nienadmiarowych fragmentów odpowiadających 100% sekwencji Mb. Dodatkowe informacje można uzyskać za pomocą nakładających się na siebie fragmentów, o czym informowała nasza grupa wcześniej24. Obliczono procentowy wychwyt deuteru dla każdego peptydu i wykreślono wyniki z próbek ze 144 godzin (ryc. 4A). Kinetyka HDX dla sześciu fragmentów trawiennych wykazała zachowanie dwuwykładnicze (Figura 4B), zgodne z subpopulacjami wodorów amidowych ulegających "szybkiej" i "wolnej" wymianie.

Analiza wychwytu deuteru, wykres słupkowy fragmentów trawiennych, wykres wychwytu kinetycznego, wyniki badań białek.
Rysunek 4: ssHDX-MS dla Mb na poziomie peptydu: (A) Procentowy wychwyt deuteru dla 6 nienadmiarowych fragmentów trawiennych z Mb w preparatach MbT (szary) i MbS (biały) po 144 godzinach HDX. (B) kinetyka ssHDX dla sześciu nienadmiarowych fragmentów trawiennych z Mb w formułach MbT (linia ciągła) i MbS (linia przerywana). Przebieg czasowy ssHDX dopasowano do równania dwufazowej asocjacji wykładniczej za pomocą oprogramowania Graph Pad Prism w wersji 5 (n = 3, ± SD).

Parametry regresji dla peptydów nieredundantnych są przedstawione na rysunku 5. Ponieważ dopasowane stałe szybkości dla fragmentów peptydów nie są średnimi stałymi szybkości dla poszczególnych amidów, obserwowane stałe szybkości dla fragmentów trawiennych nie mogą być liniowo powiązane z tymi dla nienaruszonego białka. WartościN fast dla większości fragmentów trawiennych (z wyjątkiem fragmentu 56-69) w preparatach MbS były nieco większe niż te w MbT (Figura 5A). Podobnie, wartościk fast generalnie wykazywały niewielką różnicę między preparatami i w różnych regionach cząsteczki Mb (ryc. 5B). Jednak wartości Nslow i kslow dla MbS są znacznie większe we wszystkich fragmentach niż dla MbT (Rysunek 5C i 5D). Znaczny wzrost Nslow i kslow dla MbS może odzwierciedlać większą mobilność grup amidowych w "powolnych" pulach wymiany.

Wykres słupkowy fragmentów peptycznych Mb przedstawiający analizę kinetyki Nfast, Kfast, Nslow i Kslow.
Rysunek 5: parametry kinetyczne ssHDX dla peptydów peptycznych Mb: wartości Nfast (A), kfast (B), Nslow (C) i kslow (D) uzyskane z regresji nieliniowej danych kinetycznych ssHDX-MS dla sześciu nieredundantnych peptydów peptydowych z Mb w formulacjach MbT (szary) i MbS (biały) (n = 3, ± SE).

Znakowanie fotolityczne na nienaruszonym poziomie białka

Mb napromieniowane w obecności 20x nadmiaru pLeu utworzyło wiele adduktów Mb-pLeu, co wykryto przez LC-MS (Rysunek 6A). Zdekonwolucyjne widma dla MbT napromieniowanego przez 40 minut 20x pLeu wykazały do 3 znaczników z dodatkiem +115, +230 i +345 Da do masy nieznakowanego Mb. MbS napromieniowane podobnie 20-krotnym pLeu wykazało mniejszy wychwyt pLeu na nienaruszonym poziomie, z maksymalnie 2 znakowanymi populacjami wykrytymi przez LC-MS.

