Artykuł metodologiczny

Wielonarządowy chip - platforma mikroprzepływowa do długoterminowej kokultury wielotkankowej

32.3K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/52526

⸱

28 kwietnia 2015

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Medical Biotechnology, Technische Universität Berlin, 2TissUse GmbH, 3Fraunhofer IWS

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj prezentujemy protokół kohodowli komórek pierwotnych, modeli tkanek i biopsji dziurkowania w mikroprzepływowym chipie wielonarządowym przez okres do 28 dni. Ludzkie mikronaczyniowe komórki śródbłonka skóry, agregaty wątroby i biopsje skóry z powodzeniem połączono we wspólnym krążeniu pożywki.

Streszczenie

Ciągle rosnąca ilość nowych substancji wprowadzanych na rynek i ograniczona przewidywalność obecnych systemów testów in vitro doprowadziły do dużego zapotrzebowania na nowe rozwiązania do testowania substancji. Wiele leków, które zostały wycofane z rynku z powodu polekowego uszkodzenia wątroby, uwolniło swój potencjał toksyczny dopiero po kilku dawkach przewlekłych testów na ludziach. Jednak kontrolowane mikrośrodowisko ma kluczowe znaczenie dla długoterminowych eksperymentów z wielokrotnym dawkowaniem, ponieważ nawet niewielkie zmiany w warunkach zewnątrzkomórkowych mogą znacznie wpłynąć na fizjologię komórki. W ramach naszego programu badawczego skupiliśmy się na stworzeniu bioreaktora mikroinżynieryjnego, który może być dynamicznie perfuzjowany przez pompę wbudowaną w układ scalony i łączy co najmniej dwie przestrzenie hodowlane do zastosowań wielonarządowych. Ten układ krążenia lepiej naśladuje warunki in vivo pierwotnych hodowli komórkowych i zapewnia stabilniejsze, bardziej wymierne zewnątrzkomórkowe przekazywanie sygnałów do komórek.

Dla celów demonstracyjnych, odpowiedniki ludzkiej wątroby, wygenerowane przez agregację zróżnicowanych komórek HepaRG z ludzkimi komórkami gwiaździstymi wątroby w wiszących płytkach, były hodowane wspólnie z biopsjami ludzkiej skóry przez okres do 28 dni wewnątrz mikrobioreaktora. Zastosowanie wkładek do hodowli komórkowych umożliwia hodowlę skóry na granicy faz powietrze-ciecz, co pozwala na miejscową ekspozycję na substancję. System mikrobioreaktora jest w stanie utrzymać te kokultury przy przepływie płynów i stosunku objętości do cieczy niemal fizjologicznym, zapewniając stabilne i organotypowe warunki hodowli. Możliwość długotrwałych hodowli umożliwia wielokrotne narażenie na działanie substancji. Co więcej, unaczynienie obwodu kanału mikroprzepływowego przy użyciu ludzkich komórek śródbłonka mikrokrążenia skóry daje fizjologicznie bardziej odpowiedni model naczyniowy.

Wprowadzenie

Obecne testy hodowli komórkowych w monowarstwie lub zawiesinie do opracowywania leków nie są w stanie naśladować mikrośrodowiska komórkowego człowieka, a tym samym prowadzą do szybkiego odróżnicowania i utraty funkcji w pierwotnych hodowlach komórek ludzkich. Modele tkankowe o większym znaczeniu fizjologicznym są potrzebne do przewidywania skuteczności i bezpieczeństwa związków przed dopuszczeniem ich do badań klinicznych. Ostatnio standardowe techniki hodowli komórkowych in vitro ewoluowały od dwuwymiarowych hodowli jednowarstwowych do trójwymiarowych modeli wielokomórkowych, mających na celu naśladowanie mikrośrodowiska tkanek in vivo. Systemy te wykazały już znaczne postępy w zakresie dokładniejszego przewidywania sposobu działania związków 1,2. Ponadto szczególnie interesujące jest dostosowanie warunków hodowli in vitro do wysoce wyspecjalizowanych potrzeb komórek.

W standardowych warunkach in vitro, wiele ważnych parametrów hodowli, takich jak dostarczanie składników odżywczych i tlenu, usuwanie produktów akumulujących się oraz siła mechaniczna działająca na komórki, często nie może być dokładnie kontrolowana w większości przypadków. Wiele narządów posiada fizjologicznie istotne gradienty stężeń substancji i rozpuszczonego tlenu. Jednak te wysoce regulowane i zoptymalizowane warunki są w wyraźnej opozycji do niekontrolowanych gradientów dyfuzji wokół tkanek w warunkach in vitro, co prowadzi do wysoce niestabilnego środowiska i ogranicza rozwój komórkowy 3. W związku z tym potrzebne są bardziej stabilne, a zwłaszcza bardziej wymierne warunki in vitro, aby komórki były żywotne i zróżnicowane przez dłuższy czas. Systemy perfuzjone, w których składniki pożywki są regularnie usuwane i podstawiane, są często lepiej scharakteryzowane i kontrolowane niż hodowle statyczne dotyczące bezpośredniego otoczenia tkanek. W warunkach statycznych gradienty dyfuzji wydzielin komórkowych i składników odżywczych pożywki hodowlanej mogą otaczać hodowane komórki 3. Wprowadzenie dobrze scharakteryzowanych prędkości przepływu pożywki wokół tkanek pozwala wydzielinie komórek mieszać się z bogatą pożywką poprzez perfuzję. Umożliwia to generowanie zdefiniowanych mikrośrodowisk komórkowych, zapewniając stabilny fenotyp komórkowy i ekspresję enzymów metabolizujących przez cały czas trwania testu 4.

Ostatnie osiągnięcia w systemach opartych na wielonarządowych chipach (MOC) łączą korzyści z kontrolowanego przepływu medium wokół zmodyfikowanych tkanek z wymaganiami małych średnich i mas komórkowych bioreaktorów w mikroskali, prowadząc do zmniejszenia ilości substancji potrzebnej podczas testów. Do tej pory opisano kilka systemów mikroprzepływowych do hodowli tkankowych 5,6. Stosunek tkanki do płynu w tych układach odgrywa szczególnie istotną rolę w symulacji fizjologicznie istotnych przesłuchów komórkowych. Jednak ze względu na ograniczenia techniczne, takie jak stosowanie zewnętrznych pomp i zbiorników pożyw, całkowita objętość krążących mediów w większości systemów jest zbyt duża w porównaniu z objętościami tkanek. Grupa Shulera i wsp. była pierwszą, która opracowała system zapewniający prawidłowy czas przebywania substancji w przedziałach hodowli komórkowej oraz istotne in vivo proporcje tkanek do płynów 7,8. Osiągnięto to poprzez zmniejszenie zewnętrznego zbiornika do 96-dołkowej płytki, która również reprezentuje przedział "innych tkanek". Aby zminimalizować objętość krążących mediów w naszej platformie MOC, zintegrowaliśmy perystaltyczną mikropompę na chipie, eliminując potrzebę stosowania zewnętrznych obwodów mediów. Ta mikropompa jest w stanie pracować z systemem przy wybranej liczbie prędkości przepływu mediów i szybkości naprężeń ścinających 9. System kanałów mikroprzepływowych o szerokości 500 μm i wysokości 100 μm łączy ze sobą dwie znormalizowane przestrzenie do hodowli tkankowych, z których każda ma wielkość pojedynczego dołka na płytce 96-dołkowej. Przestrzeganie rozmiarów standardowych płytek dołkowych pozwala na integrację już istniejących modeli tkanek wyprodukowanych w formacie transwell. Co więcej, pionowe położenie wkładek do hodowli komórkowych transwell jest regulowane, co umożliwia hodowlę modeli tkankowych, które są nie tylko bezpośrednio wystawione na przepływ płynu, ale mogą być również podnoszone i osłonięte przed prądem znajdującym się poniżej. Podobnie, przy użyciu tego systemu możliwe są hodowle na granicy faz powietrze-ciecz.

