Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Wyciszanie genów za pośrednictwem chitozanu/interferujących nanocząstek RNA w larwach komarów wektorów chorób

13.9K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/52523

⸱

25 marca 2015

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Division of Biology, Kansas State University, 2Department of Medical and Molecular Genetics, Indiana University School of Medicine, 3Eck Institute for Global Health, University of Notre Dame, 4Department of Biological Sciences, University of Notre Dame, 5Department of Entomology, Kansas State University

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj opisujemy procedurę hamowania funkcji genów u komarów wektorów chorób za pomocą chitozanu/interferujących nanocząsteczek RNA, które są połykane przez larwy.

Streszczenie

Wektorowe komary zadają więcej ludzkiego cierpienia niż jakikolwiek inny organizm - i zabijają ponad milion ludzi rocznie. Projekty dotyczące genomu komarów ułatwiły badania nad nowymi aspektami biologii komarów, w tym funkcjonalne badania genetyczne nad głównym wektorem malarii afrykańskiej Anopheles gambiae oraz wektorem dengi i żółtej febry Aedes aegypti. Wyciszanie genów za pośrednictwem interferencji RNA (RNAi-) zostało wykorzystane do celowania w geny będące przedmiotem zainteresowania u obu tych gatunków komarów wektorów chorób. W tym miejscu opisujemy procedurę przygotowania nanocząstek chitozanu/interferującego RNA, które są łączone z pokarmem i spożywane przez larwy. Ta technicznie prosta, wysokoprzepustowa i stosunkowo niedroga metodologia, która jest kompatybilna z długimi cząsteczkami dwuniciowego RNA (dsRNA) lub małymi interferującymi cząsteczkami RNA (siRNA), została wykorzystana do skutecznego knockknocku wielu różnych genów u larw A. gambiae i A. aegypti. Po karmieniu larw knockdown, który jest weryfikowany za pomocą qRT-PCR lub hybrydyzacji in situ, może utrzymywać się co najmniej do późnego stadium poczwarki. Metodyka ta może mieć zastosowanie do wielu różnych gatunków komarów i innych owadów, w tym agrofagów rolniczych, a także innych organizmów niebędących organizmami modelowymi. Oprócz jego użyteczności w laboratorium badawczym, w przyszłości chitozan, niedrogi, nietoksyczny i biodegradowalny polimer, może być potencjalnie wykorzystywany w terenie.

Wprowadzenie

Żywiące się krwią komary wektorowe z rodzajów Anopheline i Aedine przenoszą czynniki chorobotwórcze odpowiedzialne za kilka najgorszych plag ludzkości. Szacuje się, że 3,4 miliarda ludzi jest zagrożonych zachorowaniem na malarię, która jest odpowiedzialna za ponad pół miliona zgonów rocznie na całym świecie. Malaria wynika z zakażenia pasożytami Plasmodiumsp., które są przenoszone na ludzi poprzez ukąszenia zakażonych komarów z rodzaju Anopheles, w tym głównego afrykańskiego wektora Anopheles gambiae (http://www.who.int/topics/malaria/en/, 2014)1. Aedes aegypti jest głównym wektorem komarów dla wirusa dengi, który powoduje gorączkę denga, niespecyficzną chorobę gorączkową, która jest najbardziej rozpowszechnioną i znaczącą chorobą arbowirusową na świecie. Wirus dengi stanowi obecnie zagrożenie dla >2,5 miliarda ludzi w tropikach, z roczną częstością występowania około 50 milionów przypadków, co skutkuje ~24 000 zgonów rocznie (http://www.cdc.gov/dengue/, 2014)2. Pomimo niszczycielskiego globalnego wpływu chorób przenoszonych przez komary na zdrowie ludzkie, brakuje skutecznych środków zapobiegania i leczenia tych chorób. Zwalczanie komarów jest obecnie najlepszą metodą zapobiegania chorobom.