Dane znakowania białek metodą spektrometrii mas, wykresy czasu napromieniania w funkcji znakowanego procentu; Mechanizmy.
Rysunek 6: ssPL-MS dla nienaruszonego Mb: (A) Zdekonwolucyjne widma masowe dla MbT (linia ciągła) i MbS (linia przerywana) oznaczone 20-krotnym nadmiarem (5% w/w) pLeu. Zdekonwolucyjne widmo masowe natywnego Mb (Mb liofilizowane i napromieniowane przy braku pLeu) pokazano jako linię przerywaną. U oznacza populację białka, które pozostaje nieznakowane po napromieniowaniu. Populacje białek zawierających znaczniki 1, 2 i 3 pLeu są reprezentowane odpowiednio jako 1L, 2L i 3L. (B) kinetyka ssPL-MS dla nienaruszonego Mb w formulacjach MbT (zamknięte okręgi) i MbS (otwarte okręgi) w funkcji stężenia pLeu. Wszystkie próbki napromieniano przez 40 minut. Słupki błędów znajdują się w symbolach. (C) kinetyka ssPL-MS dla nienaruszonego Mb w preparatach MbT (zamknięte obiegi) i MbS (otwarte obiegi) liofilizowane i napromieniowane w obecności 100-krotnego nadmiaru pLeu (20,7 % w/w) w funkcji czasu napromieniania. Słupki błędów znajdują się w symbolach.

W badaniach kinetycznych, procent znakowanego białka wzrastał wykładniczo zarówno dla MbT, jak i MbS wraz ze wzrostem czasu napromieniania (Rysunek 6B). MbS wykazywał mniejszy wychwyt pLeu niż MbT w każdym czasie napromieniania. Wydawało się, że obie formuły osiągnęły plateau po 40 minutach. W związku z tym badanie kinetyczne może być przydatne do określenia czasu trwania napromieniowania potrzebnego do uzyskania całkowitej aktywacji pLeu. Badano również kinetykę znakowania w funkcji stężenia pLeu (ryc. 6C). Procent znakowanego białka wzrastał wraz ze stężeniem pLeu zarówno dla MbT, jak i MbS. Jednak przy 20,7% w/w pLeu, MbT wykazał spadek wychwytu pLEU. Może to być spowodowane wykluczeniem pLeu z powierzchni białka przy wysokim stężeniu pLeu. W związku z tym należy przeprowadzić badanie o różnym stężeniu pLeu, aby wybrać odpowiednie stężenie pLeu, które pozwala na wystarczające znakowanie na powierzchni białka bez wykluczania powierzchni. W tym badaniu wybrano 20-krotny nadmiar pLeu do dalszych badań na poziomie peptydu.

Ogólny spadek etykietowania obserwowany dla MbS sugeruje słabą dostępność łańcucha bocznego do matrycy zawierającej pLeu. Jest to zgodne ze zmianą konformacyjną w obecności sorbitolu, która powoduje zmniejszone znakowanie.

Znakowanie fotolityczne na poziomie peptydu

Na podstawie badań nad znakowaniem nienaruszonych białek, wybrano 20x nadmiar pLeu do porównania MbT i MbS na poziomie peptydu. Znakowane próbki trawiono trypsyną i analizowano za pomocą LC-MS. W próbkach MbT i MbS wykryto łącznie 40 peptydów odpowiadających 100% sekwencji MbT i MbS. W niektórych przypadkach trawienie tryptyczne może zapewnić ograniczone pokrycie sekwencji białka, jeśli reszty Lys i/lub Arg są silnie znakowane. Aby poprawić pokrycie sekwencji, do trawienia znakowanego białka można użyć mieszaniny trypsyny i chymotrypsyny.

Schemat struktury białka; oznaczone regiony alfa-helisy; analiza molekularna; Porównanie strukturalne.
Rysunek 7: ssPL-MS dla Mb na poziomie peptydu: Karykaturowa reprezentacja Mb oznaczonego 20-krotnym nadmiarem pLeu (5% w/w) w obecności trehalozy (A) i sorbitolu (B). Wyznakowane białko trawiono trypsyną, a znakowane peptydy mapowano na strukturę krystaliczną Mb (PDB ID 1WLA). Regiony oznaczone i nieoznaczone są odpowiednio kolorami karmazynowymi i zielonymi.

ssPL-MS z trawieniem trypsyny dostarcza jakościowych informacji o znakowanych peptydach. Biorąc pod uwagę różne znakowane populacje na nienaruszonym poziomie, rozwiązły mechanizm znakowania pLeu oraz różnice w wydajności jonizacji znakowanych i nieznakowanych peptydów, trudno jest uzyskać wskaźniki ilościowe dla ssPL-MS po trawieniu. Jednak informacje jakościowe mogą nadal dostarczać informacji na temat zmian konformacyjnych białek na poziomie peptydów. W tym badaniu zarówno preparaty MbT, jak i MbS wykazały wychwyt pLeu na większości powierzchni białka. W porównaniu z MbS, fragmenty peptydu 32-42, 134-139 i 146-153 z MbT wykazywały znakowanie pLeu (Figura 7). Sugeruje to, że łańcuchy boczne tych aminokwasów są wystawione na działanie pLeu, ponieważ helisy w tych regionach są nienaruszone w macierzy MbT. Natomiast ochrona przed znakowaniem pLeu w matrycy MbS jest zgodna z perturbacjami strukturalnymi w tych regionach.

