Tutaj informujemy o podwójnym znakowaniu komórek grzebienia nerwowego i naczyń krwionośnych za pomocą wewnątrzgatunkowego szczepienia rurki nerwowejGFP w połączeniu z wewnątrznaczyniowym wstrzyknięciem DiI. Ta eksperymentalna technika pozwala nam jednocześnie wizualizować i badać rozwój układu nerwowego (jelitowego) wywodzącego się z NCC i układu naczyniowego podczas organogenezy.
Artykuł metodologiczny
Podwójne znakowanie komórek grzebienia nerwowego i naczyń krwionośnych w zarodkach kurczaków za pomocą szczepienia cewy nerwowejpiskląt GFP i wstrzyknięcia barwnika karbocyjaniny DiI
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Wszystkie rozwijające się organy muszą być podłączone zarówno do układu nerwowego (do kontroli czuciowej i motorycznej), jak i do układu naczyniowego (do wymiany gazowej, dostarczania płynów i składników odżywczych). W związku z tym zarówno układ nerwowy, jak i naczyniowy rozwijają się obok siebie i mają uderzające podobieństwa w swojej rozgałęzionej architekturze. Tutaj przedstawiamy manipulacje embrionalne, które pozwalają nam badać jednoczesny rozwój tkanki nerwowej wywodzącej się z grzebienia nerwowego (w tym przypadku jelitowego układu nerwowego) i układu naczyniowego. Osiąga się to poprzez generowanie chimer kurczaków poprzez przeszczepienie dyskretnych segmentów cewy nerwowej i związanego z nią grzebienia nerwowego, w połączeniu z naczyniowym wstrzyknięciem DiI do tego samego zarodka. Nasza metoda wykorzystuje transgeniczne zarodkipiskląt GFP do szczepienia wewnątrzgatunkowego, dzięki czemu technika przeszczepu jest skuteczniejsza niż klasyczny protokół szczepienia międzygatunkowego piskląt przepiórki i pisklęcia, stosowany z dużym skutkiem od lat 70. Wewnątrzgatunkowe szczepienie pisklątGFP ułatwia obrazowanie przeszczepionych komórek i ich projekcji w nienaruszonych tkankach oraz eliminuje wszelkie potencjalne odchylenia w rozwoju komórek związane z różnicami gatunkowymi. Metoda ta w pełni wykorzystuje łatwość dostępu do zarodka ptaka (w porównaniu z innymi zarodkami kręgowców) w celu zbadania współrozwoju jelitowego układu nerwowego i układu naczyniowego.
Wprowadzenie
Zarodek kurczaka jest nieocenionym organizmem modelowym w biologii rozwoju kręgowców, nie tylko dlatego, że jego rozwój in ovo pozwala na eksperymentalne manipulacje, które są niemożliwe do wykonania u kręgowców rozwijających się w macicy. Ta dostępność i łatwość manipulacji doprowadziła do tego, że zarodek pisklęcia odegrał kluczową rolę w wielu przełomowych odkryciach w dziedzinie biologii rozwoju. Jedną z najpotężniejszych technik było wykorzystanie chimerycznych embrionów piskląt przepiórczych do badania losu komórek, metoda zapoczątkowana przez profesor Nicole Le Douarin w latach siedemdziesiątych XX wieku. W szczególności chimery piskląt przepiórczych były szczególnie przydatne do genetycznego znakowania i śledzenia populacji wysoce migrujących komórek grzebienia nerwowego (NCC) we wczesnym okresie rozwoju. NCC to multipotencjalna populacja komórek wędrownych, powstających w ektodermie grzbietowej na brzegach cewy nerwowej, które dają początek szerokiej gamie typów komórek w całym zarodku kręgowców. Należą do nich struktury twarzoczaszki (chrząstki, kości, mięśnie), neurony i glej (w czuciowym i autonomicznym układzie nerwowym), melanocyty oraz subpopulacja komórek układu hormonalnego2,4,5. Jednym z najważniejszych czynników wpływających na losy NCC jest ich początkowe umiejscowienie wzdłuż osi przednio-tylnej cewy nerwowej. Na przykład jelitowe NCC, które dają początek neuronom i glejowi jelitowego układu nerwowego (ENS), powstają z dwóch odrębnych subpopulacji: pierwsza zlokalizowana w okolicy błędnego (ogonowego tyłomózgowia), a druga w okolicy krzyżowej cewy nerwowej6-13. Międzygatunkowe lub wewnątrzgatunkowe przeszczepy odpowiednich regionów cewy nerwowej były technikami z wyboru w celu trwałego znakowania tych komórek, a następnie umożliwienia śledzenia, od ich narodzin na brzegach cewy nerwowej, do ich ostatecznych miejsc przeznaczenia w przewodzie pokarmowym6,7,10.
Kolejną manipulacją embrionalną, łatwiejszą do wykonania u piskląt, w porównaniu do innych modeli zwierzęcych, jest niezbędne oznaczanie układu naczyniowego. Rzeczywiście, gdy zarodek pisklęcia się rozwija, kładzie się na zewnątrz embrionalnej sieci naczyniowej, która krąży tlen i składniki odżywcze z żółtka. Ta dostępna sieć naczyniowa, znajdująca się na powierzchni żółtka, może być wykorzystana jako brama do oznaczania rozwijającego się układu naczyniowego zarodka podczas organogenezy12,14-17. Wstrzyknięcie donaczyniowe różnych barwników, takich jak barwnik lipofilowy DiI, umożliwia wytyczenie/zabarwienie wszystkich rozświetlonych naczyń powstającej sieci naczyniowej.