Potencjał do kontrolowania chorób przenoszonych przez stawonogi poprzez manipulację genetyczną owadów-wektorów jest uznawany od ponad czterech dekad3. Transgeniczne szczepy A. aegypti, zaprojektowane tak, aby miały preparowalny, specyficzny dla samic fenotyp nielota, sprawiły ostatnio, że potencjał stosowania strategii kontroli wektorów transgenicznych stał się rzeczywistością4-6. Postępy te zmusiły naukowców do zidentyfikowania nowych celów genetycznych do kontroli wektorów i dodatkowych sposobów manipulowania funkcją genów u komarów-wektorów. Zmiana ekspresji genów podczas rozwoju, jak to miało miejsce w przypadku samic komarów nielotnych4, może przyczynić się do wyjaśnienia nowych strategii kontroli wektorów. Jednak w dużej mierze ze względu na wyzwania techniczne, funkcje bardzo niewielu genów zostały scharakteryzowane podczas rozwoju A. gambiae, A. aegypti lub innych gatunków komarów.

Od czasu odkrycia u C. elegans7, interferencja RNA (RNAi), która jest zachowana u zwierząt, roślin i mikroorganizmów, jest szeroko stosowana do funkcjonalnych badań genetycznych w wielu różnych organizmach, w tym u owadów8,9. Szlak RNAi jest inicjowany przez Dicer, który rozszczepia długie dsRNA na krótkie siRNA o długości 20-25 nukleotydów, które działają jako specyficzne dla sekwencji interferujące RNA. siRNA wyciszają geny, które są komplementarne w sekwencji, promując obrót transkryptów, rozszczepienie i zakłócenie translacji9. Długie cząsteczki dsRNA (zwykle 300-600 pz) lub niestandardowe siRNA ukierunkowane na określoną sekwencję mogą być używane w laboratorium badawczym do wyciszania dowolnego genu będącego przedmiotem zainteresowania. Zarządzając, kiedy dostarczane jest interferujące RNA, naukowcy mogą kontrolować czas, w którym rozpoczyna się wyciszanie genów. Ta zaleta jest przydatna, ponieważ można ją wykorzystać do przezwyciężenia wyzwań, takich jak śmiertelność rozwojowa lub bezpłodność, które mogą utrudniać produkcję i utrzymanie szczepów zawierających dziedziczne mutacje, co jest kosztownym i pracochłonnym procesem, który nie jest jeszcze dostępny dla wszystkich gatunków owadów. Chociaż stopień wyciszenia genów przez RNAi może się różnić w zależności od genu, tkanki i zwierzęcia, RNAi jest szeroko stosowany do funkcjonalnej analizy genów u komarów i innych owadów8,9.

U komarów zastosowano trzy interferujące strategie dostarczania RNA: mikroiniekcja, moczenie/miejscowe stosowanie i spożycie. Szczegółowa historia i porównanie zastosowania tych trzech technik u owadów znajdują się w Yu i wsp. 8. Z powodzeniem zastosowaliśmy mikroiniekcję10 jako sposób dostarczania siRNA do docelowych genów rozwojowych w zarodkach, larwach i poczwarkach A. aegypti 11-14. Jednak ta pracochłonna strategia dostarczania wymaga zarówno konfiguracji do mikroiniekcji, jak i wprawnej ręki. Co więcej, mikroiniekcja jest stresująca dla organizmu, co jest czynnikiem zakłócającym, szczególnie gdy oceniane są fenotypy behawioralne. Wreszcie, dostarczanie mikroiniekcji nie może być rozszerzone na pole w celu kontroli wektorowej. Alternatywnie, moczenie organizmu w interferującym roztworze RNA stało się również popularnym sposobem wywoływania wyciszania genów, ponieważ jest wygodne i wymaga niewielkiego sprzętu lub pracy. Moczenie było stosowane głównie w badaniach na liniach komórkowych owadów8, ale w niedawnym badaniu nokaut osiągnięto u larw A. aegypti zanurzonych w roztworze dsRNA15, który zwierzęta wydawały się spożywać. Jednak w przypadku badań obejmujących analizę wielu grup eksperymentalnych lub fenotypów, moczenie jest dość kosztowne. Lopez-Martinez i wsp.16 opisało RNAi sterowane rehydratacją, nowatorskie podejście do zakłócającego dostarczania RNA, które polega na odwodnieniu w roztworze soli fizjologicznej i ponownym nawodnieniu pojedynczą kroplą wody zawierającej interferujący RNA. Takie podejście obniża koszty związane z zanurzeniem całego zwierzęcia, ale jest droższe niż mikroiniekcja i może być ograniczone w stosowaniu do gatunków, które tolerują wysokie ciśnienie osmotyczne. Co więcej, trudno jest wyobrazić sobie, w jaki sposób metodologia zanurzenia lub zanurzenia w odwodnieniu/nawodnieniu mogłaby zostać zaadaptowana do kontroli wektorów w terenie. Z tych powodów, w przypadku badań postembrionalnych, dostarczanie interferującego RNA wraz ze spożytym pokarmem jest realną alternatywną strategią.