Ogólnie rzecz biorąc, wyniki z ssHDX-MS i ssPL-MS sugerują, że metody te mogą dostarczyć uzupełniających informacji na poziomie peptydów o wysokiej rozdzielczości na temat ekspozycji na szkielet (ssHDX-MS) i łańcuch boczny (ssPL-MS) oraz efektów pomocniczych w liofilizowanych preparatach białkowych.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kilka badań sugerowało, że lokalne środowisko w liofilizowanych próbkach wpływa na degradację białek5,29,30. Jednak ustalenie bezpośredniego związku między strukturą białka a stabilnością w stanie stałym nie było możliwe ze względu na brak metod analitycznych o wysokiej rozdzielczości. Zastosowanie istniejących metod o wysokiej rozdzielczości, takich jak HDX i PL, do liofilizowanych proszków wymaga modyfikacji protokołów roztworów i starannej interpretacji danych. HDX-MS i PL-MS są sukcesywnie wdrażane do monitorowania konformacji białek w stanie stałym. Wyniki przedstawione tutaj i gdzie indziej27,28,31-33 wykazały zdolność tych metod do monitorowania konformacji białek z wysoką rozdzielczością w środowisku stałym. Chociaż krytyczne etapy analizy danych nie różnią się od etykietowania w roztworze34-36, w przypadku etykietowania substancji chemicznych w stanie stałym wymagane są ważne względy podczas konfiguracji eksperymentu i interpretacji danych.

Wybór odczynnika do etykietowania musi opierać się na rozmiarze i mechanizmie etykietowania. Mały rozmiar deuteru pozwala na łatwe sondowanie szkieletu peptydowego, podczas gdy stosunkowo większy rozmiar pLeu ogranicza znakowanie do łańcuchów bocznych. Zarówno ssHDX, jak i ssPL nie wykazują preferencji dla żadnego aminokwasu, więc znakowanie zależy tylko od ekspozycji szkieletu i łańcucha bocznego na matrycę. Aby skutecznie badać konformacje białek w stanie stałym, czynniki zewnętrzne wpływające na proces znakowania muszą być dokładnie kontrolowane. Całkowita ilość i rozkład przestrzenny środka znakującego w liofilizowanych ciałach stałych różni się od roztworów wodnych.

W ssHDX ilość D2O w matrycy stałej może wpływać na szybkość rozwijania się białka (lub częściowego rozwijania), ponownego fałdowania i wymiany deuteru. Inaczej jest w przypadku roztworu HDX, w którym próbka białka jest zwykle rozcieńczana dużą objętościąD2O. Staranne badanie przesiewowe wpływu hydratacji na szybkość ssHDX może pomóc w wyborze idealnych warunków wilgotności względnej. W celu kontrolowania szybkości sorpcji wilgoci i uniknięcia zapadania się proszku w preparatach zawierających higroskopijne substancje pomocnicze (np. sacharozę i trehalozę), ssHDX można przeprowadzać w warunkach chłodniczych (2-8 °C). Nasze poprzednie badanie dotyczące efektów nawodnienia wykazało zwiększoną szybkość i zakres wymiany wraz ze wzrostem zawartości wilgoci, zgodnie z oczekiwaniami. W większości naszych prac pośrednia wilgotność względna wynosząca 43% w temperaturze 5 °C okazała się idealna do rozróżniania preparatów w rozsądnym czasie24. Reakcja jest zwykle przeprowadzana do momentu osiągnięcia plateau. Gwarantuje to, że sorpcja i dyfuzja wilgoci do ciała stałego nie kontrolują szybkości HDX. Zastosowanie próbek o małych rozmiarach ciał stałych o objętości wstępnej liofilizacji wynoszącej ≤2 ml pomaga również zapewnić, że sorpcja parD2Ojest zasadniczo zakończona na wczesnym etapie wymiany. Chociaż ssHDX-MS dostarcza ilościowych informacji na temat konformacji białka w stanie stałym, istnieją pewne warunki, w których interpretacja danych nie może być całkowicie oparta na samym badaniu ssHDX. Możliwe jest, że zmniejszony wychwyt deuteru obserwowany w próbce (w porównaniu z kontrolą) może być spowodowany większą retencją struktury białka lub znaczną ilością agregatów białkowych obecnych w próbce. W takim przypadku interpretacja danych ssHDX wymaga wyników z innych metod uzupełniających. Poszerzenie pików w deuterowanych widmach masowych zaobserwowano dla kilku preparatów Mb27,28. Może to być spowodowane różnymi czynnikami, takimi jak obecność częściowo sfałdowanej populacji białka, niejednorodność przestrzenna w próbce lub gradienty przestrzenne w stężeniuD2O. Jednak czynniki te nie zostały wyróżnione w ssHDX-MS i wymagają dalszych badań.

