Eksperymentalna ocena towarzyskości myszy przy użyciu podejścia do zautomatyzowanego przetwarzania obrazu

Podsumowanie

Ten protokół opisuje metodę ilościowego określania towarzyskości myszy. Myszy są filmowane, gdy poruszają się i wchodzą w interakcje w specjalnej klatce. Przetwarzanie filmów pozwala na zautomatyzowaną kwantyfikację towarzyskości z doskonałą dokładnością i niezawodnością.

Streszczenie

Mysz jest preferowanym organizmem modelowym do testowania leków mających na celu zwiększenie towarzyskości. Przedstawiamy metodę ilościowego określania towarzyskości myszy, w której mysz testowa jest umieszczana w standaryzowanym aparacie, a odpowiednie zachowania są oceniane w trzech różnych sesjach (zwanych sesją I, II i III).

Aparat ma trzy komory (patrz Rysunek 1), lewa i prawa komora zawierają odwrócony kubek, który może pomieścić mysz (zwany "mysz bodźcową").

W sesji I, mysz testowa jest umieszczana w klatce, a jej mobilność charakteryzuje się liczbą przejść między przedziałami. W sesji II mysz bodźcowa jest umieszczana pod jednym z odwróconych kubków, a towarzyskość myszy testowej określa się na podstawie czasu, jaki spędza w pobliżu kubka zawierającego zamkniętą mysz bodźcową w porównaniu z pustą odwróconą miseczką. W sesji III odwrócone miseczki są usuwane i obie myszy wchodzą w swobodne interakcje. Towarzyskość myszy testowej w sesji III jest określana ilościowo przez liczbę podejść społecznych, które podejmuje w stosunku do myszy bodźcowej i przez liczbę przypadków, w których unika ona podejścia społecznego przez mysz bodźca.

Automatyczna ocena filmu wykrywa nos myszy testowej, co pozwala na określenie wszystkich opisanych miar towarzyskości w sesji I i II (w sesji III podejścia są identyfikowane automatycznie, ale klasyfikowane ręcznie). Aby znaleźć nos, obraz pustej klatki jest cyfrowo odejmowany od każdej klatki filmu, a wynikowy obraz jest binaryzowany w celu zidentyfikowania pikseli myszy. Ogonek myszy jest automatycznie usuwany i określane są dwa najbardziej odległe punkty pozostałej myszy; Znajdują się one blisko nosa i nasady ogona. Analizując ruch myszy i używając argumentów ciągłości, identyfikuje się nos.

Rysunek 1. Ocena towarzyskości podczas 3 sesji. Sesja I (góra): Aklimatyzacja myszy testowej do klatki. Sesja II (w środku): Przetestuj mysz poruszającą się swobodnie w klatce, podczas gdy mysz bodźcowa jest zamknięta w odwróconym kubku. Sesja III (na dole): Zarówno mysz testowa, jak i mysz bodźcowa mogą się swobodnie poruszać i wchodzić ze sobą w interakcje.

Wprowadzenie

Upośledzona towarzyskość jest jedną z głównych domen objawów w wielu zaburzeniach neurorozwojowych, w tym w zaburzeniach ze spektrum autyzmu (ASD)^1,2. Poważnie ogranicza zdolność pacjentów do nawiązywania relacji i ma ogromny wpływ na pacjentów, ich rodziny i opiekunów^2,3.

W celu lepszego zrozumienia mechanizmu leżącego u podstaw upośledzonej towarzyskości i opracowania metod leczenia, przebadano kilka modeli mysich^1,4–9. Jednym z takich szczepów jest mysz BALB/c, szczep wsobny, który wykazuje uderzająco niską towarzyskość, przypominającą cechy obserwowane u pacjentów z ASD5^8-12. Na przykład mysz BALB/c wykazuje niższą częstotliwość podejść społecznych i zwykle negatywną reakcję na podejścia społeczne ze strony myszy bodźcowej (np. unikanie społeczne) niż szwajcarski szczep porównawczy Webstera¹⁰.