Ponieważ rozwijające się organy muszą być połączone zarówno z układem nerwowym (dla kontroli sensorycznej i motorycznej), jak i z układem naczyniowym (dla wymiany gazowej, dostarczania płynów i składników odżywczych), obie sieci rozwijają się obok siebie i dzielą uderzająco podobne w swojej rozgałęzionej architekturze18-20. W tym miejscu przedstawiamy manipulacje embrionalne, które pozwalają nam badać jednoczesny rozwój ENS pochodzącego z NCC, wraz z układem naczyniowym, podczas organogenezy. Osiąga się to poprzez generowanie chimer kurczaków poprzez przeszczepienie dyskretnych segmentów cewy nerwowej, w tym grzebienia nerwowego, w połączeniu z naczyniowym wstrzyknięciem DiI. Jako postęp w stosunku do chimer kurczaków przepiórczych, nasza metoda wykorzystuje transgeniczne zarodki piskląt GFP do szczepienia wewnątrzgatunkowego, dzięki czemu technika przeszczepu jest bardziej skuteczna pod względem obrazowania komórek i ich projekcji oraz eliminuje wszelkie potencjalne uprzedzenia związane z różnicami gatunkowymi.
Protokół
1. Przygotowanie mikroskalpela do ablacji cewy nerwowej
- Uformuj mikroskalpel z dostępnej w handlu stalowej igły do szycia.
- Najpierw spłaszcz igłę po obu stronach za pomocą ściernicy zamontowanej na napędzanej szlifierce stołowej.
- Zacznij kształtować skalpel, najpierw na grubym kamieniu z Arkansas, wykonując kontrolowane ruchy okrężne, w naprzemiennych kierunkach, po obu stronach igły.
- Wykonuj te same ruchy ostrzenia na bardzo drobnym kamieniu z Arkansas, aby ukształtować bardzo cienki mikroskalpel z dobrze zarysowaną krawędzią tnącą (Rysunek 1A, B).
UWAGA: Alternatywą dla mikroskalpela mogą być elektrolitycznie ostrzone igły, dostępne w handlu igły wolframowe lub igły ze szkła ciągnionego.
2. Wysiaduj jaja typu dzikiego i GFP do pożądanego etapu
- Zapłodnione jaja kurze i transgeniczne jaja kurze zgodnie z GFP należy przechowywać w schłodzonym inkubatorze w temperaturze 14–15 °C przed inkubacją, ponieważ w tej temperaturze rozwój zostaje zatrzymany. Przechowuj jajka przez kilka dni, do tygodnia.
- Aby rozpocząć rozwój, należy umieścić jaja typu dzikiego i GFP na tacy poziomo i jednocześnie wysiadywać w wilgotnym (58 - 60%) inkubatorze w temperaturze 37,5 ºC, tak aby zarodki były w odpowiednim stadium do przeszczepu cewy nerwowej.
- Aby uzyskać zarodki w 10 - 12 somitowym stadium rozwoju do przeprowadzenia przeszczepu cewy nerwowej błędnej, należy inkubować jaja przez 1,5 dnia (33 - 38 godzin) i etapizować zarodki zgodnie z tabelami rozwoju Hamburgera i Hamiltona21.
3. Przygotuj jaja do okienkowania i szczepienia
- Przenoś jedno jajko na raz do wykonanego na zamówienie uchwytu na jajka w celu okienkowania. Zrób mały otwór w skorupce jajka, kilkakrotnie stukając prostymi nożyczkami w górną powierzchnię spiczastego końca jajka.
- Usunąć 2 - 3 ml albuminy z jaja za pomocą igły podskórnej 181/2 G i strzykawki o pojemności 5 ml. Usunięcie albuminy obniża ilość żółtka w jaju i ułatwia późniejsze okienkowanie, nie powodując żadnych uszkodzeń zarodka.
- Wyrzuć albuminę. Uszczelnij otwór małym paskiem przezroczystej taśmy przyciętej na wymiar cienkimi nożyczkami.
- Za pomocą zakrzywionych nożyczek dotknij kolejnego otworu w górnej powierzchni skorupki jajka. Włóż końcówkę nożyczek do otworu i trzymając nożyczki równolegle do ławki, pracuj okrężnymi ruchami, aby wyciąć okienko o średnicy ~2 cm na wierzchu skorupy.
- Trzymaj nożyczki w pozycji nieruchomej i obróć jajko. Wyrzuć usunięty krążek skorupki jajka. W E1,5 zarodek jest rozpoznawalny jako ciemniejszy żółty krążek na wierzchu żółtka.
- Usuń wszelkie resztki skorupki, które wpadły do jajka za pomocą pęsety. Wyrzuć wszystkie niezapłodnione jaja (oznaczone małą białą plamką na wierzchu jasnożółtego żółtka).
4. Przygotowanie zarodka gospodarza do przyjęcia przeszczepionej tkanki
- Dostosuj mikroskop stereoskopowy do poziomu oczu i zoptymalizuj orientację źródła światła na gęsiej szyi, aby odpowiednio oświetlić zarodek bez powodowania odbić.
- Aby uwidocznić właściwy zarodek, wstrzyknij niewielką ilość tuszu indyjskiego pod środek ciemniejszego żółtego dysku, używając rurki do ust i wyciągniętej szklanej mikropipety (ryc. 1C, Oii).
- Przygotować tusz w proporcji 50:50 z PBS zawierającym penicylinę/streptomycynę w stężeniu końcowym 100 μg/ml. Wprowadzić mikropipetę przez błonę żółtkową na zewnątrz obwodu blastodermy, a następnie ostrożnie ustawić jej końcówkę bezpośrednio pod zarodkiem.