Ponieważ ssPL-MS jest stosunkowo nowy w porównaniu z innymi metodami, wymagane jest ciągłe poznawanie jego zastosowań i ograniczeń. W ssPL foto-sieciownik jest liofilizowany z białkiem. Brak wilgoci ogranicza ruchliwość komponentów w osnowie stałej, a częściowe rozluźnienie strukturalne, które może wystąpić przy sorpcji wilgoci w ssHDX, nie jest zjawiskiem w ssPL. Ogranicza to znakowanie w ssPL do bezpośredniego sąsiedztwa foto-sieciownika. Jednak w przeciwieństwie do HDX-MS, analiza MS/MS kowalencyjnie znakowanego białka może dostarczyć informacji strukturalnych na poziomie reszt. Ponieważ znakowanie ssPL jest kowalencyjne i nieodwracalne, nie dochodzi do wymiany zwrotnej, a próbki mogą być przygotowywane i analizowane bez obawy o utratę etykiety. Aby ułatwić dyfuzję środka etykietującego i poprawić wydajność etykietowania w matrycy stałej, ssPL może być wykonywany z rosnącym % wilgotności względnej. Wychwyt pLeu można również poprawić poprzez zwiększenie stężenia czynnika fotoreaktywnego. Stosunek molowy białka do pLeu można dowolnie zmieniać. Ogólnie rzecz biorąc, 100-krotny molowy nadmiar pLeu w stosunku do białka zapewni odpowiednie znakowanie. Jednak wysokie stężenie pLeu może powodować utratę trzeciorzędowej struktury białka w matrycy stałej. W związku z tym, oprócz kinetyki znakowania i składu preparatu, wybór stężenia pLeu musi również opierać się na utrzymaniu integralności strukturalnej białka. Ponieważ pLeu nieselektywnie znakuje grupę X-H (gdzie X = C, N, O), możliwe jest, że substancje pomocnicze o podobnych miejscach znakowania mogą znacznie wpływać na poziom znakowania białka. Wpływ substancji pomocniczych na dostępność pLeu do znakowania białek nie został jeszcze scharakteryzowany. Wiadomo, że karben powstający w wyniku aktywacji diazyryny nie jest specyficzny dla reszt, jednak jedno z badań wskazuje na stronniczość w kierunku Asp i Glu36. Chociaż dobrze jest dowiedzieć się o interakcjach specyficznych dla pozostałości, informacje na poziomie peptydów są również przydatne i mogą być wykorzystane do projektowania substancji pomocniczych do blokowania regionów o wysokiej ekspozycji na matrycę w stanie stałym. ssPL-MS dostarcza szczegółowych informacji jakościowych, jednak konieczne jest uzyskanie danych ilościowych i opracowanie solidnych wskaźników w celu analizy różnic w recepturach w różnych systemach liofilizowanych.

Zastosowanie znacznika specyficznego dla reszty w połączeniu z analizą MS/MS może jeszcze bardziej zwiększyć rozdzielczość do poziomu aminokwasów. Odczynniki do znakowania, takie jak 2,3-butanodion do znakowania Arg, pochodne N-hydroksysukcynimidu dla Lys i pochodne N-alkilomaleimidu dla Cys, mogą być stosowane do precyzyjnego mapowania interakcji molekularnych w liofilizowanym proszku. Jednak odczynniki te są zależne od pH, a reakcje mogą nie być tak dobrze kontrolowane, jak znakowanie fotolityczne w stanie stałym. Alternatywnym podejściem jest włączenie foto-sieciera do sekwencji białka za pomocą auksotroficznych linii komórkowych, mutagenezy ukierunkowanej na miejsce lub derywatyzacji łańcucha bocznego.