Aby sprawdzić, czy proponowana terapia jest skuteczna w zwiększaniu towarzyskości, potrzebne są obiektywne środki. Powszechnie akceptowanym modelem jest analiza towarzyskości w znormalizowanym aparacie, który ma trzy komory (patrz rysunek 1).

Lewa i prawa komora zawierają odwrócony druciany kubek, w którym znajduje się społecznie istotna mysz stymulacyjna. Mysz testową wprowadza się do aparatury na trzy interwały po 10 minut (sesje I-III); sesja I ocenia aktywność lokomotoryczną myszy testowej, podczas gdy sesje II i III oceniają różne aspekty towarzyskości myszy testowej.

W sesji I, mysz testowa może się zaaklimatyzować w urządzeniu. W tej sesji mierzona jest liczba przejść, które mysz testowa wykonuje między różnymi przedziałami. Co ważne, miary towarzyskości uzyskane w standardowym aparacie trójkomorowym są zależne od aktywności lokomotorycznej, a zmniejszona aktywność lokomotoryczna może zakłócić interpretację danych dotyczących towarzyskości.

W sesji II, mysz testowa porusza się swobodnie, a mysz bodźcowa jest umieszczana pod jednym z odwróconych kubków (z przeciwwagą). Myszy bodźcowe to 4-tygodniowe niekrewniacze samce myszy ICR, dopasowane pod względem wieku i płci do myszy testowych. Mysz bodźcowa jest zamknięta w odwróconym kubku po stronie wyznaczonej jako przedział społeczny, a pusta odwrócona filiżanka jest umieszczana po stronie wyznaczonej jako przegródka niespołeczna. W sesji II towarzyskość myszy testowej jest określana ilościowo poprzez porównanie czasu, jaki spędza w pobliżu "społecznego" odwróconego kubka (mniej niż 2 cm dalej) z czasem, który spędza w pobliżu "niespołecznego" odwróconego kubka, oraz przez czas, jaki spędza w przedziale społecznym z czasem, który spędza w przedziale niespołecznym. Szwajcarskie myszy porównawcze Webstera spędzają znacznie więcej czasu w przedziale społecznym i w pobliżu odwróconego kubka społecznego w porównaniu z myszami BALB/c, które nie wykazują znaczącej preferencji dla społecznego odwróconego kubka lub przedziału społecznego¹².

W sesji III, myszy testowe i stymulujące mogą swobodnie wchodzić w interakcje (odwrócone kubki są usuwane). Miary towarzyskości, zachowań stereotypowych i przejść między przedziałami są wiarygodnie uzyskiwane w trzeciej 10-minutowej sesji swobodnej interakcji między myszami testowymi i bodźcami i analizowane. W tym raporcie towarzyskość myszy testowej jest określana ilościowo za pomocą dwóch miar: 1) liczby podejść społecznych, które wykonuje w stosunku do myszy bodźcowej, przy czym podejście społeczne definiuje się jako poruszanie się do przodu (najpierw nosem) w kierunku myszy bodźcowej, tak że nos znajduje się w odległości mniejszej niż 2 cm od myszy bodźcowej; 2) liczba unikań podejść społecznych przez mysz bodźcową. Uważa się, że mysz testowa unika podejścia, jeśli odwróci się lub odsunie od myszy bodźcowej, lub jeśli tymczasowo przestanie się poruszać ("zachowanie zamrażające") po zbliżeniu się myszy bodźcowej do myszy testowej. Myszy BALB / c wykazują spadek liczby podejść społecznych dokonywanych w stosunku do myszy bodźcowej i wzrost liczby negatywnych reakcji na podejścia społeczne przez mysz bodźcową, w porównaniu ze szwajcarskim szczepem porównawczym Webster¹⁰.