Platforma MOC jest wykonana z warstwy polidimetylosiloksanu (PDMS) o wysokości 2 mm i szklanego szkiełka mikroskopowego o wymiarach 75 x 25 mm2, które są trwale połączone przez utlenianie plazmowe pod niskim ciśnieniem, tworząc szczelny dla płynów obwód mikroprzepływowy. Warstwa PDMS zawierająca odpowiednie kanały i przedziały kultur komórkowych jest wytwarzana przez standardową miękką litografię i formowanie replik 9. Konstrukcja mikroprzepływowa MOC użyta podczas tego badania składała się z dwóch oddzielnych obwodów mikroprzepływowych na chip, z których każdy zawierał dwa przedziały hodowli komórkowej połączone ze sobą systemem kanałów o wysokości 100 μm. Pozwoliło to na przeprowadzenie dwóch indywidualnych dwutkankowych kokultur przy użyciu jednego wielonarządowego chipa. Częstotliwości pompowania dostosowano tak, aby uzyskać natężenie przepływu medium na poziomie 40 μl/min.

Ten dwutkankowy projekt MOC umożliwił kokulturację sferoidu wątroby i biopsji stempla skóry w oddzielnych przestrzeniach hodowlanych, aczkolwiek w połączonym obiegu pożywek w warunkach przepływu fizjologicznego. Zróżnicowane komórki HepaRG agregowano razem z ludzkimi komórkami gwiaździstymi wątroby (HHSteC) w stosunku 24:1, tworząc jednorodne sferoidy. Stosunek ten okazał się optymalny, jak zaobserwowano w poprzednich eksperymentach 10, mimo że użyto prawie dwukrotnie większej liczby hepatocytów w porównaniu z sytuacją in vivo. Skóra była hodowana na granicy faz powietrze-ciecz wewnątrz wkładki do hodowli komórkowej transwell, co umożliwiło miejscową ekspozycję na substancję. Te modele tkankowe były współhodowane przez 28 dni w MOC, aby zademonstrować kompleksowość tego systemu. Co więcej, obwód kanału mikroprzepływowego chipów został w pełni pokryty ludzkimi komórkami śródbłonka mikrokrążenia skóry (HDMEC), aby dokładniej symulować układ naczyniowy.

Protokół

UWAGA: Ludzki napletek młodzieńczy został pobrany za świadomą zgodą i zgodą etyczną (Komisja Etyki Charité University Medicine, Berlin, Niemcy), zgodnie z odpowiednimi przepisami, z operacji dziecięcej po rutynowym obrzezaniu.

1. Produkcja ekwiwalentów tkankowych do uprawy w MOC

  1. Agreguj HepaRG i HHSteC w wiszących płytkach kroplowych, aby wygenerować sferoidy wątroby.
    1. W celu uzyskania trypsynizacji komórek HepaRG hodowanych w kolbach do hodowli komórkowych (75 cm2), należy usunąć pożywkę z napływających, zróżnicowanych kultur jednowarstwowych, dwukrotnie przemyć PBS i dodać 3 ml 0,05% trypsyny/EDTA. Inkubować przez 3-5 minut w temperaturze 37 °C i zatrzymać reakcję przez dodanie 6 ml inhibitora trypsyny.
    2. Odwirować komórki HepaRG przy 150 x g przez 5 minut, usunąć supernatant, ponownie zawiesić osad komórkowy w 1 ml pożywki do hodowli komórkowych HepaRG i policzyć komórki. Żywotność komórek powinna wynosić >90%.
    3. W celu uzyskania trypsynizacji komórek HHSteC należy usunąć pożywkę z kultur jednowarstwowych, dwukrotnie przemyć PBS i dodać 3 ml 0,05% trypsyny/EDTA. Inkubować przez 5 minut w temperaturze 37 °C i zatrzymać reakcję przez dodanie 6 ml inhibitora trypsyny.
    4. Odwirować komórki HHSteC przy sile 150 x g przez 5 minut, usunąć supernatant, ponownie zawiesić osad komórkowy w 1 ml pożywki do hodowli komórkowych HepaRG i policzyć komórki.
    5. Połącz HepaRG i HHSteC w stosunku 24:1 w pożywce do hodowli komórkowych HepaRG. Aby to zrobić, dostosuj liczbę komórek, rozcieńczając zawiesiny komórek w pożywce do hodowli komórek HepaRG i dodaj 1 x 105 komórek/ml HHSteC do 4,8 x 106 komórek/ml komórek HepaRG. Dokładnie wymieszaj.
    6. Przygotować wiszącą płytkę kroplową, dodając 2 ml PBS do wiszącej kropli i płytki odbiorczej.
    7. Odpipetować pipetą 20 μl zawiesiny komórek do każdego dołka wiszącej płytki kroplowej. Zawsze przygotuj około 10% więcej zwisających kropli niż potrzebujesz do odzyskania kruszywa, ponieważ niektóre kruszywa giną podczas zabiegu. Ostrożnie umieścić płytkę w inkubatorze o temperaturze 37 °C. Odczekaj 48 godzin, aż uformują się sferoidy.
    8. W celu wyjęcia sferoid należy użyć końcówek do pipet z szerokimi końcówkami lub odciąć końcówki końcówek do pipet o pojemności 1 ml sterylnym nożem, aby poszerzyć otwór do około 2 do 3 mm. Użyj tych końcówek do pipet, aby obchodzić się ze sferoidami bez ich naruszania.
    9. Ostrożnie zmyć sferoidy z wiszącej płytki kroplowej, kilkakrotnie dodając 1 ml pożywki do górnej części dołków wiszącej płytki kroplowej za pomocą pipety. Myj płytkę, aż wszystkie sferoidy odpadną. Sferoidy mają lekko dyskowaty kształt o średniej średnicy od 300 do 400 μm i wysokości od 200 do 300 μm w tym miejscu.
    10. Zbierz sferoidy z płytki odbiorczej i przenieś je do 24-dołkowych płytek o bardzo niskim mocowaniu z maksymalnie 20 sferoidami na studzienkę za pomocą przygotowanych końcówek do pipet. Dostosuj objętość podłoża w każdym dołku do 0,5 ml. Użyj 20 agregatów do zaszczepienia jednego obwodu MOC, aby uzyskać współczynnik miniaturyzacji 1/100 000 w odniesieniu do liczby komórek in vivo.
    11. Inkubować sferoidy w temperaturze 37 °C i 5% CO2 aż do dalszego wykorzystania w MOC. Nie przechowuj sferoidów dłużej niż trzy dni przed użyciem, aby zapewnić porównywalność. Agregaty należy uprawiać przez co najmniej jeden dzień na bardzo niskich płytach mocujących, aby uzyskać jednorodne sferoidy.
  2. Należy zastosować jedno z dwóch podejść w celu uzyskania ekwiwalentów tkanki skórnej: zastosowanie biopsji dziurkowej (1.2.1) lub użycie gotowych modeli tkanek in vitro (1.3.1).
    1. Pokrój transwelle za pomocą żarowego noża poniżej wspornika, aby przygotować 96-dołkowe wkładki do hodowli komórkowych i przechowuj w sterylnych warunkach do dalszego użycia.
    2. Sterylizuj próbki napletka w 80% etanolu przez 30 sekund i rozetnij pierścień. Próbki powinny mieć średnią wysokość 2 mm.
    3. Użyj stempla do biopsji, aby wyciąć biopsje o średnicy 4,5 mm, aby uzyskać równy współczynnik miniaturyzacji zarówno wątroby, jak i skóry. Załaduj biopsje do przygotowanych 96-dołkowych wkładek transwell za pomocą kleszczy. Należy zwrócić uwagę, aby ułożyć biopsje stroną naskórkową skierowaną do góry.
    4. Umieścić wkładki do hodowli komórkowych z biopsjami na płytce odbiorczej zawierającej pożywkę do hodowli komórkowych HepaRG i przechowywać w temperaturze 37 °C i 5% CO2 do czasu dalszego użycia w MOC. Nie przechowuj próbek dłużej niż 2 do 3 godzin.
  3. Zintegruj gotowe modele skóry in vitro, zakupione od różnych dostawców, z MOC, upewniając się, że są one w formacie transwell 96-dołkowym. Należy użyć pożywki do hodowli komórkowej dostarczonej przez sprzedawcę lub, jeśli w dalszym etapie przewiduje się kohodowlę z inną tkanką, użyć minimalnej pożywki podtrzymującej obie tkanki. Zbadać odpowiednią minimalną pożywkę w poprzednich eksperymentach statycznych pod kątem jej zdolności do podtrzymywania tkanek.
    1. Wyjmij modele skóry z płyty uchwytu i wytnij 96-dołkowe wkładki poniżej wspornika za pomocą żarowego noża.
    2. Umieść wkładki z powrotem w płycie odbiornika i przechowuj w temperaturze 37 °C i 5% CO2 do dalszego użycia w MOC. Nie przechowuj próbek dłużej niż jeden dzień.