- Dostarcz atrament pod zarodek, w rurkę ustną. Jeśli pipetowanie doustne nie jest dozwolone, należy użyć strzykawki o pojemności 1 ml. Należy uważać, aby nie wprowadzić pod zarodek żadnych pęcherzyków powietrza, które mogą prowadzić do zanieczyszczenia, a następnie ostrożnie wyjmij szklaną mikropipetę. Jest to delikatny krok, który może prowadzić do śmierci zarodka, jeśli nie zostanie wykonany z precyzją.
- Określ stopień zarodka przez odniesienie do Hamburgera i Hamiltona21 i zapisz ten etap w książce laboratoryjnej.
- Za pomocą specjalnie wykonanego mikroskalpela (lub cienkiej igły wolframowej) zamontowanego na uchwycie igły, wykonaj bardzo małe nacięcie w błonie witelinowej, obok obszaru, w którym zostanie wykonana mikrooperacja.
- Ostrożnie nałóż 2-3 krople PBS na pęknięcie błony (za pomocą szklanej mikropipety i rurki ustnej), aby stworzyć przestrzeń między zarodkiem a błoną. Wytnij większe okno w membranie, aby odsłonić cały obszar, w którym odbędzie się mikrooperacja.
- Usuń interesujący Cię obszar cewy nerwowej za pomocą mikroskalpela, zaczynając od rostralnych i ogonowych nacięć poprzecznych na całej grzbietowej cewie nerwowej (na poziomie somitu od 1 do 7 na filmie).
- Przeciąć obustronnie między cewą nerwową a somitami, aby oddzielić cewę nerwową od otaczających tkanek, nie uszkadzając somitów.
- Bardzo delikatnie oddziel cewę nerwową od leżącej pod nią struny grzbietowej, która powinna pozostać nienaruszona. Należy pamiętać, że udane wycięcie cewy nerwowej pozostawi wszystkie otaczające tkanki całkowicie nienaruszone (ryc. 2).
- Usuń wyciętą rurkę neuronową, zasysając ją do szklanej mikropipety, a następnie wyrzuć.
- Zapisz poziom ablacji cewy nerwowej w książce laboratoryjnej. Zarodek gospodarza jest teraz gotowy do przyjęcia cewy nerwowej dawcy.
5. Przygotowanie tkanki przeszczepu dawcy
- Wybierz zarodek GFP z okienkiem, dopasowany do etapu, oglądając go pod fluorescencyjnym mikroskopem stereoskopowym z filtrem FITC. Fluorescencja GFP sprawia, że bardzo łatwo jest uwidocznić somity i zaawansowanie zarodka.
- Po zidentyfikowaniu zarodka dopasowanego do stadium wyjmij zarodek z komórki jajowej, wykonując 4 nacięcia sprężynowymi nożyczkami Pascheffa-Wolffa (ryc. 1C, l) w kształcie prostokąta wokół zarodka, a następnie delikatnie podnieś go łyżką do zarodków.
- Umieść zarodek w kwadratowym szkiełku zegarkowym z polimerową podstawą sylgard. Delikatnie potrząśnij zarodkiem pęsetą Dumont #5, aby usunąć przyczepione żółtko. Usuń błonę witeliny i przypnij zarodek do polimerowej podstawy za pomocą nierdzewnych szpilek do drobniaków (ryc. 1C).
- Za pomocą nożyczek sprężynowych wykonaj 4 nacięcia w kształcie prostokąta wokół cewy nerwowej i otaczających somitów, w tym samym obszarze, który został usunięty z zarodka gospodarza.
- Za pomocą plastikowej pipety transferowej przenieś cewę nerwową i tkanki somitowe z zarodka dawcy GFP do szkła zegarka zawierającego 0,2% pankreatyny w Pen/Strep PBS.
- Pozwól, aby trawienie enzymatyczne postępowało przez 10 minut w temperaturze pokojowej, aby pomóc w oddzieleniu tkanek. Po inkubacji w enzymie użyj nierdzewnych szpilek do drobników zamontowanych na uchwycie, aby ręcznie oddzielić cewę nerwową od wszystkich sąsiednich tkanek.
- Za pomocą szklanej mikropipety przenieś zdysocjowaną rurkę nerwową do innego szkiełka zegarkowego zawierającego DMEM + 10% surowicy (np. kozy, konia lub cielęcia płodowego) na lodzie, aby wypłukać nadmiar trzakatyny i zatrzymać trawienie enzymatyczne. Po 5 minutach wypreparowana cewa nerwowa jest gotowa do ortotopowego wszczepienia do organizmu gospodarza pisklęcia (ryc. 2 i S1).
6. Przeszczep tkankę
- Za pomocą szklanej mikropipety ostrożnie przenieś wypreparowaną rurkę nerwową ze szkła zegarka do zarodka gospodarza. Ustaw cewę nerwową w prawidłowej orientacji przednio-tylnej i delikatnie popchnij eksplant przylegający do wyciętego obszaru gospodarza pisklęcia za pomocą mikroskalpela. Pozostaw mały fragment ektodermy przyczepiony do powierzchni grzbietowej lub wycinając małe nacięcie w niej, aby określić orientację cewy nerwowej.
- W razie potrzeby użyj mikroskalpela, aby przyciąć eksplant do dokładnego rozmiaru wyciętego obszaru.
- Delikatnie wprowadź cewę nerwową do obszaru ablacji i ustaw ją tak, aby strona grzbietowa była prawidłowo zorientowana. Użyj szklanej mikropipety, zamontowanej na rurki ustnej, aby usunąć PBS i/lub płyn otaczający przeszczep. Pomaga to w przyleganiu tkanek dawcy i gospodarza oraz w ustabilizowaniu się przeszczepu.
- Uszczelnij całe okno przezroczystą taśmą o szerokości 24 mm, aby zapobiec odwodnieniu i zanieczyszczeniu.
