Eksperymentalna ocena towarzyskości myszy przy użyciu podejścia do zautomatyzowanego przetwarzania obrazu

Podsumowanie

Ten protokół opisuje metodę ilościowego określania towarzyskości myszy. Myszy są filmowane, gdy poruszają się i wchodzą w interakcje w specjalnej klatce. Przetwarzanie filmów pozwala na zautomatyzowaną kwantyfikację towarzyskości z doskonałą dokładnością i niezawodnością.

Streszczenie

Myszy są preferowanym organizmem modelowym do testowania leków zaprojektowanych w celu zwiększenia socjalizacji. Przedstawiamy metodę ilościowego pomiaru socjalizacji myszy, w której mysz testową umieszcza się w zestandaryzowanym aparacie, a odpowiednie zachowania ocenia się w trzech różnych sesjach (nazwanych sesją I, II i III).

Aparat składa się z trzech przedziałów (patrz Rycina 1); w przedziałach lewym i prawym znajduje się odwrócony kubek, w którym może przebywać mysz (tzw. „mysz bodziec”).

W sesji I mysz testowa zostaje umieszczona w klatce, a jej mobilność jest określana przez liczbę przejść między przedziałami. W sesji II mysz bodźcowa zostaje umieszczona pod jednym z odwróconych kubków, a socjalność myszy testowej jest kwantyfikowana poprzez pomiar czasu spędzonego w pobliżu kubka zawierającego zamkniętą mysz bodźcową vs. pustego odwróconego kubka. W sesji III odwrócone kubki zostają usunięte, a obie myszy wchodzą w swobodną interakcję. Socjalność myszy testowej w sesji III jest kwantyfikowana przez liczbę podejść społecznych skierowanych do myszy bodźcowej oraz liczbę sytuacji, w których mysz testowa unika podejścia społecznego ze strony myszy bodźcowej.

Zautomatyzowana ocena nagrania wykrywa nos myszy testowej, co pozwala na określenie wszystkich opisanych miar socjalizacji w sesji I i II (w sesji III podejścia są identyfikowane automatycznie, ale klasyfikowane ręcznie). Aby zlokalizować nos, z każdej klatki filmu cyfrowo odejmowany jest obraz pustej klatki, a otrzymany obraz jest binaryzowany w celu zidentyfikowania pikseli myszy. Ogon myszy jest usuwany automatycznie, a następnie wyznacza się dwa najbardziej oddalone od siebie punkty pozostałej sylwetki myszy; znajdują się one w pobliżu nosa i nasady ogona. Nos jest identyfikowany poprzez analizę ruchu myszy oraz z zastosowaniem argumentów ciągłości.

Rycina 1. Ocena socjalizacji podczas 3 sesji. Sesja I (góra): Aklimatyzacja myszy testowej do klatki. Sesja II (środek): Myszy testowa poruszająca się swobodnie w klatce, podczas gdy mysz bodziec jest zamknięta w odwróconym kubku. Sesja III (dół): Zarówno myszy testowej, jak i myszy bodziec pozwolono na swobodne poruszanie się i interakcję ze sobą.

Wprowadzenie

Upośledzona towarzyskość jest jedną z głównych domen objawów w wielu zaburzeniach neurorozwojowych, w tym w zaburzeniach ze spektrum autyzmu (ASD)^1,2. Poważnie ogranicza zdolność pacjentów do nawiązywania relacji i ma ogromny wpływ na pacjentów, ich rodziny i opiekunów^2,3.

W celu lepszego zrozumienia mechanizmu leżącego u podstaw upośledzonej towarzyskości i opracowania metod leczenia, przebadano kilka modeli mysich^1,4–9. Jednym z takich szczepów jest mysz BALB/c, szczep wsobny, który wykazuje uderzająco niską towarzyskość, przypominającą cechy obserwowane u pacjentów z ASD5^8-12. Na przykład mysz BALB/c wykazuje niższą częstotliwość podejść społecznych i zwykle negatywną reakcję na podejścia społeczne ze strony myszy bodźcowej (np. unikanie społeczne) niż szwajcarski szczep porównawczy Webstera¹⁰.