2. Produkcja MOC

  1. Wymieszaj PDMS i utwardzacz w stosunku 10:1 (v/v) i umieść mieszaninę w próżni na 15 minut, aby usunąć pęcherzyki powietrza.
  2. W międzyczasie pokryć poliwęglanową płytę osłonową dodatkiem kauczuku silikonowego w temperaturze 80 °C przez 20 minut.
  3. Włóż teflonowe do odpowiednich otworów w płycie pokrywy, aby utworzyć cztery komory do hodowli komórkowych wolne od PDMS i sześć membran PDMS o grubości 500 μm mikropompy.
  4. Podłączyć przygotowaną pokrywę do formy głównej dwóch obwodów mikronaczyniowych i wstrzyknąć odgazowany PDMS. Należy uważać, aby nie wbudowywać pęcherzyków powietrza w system. Jeśli pojawią się bąbelki, spróbuj je usunąć, przechylając urządzenie.
  5. Inkubować system w temperaturze 80 °C przez 60 minut w celu utwardzenia warstwy PDMS.
  6. Wyjmij formę wzorcową i teflonowe z urządzenia i przymocuj warstwę PDMS do szkiełka o wymiarach 75 x 25mm2 za pomocą niskociśnieniowego utleniania plazmowego.
  7. Przykręć adaptery MOC ze specjalnym gwintem do wszystkich czterech komór hodowli komórkowych płyty pokrywy.
  8. Podłączyć strzykawki zawierające pożywkę hodowlaną do żeńskich adapterów męskich Luer x 1/4-28 i przykręcić je do adapterów MOC na pokrywie.
  9. Wstrzyknąć pożywkę do obwodu mikroprzepływowego, kilkakrotnie naciskając i pociągając w górę tłoki strzykawki.
  10. Sprawdź pod mikroskopem prawidłowe wypełnienie kanałów pożywką.

3. Endotelializacja MOC

  1. Przed endotelializacją MOC przepłukać każdy obwód MOC pożywką do wzrostu komórek śródbłonka i inkubować statycznie przez trzy dni w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .
    1. Wysterylizuj MOCs za pomocą chusteczki etanolowej i umieść je pod ławką z przepływem laminarnym. Ponadto wysterylizuj dwie pary kleszczyków i dwa klucze sześciokątne do dalszego użytku.
    2. Poluzuj nasadki komory hodowli tkankowej MOC za pomocą kluczy sześciokątnych i zdejmij nasadki za pomocą kleszczy. Po włożeniu podłoża w ten sam sposób przykręć nakrętki z powrotem do MOCów.
  2. W celu uzyskania trypsynizacji ludzkich komórek mikronaczyniowych śródbłonka skóry (HDMEC), należy usunąć pożywkę z kultur jednowarstwowych, dwukrotnie przemyć PBS i dodać 3 ml 0,05% trypsyny/EDTA. Inkubować przez 5 minut w temperaturze 37 °C i zatrzymać reakcję przez dodanie 6 ml inhibitora trypsyny.
  3. Odwirować HDMEC przy 220 x g przez 5 minut, usunąć supernatant, ponownie zawiesić osad komórkowy w 1 ml pożywki do wzrostu komórek śródbłonka i policzyć komórki. Żywotność komórek powinna wynosić >90%.
  4. Doprowadzić liczbę komórek w zawiesinie komórkowej do końcowego stężenia 2 x 107 komórek/ml, rozcieńczając ją pożywką do wzrostu komórek śródbłonka i przenieść 250 μl do strzykawki o pojemności 1 ml. Zastosuj tę koncentrację komórek do MOC, aby utrzymać szybkość miniaturyzacji 1/100 000 dla wszystkich narządów.
  5. Podłączyć strzykawkę do żeńskiego adaptera męskiego Luer x 1/4-28, usunąć powietrze z tej złączki i przykręcić ją do specjalnego adaptera MOC z gwintem. Podłącz adapter do jednej z dwóch komór każdego obwodu MOC.
  6. W ten sam sposób podłączyć pustą strzykawkę do drugiej komory obwodu MOC.
  7. Wstrzyknąć komórki równomiernie, naciskając i pociągając w górę dwa tłoki strzykawki kilka razy z rzędu. Kontroluj napar komórek pod mikroskopem.
  8. Inkubować MOC w temperaturze 37 °C i 5% CO2 w warunkach statycznych przez 3 godziny, aby umożliwić komórkom przyleganie do ścianek kanału.
  9. Wyjmij chip z inkubatora, umieść go pod stołem do laminarnego przepływu, a strzykawki i adaptery MOC zastąp specjalnymi gwintowanymi komorami do hodowli komórkowych MOC.
  10. Dodać 400 μl świeżej pożywki do jednej komory każdego obwodu MOC i pozwolić mu przepłukać kanały pod ciśnieniem hydrostatycznym. Następnie zastąp pożywkę w obu komorach 300 μl świeżej pożywki.
  11. Zamknąć komory za pomocą zaślepek, jak opisano w ppkt 3.1.2.
  12. Podłącz chip do jednostki sterującej pompy. Dostosuj prędkość pompowania do częstotliwości 0,475 Hz i hoduj wióry w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .
  13. Wymieniaj pożywkę w każdej komorze MOC co jeden do dwóch dni i monitoruj morfologię komórek za pomocą mikroskopii świetlnej.

