Określanie topologii białek błonowych za pomocą ochrony proteazy fluorescencyjnej (FPP)

Podsumowanie

Tutaj prezentujemy protokół do określenia orientacji i topologii integralnych białek błonowych w żywych komórkach. Ten prosty protokół opiera się na selektywnej wrażliwości chimer na proteazę między białkiem będącym przedmiotem zainteresowania a GFP.

Streszczenie

Prawidłowa topologia i orientacja integralnych białek błonowych są niezbędne dla ich prawidłowego funkcjonowania, jednak takie informacje nie zostały ustalone dla wielu białek błonowych. Przedstawiono prostą technikę zwaną ochroną proteazy fluorescencyjnej (FPP), która pozwala na określenie topologii białek błonowych w żywych komórkach. Technika ta ma wiele zalet w porównaniu z innymi metodami określania topologii białek, ponieważ nie wymaga dostępności wielu przeciwciał przeciwko różnym domenom białka błonowego, nie wymaga dużych ilości białka i może być wykonywana na żywych komórkach. Metoda FPP wykorzystuje ograniczone przestrzennie działanie proteaz na degradację białek błonowych znakowanych zielonym białkiem fluorescencyjnym (GFP) w celu określenia ich topologii i orientacji błonowej. To proste podejście ma zastosowanie do wielu różnych typów komórek i może być wykorzystane do określenia orientacji białek błonowych w różnych organellach subkomórkowych, takich jak mitochondria, Golgi, retikulum endoplazmatyczne i składniki systemu endosomalnego/recyklingowego. Białka błonowe, znakowane na N-końcach lub C-końcach za pomocą fuzji GFP, ulegają ekspresji w komórce będącej przedmiotem zainteresowania, która podlega selektywnej przepuszczalności przy użyciu detergentu digitoniny. Digitonina ma zdolność przenikania błony komórkowej, pozostawiając nienaruszone organelle wewnątrzkomórkowe. Ugrupowania GFP wystawione na działanie cytozolu mogą ulegać selektywnej degradacji poprzez zastosowanie proteazy, podczas gdy ugrupowania GFP obecne w świetle organelli są chronione przed proteazą i pozostają nienaruszone. Test FPP jest prosty, a wyniki można uzyskać szybko.

Wprowadzenie

Błony plazmatyczne, jak również liczne błony wewnątrzkomórkowe, służą jako bariery oddzielające dwie wodne komory. W przypadku błony plazmatycznej separacja odbywa się między zewnętrzną i wewnętrzną częścią komórki; W przypadku organelli wewnątrzkomórkowych znajduje się między cytoplazmą a światłem organelli. Na przykład błona retikulum endoplazmatycznego (ER) oddziela środowisko utleniające w świetle ER od środowiska redukującego cytozolowe¹. Białka błonowe są syntetyzowane na rybosomach związanych z ER i osiągają swoją ostateczną topologię w błonie ER². Nabycie odpowiedniej orientacji i topologii błony dla białek ma kluczowe znaczenie dla ich prawidłowego funkcjonowania. Prawidłowa topologia pozwala odpowiednim domenom białek błonowych na interakcję z ich partnerami wiążącymi, umożliwia zachodzenie krytycznych modyfikacji potranslacyjnych, a w przypadku białek błony plazmatycznej umożliwia komórce interakcję i reagowanie na środowisko. Aby w pełni docenić funkcję białka błonowego, konieczne jest poznanie, w jaki sposób białko to jest zorientowane w odniesieniu do błony, w której się znajduje, tj. jego topologii błony. Oprócz zdobycia podstawowej wiedzy naukowej, zrozumienie topologii białka błonowego i tego, które aspekty powierzchni białka są narażone na działanie różnych środowisk, ma wyraźne implikacje kliniczne, ponieważ białka błonowe stanowią większość celów farmakologicznych³. Do niedawna metody określania topologii białek błonowych wymagały znacznych inwestycji czasu i pieniędzy lub wymagały trudnych do zdobycia odczynników.