Chociaż strategie oparte na spożyciu nie działają u wszystkich gatunków owadów, być może przede wszystkim u Drosophila melanogaster, doustne dostarczanie interferującego RNA zmieszanego z jedzeniem przyczyniło się do wyciszenia genów u różnych owadów8,17, w tym u dorosłych A. aegypti 18. Opisaliśmy RNAi za pośrednictwem nanocząstek chitozanu w larwach A. gambiae 19 i z powodzeniem zastosowaliśmy to podejście do redukcji ekspresji genów u larw A. aegypti 20,21. W tym miejscu szczegółowo opisano metodologię tej procedury RNAi, która polega na uwięzieniu interferującego RNA przez polimer chitozan. Nanocząstki chitozanu / interferującego RNA powstają w wyniku samoorganizacji polikacji z interferującym RNA poprzez siły elektrostatyczne między dodatnimi ładunkami grup aminowych w chitozanie a ładunkami ujemnymi przenoszonymi przez grupy fosforanowe na szkielecie interferującego RNA19. Opisana procedura jest kompatybilna zarówno z długimi cząsteczkami dsRNA (zwanymi dalej dsRNA), jak i dwuniciowymi siRNA (zwanymi dalej siRNA). Po syntezie nanocząstki chitozanu/interferującego RNA są mieszane z pokarmem dla larw i dostarczane larwom poprzez spożycie doustne. Metodologia ta jest stosunkowo niedroga, wymaga niewielkiego sprzętu i pracy19 oraz ułatwia wysokoprzepustową analizę wielu fenotypów, w tym analizę zachowań20,21. Ta metodologia, którą można zaadaptować do badań wyciszania genów u innych owadów, w tym innych wektorów chorób i owadzich szkodników rolniczych, może potencjalnie zostać wykorzystana do wyciszania genów u wielu innych gatunków zwierząt. Co więcej, chitozan, niedrogi, nietoksyczny i biodegradowalny polimer22, może być potencjalnie wykorzystany w terenie do zwalczania komarów specyficznych dla danego gatunku.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Gatunki komarów i hodowla

  1. Utrzymać szczepy A. gambiae G3 i A. aegypti Liverpool IB12 (użyte w reprezentatywnych badaniach poniżej) lub inne szczepy będące przedmiotem zainteresowania zgodnie ze standardową praktyką laboratoryjną lub zgodnie z opisem wcześniej23,24.

2. Projektowanie i produkcja dsRNA i siRNA

  1. Zaprojektuj startery do konstruowania długich matryc dsRNA specyficznych dla interesującego genu. Użyj narzędzia E-RNAi25. Wytworzyć dsRNA zgodnie z wybraną metodą lub zgodnie z wcześniejszym opisem19.
    1. W celu kontroli ujemnej należy zsyntetyzować dsRNA19 odpowiadający sekwencji białka zielonej fluorescencji (GFP), β-galaktozydazy (β-gal) lub innego genu nieulegającego ekspresji u komarów. W razie potrzeby, dsRNA19 wykorzystany do wygenerowania reprezentatywnych wyników podsumowanych poniżej może być użyty jako kontrola pozytywna. Przechowywać dsRNA rozpuszczone w wodzie wolnej od RNAzy w temperaturze -80 °C do czasu, gdy będzie potrzebne.
  2. Alternatywnie, zaprojektuj siRNA specyficzne dla genu zgodnie ze standardową praktyką laboratoryjną lub zgodnie z opisem wcześniej10. Zamieszaj sekwencję powalonego siRNA, aby zaprojektować siRNA kontroli negatywnej, które nie odpowiada żadnemu genowi komara. Kup niestandardowe siRNA, które są dostępne u wielu renomowanych dostawców.
    1. W razie potrzeby, siRNA20,21wykorzystane do uzyskania reprezentatywnych wyników podsumowanych poniżej mogą być użyte jako kontrole pozytywne. Przechowywać siRNA rozpuszczone w wodzie wolnej od RNAzy w temperaturze -80 °C do czasu, gdy będzie potrzebne.