4. Ładowanie chipa

  1. Umieść MOC pod ławką z przepływem laminarnym i otwórz ją, jak opisano w kroku 3.1.2.
  2. Usunąć pożywkę z komór kultur tkankowych i zastąpić ją 300 μl świeżej pożywki do hodowli komórkowych HepaRG.
  3. Przenieść 20 wstępnie uformowanych sferoid do jednego przedziału hodowli tkankowej każdego obwodu MOC za pomocą końcówek pipet z szerokim otworem (patrz kroki 1.1.8/9). Zamknij nasadkę za pomocą kleszczy i kluczy sześciokątnych.
  4. Przenieś 96-dołkowe wkładki do hodowli komórkowych zawierające odpowiedniki skóry do pozostałego przedziału hodowli tkankowej każdego obwodu MOC za pomocą kleszczy. Uważaj, aby nie tworzyć się pęcherzyków poniżej błony odpowiednika skóry. W tym celu włóż transwelle pod lekko pochylonym kątem i delikatnie dociśnij. Usunąć nadmiar pożywki wokół transwella, który jest wypychany od dołu za pomocą pipety.
  5. Zamknij nasadkę za pomocą kleszczy i kluczy sześciokątnych.

5. Podłączanie układu scalonego do jednostki sterującej pompy

  1. Ustaw parametry operacyjne w jednostkach sterujących na żądane wartości. Zmień ciśnienie powietrza od 0 do 8 000 mbar, podciśnienie od 0 do -800 mbar i częstotliwość pompowania od 0,24 do 2,4 Hz. Ustaw kierunek pompowania zgodnie z ruchem wskazówek zegara lub przeciwnie do ruchu wskazówek zegara.
  2. Wyjąć MOC zawierającą ekwiwalenty tkankowe spod stołu laminarnego i podłączyć go do jednostek sterujących pompy.
  3. Postępując zgodnie z numeracją na rurkach, włóż rurkę ciśnieniową powietrza do odpowiednich złączek na MOC.
  4. Hodować MOC w temperaturze 37 °C i 5% CO2 w inkubatorze lub, w przypadku obrazowania żywych tkanek, użyć nośnika MOC do podgrzania chipa do 37 °C i wyhodować go poza inkubatorem. Użyj podgrzanego podłoża do hodowli komórek w MOC pod standardowym mikroskopem.

6. Przeprowadzanie wymiany mediów, pobieranie próbek z mediów i narażenie na działanie substancji

  1. Wykonuj rutynową wymianę pożywek codziennie lub co drugi dzień, biorąc pod uwagę rodzaj hodowanej tkanki i aktywność metaboliczną komórek.
    1. Wyjmij MOC z inkubatora i obserwuj go pod mikroskopem, aby kontrolować natężenie przepływu pożywki i sprawdzić, czy nie ma zanieczyszczeń.
    2. Odłącz MOC od jednostki sterującej pompy, odłączając przewód ciśnieniowy powietrza. Wysterylizuj MOC za pomocą chusteczek na etanol i umieść go pod ławką z przepływem laminarnym.
    3. Otworzyć komorę hodowli tkankowej zawierającą sferoidy wątroby, jak opisano w kroku 3.1.2.
    4. Usunąć do 200 μl z komory za pomocą pipety bez naruszania sferoid i przechowywać pożywkę w pustym dołku na płytce głębinowej. Przeprowadzić bezpośrednią analizę próbki pożywki lub zamknąć płytkę głębinową i przechowywać próbki pożywki w temperaturze -80 °C do dalszej analizy.
    5. Zastąp pożywkę MOC roztworem o objętości do 250 μl pożywki do hodowli świeżych komórek i zamknij nakrętkę. Różnica w ilości usuniętego i wymienionego nośnika odpowiada za straty spowodowane niewielkimi ilościami wyciekającymi z chipa podczas zamykania systemu.
    6. Otwórz w tym miejscu nasadkę komory hodowli tkankowej, w której znajdują się odpowiedniki skóry, aby sprawdzić, czy tkanka jest nienaruszona. Należy uważać, aby nie wprowadzać pęcherzyków powietrza do układu. Zamknij korek.
    7. Podłącz rurkę jednostki sterującej pompy do MOC, zgodnie z krokiem 5.3, i umieść MOC w inkubatorze.

7. Analizuj codzienne próbki mediów i przeprowadzaj analizę on-line

  1. Analizuj wydajność hodowli tkankowych w trybie on-line za pomocą obrazowania żywych komórek lub offline, analizując codzienne próbki pożywek. Tę ostatnią należy przeprowadzić za pomocą standardowych rutynowych testów enzymatycznych (np. aktywność dehydrogenazy mleczanowej (LDH)) lub ELISA (np. stężenie albuminy). Analiza online jest opisana poniżej.
  2. Usunąć pożywkę z śródbłonkowego MOC, jak opisano w krokach 6.1.1 do 6.1.4, i zastąpić go w obu przedziałach hodowli tkankowej 200 μl 10 μg/ml sprzężonego z fluoroforem roztworu acetylowanej lipoproteiny o niskiej gęstości (LDL) (rozcieńczonego w pożywce do hodowli komórkowych).
  3. Zamknij zaślepki. Podłącz MOC do jednostki sterującej pompy, zgodnie z krokiem 5.3, i pompuj ją przez 30 minut z częstotliwością 0,475 Hz, aby równomiernie rozprowadzić roztwór w obwodzie mikroprzepływowym.
  4. Przerwać pompowanie i inkubować MOC statycznie przez 3,5 godziny w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .
  5. Podobnie jak w kroku 7.2, usuń acetylowany roztwór LDL z obu komór i zastąp go 400 μl świeżej pożywki w jednej z dwóch komór.
  6. Odczekaj od 3 do 5 minut, aby ciśnienie hydrostatyczne przepuściło medium przez obwód kanału mikroprzepływowego.
  7. Zastąp pożywkę, przez którą przepłynęła, 300 μl świeżej pożywki, a także wypełnij drugi przedział hodowli tkankowej 300 μl świeżej pożywki.
  8. Zamknij MOC, zgodnie z krokiem 3.1.2. Umieść go pod mikroskopem fluorescencyjnym i obserwuj wzrost i żywotność komórek.
  9. Umieść zabarwiony MOC z powrotem w inkubatorze, aby kontynuować uprawę. Usuń plamę wyciekającą z komórek przy każdej kolejnej wymianie nośnika.