Ocena filmów behawioralnych była tradycyjnie wykonywana ręcznie, tj. poprzez uważne oglądanie filmu (możliwie ze zmniejszoną prędkością) i aktywowanie stoperów na czas, który mysz spędza w określonej komorze lub w pobliżu jednego z odwróconych kubków¹⁰. Metoda ta wymaga wielokrotnego oglądania filmu i dlatego jest bardzo czasochłonna. Dokładność jest również ograniczona czasem reakcji oceniającego na pomiary stopera i zdolnością do postrzegania, czy mysz znajduje się w odległości nie większej niż 2 cm od odwróconego kubka. W ostatnich pracach dwa związki (D-seryna i D-cykloseryna) okazały się skuteczne w przywracaniu towarzyskości u myszy BALB/c^9,10,12. Wiadomo, że oba składniki modulują receptor NMDA, o którym wiadomo, że odgrywa kluczową rolę w zachowaniach społecznych^2,12. Wiadomo, że szeroka gama związków moduluje aktywność receptora NMDA na różne, dobrze zdefiniowane sposoby, a potencjał przełomu w leczeniu ASD sprawia, że przyspieszona ocena tych związków jest priorytetem i szybką automatyczną metodą oceny, która jest wysoce pożądana.

Opisana poniżej jest automatyczna procedura analizy opracowana do oceny towarzyskości myszy. Wykorzystuje metody przetwarzania obrazu we wszystkich klatkach filmów myszy w celu zidentyfikowania pozycji myszy lub myszy. W sesjach I i II dodatkowo wykrywa pozycję nosa i wykorzystuje ją do obliczania miar towarzyskości. W sesji III automatycznie wykrywa wszystkie podejścia, ale wymagana jest ręczna klasyfikacja (podejście społeczne, unikanie społeczne lub inne).

Protokół

Protokół dla ułatwienia wyjaśnienia został podzielony na 2 części: 1) Procedura eksperymentalna i 2) Automatyczna analiza. Wszystkie zwierzęta były leczone zgodnie z Przewodnikiem opieki i wykorzystania zwierząt laboratoryjnych¹⁵, a wszystkie procedury zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami i Ich Wykorzystania.

1. Procedura eksperymentalna

1. Ustaw klatkę, która jest czarnym, nieodblaskowym prostokątnym pudełkiem z pleksiglasu (52 x 25 x 23 cm³) podzielonym na trzy przedziały: socjalną, niespołeczną i neutralną środkową (ryc. 1). Umieść odwrócone druciane kubki w każdej z końcowych komór podczas sesji I i II (omówionej poniżej) i umieść mysz bodźcową podczas sesji II.
2. Ustaw kamerę w taki sposób, aby klatka wypełniała pole widzenia. Ponieważ oświetlenie może zakłócać zachowanie myszy, utrzymuj luminancję nie większą niż 3,5 luksa wewnątrz klatki, pochodzącą ze światła pośredniego z żarówki i mierzoną na podłodze klatki w kierunku do góry. Używaj również źródła światła podczerwonego, którego myszy nie mogą wykryć, ale może wykryć kamera. Nagrywaj wszystkie filmy w standardowej rozdzielczości 720 x 480.
3. Nagraj pojedynczą klatkę pustej klatki do późniejszego przetwarzania obrazu (nazywanej "klatką odniesienia") i zapisz jako obraz w skali szarości.
4. Sesja I: Wprowadź mysz testową do klatki i machnij ręką nad klatką, wskazując początek sesji (porównaj Analizę Automatyczną). Nagrywaj film przez 10 minut. Po upływie 10 minut włóż mysz z powrotem do pierwotnej klatki.
5. Sesja II: Umieść mysz bodźcową pod jednym z odwróconych kubków (z przeciwwagą).
6. Użyj przycisku "Socjalizacja po lewej" lub "Socjalna po prawej", aby wybrać, czy mysz bodźcowa znajduje się w odwróconym kubku po lewej stronie, czy w odwróconym kubku po prawej stronie.
   UWAGA: Odwrócony kubek z myszą bodźcową nazywany jest "kubkiem społecznym", podczas gdy drugi kubek "kubkiem niespołecznym". Przedział, w którym znajduje się kubek socjalny, nazywany jest przedziałem socjalnym, przedział z kubkiem niespołecznym to przedział niespołeczny, a komora środkowa to "komora neutralna".
7. Wprowadź mysz testową do klatki. Pomachaj ręką nad klatką, aby wskazać początek sesji. Nagrywaj film przez 10 minut. Co ważne, trzymaj myszy w aparacie towarzyskim przed wyjęciem odwróconych miseczek, aby rozpocząć sesję III.
8. Sesja III: Wyjmij odwrócone kubki, uwolnij obie myszy i pozwól myszom testowym i bodźcowym na swobodną interakcję ze sobą. Pomachaj ręką nad klatką, aby wskazać początek sesji. Nagrywaj film przez 10 minut. Po upływie 10 minut umieść obie myszy z powrotem w odpowiednich klatkach.