Aby sprawdzić, czy proponowana terapia jest skuteczna w zwiększaniu towarzyskości, potrzebne są obiektywne środki. Powszechnie akceptowanym modelem jest analiza towarzyskości w znormalizowanym aparacie, który ma trzy komory (patrz rysunek 1).

Lewa i prawa komora zawierają odwrócony druciany kubek, w którym znajduje się społecznie istotna mysz stymulacyjna. Mysz testową wprowadza się do aparatury na trzy interwały po 10 minut (sesje I-III); sesja I ocenia aktywność lokomotoryczną myszy testowej, podczas gdy sesje II i III oceniają różne aspekty towarzyskości myszy testowej.

W sesji I, mysz testowa może się zaaklimatyzować w urządzeniu. W tej sesji mierzona jest liczba przejść, które mysz testowa wykonuje między różnymi przedziałami. Co ważne, miary towarzyskości uzyskane w standardowym aparacie trójkomorowym są zależne od aktywności lokomotorycznej, a zmniejszona aktywność lokomotoryczna może zakłócić interpretację danych dotyczących towarzyskości.

W sesji II, mysz testowa porusza się swobodnie, a mysz bodźcowa jest umieszczana pod jednym z odwróconych kubków (z przeciwwagą). Myszy bodźcowe to 4-tygodniowe niekrewniacze samce myszy ICR, dopasowane pod względem wieku i płci do myszy testowych. Mysz bodźcowa jest zamknięta w odwróconym kubku po stronie wyznaczonej jako przedział społeczny, a pusta odwrócona filiżanka jest umieszczana po stronie wyznaczonej jako przegródka niespołeczna. W sesji II towarzyskość myszy testowej jest określana ilościowo poprzez porównanie czasu, jaki spędza w pobliżu "społecznego" odwróconego kubka (mniej niż 2 cm dalej) z czasem, który spędza w pobliżu "niespołecznego" odwróconego kubka, oraz przez czas, jaki spędza w przedziale społecznym z czasem, który spędza w przedziale niespołecznym. Szwajcarskie myszy porównawcze Webstera spędzają znacznie więcej czasu w przedziale społecznym i w pobliżu odwróconego kubka społecznego w porównaniu z myszami BALB/c, które nie wykazują znaczącej preferencji dla społecznego odwróconego kubka lub przedziału społecznego¹².

W sesji III, myszy testowe i stymulujące mogą swobodnie wchodzić w interakcje (odwrócone kubki są usuwane). Miary towarzyskości, zachowań stereotypowych i przejść między przedziałami są wiarygodnie uzyskiwane w trzeciej 10-minutowej sesji swobodnej interakcji między myszami testowymi i bodźcami i analizowane. W tym raporcie towarzyskość myszy testowej jest określana ilościowo za pomocą dwóch miar: 1) liczby podejść społecznych, które wykonuje w stosunku do myszy bodźcowej, przy czym podejście społeczne definiuje się jako poruszanie się do przodu (najpierw nosem) w kierunku myszy bodźcowej, tak że nos znajduje się w odległości mniejszej niż 2 cm od myszy bodźcowej; 2) liczba unikań podejść społecznych przez mysz bodźcową. Uważa się, że mysz testowa unika podejścia, jeśli odwróci się lub odsunie od myszy bodźcowej, lub jeśli tymczasowo przestanie się poruszać ("zachowanie zamrażające") po zbliżeniu się myszy bodźcowej do myszy testowej. Myszy BALB / c wykazują spadek liczby podejść społecznych dokonywanych w stosunku do myszy bodźcowej i wzrost liczby negatywnych reakcji na podejścia społeczne przez mysz bodźcową, w porównaniu ze szwajcarskim szczepem porównawczym Webster¹⁰.