8. Pobierz ekwiwalenty tkankowe z MOC i wykonaj analizy punktu końcowego

  1. Pobierz ekwiwalenty tkankowe z MOC na końcu eksperymentu w celu analizy punktu końcowego.
    1. W celu pobrania odpowiedników wątroby i skóry z MOC, należy usunąć pożywkę z każdego przedziału kultury tkankowej, jak opisano w krokach 6.1.1 do 6.1.4.
    2. Usuń 96-dołkowe wkładki do hodowli komórkowych zawierające skórę z MOC za pomocą kleszczy. Ostrożnie oderwij membranę od wkładu, chwytając ją z jednej strony kleszczami i pociągając w dół. Uważaj, aby w tym momencie nie stracić odpowiednika skórnego.
    3. Zamrozić membranę zawierającą odpowiednik skóry w związku do zatapiania w krioterapii i przechowywać ją w temperaturze -80 °C do czasu dalszej analizy.
  2. W podobny sposób usunąć ich odpowiedniki wątrobowe z komory hodowli tkankowej, pipetując je za pomocą odciętych końcówek pipet (patrz krok 1.1.8/9).
    1. Osadź sferoidy wątroby w związku do zatapiania w krio. Uważaj, aby nie przenieść zbyt dużej ilości płynu i usunąć nadmiar płynu za pomocą pipety. Po umieszczeniu sferoid na masie zatapiającej i usunięciu pożywki, dodaj kolejny związek kriogeniczny na wierzch sferoid, aby całkowicie je zamknąć.
    2. Zamrozić ekwiwalenty wątroby i przechowywać je w temperaturze -80 °C do czasu dalszej analizy.
  3. Przeprowadzić analizę punktu końcowego, przycinając równoważniki tkankowe w kriomikrotomie do odcinków 8 μm i barwiąc w celu uzyskania markerów specyficznych dla tkanki, jak opisano w poprzednich protokołach 10.

Wyniki

Standardowe hodowle tkankowe in vitro są prowadzone w warunkach statycznych, co ogranicza dyfuzję tlenu i dopływ substancji odżywczych do tkanek. Systemy fluidyczne, wykazujące lepsze właściwości dostarczania tych składników, są często utrudnione przez duże zapotrzebowanie na medium, wykazując niefizjologicznie wysokie stosunki objętości medium do tkanki. W rezultacie metabolity ulegają rozcieńczeniu, a komórki nie są w stanie odpowiednio modyfikować swojego otoczenia. Przedstawiony w niniejszym badaniu MOC łączy dwie oddzielne komory hodowli tkankowej, z których każda ma rozmiar pojedynczego dołka standardowej płytki 96-dołkowej, za pomocą mikrofluidycznego systemu kanałów. Mała skala systemu oraz integracja pompy na chipie pozwalają systemowi pracować przy objętościach mediów wynoszących zaledwie od 200 do 800 µl. Odpowiada to całkowitemu systemowemu stosunkowi medium do tkanki od 8:1 do 31:1 odpowiednio dla kokultur tkanek wątroby i skóry (o całkowitej objętości tkanki wynoszącej około 26 µl). Całkowita objętość płynu pozakomórkowego u człowieka o masie 73 kg wynosi 14,6 L, z czego objętość płynu międzykapilarnego to 5,1 L, co prowadzi do fizjologicznego stosunku płynu pozakomórkowego do tkanki wynoszącego 1:4. Zatem ilość mediów w całym systemie krążenia w MOC jest nadal większa w porównaniu z sytuacją fizjologiczną; mimo to stanowi ona najniższy zgłoszony dotychczas stosunek medium do tkanki dla systemów wieloorganowych 5. Ponieważ zachowano standardowe przemysłowe formaty hodowli tkankowej, badacze mogą łączyć istniejące i już zwalidowane statyczne modele tkankowe w obrębie wspólnego przepływu płynu. Rycina 1 przedstawia schemat układu eksperymentalnego możliwych jednotkankowych lub wielotkankowych kokultur MOC. Pierwotne biopsje tkanek oraz równoważniki tkanek generowane in vitro z linii komórkowych lub komórek pierwotnych mogą być hodowane albo przy użyciu wkładek do hodowli komórkowej do płytek 96-dołkowych, albo poprzez ich bezpośrednie umieszczenie w komorach hodowli tkankowej. Ponieważ system kanałów łączący komory hodowli komórkowej ma wysokość zaledwie 100 µm, równoważniki tkanek przekraczające te wymiary pozostaną wewnątrz komór hodowlanych. Endotelializacja obwodu MOC za pomocą pierwotnych HDMECs umożliwia dalszy krok w stronę bardziej fizjologicznych warunków hodowli poprzez zapewnienie biologicznej struktury naczyniowej.

Schemat mikroprzepływowego organu na chipie z ludzkimi komórkami HDMEC, biopsjami tkanek, kokulturą i układem perfuzyjnym.
Rycina 1: Schematyczne przedstawienie kultur MOC. Ekwiwalenty tkanek są przygotowywane w standardowych warunkach in vitro, wprowadzane do MOC i hodowane jako monokultury lub kokultury w warunkach dynamicznych. Wykonywane są codzienne pobrania próbek pożywki oraz analizy końcowe. Ciśnienie powietrza napędzające pompę jest dostarczane przez trzy niebieskie rurki podłączone do MOC od góry. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

Zgodnie z protokołem endotelializacji, w ciągu czterech dni hodowli dynamicznej uzyskano konfluentną warstwę komórek HDMEC pokrywającą obwód kanałów mikrofluidycznych, co przedstawiono na Rysunku 2. Komórki łatwo przylegają do ścianek kanału MOC, tworzą konfluentną monowarstwę i wydłużają się zgodnie z kierunkiem naprężenia ścinającego (Rysunek 2B). Co więcej, komórki pokrywają cały obwód kanałów, co zgłoszono we wcześniejszych doniesieniach 9. Po czterech dniach hodowli, aż do jej zakończenia, nie zaobserwowano dalszych zmian w morfologii śródbłonka.

Obrazy z mikroskopii fluorescencyjnej przedstawiające struktury komórkowe; analiza składu tkankowego i komórkowego.
Rycina 2: Zendotelizowane kanały MOC. Ludzkie mikro naczyniowe komórki śródbłonka skóry (HDMEC) utworzyły konfluencyjną monowarstwę w obwodzie mikrofluidycznym. Komórki barwiono acetylowanym LDL po 23 dniach hodowli MOC. (A) Cały obwód mikronaczyniowy został pokryty komórkami oraz (B) komórki wydłużyły się wzdłuż kierunku naprężenia ścinającego. Paski skali: (A) 1,000 µm oraz (B) 100 µm.

W kolejnym eksperymencie, podczas dwudniowej hodowli metodą wiszącej kropli, z komórek HepaRG i HHSteC utworzono jednorodne, dyskowate sferoidy komórek wątrobowych, ponieważ system ten był wcześniej opisywany jako odpowiedni do badań nad metabolizmem leków 11–13. W celach demonstracyjnych w jednym przedziale hodowli tkankowej każdego obwodu MOC umieszczono 20 sferoidów w insertach do hodowli komórkowej w płytkach 96-dołkowych, a tkanki hodowano przez 14 dni w warunkach dynamicznych z wykorzystaniem nieuendotelializowanych MOC. Dowolna liczba agregatów lub ilość materiału pierwotnego może zostać zintegrowana bezpośrednio w przedziałach lub z wykorzystaniem insertów do hodowli komórkowej. Barwienie immunofluorescencyjne sferoidów po wyjęciu z MOC wykazuje silną, homogeniczną ekspresję typowej dla wątroby cytokeratyny 8/18 oraz enzymów metabolizujących fazy I: cytochromu P450 3A4 i 7A1 (Rycina 3A i 3B). Barwienie transportera kanalikowego białka oporności wielolekowej 2 (MRP-2) ujawniło polaryzację fenotypową oraz istnienie rudymentarnych sieci przypominających kanaliki żółciowe (Rycina 3C).