Zarówno podejście eksperymentalne, jak i in silico zostało wykorzystane do określenia topologii błony białek znajdujących się w błonie plazmatycznej. Od czasu pierwszych przewidywań domen obejmujących błonę w oparciu o ocenianą hydrofobowość poszczególnych aminokwasów³, w Internecie dostępnych jest obecnie wiele algorytmów predykcyjnych, które wymagają po prostu wiedzy na temat sekwencji aminokwasów białka. Jednak w takich programach do modelowania często kluczowe są założenia, które mogą prowadzić do nieprawidłowych przypisań topologii^4,5. Co więcej, chociaż te prognozy komputerowe mogą wstępnie przypisać regiony obejmujące błonę, nie zawsze określają, czy zakończenia aminowe lub karboksylowe białek znajdują się w cytoplazmie, świetle organelli czy na zewnątrz komórki. Nawet przy zwiększonej mocy obliczeniowej i zastosowaniu algorytmów uczenia maszynowego⁶ takie dane są nadal modelem i muszą być walidowane przy użyciu danych uzyskanych eksperymentalnie. Bezpośrednie eksperymentalne określenie topologii błony przeprowadzono przy użyciu paneli przeciwciał monoklonalnych ze znanymi epitopami rozmieszczonymi w całym białku, przy czym dokonano oceny ich immunoreaktywności przed i po przenikaniu komórek. Takie podejście wymaga zestawu przeciwciał, które mogą być niedostępne dla interesującego białka.

Alternatywną strategią jest inżynieria znaczników epitopów, takich jak myc lub hemaglutynina (HA) w różnych miejscach w całym białku, a następnie określenie immunoreaktywności przed i po przepuszczalności błony. Oprócz znaczników immunogennych, znaczniki enzymatyczne (w tym fosfataza alkaliczna, β-galaktozydaza lub β-laktamaza) i modyfikacje chemiczne, takie jak skanowanie cysteiny, zostały wykorzystane do określenia topologii białek błonowych^7,8. Dodatkowa metoda stosowana do mapowania topologicznego białek błony plazmatycznej opiera się na nieco innym podejściu do znaczników epitopów. W tej metodzie sekwencją znaczników jest sekwencja konsensusu glikozylacji sprzężonej z N NXS / T. Ponieważ glikozylacja zachodzi tylko wtedy, gdy taka sekwencja jest obecna w świetle szlaku biosyntezy, obecność znacznika w przedziale luminalnym w porównaniu z cytozolowym można łatwo zaobserwować jako przesunięcie masy w żelach SDS-PAGE. Takie podejście zostało zastosowane do wieloprzęsłowego kanału jonowego CFTR⁹. Chociaż wszystkie te podejścia zostały wykorzystane, jasne jest, że wszystkie wymagają znacznych inwestycji w biologię molekularną, aby wygenerować i zsekwencjonować różnorodne konstrukty.

Określenie informacji topologicznej dotyczącej białek transbłonowych znajdujących się w organellach wewnątrzkomórkowych okazało się trudniejsze. Zastosowanie technologii opartych na fluorescencji sprawiło jednak, że określenie topologii membrany stało się znacznie prostsze. Technika dwucząsteczkowej komplementacji fluorescencji (BiFC) opiera się na interakcji między dwoma niefluorescencyjnymi fragmentami białka fluorescencyjnego, przywracając właściwości fluorescencyjne tego białka¹⁰. Chociaż początkowo opisano to do określania interakcji białko-białko in vivo¹⁰, podejście to zostało również wykorzystane do określenia topologii białek błonowych w komórkach roślinnych¹¹. Jednak podejście to jest również czasochłonne, ponieważ wymaga wytwarzania nie tylko białek fuzyjnych z białkiem będącym przedmiotem zainteresowania, ale także różnych białek fuzyjnych ukierunkowanych na światło cytozolu lub organelli, a także wymaga wiedzy na temat tego, w których błonach wewnątrzkomórkowych znajduje się interesujące białko.

Alternatywne, prostsze podejście do określania topologii białek błonowych zostało opisane¹². Test ochrony proteazy fluorescencyjnej (FPP) wymaga wytworzenia białka fuzyjnego między GFP a genem będącym przedmiotem zainteresowania. Podejście to opiera się na względnej dostępności nieswoistych proteaz dla ugrupowania GFP; w zależności od tego, czy GFP jest chroniony przed proteolizą przez przebywanie w świetle organelli wewnątrzkomórkowych, czy też jest narażony na proteolizę poprzez obecność w cytozolu. Tak więc, jeśli ugrupowanie GFP na białku będącym przedmiotem zainteresowania jest skierowane w stronę cytoplazmy, zostanie wystawione na aktywność proteazy i utracony sygnał fluorescencyjny. I odwrotnie, jeśli ugrupowanie GFP na białku będącym przedmiotem zainteresowania napotka środowisko "chronione" przed proteazą (takie jak światło Golgiego), wówczas sygnał fluorescencyjny będzie się utrzymywał.