3. Przygotowanie chitozanu/interferujących nanocząstek RNA

  1. Zebrać gotowe RT 100 mM siarczanu sodu (100 mM Na2SO4 w dejonizowanymH2O) i 0,1 M octanu sodu (0,1 M NaC2H3O2–0,1 M kwasu octowego, pH 4,5 w dejonizowanymH2O).
  2. Rozpuścić chitozan (≥75% deacetylowany) w 0,1 M buforze octanu sodu w celu uzyskania 0,02% (w/v) roztworu roboczego i przed użyciem utrzymywać roztwór w temperaturze pokojowej.
  3. Rozpuścić dsRNA lub siRNA w 50 μl dejonizowanegoH2Oi dodać go do 100 mM buforu siarczanu sodu, aby uzyskać 100 μl roztworu 32 μg dsRNA/siRNA na 100 μl 50 mM siarczanu sodu.
  4. Dodać 100 μl roztworu chitozanu do roztworu dsRNA/siRNA, a następnie podgrzewać mieszaninę w łaźni wodnej w temperaturze 55 °C przez 1 min. Ustawić kontrolę, dodając 100 μl 50 mM siarczanu sodu do 100 μl roztworu chitozanu i postępować zgodnie z tą samą procedurą.
  5. Roztwory należy natychmiast mieszać przez 30 sekund za pomocą szybkiego wirowania w temperaturze pokojowej, aby ułatwić tworzenie się nanocząstek.
  6. Odwirować mieszaninę przy 13 000 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej, po upływie tego czasu powinna być widoczna osadka. Przenieść supernatant do nowej probówki o pojemności 1,5 ml. Suszyć granulki na powietrzu przez ≈10 minut w temperaturze pokojowej przed użyciem do przygotowania pokarmu dla komarów.
  7. Zmierzyć stężenie dsRNA/siRNA w supernatancie, używając supernatantu z kontroli (patrz 3.5) jako ślepej próby w celu obliczenia całkowitej ilości dsRNA/siRNA, która pozostała w supernatancie. Użyj różnicy między początkowymi ilościami dsRNA/siRNA a ilościami pozostałymi w supernatantach, aby obliczyć procent dsRNA/siRNA uwięzionych w nanocząstkach. Ta wydajność ładowania wynosi zwykle ponad 90%.
  8. Powtórz tę samą procedurę, jeśli potrzebnych jest więcej nanocząstek. Wysuszone nanocząstki należy natychmiast wykorzystać. Wpływ przechowywania cząstek w chłodni przed użyciem nie został oceniony.

4. Przygotowanie pokarmu dla komarów zawierającego chitozan/interferujące nanocząstki RNA

  1. Przygotować 1 ml 2% roztworu agarozy (w/v) w wodzie dejonizowanej, rozpuść agarozę i przed użyciem trzymaj stopiony roztwór agarozy w łaźni wodnej o temperaturze 55 °C.
  2. Wymieszaj płatki pokarmu dla ryb (47% białka surowego, min. tłuszcz surowy 10%, maks. włókno surowe 3%) i suche drożdże w stosunku 2:1 (w/w). Zmiel mieszaninę na małe cząstki za pomocą moździerza i tłuczka (przechodzącego przez standardowe sito testowe nr 50 USA). Zmieloną żywność, która powinna mieć brązowawy kolor, należy natychmiast użyć lub przechowywać w szczelnie zamkniętym pojemniku w temperaturze 4 °C przez kilka tygodni.
  3. W probówce o pojemności 1,5 ml wymieszaj wykałaczką 6 mg zmielonego pokarmu z wysuszonymi nanocząstkami z sekcji 3.7.
  4. Dodać 30 μl 2% wstępnie stopionego roztworu żelu agarozowego do mieszaniny żywności i nanocząstek; natychmiast i dokładnie wymieszać za pomocą wykałaczki lub końcówki do pipetowania.
  5. Użyj żelu zawierającego pokarm i nanocząsteczki, aby natychmiast nakarmić larwy komarów. Alternatywnie, po całkowitym zestaleniu się żelu w temperaturze pokojowej, należy go przechowywać w temperaturze 4 °C i zużyć następnego dnia lub w temperaturze -80 °C do późniejszego użycia.