- Oznacz chimeryczny zarodek, zaznaczając ołówkiem na skorupce jajka i zapisz jego numer w książce laboratoryjnej. Zwróć jajo do inkubatora w celu dalszego rozwoju.
7. Wstrzyknąć DiI do naczyń krwionośnych zarodka gospodarza
- W pożądanym momencie doświadczalnym (w tym przypadku 3 - 10 dni później) wyjmij chimeryczny zarodek z inkubatora i usuń przezroczystą taśmę za pomocą prostych nożyczek, aby uzyskać dostęp do zarodka w jaju.
- W razie potrzeby powiększ okienko w skorupie za pomocą nożyczek. Należy uważać, aby nie uszkodzić błony kosmówkowo-omoczniowej, jeśli jest ona przyczepiona do muszli, co spowodowałoby krwotok i zagroziłoby oznakowaniu naczyń krwionośnych.
- Wybierz dostępną żyłę na żółtku, upewniając się, że przepływ krwi jest skierowany w stronę zarodka. Wybierz punkt rozgałęzienia jednej z żył witeliny (Rysunek 3B, C).
UWAGA: W E6,5 - E7,5 błona kosmówkowo-omoczniowa może wymagać delikatnego odsunięcia na bok pęsetą, aby uzyskać dostęp do żył żółtkowych. Po E8,5 jedyną opcją jest wstrzyknięcie do jednej z żył błony kosmówkowo-omoczniowej, ponieważ na tym etapie błona kosmówkowo-omoczniowa całkowicie pokrywa zarodek. - Usuń błonę witeliny powyżej wybranego punktu wstrzyknięcia za pomocą dwóch pęset Dumont #5, rozrywając w przeciwnych kierunkach.
- Rozbij wyciągniętą szklaną igłę za pomocą Dumont #5 i dostosuj jej średnicę do przybliżonego rozmiaru żyły przed załadowaniem CellTracker CM-DiI. Przygotować roztwór podstawowy DiI o stężeniu 40 μg/μl w DMSO i przechowywać w temperaturze -20 °C. Przygotować roztwór roboczy w 0,3 M sacharozy/PBS o stężeniu 4 μg/μl.
- Odessać od 5 do 10 μl DiI w 0,3 M sacharozy/PBS do igły za pomocą odsysania za pomocą rurki ustnej. Starsze zarodki mogą wymagać do 25 μl lub więcej. Od E8.5 zarodki mają większe, bardziej umięśnione żyły, które mogą wymagać utrzymania w pozycji za pomocą Dumont #5 przed dźgnięciem szklaną igłą obciążoną DiI.
- Szybko włóż igłę do żyły i równomiernie rurką ustną, aby DiI powoli łączyło się z przepływem krwi bez tworzenia skrzepu. Alternatywnie użyj wtryskiwacza ciśnieniowego do dostarczania DiI.
8. Pobieranie zarodków do sekcji lub badania całościowego
- Aby zatrzymać jak najwięcej DiI w zarodku, należy pobrać zarodek natychmiast po wstrzyknięciu, nabierając go na perforowaną łyżkę i przecinając naczynia krwionośne i tkanki łączne prostymi nożyczkami, aby uwolnić zarodek od żółtka.
- Usuń wszelkie luźne błony i wypreparuj interesujące nas narządy (tj. płuca i przewód pokarmowy w tym samouczku), zwracając szczególną uwagę, aby nie ściskać tkanki, co powoduje dyfuzję DiI. Natychmiast utrwalić tkanki przez zanurzenie w 4% PFA na 1 - 2 godziny w temperaturze pokojowej.
- Płukać tkankę przez 5 minut w PBS, a następnie 15 minut w PBS zawierającym 5 μg/ml DAPI. Zamontuj próbki na zmostkowanym szkiełku mikroskopowym w celu zbadania całego mocowania lub osadź je w celu kriosekcji.
Wyniki
Rysunek 1 przedstawia typowe instrumenty wymagane do przeprowadzenia mikrochirurgicznej izolacji i transplantacji rurki neuralnej. Rysunek 2 przedstawia procedurę transplantacji. Po transplantacji zarodki są poddawane ocenie pod kątem sukcesu zabiegu. Polega to na badaniu zarodka pod stereomikroskopem fluorescencyjnym, zazwyczaj rano następnego dnia po mikrochirurgii, w celu stwierdzenia obecności pochodzących z przeszczepu komórek NCC (GFP+). Jeśli transplantacja zakończyła się sukcesem, komórki NCC GFP+ mogą być obserwowane w sąsiedztwie rurki neuralnej oraz w wczesnych szlakach migracyjnych prowadzących w stronę przedjelita. W przypadku niepowodzenia procedury, komórki NCC GFP+ nie będą obserwowane poza rurką neuralną lub, jeśli będą obecne w organizmie biorcy, mogą występować w mniejszej liczbie. Takie nieudane zarodki są odrzucane. Zazwyczaj w ciągu jednego dnia wykonuje się 5-8 transplantacji rurki neuralnej, z czego 80% kończy się sukcesem. Przyczynami nieudanej transplantacji rurki neuralnej mogą być śmierć zarodka wskutek uszkodzeń tkanek powstałych podczas mikrochirurgii lub brak integracji rurki neuralnej z zarodkiem biorcy. To drugie może wynikać ze złego umiejscowienia rurki neuralnej w organizmie biorcy lub z niskiej jakości rurki neuralnej spowodowanej błędną techniką sekcji lub nadmierną ekspozycją na enzym dysocjujący. Wstępny etap oceny, podobnie jak późniejsze badania w celu wykrycia komórek GFP+, jest użyteczny, ponieważ pozwala uniknąć marnowania czasu i zasobów na przeprowadzanie eksperymentów na zarodkach, które nie posiadają znakowanych GFP komórek NCC w obrębie jelit.