Aby umożliwić proteazy przedostanie się do komórki, ale nie wejść do wewnątrzkomórkowych przedziałów błony, stosuje się lek wiążący cholesterol, digitoninę. Cholesterol jest dominującym sterolem u kręgowców i jest specyficznie wzbogacony w błonę plazmatyczną w stosunku do przedziałów wewnątrzkomórkowych. Toksyna glikozydowa, digitonina, jest ekstrahowana z rośliny Digitalis purpurea. Digitonina ma powinowactwo do błon bogatych w cholesterol, gdzie prowadzi do selektywnej przepuszczalności błon^14,16 (ryc. 1). Oprócz umożliwienia wyjścia małych składników cytozolowych, przepuszczalność digitoniny umożliwia również wejście cząsteczek egzogennych, takich jak proteinaza K lub trypsyna. Protokół FPP wykorzystuje fakt, że błona plazmatyczna zawiera do 80% cholesterolu komórkowego¹⁷, podczas gdy inne organelle, takie jak ER, Golgi, endosomy, mitochondria, które mają bardzo niską zawartość cholesterolu, pozostają nienaruszone¹⁴. Selektywne włączanie cholesterolu do błony komórkowej zaobserwowano w wielu komórkach eukariotycznych, co pozwala na zastosowanie zależnej od digitoniny przepuszczalności błony plazmatycznej u tak różnych gatunków eukariotycznych, jak S. cerevisiae dla człowieka^14,18. Test FPP zapewnia prosty, szybki i dość solidny sposób określania (a) czy białko jest związane z błoną/związane lub swobodnie dyfuzyjne w cytozolu oraz (b) która domena białka błonowego jest zwrócona w stronę światła cytozolu lub organelli. Jeśli białko błonowe ma wiele orientacji, sygnał będzie pochodził z formy dominującej, a formy mniejsze nie zostaną wykryte. Chociaż mogą istnieć pewne obawy, że dodanie ugrupowania GFP do interesującego białka może wpłynąć na jego funkcję i / lub lokalizację subkomórkową, w rzeczywistości jest to bardziej teoretyczne niż rzeczywiste. Rzeczywiście, wiele badań wyraźnie wykazało, że znacznik GFP nie zmienia właściwości białka^19,20.