Nasze poprzednie badania ssHDX-MS i ssPL-MS wykazały, że znakowanie białka zależy od charakteru i ilości użytych substancji pomocniczych24,27,28,31-33,37,38. ssHDX-MS Mb koliofilizowany chlorowodorkiem guanidyny (Gdn.HCl) wykazywał większy wychwyt deuteru niż Mb koliofilizowany z cukrami o niskiej masie cząsteczkowej32. W oddzielnym badaniu ssPL-MS Mb koliofilizowany z Gdn.HCl wykazał większą ochronę przed znakowaniem fotolitycznym niż Mb z sacharozą33. Co więcej, pomiary ilościowe z ssHDX-MS były silnie skorelowane ze stabilnością białka podczas długotrwałego przechowywania28. Badania te sugerują, że ssHDX lub ssPL białka odzwierciedla zakres strukturalnej retencji białka w liofilizowanym proszku. Uważamy, że zachowanie struktury drugorzędowej w liofilizowanych proszkach zapewnia korzystne środowisko do znakowania łańcucha bocznego za pomocą pLeu i ochrony wodoru amidowego przed wymianą deuteru. Jednak w przyszłości konieczne jest szczegółowe porównanie treści informacyjnych z tych metod. Chociaż ustalenie użyteczności ssHDX-MS i ssPL-MS jako narzędzia do badań przesiewowych preparatów będzie ostatecznie wymagało zastosowania ich do wielu białek, wyniki naszych ostatnich badań potwierdzają ich szersze zastosowanie. Oczekuje się, że wraz z dalszym rozwojem metody te będą szeroko przydatne do charakteryzowania preparatów białek w stanie stałym w przemyśle biofarmaceutycznym.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy dziękują za wsparcie finansowe od NIH R01 GM085293 (PI: E. M. Topp) oraz od College of Pharmacy na Purdue University.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Mioglobina koniSigma-AldrichM0630-5G
D-(+)-trehaloza dwuwodnaSigma Aldrich#T9531
D-SorbitolSigma Aldrich#240850
L-Photo-leucineThermo Scientific#22610
Fosforan potasu jednozasadowySigma-Aldrich#P0662
Potas dwuzasadowy fosforanSigma-Aldrich#P3786
Tlenek deuteruCambridge Isotope Laboratories#DLM-4-PKAlternatywa (Kat. Nr: 151882, Sigma-Aldrich)
Immobilizowana pepsynaApplied Biosystems#2-3132-00
TrypsynaPromega#V511AChymotrypsyna (Kat. Nr: #V1062, Promega) może być dodatkowo stosowany
Woda, klasa Optima LC/MSFisher Chemical#7732-18-5
AcetonitrylSigma-Aldrich#34998
Kwas mrówkowyThermo Scientific#28905
ESI-TOF CalibrantAgilent Technologies#G1969-85000Wysoce łatwopalna ciecz
Mikropułapka białkowaMichrom BioresourcesTR1/25108/03
Mikropułapka peptydowaMichrom BioresourcesTR1/25109/02
Kolumnaanalityczna Agilent TechnologiesZorbax 300SB-C18
LiofilizatorVirTis AdVantage Plus
Stratalinker wyposażony w pięć lamp 365 nmStratagene Corp.Stratalinker 2400
HPLCAgilent Technologies1200 series LCChłodzony system LC dla HDX-MS
ESI-qTOF MSAgilent Technologies6520 qTOF
HDExaminer (oprogramowanie do analizy danych HDX-MS)Sierra Analyticshttp://www.massspec.com/HDExaminer.html