Obrazy z mikroskopii fluorescencyjnej z przekrojów tkankowych ukazujące struktury komórkowe w różnych wzorach barwienia.
Rysunek 3:. Hodowla ludzkich sztucznych mikro-tkanek wątrobowych w MOC. Agregaty wątrobowe hodowane przez 14 dni w MOC zostały zabarwione na (A) cytokieratynę 8/18 (czerwony) oraz (B) cytochrom P450 3A4 (czerwony) i 7A1 (zielony). (C) Ekspresja kanalikowego transportera MRP-2 (zielony), niebieskie barwienie jąder komórkowych. Paski skali: 100 µm.

Ponieważ produkcja albuminy jest jednym z kluczowych warunków wstępnych dla hodowli tkanki wątrobowej, wybrano ją do monitorowania aktywności typowej dla wątroby w MOC. Analiza codziennych próbek pożywki pod kątem produkcji albuminy wykazuje znaczący wzrost tempa produkcji w hodowlach MOC w porównaniu do hodowli statycznych (Rysunek 4) oraz wartości raportowanych w literaturze 11. Wzrost tempa syntezy albuminy można przypisać zwiększonemu dopływowi tlenu i składników odżywczych w hodowlach MOC. Zatem MOC jest w stanie utrzymać agregaty wątrobowe w metabolicznie aktywnym stanie przez okres 14 dni hodowli, wzmacniając zachowania typowe dla wątroby, takie jak produkcja albuminy.

Wykres porównujący produkcję albuminy w czasie w MOC w porównaniu z kulturą statyczną; trend danych eksperymentalnych.
Rycina 4: Wydajność sferoidów wątrobowych w MOC w ciągu czternastu dni. Produkcja albuminy w monokulturach tkanki wątrobowej w MOC oraz w kulturze statycznej. Dane przedstawiono jako średnie ± SEM (n = 4).

Badania toksyczności powtarzanych dawek substancji chemicznych i kosmetyków podawanych ogólnoustrojowo u zwierząt wymagają ekspozycji trwającej od 21 do 28 dni, zgodnie z wytyczną OECD nr 410 „Repeated Dose Dermal Toxicity: 21/28-day Study”. W celu spełnienia wymogów regulacyjnych przedstawiono tutaj przykład długoterminowych kokultur skóry i wątroby utrzymywanych przez okres do 28 dni. Interfejs powietrze-ciecz, umożliwiający późniejszą dermalną ekspozycję na substancje, jest zapewniony poprzez hodowlę biopsji skóry w insertach do hodowli komórkowych z 96 dołkami. Eksperyment z kokulturą przeprowadzono przykładowo w endotelializowanych MOCs, aby sprawdzić, czy kokultura trzech tkanek w połączonym obiegu pożywek może pozostać żywotna i metabolicznie aktywna przez 28 dni.

Analiza aktywności LDH w supernatantach pożywki wykazała stały spadek poziomu w ciągu pierwszych ośmiu dni hodowli, który następnie utrzymywał się na stałym poziomie około 80 U/l (Rysunek 5). Wskazuje to na sztuczny, lecz stabilny obrót tkankowy w układzie w późniejszych punktach czasowych. Porównując kokulturę trzech tkanek z eksperymentami z pojedynczą tkanką wątroby oraz kokulturą wątroby i śródbłonka, stwierdzono znacząco obniżony poziom LDH, szczególnie w ciągu pierwszych dni w hodowlach niezawierających skóry. Śmierć komórek w tym pierwszym okresie wysokiej aktywności LDH występowała głównie w przedziale hodowli skóry, co wykazały hodowle MOC z pojedynczą tkanką skóry (dane niepokazane). Może to wynikać z obszaru uszkodzenia wokół biopsji powstałego w wyniku wycięcia fragmentu skóry.

Wykres aktywności LDH w ciągu 15 dni; wykres liniowy; porównanie danych dla MOC Li, MOC Li-Va, MOC Li-Va-Sk.
Rysunek 5: Piętnastodniowa wydajność tkanek w MOC. Aktywność LDH w nadsączach pożywki z monokultur tkankowych wątroby (MOC Li), kultur wątroby w endotelializowanych MOC (MOC Li-Va) oraz kokultur wątroba-skóra w endotelializowanych MOC (MOC Li-Va-Sk). Dane przedstawiono jako średnie ± SEM (n = 4).

W ciągu 28-dniowego okresu hodowli sferoidy wątrobowe przylgały do dna MOC, a komórki przerastały na zewnątrz, tworząc wielowarstwowe połączenie między sąsiednimi sferoidami. Nie upośledziło to funkcjonalności tkanki. Analiza końcowa z wykorzystaniem immunofluorescencji wykazała, że sferoidy wątrobowe pozostawały metabolicznie aktywne po 28 dniach kokultury w MOC, co potwierdziło barwienie na cytochrom P450 3A4 (Rysunek 6A). Komórki HHSteC były rozmieszczone w całej strukturze ekwiwalentu wątroby, co wykazało barwienie na wimentynę (Rysunek 6B). Zwiększenie intensywności barwienia wimentyny można było zaobserwować w obszarach, w których komórki przerastały poza sferoidy. Barwienie na czynnik von Willebranda (vWF) wykazało, że komórki endotelialne nie wniknęły głęboko w tkankę, lecz znajdowały się w bezpośrednim kontakcie komórka-komórka z zewnętrznymi hepatocytami (Rysunek 6C).

Barwienie immunohistochemiczne biopsji skóry wykazało ekspresję tenascyny C i kolagenu IV w błonie podstawnej (Rysunek 6D), podczas gdy barwienie kontroli statycznej wykazało podwyższone poziomy tenascyny C (Rysunek 6E). Wykazano, że ekspresja tenascyny C wzrasta podczas gojenia ran, procesów zapalnych i włóknienia, co sugeruje indukcję procesów włóknienia w kulturach statycznych, ale nie w dynamicznych 14,15.

Stabilna żywotność komórek i funkcjonalność tkanek po 28-dniowej kokulturze w MOC dowodzą, że system ten jest w stanie utrzymać kombinację do trzech tkanek we wspólnym obiegu mediów. W systemie MOC można jednocześnie hodować komórki pierwotne, a także modele tkanek i biopsje.

Immunofluorescencja histologiczna, przekrój tkanki, obraz mikroskopowy, analiza rozkładu komórkowego.
Rycina 6: Wydajność wielotkankowych kultur w ciągu 28 dni. Ekwiwalenty wątroby i biopsje skóry hodowano w endotelializowanym MOC, a funkcjonalność komórek wykazano za pomocą immunobarwienia (A) enzymów fazy I cytochromu P450 3A4 (czerwony), (B) wimentyny (czerwony), (C) cytokeratyny 8/18 (czerwony) oraz vWF (zielony) w tkance wątroby. Biopsje skóry współhodowane przez 28 dni (D) w MOC lub (E) w warunkach statycznych barwiono na tenascynę C (czerwony) i kolagen IV (zielony), niebieskie barwienie jąder. (F) Barwienie H&E skóry po 28 dniach hodowli w MOC. Paski skali: 100 µm.

Dyskusja

Opisana tutaj platforma MOC stanowi stabilne i wydajne narzędzie do hodowli tkanek różnego pochodzenia w warunkach dynamicznego przepływu pożywki przez przedłużone okresy hodowli 10,16. W tym przykładzie platforma została wykorzystana do hodowli komórek pierwotnych (HDMEC), ekwiwalentów tkankowych generowanych z linii komórkowej (agregaty wątroby) oraz kokultury wyżej wymienionych komórek z biopsją tkanki. MOC był w stanie utrzymać kokulturę trójtkankową przez okres do 28 dni w połączonym obiegu pożywki. Zgodnie z najlepszą wiedzą autorów, jest to pierwszy raz, kiedy wielotkankowa kokultura, obejmująca biopsje, komórki pierwotne i linie komórkowe, została przeprowadzona w ciągu czterech tygodni.