Protokół

1. Generowanie i walidacja chimer białek fluorescencyjnych

1. Dołączyć białko zielonej fluorescencji (GFP) do zakończeń aminowych lub karboksylowych białka będącego przedmiotem zainteresowania przy użyciu standardowych strategii rekombinacji DNA¹³,
   UWAGA: Chociaż szeroko stosowaliśmy GFP, można zastosować inne warianty, takie jak białko fluorescencyjne cyjanu (CFP), białko fluorescencji żółtej (YFP), DsRed i mCherry. Stale wprowadzane są ulepszenia w zakresie wydajności fałdowania fluoroforu, jasności i fotostabilności, a badacze powinni skorzystać z konstruktów najnowszej generacji.
   1. Potwierdź prawidłową sekwencję DNA i upewnij się, że ugrupowanie GFP znajduje się w ramce z białkiem będącym przedmiotem zainteresowania. Wykonaj sekwencjonowanie przy użyciu standardowych strategii rekombinacji DNA²¹,
      UWAGA: Wiele instytucji posiada podstawowe placówki DNA, z którymi badacz powinien się skontaktować w celu uzyskania dodatkowych informacji.
   2. W przypadku białek błonowych z pojedynczym lub podwójnym przejściem należy wygenerować zarówno amino-, jak i karboksylowe wersje końcowych białek fuzyjnych¹⁹.
   3. W przypadku białek wielozakresowych należy wstawić GFP w przypuszczalnych pętlach zewnątrzbłonowych, a także na końcach. Należy zachować szczególną ostrożność podczas generowania chimer transbłonowych z fluorescencyjnym białkiem fuzyjnym przyłączonym do końca aminowego białka docelowego, ponieważ sekwencje sygnałowe są często rozszczepiane przez proteolizę, gdy białko przejdzie przez translokon ER.
   4. W przypadku istniejących sekwencji sygnałowych należy wprowadzić fluorescencyjne białko fuzyjne dystalnie do miejsca rozszczepienia, aby wytworzyć dojrzałe białko zawierające nienaruszone białko fluorescencyjne znakowane aminokońcem. Zastosuj standardowe strategie rekombinacji DNA do generowania chimer²¹.
2. Określ obecność wystarczającego, odpowiednio zlokalizowanego sygnału fluorescencyjnego w linii komórkowej będącej przedmiotem zainteresowania.
   1. Obserwuj komórki pod mikroskopią epifluorescencyjną przy użyciu wewnętrznej fluorescencji GFP w odpowiednich warunkach zestawu filtrów. W przypadku zestawów filtrów GFP, które obejmują 510-560 nm, upewnij się, że dla zastosowanego fluoroforu używane są właściwe filtry.
      UWAGA: Wystarczający sygnał uzyskuje się, gdy ocena wzrokowa dostarcza wystarczająco silny sygnał, aby struktura komórkowa, w której znajduje się sygnał, była łatwo rozdzielona ponad tłem. Ponadto wzór barwienia białka GFP powinien być zgodny z markerami dla odpowiednich organelli i najlepiej identyczny z wzorcem natywnego białka nieznakowanego.
3. Określ, czy w oparciu o oceniane białko zostanie zastosowane podejście transfekcji stabilnej czy przejściowej.
   UWAGA: Stabilne transfektanty na ogół zapewniają niższe poziomy ekspresji niż systemy przejściowe. Chociaż ekspresja przejściowa zapewnia wysoki poziom ekspresji białek i zwiększa intensywność sygnału (~ 5-24 godziny po transfekcji w zależności od białka), może również prowadzić do artefaktów nadekspresji, takich jak agregacja białek lub nasycenie szlaków docelowych białek, co prowadzi do błędnej lokalizacji subkomórkowej.

2. Transfekcja komórek i hodowla komórkowa

UWAGA: Do analizy FPP można poddawać różne komórki, w tym Hek293, HeLa, COS-7 i CHO¹⁴. Poniższy opis opiera się na ekspresji białek błonowych w komórkach Hek293.

1. Hodować ludzkie embrionalne komórki nerkowe (Hek293) jako przylegające monowarstwy w 6 ml zmodyfikowanego podłoża Eagles (DMEM) firmy Dulbecco, uzupełnionego 5% płodową surowicą bydlęcą (FBS), 1% pirogronianem sodu i 250 μg/ml penicyliny/streptomycyny w temperaturze 37 °C z 5% CO₂ . Całą pracę należy wykonać z komórkami w kapturze do hodowli tkankowej z przepływem laminarnym. Hoduj komórki w pożywce hodowlanej do ~80% zlewania się w kolbie T-75.
2. Komórki transfekcyjne przy użyciu dowolnej standardowej metody transfekcji o wysokiej wydajności i niskiej toksyczności, w tym technologii opartych na lipidach, wirusach lub elektroporacji, w celu wygenerowania przejściowej lub stabilnej ekspresji. Zazwyczaj 2 μg plazmidowego DNA na 1 x 10⁶ komórek daje dobrą odtwarzalną ekspresję białka. Utrzymywać komórki przez 5–48 godzin w odpowiednich pożywkach do hodowli tkankowych w temperaturze 37 °C w inkubatorze do hodowli tkankowych zdolnym do emisji_CO2.
3. Monitoruj komórki pod kątem ekspresji białka fuzyjnego GFP za pomocą mikroskopii epifluorescencyjnej, wykorzystując wewnętrzny sygnał fluorescencyjny GFP, używając odpowiednich zestawów filtrów zgodnie z protokołem producenta. Sygnał fluorescencji zwykle osiąga maksimum w ciągu 24-72 godzin po transfekcji. Używaj komórek, gdy sygnał fluorescencji osiągnie maksymalny poziom. Monitoruj poziomy ekspresji białek za pomocą analizy immunoblot przy użyciu przeciwciał skierowanych przeciwko białku będącemu przedmiotem zainteresowania lub ugrupowaniu GFP.
4. Do analizy eksperymentalnej komórek płytkowych na powlekanych szkiełkach nakrywkowych. Oglądaj w konfiguracji z żywymi komórkami lub po utrwaleniu i zamontowaniu na szkiełkach mikroskopowych. Płytki komórkowe, aby osiągnąć 60%-80% konfluencji w ciągu 24-48 godzin.
   1. Szkiełka nakrywkowe pokryć roztworem polilizyny (0,1 mg/ml), tak aby pokryć całą powierzchnię. Inkubować przez 30 minut w świetle ultrafioletowym w temperaturze pokojowej, a następnie 60 minut w inkubatorze do hodowli komórkowych w temperaturze 37 °C. Usunąć nadmiar polilizyny i spłukać szkiełka nakrywkowe w PBS 3 razy.
   2. Alternatywnie, umieszczono komórki na komorze na szkle nakrywkowym składającym się z płytek do hodowli komórkowych z dnem ze szkła optycznego, aby umożliwić bezpośrednie obrazowanie za pomocą obiektywów zanurzonych w oleju. Rzeczywista konfiguracja mikroskopii zależy od sprzętu dostępnego dla badacza, ale powinna być zdolna do szybkiej zmiany roztworu. W zależności od typu komórki i kształtu komórki, komórki powinny być w około 60-90% zlewające się w momencie testu FPP.