2. Zautomatyzowana analiza

UWAGA: Polecenia w sekcji 2 są wydawane za pomocą graficznego interfejsu użytkownika (patrz Rysunek 2), który steruje naszym oprogramowaniem. Tutaj wyjaśniamy krok po kroku przetwarzanie, na które pozwala nasze oprogramowanie; Oprogramowanie jest również w stanie wykonywać analizę w trybie wsadowym bez udziału użytkownika.

1. Dla każdego filmu wykonaj następujące kroki przetwarzania:
   1. Wczytaj film (kliknij przycisk Wczytaj).
   2. Wybierz konfigurację koszyka, która informuje program analityczny o położeniu granic koszyka, granic przedziałów i położenia kubków. Wybierz jedną z czterech zapisanych konfiguracji lub ręcznie dostosuj wszystkie współrzędne.
      UWAGA: Konfiguracja zwykle nie zmienia się z jednego eksperymentu na drugi i dlatego może być ponownie użyta.
   3. Dla każdej klatki filmu wykonaj następujące kroki przetwarzania (2.1.3.1-2.1.3.6).
      1. Przekonwertuj ramkę na skalę szarości, klikając przycisk "Skala szarości".
      2. Odejmij cyfrowo ramkę odniesienia w skali szarości (patrz krok 1.3), klikając przycisk "Odejmij". UWAGA: Celem tego kroku jest sprawienie, aby wartości pikseli ramki były bardzo bliskie zeru wszędzie z wyjątkiem pozycji myszy.
      3. Binaryzuj ramkę, ustawiając wszystkie piksele poniżej określonego poziomu progu na, wszystkie piksele powyżej tego poziomu na biały (kliknij przycisk "Binaryzuj").
         Uwaga: Chodzi o to, że ponieważ piksele myszy mają zazwyczaj wyższe wartości niż pozostałe piksele, piksele myszy staną się białe, a wszystkie inne piksele czarne. Optymalny poziom progowy zależy od warunków oświetleniowych i można go określić, oceniając kształt myszy w całym filmie. Jeśli próg zostanie wybrany zbyt nisko, mysz będzie wydawać się zbyt duża, a piksele, które nie należą do myszy, mogą zostać pokolorowane na biało. Jeśli próg jest zbyt wysoki, mysz staje się mała i może rozpadnąć się na rozłączone części. W nagranych filmach optymalny próg mieścił się zawsze w przedziale od 20 do 35 (w skali od 0 do 255).
      4. Erodować¹³ binaryzowany obraz e razy, następnie rozszerzać¹³ razy 2e, a następnie ponownie erodować e razy, naciskając przycisk "Erod/Dil".
         Uwaga: Celem tej procedury jest usunięcie ogona. Dla zastosowanej rozdzielczości (720 x 480) e = 3 działało w każdych okolicznościach.
         Uwaga: Oprogramowanie automatycznie sprawdza, czy na zdjęciu znajduje się ręka (podczas nagrywania filmów wskazówki są przesuwane przez obraz, aby wskazać początek sesji). Jeśli ręka jest obecna, w binaryzowanej ramce będzie niezwykle dużo białych pikseli, ponieważ ręka jest znacznie większa niż mysz. Warunkiem obecności dłoni jest to, że w binaryzowanej ramce znajduje się więcej niż 10 000 białych pikseli. Oprogramowanie określa początki sesji I, II i III, wykrywając zakres klatek, w których występują ruchy ręki.
2. W sesjach I i II kontynuuj w następujący sposób:
   1. Wykryj największy połączony składnik zestawu białych pikseli (kliknij "LComp"). Uwaga: Celem tego kroku jest wyeliminowanie białych pikseli, które nie należą do myszy, np. spowodowanych ruchem myszy bodźcowej w sesji II. Największym połączonym komponentem jest w prawie wszystkich klatkach mysz.
   2. Określ dwa najbardziej odległe białe piksele (zwane "końcami" myszy), klikając "Znajdź końce".
      Uwaga: Oprogramowanie ustala ciągłość dwóch końców, tj. dla każdego z końców w pierwszej ramce, do którego z końców w kolejnych ramkach należą. Ogólna idea jest taka, że ponieważ klatki są rejestrowane z dużą szybkością, końce nie mogą przemieszczać się daleko od jednej klatki do drugiej, tak więc dla prawidłowej kontynuacji końców z jednej klatki do drugiej jest to, co minimalizuje sumę odległości, na jakie przesuwają się końce. Zobacz dyskusję, aby uzyskać więcej informacji.
   3. Określ, który koniec myszy jest nosem.
      1. Określ kierunek, w którym porusza się mysz, obserwując, jak zmienia się środek ciężkości (COG) z klatki na klatkę (ruch COG to ruch sumy wszystkich pikseli myszy).
         Uwaga: Środek ciężkości zbioru pikseli p₁, ... , p_n o współrzędnych x₁, .. , x_n jest definiowane przez:
         