5. Karmienie larw komarów pokarmem zawierającym chitozan/interferujące nanocząstki RNA

  1. Karmienie larw komarów A. gambiae:
    1. Usuń pojedynczą granulkę żelu z tubki o pojemności 1,5 ml za pomocą wykałaczki i pokrój ją na 6 równych plasterków za pomocą czystej żyletki lub wykałaczki.
    2. Przenieść 20 larw trzeciego stadium rozwojowego na 500 ml szalki Petriego zawierającej 100 ml wody dejonizowanej.
    3. Karm larwy komarów, dodając jeden plasterek granulki żelu (drobno posiekanej na mniejsze kawałki) na szalkę Petriego raz dziennie przez cztery dni. Pamiętaj, aby obserwować larwy żerujące na granulce, które następnego dnia powinny być znacznie zmniejszone lub całkowicie nieobecne. Po pewnym czasie komary rozwiną się w larwy późnego czwartego stadium rozwojowego.
    4. Zapisz wszelkie widoczne zmiany fenotypowe podczas eksperymentu. Zbadaj poziomy transkryptu i inne zmiany fenotypowe, jak omówiono w sekcji 6, pod koniec czterodniowego okresu.
  2. Karmienie larw komarów A. aegypti:
    1. Pokrój granulkę żelu na 6 równych plasterków za pomocą czystej żyletki lub wykałaczki.
    2. Umieść 50 zsynchronizowanych z wiekiem 24 godziny po wykluciu się z jaj larw pierwszego stadium rozwojowego na szalce Petriego w ≈40 ml wody dejonizowanej.
    3. Karm larwy jednym plasterkiem na szalkę Petriego przez 4 godziny dziennie, a następnie przenieś larwy z powrotem do regularnej diety larwalnej składającej się w proporcji 2:1 z mielonych płatków pokarmu dla ryb i suchych drożdży przez resztę dnia. Powtarzaj procedurę codziennie we wszystkich czterech stadiach larwalnych.
    4. Zbadaj poziomy transkryptu i inne zmiany fenotypowe, jak omówiono w sekcji 6, w pożądanych punktach czasowych rozwoju.

6. Potwierdzenie nokautowaluacji genu

  1. Względna kwantyfikacja transkryptu metodą qRT-PCR u larw A. aegypti i A. gambiae.
    1. Wykonaj i przeanalizuj testy qRT-PCR z trzema kontrpróbami biologicznymi na co najmniej 10 zbiorczych larwach kontrolnych i eksperymentalnych, jak opisano11,19,20 lub zgodnie ze standardową procedurą laboratoryjną. Reprezentatywne wyniki znajdują się poniżej.
    2. W celu analizy określonego typu tkanki/części ciała (tj. mózgu lub anteny), należy wykonać qRT-PCR zgodnie z opisem w 6.1.1 po sekcji w celu odzyskania tkanki będącej przedmiotem zainteresowania (na przykład patrz Mysore i wsp.Rozdział 21).
  2. Potwierdzenie knockdown przez hybrydyzację in situ
    1. Zsyntetyzuj antysensowne i kontrolne rybosondy znakowane digoksygeniną zgodnie ze standardową praktyką laboratoryjną lub zgodnie z opisem26.
    2. Wykonaj hybrydyzację in situ zgodnie z Haugen i wsp. 27 Protokół potwierdzenia knockdown, jak opisano wcześniej11,20 i omówiono w sekcji dotyczącej reprezentatywnych wyników poniżej.
  3. Potwierdzenie knockdownu za pomocą immunohistochemii
    1. Jeśli dostępne są przeciwciała przeciwko produktowi białkowemu docelowego genu, należy przeprowadzić immunohistochemię, jak opisano wcześniej28, co ułatwia identyfikację osób z największymi poziomami knockdownu do analizy fenotypu20, jak pokazano w sekcji reprezentatywnych wyników poniżej.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