Ocena filmów behawioralnych była tradycyjnie wykonywana ręcznie, tj. poprzez uważne oglądanie filmu (możliwie ze zmniejszoną prędkością) i aktywowanie stoperów na czas, który mysz spędza w określonej komorze lub w pobliżu jednego z odwróconych kubków¹⁰. Metoda ta wymaga wielokrotnego oglądania filmu i dlatego jest bardzo czasochłonna. Dokładność jest również ograniczona czasem reakcji oceniającego na pomiary stopera i zdolnością do postrzegania, czy mysz znajduje się w odległości nie większej niż 2 cm od odwróconego kubka. W ostatnich pracach dwa związki (D-seryna i D-cykloseryna) okazały się skuteczne w przywracaniu towarzyskości u myszy BALB/c^9,10,12. Wiadomo, że oba składniki modulują receptor NMDA, o którym wiadomo, że odgrywa kluczową rolę w zachowaniach społecznych^2,12. Wiadomo, że szeroka gama związków moduluje aktywność receptora NMDA na różne, dobrze zdefiniowane sposoby, a potencjał przełomu w leczeniu ASD sprawia, że przyspieszona ocena tych związków jest priorytetem i szybką automatyczną metodą oceny, która jest wysoce pożądana.

Opisana poniżej jest automatyczna procedura analizy opracowana do oceny towarzyskości myszy. Wykorzystuje metody przetwarzania obrazu we wszystkich klatkach filmów myszy w celu zidentyfikowania pozycji myszy lub myszy. W sesjach I i II dodatkowo wykrywa pozycję nosa i wykorzystuje ją do obliczania miar towarzyskości. W sesji III automatycznie wykrywa wszystkie podejścia, ale wymagana jest ręczna klasyfikacja (podejście społeczne, unikanie społeczne lub inne).

Protokół

W celu ułatwienia wyjaśnień protokół został podzielony na 2 części: 1) Procedura eksperymentalna oraz 2) Analiza automatyczna. Wszystkie zwierzęta były traktowane zgodnie z Guide for the Care and Use of Laboratory Animals¹⁵, a wszystkie procedury zostały zatwierdzone przez Institutional Animal Care and Use Committee.

1. Procedura eksperymentalna

1. Przygotuj klatkę, która stanowi czarne, nierefleksyjne prostokątne pudełko z pleksiglasu (52 x 25 x 23 cm³) podzielone na trzy przedziały: społeczny, niespołeczny oraz neutralny przedział środkowy (Rysunek 1). W każdym z końcowych przedziałów umieść odwrócone druciane kubki podczas sesji I i II (omówionych poniżej) i umieść w nich mysz bodziec podczas sesji II.
2. Ustaw kamerę w taki sposób, aby klatka wypełniała pole widzenia. Ponieważ oświetlenie może wpływać na zachowanie myszy, należy utrzymać natężenie oświetlenia wewnątrz klatki na poziomie nieprzekraczającym 3,5 lux, pochodzącego z pośredniego światła żarówki żarowej i mierzonego na dnie klatki w kierunku górnym. Należy również użyć źródła światła podczerwonego, którego myszy nie wyczuwają, ale które jest wykrywane przez kamerę. Wszystkie filmy należy nagrywać w standardowej rozdzielczości 720 x 480.
3. Zarejestruj pojedynczą klatkę pustej klatki do późniejszego przetwarzania obrazu (tzw. „klatka referencyjna”) i zapisz ją jako obraz w skali szarości.
4. Sesja I: Wprowadź mysz badaną do klatki i pomachaj ręką nad klatką, sygnalizując rozpoczęcie sesji (por. Analiza automatyczna). Nagrywaj film przez 10 min. Po upływie 10 min umieść mysz z powrotem w jej oryginalnej klatce.
5. Sesja II: Umieść mysz bodziec pod jednym z odwróconych kubków (z zastosowaniem przeciwwagi).
6. Użyj przycisku „Social left” (Społeczny lewy) lub „Social right” (Społeczny prawy), aby wybrać, czy mysz bodziec znajduje się w odwróconym kubku po lewej, czy po prawej stronie.
   UWAGA: Odwrócony kubek z myszą bodziec nazywany jest „kubkiem społecznym”, natomiast drugi kubek „kubkiem niespołecznym”. Przedział, w którym znajduje się kubek społeczny, nazywany jest przedziałem społecznym, przedział z kubkiem niespołecznym to przedział niespołeczny, a przedział środkowy to „przedział neutralny”.
7. Wprowadź mysz badaną do klatki. Pomachaj ręką nad klatką, aby zasygnalizować rozpoczęcie sesji. Nagrywaj film przez 10 min. Ważne jest, aby utrzymać myszy w aparaturze do badania socjalizacji przed usunięciem odwróconych kubków w celu rozpoczęcia sesji III.
8. Sesja III: Usuń odwrócone kubki, wypuść obie myszy i pozwól myszy badanej oraz myszy bodziec na swobodną interakcję. Pomachaj ręką nad klatką, aby zasygnalizować rozpoczęcie sesji. Nagrywaj film przez 10 min. Po upływie 10 min umieść obie myszy z powrotem w ich odpowiednich klatkach.