Rysunek 3 przedstawia procedurę wstrzykiwania DiI do naczyń krwionośnych. Efektywność/sukces techniki wstrzykiwania DiI zależy od: po pierwsze, przycięcia igły do optymalnej średnicy dla docelowej żyły; po drugie, precyzyjnego ruchu podczas wprowadzania igły do żyły (aby nie przebić przeciwległej ściany) oraz po trzecie, unikania zapchania igły podczas wstrzykiwania poprzez dmuchanie ze stałą prędkością. Jeśli którykolwiek z tych trzech parametrów zostanie wykonany nieprawidłowo, zarodek wykrwawi się lub będzie potrzebował kilku godzin na regenerację przed drugą próbą, ponieważ krwotok niemal uniemożliwia natychmiastowe ponowne wstrzyknięcie. Wybrane pomyślnie zarodki należy niezwłocznie zidentyfikować, obserwując je pod stereomikroskopem fluorescencyjnym, a następnie szybko poddać sekcji. W przypadku udanych prób, naczynia krwionośne znakowane DiI są obecne w całym zarodku (Rysunek 3C,D), w tym w łożach kapilarnych (Rysunek 3D).
Po zbiorze embrionów i badaniu przekrojów tkankowych lub całych preparatów przewodu pokarmowego, typowe wyniki wykazują obecność komórek NCC GFP+ w obrębie prymitywnego ENS oraz drobną strukturę sieci naczyń krwionośnych jelit znakowanych DiI (Rysunek 4). Preparaty całych organów można badać za pomocą mikroskopii konfokalnej, w której stosy obrazów pozwalają na stworzenie rekonstrukcji trójwymiarowych (3D), ukazujących wzajemne zależności między cienkimi wypustkami komórek ENS GFP+ a układem naczyniowym barwionym DiI (Rysunek 4 A-C; G-I; Filmy 1 i 2).
Rysunek 1. Zalecane instrumenty mikrochirurgiczne. (A) mikroskalpel wykonany z igły do szycia. (B) drobnoziarnisty kamień arkansaski do kształtowania mikroskalpela. (C) a) nożyce proste, b) nożyce zakrzywione, c) strzykawka 5 ml z igłą hipodermiczną 181/2 G, d) pipeta plastikowa, e) uchwyt do jaj wykonany na zamówienie, f) czarny tusz, g) kwadratowe szkiełko zegarkowe, h) kwadratowe szkiełko zegarkowe z czarną podstawą z Sylgardu, i) mikroskalpel w uchwycie do igieł, j) piny minutien, k) igła minutien lub wolframowa w uchwycie do igieł, l) nożyczki sprężynowe Pascheffa-Wolffa, m) pęseta Dumont #5, n) łyżeczka perforowana, oi) krótka igła transferowa wyciągana ogniem, oii) długa igła do nakładania tuszu wyciągana ogniem, p) rurka do ust. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
Rycina 2. Wewnątrzgatunkowy przeszczep cewy nerwowej. Obrazy zarodka kurczaka/cewy nerwowej GFP zostały zmodyfikowane z Delalande et al.12. Unaczynienie nie jest niezbędne do kolonizacji jelit przez komórki grzbietowe grzebienia nerwowego. Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Rysunek 3. Dożylna iniekcja DiI. (A) Zalecane narzędzia: a) kropla CellTracker CM-DiI na parafilmie, b) dociągnięta szklana igła do iniekcji, c) rurka do dmuchania. (B) Schemat dożylnej iniekcji DiI do chimerycznego zarodka kurczaka w dniu E4. (C) Dożylna iniekcja DiI in ovo przedstawiająca cienką szklaną igłę z DiI wprowadzoną do żyły (strzałka). (D) Chimeryczny zarodek E4 po iniekcji DiI (czerwony) z neuralną rurką GFP+ (strzałka). (E) Sieć drobnych naczyń krwionośnych zabarwiona DiI w żywym zarodku, 24 h po iniekcji. Br: mózg; H: serce; LB: pączek kończyny; A: allantois. Obrazy w punktach (C) i (D) zostały zmodyfikowane na podstawie pracy Delalande et al.12 Unaczynienie nie jest niezbędne do kolonizacji jelit przez komórki grzbietowe neurulne. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.
Rycina 4: Reprezentatywne wyniki dla żołądka i kątnicy zarodka kurczego w dniu E5.5. (A-C) Rekonstrukcja trójwymiarowa (3D) stosu obrazów konfokalnych w obszarze żołądka pokazująca (D) GFP+ komórki grzebienia neuralnego jelit (ENCC), (E) układ naczyniowy barwiony DiI oraz (F) obraz scalony obu sieci. D-F Przekroje histologiczne na poziomie żołądka pokazujące (G) GFP+ ENCC, (H) układ naczyniowy barwiony DiI oraz (I) obraz scalony obu sieci. Jądra komórkowe są zabarwione DAPI (cyjan). (G-H) Rekonstrukcja 3D stosu obrazów konfokalnych w obszarze kątnicy pokazująca (A) front migracji GFP+ ENCC w kolorze zielonym, (B) układ naczyniowy barwiony DiI w kolorze czerwonym oraz (C) obraz scalony obu sieci. Obrazy (A-F) zostały zmodyfikowane z pracy Delalande et al.12 Unaczynienie nie jest niezbędne dla kolonizacji jelit przez komórki grzebienia neuralnego jelit. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Rycina S1. Izolacja dawczej rurki neuralnej GFP+ z tkanek otaczających poprzez trawienie enzymatyczne i mikrosekcję. (A) Rurka neuralna GFP+ i przyległe somity wypreparowane z embrionu dawcy. (B) Izolowana rurka neuralna po trawieniu pancreatiną i mikrosekcji przy użyciu stalowych mikroigieł. So: somity; NT: rurka neuralna; Nc: notochorda.