         Myszy zwykle poruszają się do przodu (tj. w kierunku nosa). W sekcji liczącej kilkaset klatek zawsze występuje bardzo duża pewność wykrywania orzeł/reszka.
         Uwaga: Oprogramowanie automatycznie określa, w kierunku którego z wykrytych końców porusza się mysz; Ten koniec jest zidentyfikowany jako nos i oznaczony czerwonym kółkiem w filmie. Gdy wykryty nos jest oznaczony czerwonym kółkiem w każdej klatce, użytkownik może sprawdzić jakość wykrywania.
3. W sesji III kontynuuj w następujący sposób:
   1. Wykrywanie dwóch największych składowych białych pikseli.
      1. Jeśli oba mają akceptowalny rozmiar dla myszy, a ich środki ciężkości (COG) są kompatybilne z COG myszy z poprzedniej ramki, rozważ te dwa składniki: dwie myszy.
      2. Uważa się rozmiary myszy za dopuszczalne, jeśli nie zmieniły się o więcej niż 20% od poprzedniej klatki, a COG dwóch kolejnych ramek za zgodne, jeśli ich różnica nie jest większa niż odległość, jaką mysz może przebyć w czasie między klatkami (odległość ta wynika z maksymalnej prędkości myszy, którą można określić w ramach przygotowań do serii eksperymentów, analizując ruch kilku pojedynczych myszy (jak w sesje I i II).
         Uwaga: Jeśli dwa największe komponenty nie są akceptowalnymi rozmiarami dla myszy lub COG są zbyt różne od tych w poprzedniej ramce, oprogramowanie automatycznie zwiększa próg binaryzacji, aż dwa największe komponenty będą miały akceptowalny rozmiar, a ich COG będą kompatybilne z tymi z poprzedniej ramki.
   2. Kliknij myszą testową w pierwszej klatce. Użyj analizy w 2.3.1, aby zidentyfikować zarówno mysz testową, jak i bodźcową w każdej klatce sesji III.
   3. Zidentyfikuj klatki w sesji III, w których jedna mysz zbliża się społecznie do drugiej. Uwaga: Oprogramowanie realizuje ten krok, automatycznie sprawdzając, czy odległość między myszami jest mniejsza niż typowa odległość interakcji myszy (używamy 2 cm).
   4. Gdy oprogramowanie odtwarza użytkownikowi krótki fragment filmu z wykrytym podejściem, kliknij przycisk, aby wskazać, czy to podejście kwalifikuje się jako podejście społeczne przez mysz testową, unikanie kontaktów społecznych przez mysz testową, czy też żadne.
      Uwaga: Krok 2.3.4 można zautomatyzować, jeśli wiadomo, która mysz jest myszą testową. Ponieważ informacje te gubią się, gdy myszy zbytnio się do siebie zbliżają (lub wspinają się na siebie) i ponieważ nie znaleźliśmy jeszcze sposobu na oznaczenie myszy w sposób, który może być niezawodnie wykryty przez nasze oprogramowanie ORAZ nie wpływa na ich zachowanie, na razie powróciliśmy do ręcznej klasyfikacji.
4. Aby ocenić przetworzone filmy, załaduj film za pomocą przycisku Wczytaj.
   1. Kliknij Rozpocznij sesję 1, aby wyświetlić pierwszą klatkę sesji 1 (lub Rozpocznij sesję 2, aby wyświetlić pierwszą klatkę sesji 2).
   2. Kliknij Odtwórz/Zatrzymaj, aby odtwarzać i zatrzymywać filmy.
      Uwaga: Przetworzone filmy będą wyświetlać mysz z głową i ogonem oznaczonymi różnokolorowymi kółkami. Wszystkie miary towarzyskości są wyświetlane na ekranie i aktualizowane w miarę odtwarzania filmu.
   3. Eksportuj dane towarzyskie w formacie Excel, klikając "Eksportuj".
   4. Kliknij "Kompiluj dane", aby skompilować wszystkie dane wszystkich filmów w folderze w jeden plik Excela.