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Lawrence, S. Billion dollar babies--biotech drugs as blockbusters. Nat. Biotechnol. 25 (4), 380-382 (2007).
  2. Global Markets and Manufacturing Technologies for Protein Drugs. , BCC Research. BIO021D(2013).
  3. Lai, M. C., Topp, E. M. Solid-state chemical stability of proteins and peptides. J. Pharm. Sci. 88 (5), 489-500 (1999).
  4. Carpenter, J. F., Pikal, M. J., Chang, B. S., Randolph, T. W. Rational design of stable lyophilized protein formulations: some practical advice. Pharm. Res. 14 (8), 969-975 (1997).
  5. Carpenter, J. F., Chang, B. S., Garzon-Rodriguez, W., Randolph, T. W. Rational design of stable lyophilized protein formulations: theory and practice. Pharm. Biotechnol. 13, 109-133 (2002).
  6. Wüthrich, K. Protein structure determination in solution by NMR spectroscopy. J. Biol. Chem. 265 (36), 22059-22062 (1990).
  7. Ilari, A., Savino, C. Protein structure determination by x-ray crystallography. Methods. Mol. Biol. 452, 63-87 (2008).
  8. Brunger, A. T. X-ray crystallography and NMR reveal complementary views of structure and dynamics. Nat. Struct. Biol. 4, 862-865 (1997).
  9. Yu, L. Amorphous pharmaceutical solids: preparation, characterization and stabilization. Adv Drug. Deliv. Rev. 48 (1), 27-42 (2001).
  10. Manning, M. C. Use of infrared spectroscopy to monitor protein structure and stability. Expert. Rev. Proteomics. 2 (5), 731-743 (2005).
  11. Grohganz, H., Gildemyn, D., Skibsted, E., Flink, J. M., Rantanen, J. Rapid solid-state analysis of freeze-dried protein formulations using NIR and Raman spectroscopies. J. Pharm. Sci. 100 (7), 2871-2875 (2011).
  12. Bai, S., Nayar, R., Carpenter, J. F., Manning, M. C. Noninvasive determination of protein conformation in the solid state using near infrared (NIR) spectroscopy. J. Pharm. Sci. 94 (9), 2030-2038 (2005).
  13. Pikal, M. J., et al. Solid state chemistry of proteins: II. The correlation of storage stability of freeze-dried human growth hormone (hGH) with structure and dynamics in the glassy solid. J. Pharm. Sci. 97 (12), 5106-5121 (2008).
  14. Wang, B., Tchessalov, S., Cicerone, M. T., Warne, N. W., Pikal, M. J. Impact of sucrose level on storage stability of proteins in freeze-dried solids: II. Correlation of aggregation rate with protein structure and molecular mobility. J. Pharm. Sci. 98 (9), 3145-3166 (2009).
  15. Schule, S., Friess, W., Bechtold-Peters, K., Garidel, P. Conformational analysis of protein secondary structure during spray-drying of antibody/mannitol formulations. Eur. J. Pharm. Biopharm. 65 (1), 1-9 (2007).
  16. Baerga-Ortiz, A., Hughes, C. A., Mandell, J. G., Komives, E. A. Epitope mapping of a monoclonal antibody against human thrombin by H/D-exchange mass spectrometry reveals selection of a diverse sequence in a highly conserved protein. Protein. Sci. 11 (6), 1300-1308 (2002).
  17. Coales, S. J., Tuske, S. J., Tomasso, J. C., Hamuro, Y. Epitope mapping by amide hydrogen/deuterium exchange coupled with immobilization of antibody, on-line proteolysis, liquid chromatography and mass spectrometry. Rapid. Commun. Mass. Spectrom. 23 (5), 639-647 (2009).
  18. Pacholarz, K. J., Garlish, R. A., Taylor, R. J., Barran, P. E. Mass spectrometry based tools to investigate protein-ligand interactions for drug discovery. Chem. Soc. Rev. 41 (11), 4335-4355 (2012).
  19. Houde, D., Peng, Y., Berkowitz, S. A., Engen, J. R. Post-translational modifications differentially affect IgG1 conformation and receptor binding. Mol. Cell. Proteomics. 9 (8), 1716-1728 (2010).
  20. Houde, D., Berkowitz, S. A., Engen, J. R. The utility of hydrogen/deuterium exchange mass spectrometry in biopharmaceutical comparability studies. J. Pharm. Sci. 100 (6), 2071-2086 (2011).