3. Konfiguracja mikroskopii fluorescencyjnej

1. Użyj obiektywu zanurzeniowego z olejkiem o dużej aperturze numerycznej (NA), aby uzyskać maksymalne zbieranie sygnału i rozdzielczość przestrzenną, takiego jak obiektyw zanurzeniowy z olejkiem 60X, 1,42 NA. Do stymulacji fluoroforów należy użyć następujących laserów: argon gazowy 488 nm (GFP i YFP) oraz dioda 561 (RFP, mCherry).
2. Określ optymalną ekspozycję, wzmocnienie i szybkość przechwytywania obrazów dla każdej konstrukcji. Dostosuj intensywność lasera i czas ekspozycji, aby zminimalizować fotowybielanie (patrz krok 7.1.2).
3. W przypadku badań z użyciem wielu fluoroforów (np. rozpuszczalnego markera przepuszczalności błony w połączeniu z markerem białka błonowego) należy wybrać odpowiednie zestawy filtrów, aby zminimalizować przesłuchy sygnału i zmaksymalizować stosunek sygnału do szumu.

4. Ustalanie optymalnych warunków dla przepuszczalności błony plazmatycznej

1. Usunąć pożywkę do hodowli komórkowych z komórek, w których występuje ekspresja tylko rozpuszczalnych białek fluorescencyjnych (np. EGFP, DsRed). Przemyj komórki 3 razy (po 1 minutzie) w buforze KHM (110 mM octan potasu, 3 mM MgCl₂, 20 mM HEPES-NaOH, pH 7,2). Wykonuj eksperymenty z komórkami i wszystkimi odczynnikami w temperaturze pokojowej.
2. Umieścić komórki na szkiełkach nakrywkowych (patrz krok 2.4) w buforze KHM na stoliku mikroskopu fluorescencyjnego i zebrać pierwszy obraz, który reprezentuje kontrolny etap "nieprzepuszczalny".
3. Aby selektywnie przepuszczalność błony plazmatycznej, dodaj do komórek digitoninę (30 μM) w buforze KHM. Perfuzja komórek z buforem (bufor + digitonina) z szybkością 5 ml/min przez 10-60 sek.
4. Określ optymalne stężenie digitoniny, stopniowo zwiększając stężenie digitoniny. Optymalne stężenie digitoniny osiąga się, gdy następuje całkowita utrata sygnału fluorescencji z rozpuszczalnego EGFP w ciągu 10-60 sekund od podania digitoniny. W przypadku wielu komórek zastosowanie 10-50 μM digitoniny jest wystarczające do przepuszczalności błony komórkowej.
   1. Do wszystkich zastosowań należy stosować najniższe możliwe stężenie digitoniny. Zbierz obrazy po przepuszczalności digitoniny dla przepuszczalnego sygnału tła.
5. Potwierdź, że chimera białka GFP, która jest przedmiotem zainteresowania, jest zintegrowana z błoną, potwierdzając komórkowe zatrzymywanie sygnału fluorescencji po przepuszczalności digitoniny przez błonę plazmatyczną¹⁶.
   1. Wyrażają białko fluorescencyjne specyficzne dla organelli²³. Dobrze sprawdzają się w tym zakresie białka mitochondrialne¹⁶, np. wektor pDsRed2-Mito. Określ optymalne warunki wyrażania zgodnie z opisem w kroku 2.1.
   2. Potwierdzić, że stężenie digitoniny jest odpowiednie dla zastosowanego typu komórki, zapewniając, że morfologia organelli wewnątrzkomórkowych pozostaje stała przez długotrwałe (do 60 minut) narażenie na digitoninę.
      UWAGA: Stosuj standardowe protokoły mikroskopii immunofluorescencyjnej z wykorzystaniem przeciwciał przeciwko różnym kompartmentom komórkowym, takim jak lizosomy (np. LAMP1), Golgiego (np. TGN38), retikulum endoplazmatyczne (np. kalneksyna), endosomy (np. Rab5), mitochondria (np. cytochrom c). Jeśli morfologia/integralność organelli wewnątrzkomórkowych zmienia się dramatycznie w ciągu 60 minut, jest prawdopodobne, że stężenie digitoniny było zbyt wysokie i wymaga zmniejszenia stężenia digitoniny i/lub czasu ekspozycji.
      UWAGA: Digitonina jest toksyczna przez drogi oddechowe i kontakt ze skórą. Nosić odpowiednie środki ochrony osobistej (PPE).