Jedną z głównych wad układów mikroprzepływowych jest powinowactwo małych cząsteczek do przylegania do materiału powierzchniowego obwodu fluidalnego. Ponieważ stosunek powierzchni do objętości jest szczególnie wysoki w układach mikroprzepływowych, efekt ten staje się jeszcze bardziej wyraźny 17. Stabilne pokrycie kanałów HDMEC, wprowadzone tutaj, może działać jak bariera biologiczna zapobiegająca adhezji cząsteczek do MOC. Ponadto może służyć jako naczynie hemokompatybilne dla pełnego krążenia krwi, zapobiegając krzepnięciu krwi. Jednak użycie krwi pełnej jako substytucji pożywki nie jest możliwe, ponieważ nie osiągnięto jeszcze pełnego unaczynienia odpowiedników narządów. Dotychczasowe prace nad unaczynieniem tkanek powstałych in vitro są obiecujące i wytyczają drogę do dalszych badań 18,19.

Powszechnie wiadomo, że hepatocyty mają tendencję do utraty swoich specyficznych dla wątroby funkcji w miarę upływu czasu w statycznych dwuwymiarowych warunkach hodowli in vitro 20. Enzymy metabolizujące, takie jak rodzina cytochromów P450, mają szczególne znaczenie, jeśli ma być badany metabolizm określonego leku. Cytochrom P450 3A4, enzym związany z biotransformacją wielu ksenobiotyków, oraz cytochrom P450 7A, który bierze udział w syntezie kwasów żółciowych, ulegały ekspresji w agregatach wątrobowych hodowanych w MOC przez 14 dni. Wskazuje to na zachowanie metabolicznie aktywnego fenotypu, co pozwala na badania metabolizmu leków. Zwiększona szybkość produkcji albumin agregatów w MOC w porównaniu z kulturami statycznymi jest dodatkowym wskazaniem do odpowiednich warunków hodowli. Tempo produkcji albumin zaobserwowane podczas tego badania było porównywalne lub nawet wyższe niż wcześniej zgłaszane wartości uzyskane przez chipy mikroprzepływowe, w tym komórki HepG2 21-23, jednak wartości nie osiągnęły wartości pierwotnych ludzkich kultur hepatocytów 24. Co więcej, system MOC w swoim tymczasowym układzie nie pozwala na oddzielną segregację żółci. Komórki w agregacji spolaryzowały się i utworzyły struktury podobne do kanałów żółciowych, jak wykazano barwieniem MRP-2. Kanaliki te nie były jednak podłączone do kanału technicznego zbierającego żółć. To niefizjologiczne mieszanie się żółci z przedziałem krwi musi zostać rozwiązane w ramach przyszłego przeprojektowania systemu.

Regulacja charakterystyki przepływu ma duże znaczenie 25, zwłaszcza w odniesieniu do tkanek wrażliwych na naprężenia ścinające, takich jak wątroba. Wielkość naprężeń ścinających odczuwanych przez tkankę można modyfikować na dwa sposoby: Po pierwsze, ciśnienie powietrza używane do dociskania membran pompy można obniżyć, zmniejszając szczytowe wartości naprężeń ścinających w układzie. Po drugie, tkanki mogą być osadzone w warstwie macierzy zewnątrzkomórkowej lub hodowane we wkładkach do hodowli transwell. Te ostatnie osłaniają tkanki przed leżącym poniżej prądem za pomocą porowatej membrany. Korekty te muszą być wykonane indywidualnie dla każdego równoważnika narządu przed rozpoczęciem eksperymentu MOC. Na przykład przy pulsacyjnym działaniu 2,4 Hz, co odpowiada wysokiej, ale nadal fizjologicznej aktywności serca wynoszącej 144 uderzenia/min u ludzi, naprężenie ścinające mierzone w kanałach obwodu mikronaczyniowego osiąga około 25 dyn/cm2. Odpowiada to fizjologicznemu naprężeniu ścinającemu na górnym końcu skali w mikrokrążeniu i dlatego ma dobre zastosowanie w eksperymentach obejmujących endotelializację kanałów. Jednakże, ponieważ obecny układ mikroprzepływowy prezentowanego systemu MOC składa się tylko z jednego obwodu mediów łączącego dwa przedziały narządowe, dla całego systemu należy wybrać jedną prędkość pompowania i współczynnik naprężeń ścinających. W związku z tym dokładne dostosowanie charakterystyki przepływu do potrzeb każdego narządu z osobna nie zawsze jest wykonalne.

Ponadto należy zachować ostrożność przy dostosowaniu komórek do wspólnego podłoża. Komórki są hodowane w MOC w połączonym obiegu pożywki, dlatego nie można stosować indywidualnych pożywek do hodowli komórkowych dla każdego modelu tkankowego, jak jest to standardem w przypadku hodowli komórkowych in vitro . Minimalna formuła pożywek złożonych musi być wcześniej zdefiniowana, a komórki muszą być stopniowo dostosowywane do tego nowego podłoża. Procedura adaptacji 80%/20% starych pożywek na nowe przez dwa dni, następnie 50%/50%, a następnie 20%/80% i pełna wymiana zawsze prowadziła do rozsądnej żywotności komórek i funkcjonalności kultur w naszych rękach.

Obecny układ mikroprzepływowy systemu MOC pozwala na kokulturację do trzech tkanek. Aby osiągnąć homeostazę, potrzebna jest kokultura co najmniej dziesięciu najważniejszych organów ludzkiego ciała. W związku z tym przedstawiony system jest w stanie przewidzieć określone interakcje tkanka-tkanka, ale nie rzeczywistą odpowiedź ogólnoustrojową na substancję. Przewiduje się dalszy rozwój MOC w celu uwzględnienia większej liczby jam narządowych. Ponadto ważność systemu należy wykazać przy użyciu zestawu związków odniesienia. Najlepiej, aby związki, które zawiodły podczas badań klinicznych (takie jak troglitazon), były testowane pod kątem ich działania w MOC. Podczas gdy prawdziwa walidacja takich złożonych systemów jest nadal utrudniona ze względu na brak standaryzacji dotyczącej biomarkerów i punktów końcowych oceny funkcjonalnej, zebranie większej ilości danych na temat skuteczności toksykologicznej tego i podobnych systemów poszerzy ich wiarygodność i obszar zastosowania.

Oświadczenia

Uwe Marx jest dyrektorem generalnym firmy TissUse GmbH, która produkuje i sprzedaje platformę Multi-Organ Chip wykorzystaną w artykule. Publikacja ta została sfinansowana z nagrody przyznanej przez Corning Inc.