Wideo 1. Trójwymiarowy obrót o 360° obrazu z Rysunku 4C, przedstawiający układ naczyniowy i ENCC w żołądku w stadium E5.5 (HH27-28). Kliknij tutaj, aby wyświetlić ten film.
Wideo 2. Trójwymiarowy obrót obrazu z ryciny 4I o 360°, przedstawiający układ naczyniowy oraz front migracji ENCC w obszarze kątnicy w stadium E5.5 (HH27-28). Kliknij tutaj, aby wyświetlić to wideo.
Dyskusja
Opisana tutaj metoda wewnątrzgatunkowego szczepienia cewy nerwowej, w połączeniu z znakowaniem naczyń krwionośnych, w pełni wykorzystuje łatwość dostępu zarodka ptaka do komórki jajowej (w porównaniu z innymi zarodkami kręgowców) do badania wspólnego rozwoju elementu autonomicznego układu nerwowego (ENS) i układu naczyniowego.
Do oznaczania pochodnych NCC, opisana przez nas metoda wewnątrzgatunkowego szczepienia pisklątGFP ma szereg zalet w porównaniu z klasyczną metodą chimery piskląt przepiórczych, która została opracowana ponad 40 lat temu1-3. Po pierwsze, w świetle FITC fluorescencja GFP jest niezwykle jasna, do tego stopnia, że komórki GFP+ są łatwo dostrzegalne w żywych zarodkach chimerycznych. Pozwala to na sprawdzenie powodzenia przeszczepu in ovo, podczas gdy szczepienie piskląt przepiórczych wymaga zabicia, przetworzenia i barwienia immunologicznego zarodka za pomocą QCPN, zanim będzie można stwierdzić powodzenie przeszczepu2. Po drugie, ekspresja GFP w transgenicznym pisklątkuGFP jest cytoplazmatyczna, dlatego nie tylko znakuje ciała komórek, ale także umożliwia wizualizację projekcji przeszczepionych komórek22. Pozwala to na obserwację skomplikowanych sieci neuronalnych w wysokiej rozdzielczości (należy pamiętać, że drobne projekcje są najlepiej wizualizowane, gdy próbka jest wybarwiona immunologicznie przeciwciałem anty-GFP). Ponieważ znakowanie QCPN jest ograniczone do jądra komórki przepiórczej, takie sieci nie są ujawniane za pomocą chimer piskląt przepiórczych. Po trzecie, przeszczepianie wewnątrzgatunkowe eliminuje wszelkie potencjalne różnice gatunkowe między komórkami w obrębie chimerycznego zarodka. Ponieważ zarodki przepiórcze mają krótszy okres inkubacji niż pisklęta (19 dni w porównaniu z 21 dniami), sugeruje się, że komórki przepiórcze mają wyższy wskaźnik proliferacji niż komórki kurcząt, co może potencjalnie wpływać na rozwój tkanek chimerycznych23. Co ciekawe, wykazano również na roślinach, że szczepienie międzygatunkowe może powodować rozległe zmiany we wzorcach metylacji DNA u gospodarza 24. Po czwarte,GFP piskląt ułatwia eksperymenty z przeszczepami wstecznymi w celu poruszenia takich tematów, jak los NCC i zaangażowanie komórek25. Po piąte,transgeniczny GFP piskląt jest również przydatny w wielu innych technikach, w tym w sortowaniu FACS subpopulacji komórek GFP+, hodowli organotypowej narządów zawierających komórki GFP+, manipulacji genetycznej tkanki przeszczepionej GFP+ poprzez elektroporację plazmidów ekspresyjnych26 oraz innych technologii obrazowania, takich jak optyczna tomografia projekcyjna27.
Podejście do przeszczepu cewy nerwowej można zmodyfikować poprzez mikrochirurgiczną wymianę krótszych ilości cewy nerwowej. Dzięki zastosowaniu mniejszych odcinków cewy nerwowej mikrochirurgia jest potencjalnie mniej szkodliwa dla zarodka i można poprawić przeżycie. Jednak wadą przeszczepiania mniejszej ilości cewy nerwowej jest to, że liczba GFP+ NCC w gospodarzu zostanie zmniejszona. Użytkownicy mogą próbować osiągnąć równowagę między ilością przeszczepianej cewy nerwowej w celu zapewnienia optymalnego przeżycia zarodków, a liczbą GFP+ NCC w jelicie gospodarza, wystarczającą do uzyskania pouczających wyników.
W przypadku malowania naczyń DiI ma tę zaletę, że jego fluorescencja jest bardzo jasna i wytrzymała. Ma również zdolność dyfuzji podczas utrwalania, zapewniając zabarwienie najdrobniejszych otwartych naczyń włosowatych. Ponieważ jest to niezbędny barwnik, zarodki mogą przetrwać procedurę wstrzyknięcia i rozwijać się z zabarwionym układem naczyniowym (do 24 godzin w naszych rękach, chociaż barwienie staje się z czasem bardziej punktowe, patrz ryc. 3E). Połączenie szczepieniapiskląt GFP z malowaniem naczyniowym DiI jest zatem kompatybilne z obrazowaniem na żywo. Oprócz tych wszystkich zalet należy zauważyć, że iniekcja naczyniowa oznacza tylko rozświetlone naczynia i dlatego nie identyfikuje nieotwartych naczyń włosowatych, komórek wierzchołka śródbłonka ani izolowanych komórek śródbłonka. Jednak dalszy postęp w transgenezie ptaków może dostarczyć nowych sposobów na obejście takich problemów, czego przykładem są eksperymenty z wykorzystaniem zarodków przepiórczych Tg(tie1:H2B-eYFP) do badania morfogenezy naczyńkrwionośnych 28. Innym ograniczeniem tej techniki jest to, że w celu skutecznego znakowania naczyń w zarodkach w E7,5 i wyższych, konieczne jest wstrzyknięcie większych ilości barwnika, co może sprawić, że eksperymenty będą kosztowne. Jednak modyfikacja techniki może obejmować tanie znakowanie naczyń krwionośnych za pomocą tuszu rozświetlacza14, chociaż takie podejście nie zostało wypróbowane w naszych rękach.