A. gambiae:

Nanocząstki chitozan/dsRNA powstają w wyniku oddziaływań elektrostatycznych między grupami aminowymi chitozanu a grupami fosforanowymi dsRNA. Efektywność wbudowywania dsRNA w nanocząstki zazwyczaj przekracza 90%, co mierzono na podstawie ubytku dsRNA z roztworu. Obrazy z mikroskopii sił atomowych wykazują, że średnica cząstek chitozan-dsRNA wynosi średnio 140 nm, w zakresie od 100-200 nm (Rysunek 1).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Opisana w niniejszym dokumencie metodologia chitozan/interferujące nanocząstki RNA została wykorzystana do skutecznego celowania w geny podczas rozwoju larwalnego u A. gambiae (ryc. 2, 3) i A. aegypti (ryc. 4, 5, 6, tabele 1, 2). Nanocząstki chitozanu można przygotować z długimi dsRNA lub siRNA, które są z powodzeniem stosowane u komarów, o czym świadczą reprezentatywne wyniki opisane w niniejszym dokumencie. Synteza dsRNA jest tańsza n...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Finansowanie z Kansas Agricultural Experiment Station i K-State Arthropod Genomics Center dla KYZ wsparło oryginalny rozwój wyciszania genów za pośrednictwem chitozanu/dsRNA u A. gambiae19. Opisana tutaj praca A. gambiae była częściowo wspierana przez R01-AI095842 z NIH/NIAID do KM. Rozwój wyciszania genów za pośrednictwem chitozanu / siRNA u A. aegypti20,21 był wspierany przez NIH / NIAID Award R01-AI081795 dla MDS. Za treść tego badania wyłączną odpowiedzialność ponoszą autorzy i niekoniecznie reprezentują one oficjalne poglądy NIH.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Pipeta 0,02 mlRaininPR20do resuspension interferującego RNA
0,2 mlRaininPR200do reinsorpcji interferującego RNA i przygotowania interferującego RNA/nanocząstek
Probówka z podziałką 0,5 ml Fischer Scientific05-408-120do porcjowania rezawieszonego interferującego RNA
1 ml pipetaRaininPR1000do ponownego zawieszenia interferującego RNA i przygotowania interferującego RNA/nanocząstek
1,5 ml rurka miarowa Fischer Scientific05-408-046do przygotowania interferujących RNA/nanocząstek
1M Octan Sodu, pH 4,5TEKnovaS0299do przygotowania buforu octanu sodu
Kwas octowy, AIRSTAR. ACS, USP, FCC GradeBDHVWR BDH3092-500MLPdo przygotowania buforu octanu sodu
Agaroza Genetic Technology GradeMP Biomedicals LLC.800668do powlekania przygotowanych interferujących RNA/nanocząstek
WirówkaEppendorf AG5415Ddo osadzania interferujących RNA/nanocząstek
Chitozan, z muszli krewetekSigma-AldrichC3646-25Gdo łączenia z interferującym RNA w celu przygotowania interferujących RNA/nanocząstek
Suche drożdżeUniversal Food CorpNAdo przygotowania pokarmu dla larw komarów z interferującym RNA/ nanocząstki
Narzędzie E-RNAiNiemieckie Centrum Badań nad RakiemNAdo projektowania dsRNA; http://www.dkfz.de/signaling/e-rnai3//
pokarm dla złotych rybekWardleyGoldfish FLAKE FOODdo przygotowania pokarmu dla larw komarów z interferującymi RNA/nanocząstkami
Podgrzewana kąpiel wodnaThermo Scientific51221048do podgrzewania interferującego RNA/nanocząstek w temperaturze 55oC
Lódnie dotyczy, nie dotyczyrozmrażania interferującego RNA i otrzymywania interferujących RNA/nanocząstek
[nagłówek]
Wiadro na lódFisher Scientific02-591-44do przechowywania lodu używanego podczas zabiegu
sproszkowana wątrobaMP Biomedicals LLC.900396karmić larwy komarów po interferującej obróbce RNA/nanocząstek
Kuchenka mikrofalowaRóżni dostawcynie mają zastosowaniado przygotowania 2% roztworu agarozy
Petrydisz (100 x 15 mm)Fischer Scientific875713interferencyjna komora karmienia RNA/nanocząstek dla larw
pH-metrMettlerToledo S220do przygotowania
ŻyletkaFischer Scientific12-640do podziału interferującego RNA/nanocząsteczki do karmienia
siRNAThermo Scientific/Dharmaconzwyczajdo przygotowania siRNA/nanocząstek
Siarczan sodu, bezwodny (Na2SO4)BDH/dystrybuowany przez VWRVWR BDH0302-500Gw celu przygotowania 50 mM roztworu siarczanu sodu, w którym będzie znajdował się interferujący RNA ponownie zawieszony
termometrVWR61066-046do pomiaru temperatury łaźni wodnej
WykałaczkiVWR470146-908do mieszania podczas zakłócania RNA/nanocząstek Przygotowywanie żywności i krojenie granulek żelu
Zamrażarka o ultraniskiejRóżni dostawcynie mają zastosowaniado przechowywania interferujących podwielokrotności RNA i interferujących RNA/nanocząstek w temperaturze -80oC
Mieszalnik wirowyFischer Scientific02-216-108do przygotowania chitozanu/interferującego RNA
Papierwagowy Fischer ScientificNC9798735do podziału interferującego RNA/nanocząstek do karmienia
pipeta temperaturze