Podziękowania

Praca została sfinansowana przez niemieckie Federalne Ministerstwo Edukacji i Badań, Grant GO-Bio nr 0315569.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Komórki HepaRGBiopredic InternationalNiezróżnicowane komórki
HHSteCScienCell Research Laboratorieskomórki i wszystkie suplementy hodowlane
HepaRG MediumSigma-AldrichWilliam's Medium E
10% FCS
100 U/ml penicylina
100 &mikro; g/ml streptomycyny
5 i mikro; g/ml insuliny ludzkiej
2 mM L-glutamina
5 x 10-5 M hemibursztynian hydrokortyzonu
HDMEC MediumPromoCell EndothelialCell Growth Medium MV2 z pakietem uzupełniającym MV2 i 1% penicyliną-streptomycyną
Dimetylosulfotlenek CarlRothdodać 2% do podłoża HepaRG
Trypsin/EDTABiowest
TrypsininhibitorCarl Roth
MAXYMum Wskazówki dotyczące odzyskiwaniaCorning1,000 µ l Końcówki do pipet Wide Bore
384-well Wisząca płytka kroplowa 3DBiomatrixPerfecta 3D 384-well Wisząca płytka
kroplowa Kolby do hodowli tkankowychCorning75 cm2
Ultra-niska płytka mocującaCorning24-dołkowe
wkładki do hodowli komórkowych TranswellCorning96-dołkowa jednostka, 0,4 i mikro; m wielkość
porów Płytki głębinoweCorning96-dołkowy, 1 ml
Dziurkacz do biopsjiStusche4,5 mm
Szkiełko mikroskopoweMenzelFootprint 75 x 25  mm
PolidimetylosiloksanDow CorningSylgard 184
Dodatek do kauczuku silikonowegoWacker ChemieWacker Primer G790
Rurki do ciśnienia powietrzaSMC Pneumatik GmbHPoliuretan-Schlauch, metrisch
Alumin ELISABethyl LaboratoriesZestaw do oznaczania ilościowego ELISA albuminy ludzkiej
dehydrogenazymleczanowejStanbio LaboratoriumLDH Liqui-UV zestaw
Alexa Fluor 594 acetylowany LDLInvitrogen1 mg/ml
Test

Bibliografia

  1. Kelm, J. M., Fussenegger, M. Microscale tissue engineering using gravity-enforced cell assembly. Trends in biotechnology. 22 (4), 195-202 (2004).
  2. Marx, U., Walles, H., et al. Human-on-a-chip Developments: A Translational Cutting-edge Alternative to Systemic Safety Assessment and Efficiency Evaluation of Substances in Laboratory Animals and Man. ATLA. 40 (5), 235-257 (2012).
  3. Baudoin, R., Griscom, L., Prot, J. M., Legallais, C., Leclerc, E. Behavior of HepG2/C3A cell cultures in a microfluidic bioreactor. Biochemical Engineering Journal. 53 (2), 172-181 (2011).
  4. Dash, A., Inman, W., et al. Liver tissue engineering in the evaluation of drug safety. Expert opinion on drug metabolism & toxicology. 5 (10), 1159-1174 (2009).
  5. Materne, E. -M., Tonevitsky, A. G., Marx, U. Chip-based liver equivalents for toxicity testing--organotypicalness versus cost-efficient high throughput. Lab on a chip. 13 (18), 3481-3495 (2013).
  6. Huh, D., Torisawa, Y., Hamilton, G. a, Kim, H. J., Ingber, D. E. Microengineered physiological biomimicry: organs-on-chips. Lab on a chip. 12 (12), 2156-2164 (2012).
  7. Sin, A., Chin, K. C., Jamil, M. F., Kostov, Y., Rao, G., Shuler, M. L. The design and fabrication of three-chamber microscale cell culture analog devices with integrated dissolved oxygen sensors. Biotechnology progress. 20 (1), 338-345 (2004).
  8. Tatosian, D. a, Shuler, M. L. A novel system for evaluation of drug mixtures for potential efficacy in treating multidrug resistant cancers. Biotechnology and bioengineering. 103 (1), 187-198 (2009).
  9. Schimek, K., Busek, M., et al. Integrating biological vasculature into a multi-organ-chip microsystem. Lab on a chip. 13 (18), 3588-3598 (2013).
  10. Wagner, I., Materne, E. -M., et al. A dynamic multi-organ-chip for long-term cultivation and substance testing proven by 3D human liver and skin tissue co-culture. Lab on a chip. 13 (18), 3538-3547 (2013).
  11. Vieira, U., et al. HepaRG human hepatic cell line utility as a surrogate for primary human hepatocytes in drug metabolism assessment in vitro. Journal of pharmacological and toxicological methods. 63 (1), 59-68 (2010).
  12. Abu-Absi, S. F., Hansen, L. K., Hu, W. -S. Three-dimensional co-culture of hepatocytes and stellate cells. Cytotechnology. 45 (3), 125-140 (2004).
  13. Leite, S. B., Wilk-Zasadna, I., et al. Three-dimensional HepaRG model as an attractive tool for toxicity testing. Toxicological sciences. 130 (1), 106-116 (2012).
  14. Chiquet-Ehrismann, R. Tenascins. The international journal of biochemistry & cell biology. 36 (6), 986-990 (2004).
  15. Sidgwick, G. P., Bayat, A. Extracellular matrix molecules implicated in hypertrophic and keloid scarring. Journal of the European Academy of Dermatology and Venereology JEADV. 26 (2), 141-152 (2012).
  16. Ataç, B., Wagner, I., et al. Skin and hair on-a-chip: in vitro skin models versus ex vivo tissue maintenance with dynamic perfusion. Lab on a chip. 13 (18), 3555-3561 (2013).
  17. Wu, M. -H., Huang, S., Lee, G. -B. Microfluidic cell culture systems for drug research. Lab on a chip. 10 (8), 939-956 (2010).
  18. Schanz, J., Pusch, J., Hansmann, J., Walles, H. Vascularised human tissue models A new approach for the refinement of biomedical research. Journal of Biotechnology. 148 (1), 56-63 (2010).
  19. Holnthoner, W., Hohenegger, K., et al. Adipose-derived stem cells induce vascular tube formation of outgrowth endothelial cells in a fibrin matrix. J Tissue Eng Regen Med. , (2012).
  20. Dunn, J. C. Y., Yarmush, M. L., Koebe, H. G., Tompkins, R. G. Hepatocyte function and extracellular matrix geometry: long-term culture in a sandwich configuration. FASEB Journal. 3, 174-177 (1989).
  21. Leclerc, E., Sakai, Y., Fujii, T. Microfluidic PDMS (polydimethylsiloxane) bioreactor for large-scale culture of hepatocytes. Biotechnology progress. 20 (3), 750-755 (2004).
  22. Kim, M. S., Yeon, J. H., Park, J. -K. A microfluidic platform for 3-dimensional cell culture and cell-based assays. Biomedical microdevices. 9 (1), 25-34 (2007).
  23. Prot, J. -M., Aninat, C., et al. Improvement of HepG2/C3A Cell Functions in a Microfluidic Biochip. Biotechnology and bioengineering. 108 (7), 1704-1715 (2011).
  24. Riccalton-Banks, L., Liew, C., Bhandari, R., Fry, J., Shakesheff, K. Long-term culture of functional liver tissue: three-dimensional coculture of primary hepatocytes and stellate cells. Tissue engineering. 9 (3), 401-410 (2003).
  25. Powers, M. J., Domansky, K., et al. A Microfabricated Array Bioreactor for Perfused 3D Liver Culture. Biotechnology and Bioengineering. 78 (3), 257-269 (2002).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Ekwiwalent w trobybiopsja punch sk ryinterfejs powietrze cieczmodel waskularyzacjipompa na chipieprzep yw zbli ony do fizjologicznegohodowla d ugoterminowa
Wielonarządowy chip - platforma mikroprzepływowa do długoterminowej kokultury wielotkankowej
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.