Do krytycznych etapów zabiegów zalicza się proces wizualizacji zarodka poprzez wstrzyknięcie tuszu pod blastodysk. Jeśli błona pokrywająca żółtko zostanie na tym etapie rozerwana przez igłę wypełnioną tuszem, przeżywalność zarodka jest poważnie zagrożona. Ważne jest również, aby podczas przygotowywania cewy nerwowej dawcy tkanka nie pozostawała zbyt długo w pankreatynie (należy wziąć pod uwagę około 10 minut jako maksimum). Długotrwałe narażenie na pankreatynę uszkadza tkankę i cewę nerwową, jest wtedy trudne do opanowania i nie wchłonie się dobrze przez gospodarza. Zdobycie doświadczenia w technice wstrzykiwania DiI na zarodkach typu dzikiego jest niezbędne przed wstrzyknięciem zarodków chimerycznych, ponieważ na ogół możliwa jest tylko jedna próba wstrzyknięcia dla każdego zarodka. Objętość DiI i średnica igły są parametrami krytycznymi dla każdego zarodka i powinny być oceniane w grupie kontrolnej dopasowanej do typu dzikiego.
Podsumowując, nasza metoda podwójnego znakowania polegająca na przeszczepianiu cewy nerwowej i malowaniu naczyń DiI w żywych zarodkach piskląt może być wykorzystana do zbadania wzajemnych relacji między NCC a sieciami naczyń krwionośnych podczas organogenezy. Biorąc pod uwagę, że mechanizmy odpowiedzialne za ustanowienie prawidłowego docelowego unerwienia i unaczynienia podczas rozwoju narządu są nadal w dużej mierze nieznane, metodologia ta ma potencjał dla przyszłych odkryć w tej dziedzinie.
Oświadczenia
Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.
Podziękowania
Zapłodnione jaja kurze GFP zostały dostarczone przez Prof. Helen Sang, The Roslin Institute, oraz University of Edinburgh, UK. Zakład Transgenicznych Kurczaków Roslin jest finansowany przez Wellcome Trust oraz Radę ds. Badań Biotechnologii i Nauk Biologicznych (BBSRC). Praca była częściowo finansowana, a NT wspierana, przez Great Ormond Street Hospital Children's Charity, Londyn, Wielka Brytania. Autorzy dziękują Benowi Jevansowi z UCL Institute of Child Health za pomoc w przygotowaniu zarodków do szczepienia.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Zapłodnione jaja piskląt | Henry Stewart and Co, Louth, Wielka Brytania | ||
| Zapłodnione jaja piskląt GFP | Transgeniczny Zakład Kurcząt, Instytut Roslin, Uniwersytet w Edynburgu | ||
| Inkubator jaj (Profi-H Hatcher) | Lyon Technologies, CA, USA | 910-033 | |
| Inkubator 14C Inkubator | z chłodzeniem precyzyjnym, Leec Ltd., Nottingham, Wielka Brytania | Model LT2 | |
| Mikroskop stereoskopowy | Aparat cyfrowy LEICA | Model MZ 12.5 | |
| Oprogramowanie do pozyskiwania obrazów | LEICA | ||
| 181⁄ Igła podskórna 2 G | SIGMA - ALDRICH | HSWNH181 | |
| Pankreatyna | SIGMA - ALDRICH | P3292 | |
| DMEM | SIGMA - ALDRICH | D5030 | |
| Serum kozie | SIGMA - ALDRICH | G6767 | |
| Strzykawka 5 ml | SIGMA - ALDRICH | Z248010 | |
| Rurka do ust | SIGMA - ALDRICH | A5177 | |
| Pipety Sigma Pasteur bez podłączenia, L 5 3/4 cala. | SIGMA - ALDRICH | S6018 | |
| Pipety transferowe, polietylenowe | SIGMA - ALDRICH | Z350796 | |
| Kapilary ze szkła borokrzemianowego, cienkościenne bez filamentu | Aparat Harvard | PY8 30-0035 | |
| Nożyczki do przysłony - ToughCut | Fine Science Tools | 14058-09 | |
| Nożyczki z zakrzywioną tęczówką - ToughCut | Fine Science Tools | 14059-09 | |
| Uchwyty na igły (niklowany uchwyt na szpilki) | Narzędzia Nauk Pięknych | 26018-17 | |
| Nożyczki sprężynowe Pascheff-Wolff | Narzędzia naukowe | 15371-92 | |
| Kleszcze Dumont #5 | Narzędzia naukowe | 11251-30 | |
| Minutien pins | Fine Science Tools | 26002-15 | |
| Kleszcze AA Dumont, powlekane żywicą epoksydową Inox | Narzędzia Fine Science | 11210-10 | |
| Łyżka perforowana | Fine Science Tools | 10370-18 | |
| Igły wolframowe (średnica 0,125 mm) | Fine Science Tools | 10130-05 | |
| Taśma klejąca (przezroczysta, szerokość 24 mm) | Dowolny dostawca Rozwiązanie | ||
| Pióro/paciorkowiec (penicylina, streptomycyna) | VWR international | 101447-068 | |
| Zestaw elastomerów silikonowych Sylgard 184 | Dow Corning | S09 512 516 | |
| Pelikan tusz | Pelikan | 211-169 | |
| CellTracker CM-DiI | Sondy molekularne | C-7001 | |
| DAPI (4',6-diamidyn-2-fenyloindol, dichlorowodorek) | Sondy molekularne | D1306 | |
| Ustawienia dla ściągacza igieł szklanych | Sutter Instruments | Ściągacz do mikropipet płomieniowy/brązowy model P-86 | |
| Heat 950; Pociągnij 150; Prędkość 100; Czas 200; Ciśnienie 500 |
Bibliografia
- Le Douarin, N. A biological cell labeling technique and its use in expermental embryology. Developmental Biology. 30, 217-222 (1973).