Bibliografia

  1. Malaria. , World Health Organization. http://www.who.int/topics/malaria/en (2014).
  2. Dengue. , Malaria Centers for Disease Control and Prevention. http://www.cdc.gov/dengue/ (2014).
  3. Knipling, E. F., et al. Genetic control of insects of public health importance. Bulletin of the World Health Organization. 38 (3), 421-438 (1968).
  4. Fu, G., et al. Female-specific flightless phenotype for mosquito control. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (10), 4550-4554 (2010).
  5. Wise de Valdez, M. R., et al. Genetic elimination of dengue vector mosquitoes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (12), 4772-4775 (2011).
  6. Harris, A. F., et al. Successful suppression of a field mosquito population by sustained release of engineered male mosquitoes. Nature Biotechnology. 30 (9), 828-830 (2012).
  7. Fire, A., et al. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature. 391 (6669), 806-811 (1998).
  8. Yu, N., et al. Delivery of dsRNA for RNAi in insects: an overview and future directions. Insect science. 20 (1), 4-14 (2013).
  9. Zhang, H., Li, H. C., Feasibility Miao, X. X. limitation and possible solutions of RNAi-based technology for insect pest control. Insect science. 20 (1), 15-30 (2013).
  10. Clemons, A., Haugen, M., Severson, D. W., Duman-Scheel, M. Functional analysis of genes in Aedes aegypti embryos. Cold Spring Harb Protoc. 2010 (10), (2010).
  11. Clemons, A., et al. siRNA-mediated gene targeting in Aedes aegypti embryos reveals that frazzled regulates vector mosquito CNS development. PLoS One. 6 (1), e16730(2011).
  12. Haugen, M., et al. Semaphorin-1a is required for Aedes aegypti embryonic nerve cord development. PLoS One. 6 (6), e21694(2011).
  13. Nguyen, C., et al. Functional genetic characterization of salivary gland development in Aedes aegypti. EvoDevo. 4 (1), 9(2013).
  14. Sarro, J., et al. Requirement for commissureless2 function during dipteran insect nerve cord development. Developmental dynamics: an official publication of the American Association of Anatomists. 242 (12), 1466-1477 (2013).
  15. Singh, A. D., Wong, S., Ryan, C. P., Whyard, S. Oral delivery of double-stranded RNA in larvae of the yellow fever mosquito, Aedes aegypti: implications for pest mosquito control. J Insect Sci. 13, 69(2013).
  16. Lopez-Martinez, G., Meuti, M., Denlinger, D. L. Rehydration driven RNAi: a novel approach for effectively delivering dsRNA to mosquito larvae. Journal of medical entomology. 49 (1), 215-218 (2012).
  17. Scott, J. G., et al. Towards the elements of successful insect RNAi. Journal of insect physiology. 59 (12), 1212-1221 (2013).
  18. Coy, M. R., et al. Gene silencing in adult Aedes aegypti mosquitoes through oral delivery of double-stranded RNA. J Appl Entomol. 136 (10), 741-748 (2012).
  19. Zhang, X., Zhang, J., Zhu, K. Y. Chitosan/double-stranded RNA nanoparticle-mediated RNA interference to silence chitin synthase genes through larval feeding in the African malaria mosquito (Anopheles gambiae). Insect molecular biology. 19 (5), 683-693 (2010).
  20. Mysore, K., Flannery, E. M., Tomchaney, M., Severson, D. W., Duman-Scheel, M. Disruption of Aedes aegypti olfactory system development through chitosan/siRNA nanoparticle targeting of semaphorin-1a. PLoS neglected tropical diseases. 7 (5), e2215(2013).