5. Leczenie proteazą białek fluorescencyjnych

1. Umyj komórki w buforze KHM, a następnie dodaj proteazę (proteinazę K; 50 μg/ml w buforze KHM) bezpośrednio na komórki. Perfuzja komórek z natężeniem przepływu 5 ml/min za pomocą grawitacyjnego systemu perfuzyjnego w celu ciągłej kąpieli preparatu.
   1. Roztwory należy przechowywać w strzykawkach o pojemności 50 ml i rurkach polietylenowych połączonych niezależnymi zbiornikami z kolektorem z pojedynczym wylotem w kąpieli (natężenie przepływu 5 ml/min). Ustawić pipetę ssącą tak, aby utrzymać stałą (0,5 ml) objętość kąpieli i uzyskać wymianę roztworu poprzez ręczne przełączanie między zbiornikami perfuzyjnymi.
2. Zbierz obrazy, aby określić, czy sygnał fluorescencyjny utrzymuje się, czy ulega degradacji. Utrata >90% początkowej intensywności sygnału w ciągu 30-60 sekund jest zgodna z proteolityczną degradacją chimery białka GFP (patrz Reprezentatywne wyniki).
3. Jeśli nie obserwuje się degradacji sygnału w przypadku proteinazy K, gdy przewiduje się taką stratę, należy zastąpić roztwór proteinazy K trypsyną (4-8 mM) w buforze KHM. W razie potrzeby użyj mieszaniny proteinazy K i trypsyny. Nie ma potrzeby wygaszania aktywności proteazy.

6. Alternatywne podejście do białek błony plazmatycznej z domenami zewnętrznymi

1. W przypadku białek błony plazmatycznej należy wykonać test dla chimer zewnętrznych białek fluorescencyjnych przed przepuszczalnością digitoniny. Umyj komórki na szkiełkach nakrywkowych w buforze KHM (5 ml/min x 3 min) i wykonaj obraz do leczenia przed proteazą i określ ilościowo sygnał fluorescencji przed proteazą, jak w kroku 7.
2. Wystawić komórki na działanie proteazy (proteinaza K; 50 μg/ml lub trypsyna 4-8 mM w buforze KHM) pod nieobecność digitoniny poprzez perfuzję komórek pożywką KHM zawierającą proteazę (szybkość przepływu 5 ml/min). Zbierz obrazy białka fluorescencyjnego, aby określić, jak szybko sygnał znika lub jak długo sygnał się utrzymuje.
3. Przed przepuszczalnością digitoniny należy wygasić całą aktywność proteazy, myjąc komórki trzykrotnie (po 1 minutzie) w pożywce do hodowli komórkowych zawierającej 10% surowicy (FBS).
4. Przemyć komórki przez perfuzję buforem KHM (szybkość przepływu 5 ml/min) przez 2 minuty. Uzyskaj obraz przed przepuszczalnością. Przepuszczalność błony komórkowej zgodnie z opisem w kroku 4.
5. Zbierz obrazy po dodaniu proteazy zgodnie z opisem w kroku 5.