- Teillet, M. A., Ziller, C., Le Douarin, N. M. Quail-chick chimeras. Methods in Molecular Biology. 461, 337-350 (2008).
- Teillet, M. A., Ziller, C., Le Douarin, N. M. Quail-chick chimeras. Methods in Molecular Biology. 97, 305-318 (1999).
- Garcia-Castro, M., Bronner-Fraser, M. Induction and differentiation of the neural crest. Current Opinion In. Cell Biology. 11, 695-698 (1999).
- Bhatt, S., Diaz, R., Trainor, P. A. Signals and switches in Mammalian neural crest cell differentiation. Cold Spring Harbor Perspectives In Biology. 5, (2013).
- Burns, A. J., Douarin, N. M. The sacral neural crest contributes neurons and glia to the post-umbilical gut: spatiotemporal analysis of the development of the enteric nervous system. Development. 125, 4335-4347 (1998).
- Burns, A. J., Le Douarin, N. M. Enteric nervous system development: analysis of the selective developmental potentialities of vagal and sacral neural crest cells using quail-chick chimeras. The Anatomical Record. 262, 16-28 (2001).
- Burns, A. J., Delalande, J. M., Le Douarin, N. M. In ovo transplantation of enteric nervous system precursors from vagal to sacral neural crest results in extensive hindgut colonisation. Development. 129, 2785-2796 (2002).
- Burns, A. J., Champeval, D., Le Douarin, N. M. Sacral neural crest cells colonise aganglionic hindgut in vivo but fail to compensate for lack of enteric ganglia. Developmental Biology. 219, 30-43 (1006).
- Wang, X., Chan, A. K., Sham, M. H., Burns, A. J., Chan, W. Y. Analysis of the sacral neural crest cell contribution to the hindgut enteric nervous system in the mouse embryo. Gastroenterology. 141, 992-1002 (2011).
- Goldstein, A. M., Hofstra, R. M., Burns, A. J. Building a brain in the gut: development of the enteric nervous system. Clinical Genetics. 83, 307-316 (1111).
- Delalande, J. M., et al. Vascularisation is not necessary for gut colonisation by enteric neural crest cells. Developmental Biology. 385, 220-229 (2014).
- Anderson, R. B., Stewart, A. L., Young, H. M. Phenotypes of neural-crest-derived cells in vagal and sacral pathways. Cell And Tissue Research. 323, 11-25 (2006).
- Takase, Y., Tadokoro, R., Takahashi, Y. Low cost labeling with highlighter ink efficiently visualizes developing blood vessels in avian and mouse embryos. Development, Growth & Differentiation. 55, 792-801 (2013).
- Bates, D., Taylor, G. I., Newgreen, D. F. The pattern of neurovascular development in the forelimb of the quail embryo. Developmental Biology. 249, 300-320 (2002).
- Mayes, P., Dicker, D., Liu, Y., El-Deiry, W. Noninvasive vascular imaging in fluorescent tumors using multispectral unmixing. BioTechniques. 45, 459-460 (2008).
- Li, Y., et al. Direct labeling and visualization of blood vessels with lipophilic carbocyanine dye DiI. Nature Protocols. 3, 1703-1708 (2008).
- Eichmann, A., Thomas, J. L. Molecular parallels between neural and vascular development. Cold Spring Harbor Perspectives In Medicine. 3, a006551(2013).
- Weinstein, B. M. Vessels and nerves: marching to the same tune. Cell. 120, 299-302 (2005).
- Carmeliet, P., Tessier-Lavigne, M. Common mechanisms of nerve and blood vessel wiring. Nature. 436, 193-200 (2005).
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. Journal of Morphology. 88, 49-92 (1951).
- Barraud, P., et al. Neural crest origin of olfactory ensheathing glia. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107, 21040-21045 (2010).
- Senut, M. C., Alvarado-Mallart, R. M. Cytodifferentiation of quail tectal primordium transplanted homotopically into the chick embryo. Brain Research. 429, 187-205 (1987).
- Wu, R., et al. Inter-species grafting caused extensive and heritable alterations of DNA methylation in Solanaceae plants. PLoS One. 8, e61995(2013).
- Freem, L. J., Delalande, J. M., Campbell, A. M., Thapar, N., Burns, A. J. Lack of organ specific commitment of vagal neural crest cell derivatives as shown by back-transplantation of GFP chicken tissues. The International Journal Of Developmental Biology. 56, 245-254 (2012).
- Delalande, J. M., et al. The receptor tyrosine kinase RET regulates hindgut colonization by sacral neural crest cells. Developmental Biology. 313, 279-292 (2008).
- Freem, L. J., et al. The intrinsic innervation of the lung is derived from neural crest cells as shown by optical projection tomography in Wnt1-Cre;YFP reporter mice. Journal of Anatomy. 217, 651-664 (2010).
- Sato, Y., et al. Dynamic analysis of vascular morphogenesis using transgenic quail embryos. PloS One. 5, e12674(2010).
Przedruki i uprawnienia