  21. Mysore, K., Andrews, E., Li, P., Duman-Scheel, M. Chitosan/siRNA nanoparticle targeting demonstrates a requirement for single-minded during larval and pupal olfactory system development of the vector mosquito Aedes aegypti. BMC developmental biology. 14 (1), 9(2014).
  22. Dass, C. R., Choong, P. F. Chitosan-mediated orally delivered nucleic acids: a gutful of gene therapy. Journal of drug targeting. 16 (4), 257-261 (2008).
  23. An, C., Budd, A., Kanost, M. R., Michel, K. Characterization of a regulatory unit that controls melanization and affects longevity of mosquitoes. Cellular and molecular life sciences : CMLS. 68 (11), 1929-1939 (2011).
  24. Clemons, A., Mori, A., Haugen, M., Severson, D. W., Duman-Scheel, M. Culturing and egg collection of Aedes aegypti. Cold Spring Harb Protoc. 2010 (10), (2010).
  25. Horn, T., Boutros, M. E-RNAi: a web application for the multi-species design of RNAi reagents--2010 update. Nucleic acids research. 38, W332-W339 (2010).
  26. Patel, N. H. Ch. 19. In situ hybridization to whole mount Drosophila embryos. A laboratory guide to RNA: Isolation, Analysis, and Synthesis. PA, K. rieg , Wiley-Liss. (1996).
  27. Haugen, M., et al. Whole-mount in situ hybridization for analysis of gene expression during Aedes aegypti development. 2010 (10), Cold Spring Harb Protoc. (2010).
  28. Clemons, A., Flannery, E., Kast, K., Severson, D. W., Duman-Scheel, M. Immunohistochemical analysis of protein expression during Aedes aegypti development. Cold Spring Harb Protoc. 2010 (10), (1101).
  29. Rund, S. S., Hou, T. Y., Ward, S. M., Collins, F. H., Duffield, G. E. Genome-wide profiling of diel and circadian gene expression in the malaria vector Anopheles gambiae. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (32), E421-E430 (2011).
  30. Gaj, T., Gersbach, C. A., Barbas, C. F. 3rd ZFN, TALEN, CRISPR/Cas-based methods for genome engineering. Trends in biotechnology. 31 (7), 397-405 (2013).
  31. Aryan, A., Myles, K. M., Adelman, Z. N. Targeted genome editing in Aedes aegypti using TALENs. Methods. 69 (1), 38-45 (2014).
  32. Sarathi, M., Simon, M. C., Venkatesan, C., Hameed, A. S. Oral administration of bacterially expressed VP28dsRNA to protect Penaeus monodon from white spot syndrome virus. Mar Biotechnol (NY). 10 (3), 242-249 (2008).
  33. He, B., et al. Fluorescent nanoparticle delivered dsRNA toward genetic control of insect pests). Adv Mater. 25 (33), 4580-4584 (2013).
  34. Giljohann, D. A., Seferos, D. S., Prigodich, A. E., Patel, P. C., Mirkin, C. A. Gene regulation with polyvalent siRNA-nanoparticle conjugates. Journal of the American Chemical Society. 131 (6), 2072-2073 (2009).
  35. Davis, M. E., et al. Evidence of RNAi in humans from systemically administered siRNA via targeted nanoparticles. Nature. 464 (7921), 1067-1070 (2010).
  36. Molinaro, R., et al. Polyethylenimine and chitosan carriers for the delivery of RNA interference effectors. Expert opinion on drug delivery. 10 (12), 1653-1668 (2013).
  37. Singha, K., et al. Polymers in small-interfering RNA delivery. Nucleic acid therapeutics. 21 (3), 133-148 (2011).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Nanocz steczki chitozanoweinterferencja RNAprzygotowanie nanocz steczekformowanie peletu paszowegoanaliza qRT PCRhybrydyzacja in situAedes aegyptiAnopheles gambiae
Wyciszanie genów za pośrednictwem chitozanu/interferujących nanocząstek RNA w larwach komarów wektorów chorób
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.