2. Analiza zautomatyzowana

UWAGA: Polecenia w sekcji 2 są wydawane za pośrednictwem graficznego interfejsu użytkownika (patrz Rysunek 2), który steruje naszym oprogramowaniem. Poniżej wyjaśniamy krok po kroku procesy możliwe do przeprowadzenia w naszym oprogramowaniu; program ten umożliwia również przeprowadzenie analizy w trybie wsadowym bez ingerencji użytkownika.

1. Dla każdego filmu wykonaj następujące kroki przetwarzania:
   1. Wczytaj film (kliknij przycisk Load).
   2. Wybierz konfigurację klatki, która informuje program analityczny o położeniu granic klatki, granic przedziałów oraz lokalizacji kubków. Wybierz jedną z czterech zapisanych konfiguracji lub ręcznie dostosuj wszystkie współrzędne.
      UWAGA: Konfiguracja zazwyczaj nie zmienia się między kolejnymi eksperymentami, dlatego może zostać wykorzystana ponownie.
   3. Dla każdej klatki filmu wykonaj następujące kroki przetwarzania (2.1.3.1-2.1.3.6).
      1. Konwertuj klatkę na skalę szarości, klikając przycisk „Grayscale”.
      2. Odejmij cyfrowo referencyjną klatkę w skali szarości (patrz krok 1.3), klikając przycisk „Subtract”. UWAGA: Celem tego kroku jest sprawienie, aby wartości pikseli klatki były bardzo bliskie zeru wszędzie poza pozycją myszy.
      3. Zbinaryzuj klatkę, ustawiając wszystkie piksele poniżej określonego poziomu progu na czarne, a wszystkie piksele powyżej tego poziomu na białe (kliknij przycisk „Binarize”).
         Uwaga: Założeniem jest to, że ponieważ piksele myszy mają zazwyczaj wyższe wartości niż pozostałe piksele, piksele myszy staną się białe, a wszystkie pozostałe czarne. Optymalny poziom progu zależy od warunków oświetlenia i można go określić, oceniając kształt myszy w całym filmie. Jeśli próg zostanie wybrany zbyt nisko, mysz wydaje się zbyt duża i piksele, które nie należą do myszy, mogą zostać pokolorowane na biało. Jeśli próg jest zbyt wysoki, mysz staje się mała i może rozpaść się na niepołączone fragmenty. W nagranych filmach optymalny próg zawsze mieścił się w zakresie od 20 do 35 (w skali od 0 do 255).
      4. Wykonaj erozję¹³ zbinaryzowanego obrazu e razy, następnie dylatację¹³ 2e razy, a potem ponownie erozję e razy, naciskając przycisk „Erod/Dil”.
         Uwaga: Celem tej procedury jest usunięcie ogona. Dla zastosowanej rozdzielczości (720 x 480) wartość e = 3 sprawdziła się we wszystkich przypadkach.
         Uwaga: Oprogramowanie automatycznie sprawdza obecność dłoni na obrazie (podczas nagrywania filmów dłonie są przesuwane przez kadr, aby zasygnalizować początek sesji). Jeśli dłoń jest obecna, w zbinaryzowanej klatce pojawi się nietypowo duża liczba białych pikseli, ponieważ dłoń jest znacznie większa od myszy. Warunkiem stwierdzenia obecności dłoni jest wystąpienie ponad 10 000 białych pikseli w zbinaryzowanej klatce. Oprogramowanie wyznacza początki sesji I, II i III poprzez wykrywanie zakresu klatek, w których występują ruchy dłoni.
2. W sesjach I i II kontynuuj w następujący sposób:
   1. Wykryj największą spójną składową zbioru białych pikseli (kliknij „LComp”). Uwaga: Celem tego kroku jest wyeliminowanie białych pikseli, które nie należą do myszy, np. tych spowodowanych ruchem myszy bodźca w sesji II. Największa spójna składowa w prawie wszystkich klatkach jest myszą.
   2. Wyznacz dwa najbardziej oddalone od siebie białe piksele (nazywane „końcami” myszy), klikając „Find Ends”.
      Uwaga: Oprogramowanie ustala ciągłość tych dwóch końców, tj. przypisuje każdy z końców w pierwszej klatce do odpowiedniego końca w klatkach następnych. Ogólna zasada polega na tym, że ponieważ klatki są rejestrowane z wysoką częstotliwością, końce nie mogą przemieścić się daleko między jedną klatką a drugą, zatem prawidłowa kontynuacja końców z jednej klatki do następnej jest taka, która minimalizuje sumę odległości, o jakie przemieściły się końce. Więcej szczegółów znajduje się w sekcji Discussion.
   3. Określ, który koniec myszy jest nosem.
      1. Wyznacz kierunek, w którym porusza się mysz, obserwując, jak zmienia się środek ciężkości (COG) z klatki na klatkę (ruch COG jest ruchem sumy wszystkich pikseli myszy).
         Uwaga: Środek ciężkości (COG) zbioru pikseli p₁, ... , p_n o współrzędnych x₁, .. , x_n jest definiowany przez:
         