Wyniki

Rysunek 3 pokazuje kolorową klatkę filmu behawioralnego z pustą klatką. Mysz nie została jeszcze wprowadzona do klatki. Położenie miseczek (społeczne i niespołeczne) oraz granice przedziałów nakładają się na siebie. Kolorowa ramka pustej klatki jest konwertowana na 8-bitową skalę szarości, jak pokazano na rysunku 4, i używana jako ramka odniesienia. Klatka odniesienia jest odejmowana od każdej innej klatki przechwyconego filmu.

Rysunek 5 pokaz...

Dyskusja

Łącząc myszy do nagrywania filmów i automatyczną analizę filmu, stworzyliśmy przystępną cenowo, niezawodną technikę badań przesiewowych o wysokiej przepustowości.

Dokładność automatycznej analizy porównano z wynikami ręcznej analizy dla ponad 100 filmów. W zdecydowanej większości klatek (> 99%) ramek nos myszy jest identyfikowany z dobrą precyzją. Większość (nielicznych) błędnych wykryć nie ma wpływu na wskaźniki towarzyskości, więc około 80% filmów nie wymaga żadnych poprawek.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Klatka z pleksiglasu	Norva Plastics, Norfolk, VA	na zamówienie	Wymiary i układ opisane w rękopisie, można dostosować do potrzeb. Użyj nieodblaskowej pleksi, aby ułatwić przetwarzanie obrazu
Kubki druciane	Kuchnia plus	315	Użyj jednego do domu myszy stymulującej, jednego pustego
Kamera wideo	SONY	HDR-PJ790	Może być zastąpiony przez dowolną kamerę z Porównywalne specyfikacje
OpenCV (biblioteka przetwarzania obrazu)	Willow Garage	N/A	Można użyć dowolnej nowoczesnej biblioteki przetwarzania obrazu .