  21. Dorman, G., Prestwich, G. D. Using photolabile ligands in drug discovery and development. Trends. Biotechnol. 18 (2), 64-77 (2000).
  22. Robinette, D., Neamati, N., Tomer, K. B., Borchers, C. H. Photoaffinity labeling combined with mass spectrometric approaches as a tool for structural proteomics. Expert. Rev. Proteomics. 3 (4), 399-408 (2006).
  23. Greenspan, L. Humidity fixed points of binary saturated aqueous solutions. Journal of Research of the National Bureau of Standards. 81A (1), 8(1977).
  24. Sophocleous, A. M., Zhang, J., Topp, E. M. Localized hydration in lyophilized myoglobin by hydrogen-deuterium exchange mass spectrometry. 1. Exchange mapping. Mol. Pharm. 9 (4), 718-726 (2012).
  25. Keppel, T. R., Jacques, M. E., Young, R. W., Ratzlaff, K. L., Weis, D. D. An efficient and inexpensive refrigerated LC system for H/D exchange mass spectrometry. J. Am. Soc. Mass. Spectrom. 22 (8), 1472-1476 (2011).
  26. Gasteiger, E., et al. ExPASy: The proteomics server for in-depth protein knowledge and analysis. Nucleic. Acids. Res. 31 (13), 3784-3788 (2003).
  27. Sophocleous, A. M., Topp, E. M. Localized hydration in lyophilized myoglobin by hydrogen-deuterium exchange mass spectrometry. 2. Exchange kinetics. Mol. Pharm. 9 (4), 727-733 (2012).
  28. Moorthy, B. S., Schultz, S. G., Kim, S. G., Topp, E. M. Predicting Protein Aggregation during Storage in Lyophilized Solids Using Solid State Amide Hydrogen/Deuterium Exchange with Mass Spectrometric Analysis (ssHDX-MS). Mol. Pharm. 11 (6), 1869-1879 (2014).
  29. Wang, W. Lyophilization and development of solid protein pharmaceuticals. Int. J. Pharm. 203 (1-2), 1-60 (2000).
  30. Sarciaux, J. M., Mansour, S., Hageman, M. J., Nail, S. L. Effects of buffer composition and processing conditions on aggregation of bovine IgG during freeze-drying. J. Pharm. Sci. 88 (12), 1354-1361 (1999).
  31. Li, Y., Williams, T. D., Schowen, R. L., Topp, E. M. Characterizing protein structure in amorphous solids using hydrogen/deuterium exchange with mass spectrometry. Anal. Biochem. 366 (1), 18-28 (2007).
  32. Sinha, S., Li, Y., Williams, T. D., Topp, E. M. Protein conformation in amorphous solids by FTIR and by hydrogen/deuterium exchange with mass spectrometry. Biophys. J. 95 (12), 5951-5961 (2008).
  33. Iyer, L. K., Moorthy, B. S., Topp, E. M. Photolytic labeling to probe molecular interactions in lyophilized powders. Mol. Pharm. 10 (12), 4629-4639 (2013).
  34. Hentze, N., Mayer, M. P. Analyzing protein dynamics using hydrogen exchange mass spectrometry. J. Vis. Exp. (81), e50839(2013).
  35. Kaltashov, I. A., Bobst, C. E., Abzalimov, R. R. H/D exchange and mass spectrometry in the studies of protein conformation and dynamics: is there a need for a top-down approach. Anal. Chem. 81 (19), 7892-7899 (2009).
  36. Jumper, C. C., Schriemer, D. C. Mass spectrometry of laser-initiated carbene reactions for protein topographic analysis. Anal. Chem. 83 (8), 2913-2920 (2011).
  37. Li, Y., Williams, T. D., Topp, E. M. Effects of excipients on protein conformation in lyophilized solids by hydrogen/deuterium exchange mass spectrometry. Pharm. Res. 25 (2), 259-267 (2008).
  38. Li, Y., Williams, T. D., Schowen, R. L., Topp, E. M. Trehalose and calcium exert site-specific effects on calmodulin conformation in amorphous solids. Biotechnol. Bioeng. 97 (6), 1650-1653 (2007).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Spektrometria maswymiana wodoru na deuterznakowanie fotolityczneliofilizowane bia koanaliza struktury bia ekHDX w stanie sta ymznakowanie a cuch w bocznychrozdzielczo na poziomie peptyd wformulacja mioglobinywp yw substancji pomocniczych

Powiązane artykuły