         Myszy zazwyczaj poruszają się naprzód (tj. w kierunku nosa). W sekcji obejmującej kilkaset klatek zawsze istnieje bardzo wysoka pewność co do wykrycia głowy/ogona.
         Uwaga: Oprogramowanie automatycznie określa, w stronę którego z wykrytych końców porusza się mysz; koniec ten jest identyfikowany jako nos i zaznaczany czerwonym kółkiem na filmie. Gdy wykryty nos jest zaznaczony czerwonym kółkiem w każdej klatce, użytkownik może sprawdzić jakość detekcji.
3. W sesji III kontynuuj w następujący sposób:
   1. Wykryj dwie największe składowe białych pikseli.
      1. Jeśli obie mają rozmiar akceptowalny dla myszy, a ich środki ciężkości (COG) są zgodne z COG myszy z poprzedniej klatki, uznaj te dwie składowe za dwie myszy.
      2. Uznaj rozmiary myszy za akceptowalne, jeśli nie zmieniły się o więcej niż 20% od poprzedniej klatki, a COG dwóch kolejnych klatek uznaj za zgodne, jeśli ich różnica nie jest większa niż odległość, jaką mysz może pokonać w czasie między klatkami (odległość ta wynika z maksymalnej prędkości myszy, którą można określić w ramach przygotowań do serii eksperymentów poprzez analizę ruchu kilku poszczególnych myszy (jak w sesjach I i II).
         Uwaga: Jeśli dwie największe składowe nie mają rozmiarów akceptowalnych dla myszy lub ich COG zbyt mocno różnią się od tych w poprzedniej klatce, oprogramowanie automatycznie zwiększa próg binarizacji, aż dwie największe składowe osiągną akceptowalny rozmiar, a ich COG będą zgodne z tymi z poprzedniej klatki.
   2. Kliknij mysz testową w pierwszej klatce. Użyj analizy z punktu 2.3.1, aby zidentyfikować zarówno mysz testową, jak i bodziec w każdej klatce sesji III.
   3. Zidentyfikuj klatki w sesji III, w których jedna mysz zbliża się społecznie do drugiej. Uwaga: Oprogramowanie realizuje ten krok poprzez automatyczne sprawdzanie, czy odległość między myszami jest mniejsza niż typowa odległość interakcji myszy (używamy 2 cm).
   4. Gdy oprogramowanie odtworzy dla użytkownika krótki fragment filmu z wykrytym zbliżeniem, kliknij przycisk, aby wskazać, czy zbliżenie to kwalifikuje się jako zbliżenie społeczne myszy testowej, unikanie społeczne myszy testowej, czy żadne z powyższych.
      Uwaga: Krok 2.3.4 może zostać zautomatyzowany, jeśli wiadomo, która mysz jest myszą testową. Ponieważ informacja ta zostaje utracona, gdy myszy znajdą się zbyt blisko siebie (lub wejdą jedna na drugą), a nie znaleźliśmy jeszcze sposobu znakowania myszy, który mógłby być wiarygodnie wykrywany przez nasze oprogramowanie I nie wpływałby na ich zachowanie, na razie powróciliśmy do klasyfikacji ręcznej.
4. Aby ocenić przetworzone filmy, wczytaj film za pomocą przycisku Load.
   1. Kliknij Start Session 1, aby wyświetlić pierwszą klatkę sesji 1 (lub Start Session 2, aby wyświetlić pierwszą klatkę sesji 2).
   2. Kliknij Play/Stop, aby odtworzyć i zatrzymać filmy.
      Uwaga: Przetworzone filmy będą wyświetlać mysz z głową i ogonem zaznaczonymi kółkami o różnych kolorach. Wszystkie miary socjalizacji są wyświetlane na ekranie i aktualizowane w miarę odtwarzania filmu.
   3. Eksportuj dane o socjalizacji w formacie Excel, klikając „Export”.
   4. Kliknij „Compile Data”, aby skompilować wszystkie dane ze wszystkich filmów w folderze do jednego pliku Excel.