7. Analiza obrazu

1. Użyj odwróconego mikroskopu zdolnego do rejestracji "żywych komórek", w którym utrata sygnału fluorescencji może być monitorowana w czasie rzeczywistym. Do ciągłego monitorowania należy stosować identyczne parametry (czas ekspozycji, wzmocnienie, intensywność lasera itp.).
   1. Określić parametry eksperymentalne, obserwując sygnał fluorescencyjny z białka GFP będącego przedmiotem zainteresowania w warunkach kontrolnych (tj. sam bufor KBH). Dostosuj ustawienia wzmocnienia, intensywności lasera i czasu ekspozycji w mikroskopie sterowanym komputerowo, aby upewnić się, że nie ma znaczącej utraty intensywności sygnału w okresie 10-20 minut.
      UWAGA: Intensywność sygnału nie jest wartością bezwzględną, ale opiera się na systemie mikroskopu i ustawieniach dostępnych dla każdego PI. Monitoruj zmiany względnej intensywności fluorescencji.
2. Alternatywnie, potraktuj komórki w określonych punktach czasowych digitoniną, a następnie proteazą i utrwal komórki przed zamontowaniem na szkiełkach nakrywkowych w celu obrazowania. Określ punkty czasowe empirycznie, postępując zgodnie z procedurami w krokach 4 i 5. W przypadku wstępnego badania należy rozpocząć od 0, 30, 60, 120 i 300 sekund po dodaniu digitoniny lub proteazy.
   1. Utrwalić komórki (20 minut w temperaturze pokojowej) za pomocą wystarczającej ilości utrwalacza (3,7% paraformaldehydu w PBS), aby całkowicie zanurzyć komórki.
   2. Ugasić resztki paraformaldehydu poprzez przepłukanie komórek PBS zawierającym 20 mM glicyny (3 x 5 min).
   3. Zamontuj szkiełka nakrywkowe, usuwając nadmiar płynu z szkiełka nakrywkowego i odwracając szkiełko nakrywkowe na 50 μl podłoża montażowego na szklanych szkiełkach mikroskopowych do obrazowania. Pozostaw szkiełka do wyschnięcia przez noc przed obrazowaniem.
3. Zbieraj obrazy z mikroskopii fluorescencyjnej (pod odpowiednimi zestawami filtrów kompatybilnymi z używanym fluoroforem) za pomocą funkcji przechwytywania obrazu wideo na sterowanym komputerowo mikroskopie fluorescencyjnym.
4. Określ ilościowo natężenie sygnału fluorescencyjnego w funkcji warunków inkubacji. Uzyskaj średnią intensywność pikseli w obszarze zainteresowania (ROI), który otacza pojedynczą komórkę.

Wyniki

Przepuszczalność błony plazmatycznej

Efektywna przepuszczalność błony plazmatycznej jest określana przez użycie rozpuszczalnych białek fluorescencyjnych (np. GFP, DsRed) (Krok 4). Białka te, gdy ulegają ekspresji w komórkach, mogą swobodnie dyfundować w cytozolu i są tracone, gdy błona plazmatyczna jest przepuszczalna za pomocą digitoniny (ryc. 2). Całkowite zanik sygnału fluorescencyjnego powinien nastąpić w ciągu 10-60 sekund od podania digitoniny. Potwierd...

Dyskusja

Prawidłowa orientacja i topologia białek błonowych jest niezbędna do ich prawidłowego funkcjonowania. Pomimo tego, jak ważne jest zrozumienie topologii białek błonowych, istnieje wiele białek, dla których takich danych całkowicie brakuje. FPP zapewnia łatwy i wydajny sposób określania topologii białek błonowych, który może być wykonywany przez większość laboratoriów. Podejście FPP daje znaczące korzyści w porównaniu z poprzednimi metodami określania topologii białek. Na przykład, nie ma potrzeby posiadania panelu wielu p...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Digitonina	Calbiochem	300410
Proteinaza K	Sigma	P2308
Trypsyna	Sigma	T3924
Cav1-GFP	Addgene	44433
pAcGFP-1 Golgi	Clontech	632464
Polylysine	Sigma	P4707
Podłoże montażowe	Dako	Zobacz materiał cS704