Wyniki

Rycina 3 przedstawia kolorową klatkę z filmu behawioralnego z pustą klatką. Mysz nie została jeszcze wprowadzona do klatki. Na obraz nałożono pozycje kubków (społecznych i niespołecznych) oraz granice przedziałów. Kolorowa klatka z pustą klatką zostaje przekonwertowana na 8-bitową skalę szarości, jak pokazano na Rycynie 4, i służy jako klatka referencyjna. Klatka referencyjna jest odejmowana od każdej kolejnej klatki zarejestrowanego filmu.

Rycina 5

Dyskusja

Dzięki połączeniu nagrywania myszy oraz automatycznej analizy filmów stworzyliśmy przystępną cenowo i niezawodną technikę przesiewania wysokoprzepustowego.

Dokładność zautomatyzowanej analizy porównano z wynikami analizy ręcznej dla ponad 100 filmów. W przytłaczającej większości klatek (> 99%) nos myszy został zidentyfikowany z wysoką precyzją. Większość z (nielicznych) błędnych detekcji nie wpływa na miary socjalizacji, dzięki czemu około 80% filmów nie wymaga żadnych korekt.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Klatka z pleksiglasu	Norva Plastics, Norfolk, VA	na zamówienie	Wymiary i układ opisane w rękopisie, można dostosować do potrzeb. Użyj nieodblaskowej pleksi, aby ułatwić przetwarzanie obrazu
Kubki druciane	Kuchnia plus	315	Użyj jednego do domu myszy stymulującej, jednego pustego
Kamera wideo	SONY	HDR-PJ790	Może być zastąpiony przez dowolną kamerę z Porównywalne specyfikacje
OpenCV (biblioteka przetwarzania obrazu)	Willow Garage	N/A	Można użyć dowolnej nowoczesnej biblioteki przetwarzania obrazu .