Wielonarządowy chip - platforma mikroprzepływowa do długoterminowej kokultury wielotkankowej

Podsumowanie

Tutaj prezentujemy protokół kohodowli komórek pierwotnych, modeli tkanek i biopsji dziurkowania w mikroprzepływowym chipie wielonarządowym przez okres do 28 dni. Ludzkie mikronaczyniowe komórki śródbłonka skóry, agregaty wątroby i biopsje skóry z powodzeniem połączono we wspólnym krążeniu pożywki.

Streszczenie

Ciągle rosnąca ilość nowych substancji wprowadzanych na rynek i ograniczona przewidywalność obecnych systemów testów in vitro doprowadziły do dużego zapotrzebowania na nowe rozwiązania do testowania substancji. Wiele leków, które zostały wycofane z rynku z powodu polekowego uszkodzenia wątroby, uwolniło swój potencjał toksyczny dopiero po kilku dawkach przewlekłych testów na ludziach. Jednak kontrolowane mikrośrodowisko ma kluczowe znaczenie dla długoterminowych eksperymentów z wielokrotnym dawkowaniem, ponieważ nawet niewielkie zmiany w warunkach zewnątrzkomórkowych mogą znacznie wpłynąć na fizjologię komórki. W ramach naszego programu badawczego skupiliśmy się na stworzeniu bioreaktora mikroinżynieryjnego, który może być dynamicznie perfuzjowany przez pompę wbudowaną w układ scalony i łączy co najmniej dwie przestrzenie hodowlane do zastosowań wielonarządowych. Ten układ krążenia lepiej naśladuje warunki in vivo pierwotnych hodowli komórkowych i zapewnia stabilniejsze, bardziej wymierne zewnątrzkomórkowe przekazywanie sygnałów do komórek.

Dla celów demonstracyjnych, odpowiedniki ludzkiej wątroby, wygenerowane przez agregację zróżnicowanych komórek HepaRG z ludzkimi komórkami gwiaździstymi wątroby w wiszących płytkach, były hodowane wspólnie z biopsjami ludzkiej skóry przez okres do 28 dni wewnątrz mikrobioreaktora. Zastosowanie wkładek do hodowli komórkowych umożliwia hodowlę skóry na granicy faz powietrze-ciecz, co pozwala na miejscową ekspozycję na substancję. System mikrobioreaktora jest w stanie utrzymać te kokultury przy przepływie płynów i stosunku objętości do cieczy niemal fizjologicznym, zapewniając stabilne i organotypowe warunki hodowli. Możliwość długotrwałych hodowli umożliwia wielokrotne narażenie na działanie substancji. Co więcej, unaczynienie obwodu kanału mikroprzepływowego przy użyciu ludzkich komórek śródbłonka mikrokrążenia skóry daje fizjologicznie bardziej odpowiedni model naczyniowy.

Wprowadzenie

Obecne testy hodowli komórkowych w monowarstwie lub zawiesinie do opracowywania leków nie są w stanie naśladować mikrośrodowiska komórkowego człowieka, a tym samym prowadzą do szybkiego odróżnicowania i utraty funkcji w pierwotnych hodowlach komórek ludzkich. Modele tkankowe o większym znaczeniu fizjologicznym są potrzebne do przewidywania skuteczności i bezpieczeństwa związków przed dopuszczeniem ich do badań klinicznych. Ostatnio standardowe techniki hodowli komórkowych in vitro ewoluowały od dwuwymiarowych hodowli jednowarstwowych do trójwymiarowych modeli wielokomórkowych, mających na celu naśladowanie mikrośrodowiska tkanek in vivo. Systemy te wykazały już znaczne postępy w zakresie dokładniejszego przewidywania sposobu działania związków ^1,2. Ponadto szczególnie interesujące jest dostosowanie warunków hodowli in vitro do wysoce wyspecjalizowanych potrzeb komórek.

W standardowych warunkach in vitro, wiele ważnych parametrów hodowli, takich jak dostarczanie składników odżywczych i tlenu, usuwanie produktów akumulujących się oraz siła mechaniczna działająca na komórki, często nie może być dokładnie kontrolowana w większości przypadków. Wiele narządów posiada fizjologicznie istotne gradienty stężeń substancji i rozpuszczonego tlenu. Jednak te wysoce regulowane i zoptymalizowane warunki są w wyraźnej opozycji do niekontrolowanych gradientów dyfuzji wokół tkanek w warunkach in vitro, co prowadzi do wysoce niestabilnego środowiska i ogranicza rozwój komórkowy ³. W związku z tym potrzebne są bardziej stabilne, a zwłaszcza bardziej wymierne warunki in vitro, aby komórki były żywotne i zróżnicowane przez dłuższy czas. Systemy perfuzjone, w których składniki pożywki są regularnie usuwane i podstawiane, są często lepiej scharakteryzowane i kontrolowane niż hodowle statyczne dotyczące bezpośredniego otoczenia tkanek. W warunkach statycznych gradienty dyfuzji wydzielin komórkowych i składników odżywczych pożywki hodowlanej mogą otaczać hodowane komórki ³. Wprowadzenie dobrze scharakteryzowanych prędkości przepływu pożywki wokół tkanek pozwala wydzielinie komórek mieszać się z bogatą pożywką poprzez perfuzję. Umożliwia to generowanie zdefiniowanych mikrośrodowisk komórkowych, zapewniając stabilny fenotyp komórkowy i ekspresję enzymów metabolizujących przez cały czas trwania testu ⁴.

Ostatnie osiągnięcia w systemach opartych na wielonarządowych chipach (MOC) łączą korzyści z kontrolowanego przepływu medium wokół zmodyfikowanych tkanek z wymaganiami małych średnich i mas komórkowych bioreaktorów w mikroskali, prowadząc do zmniejszenia ilości substancji potrzebnej podczas testów. Do tej pory opisano kilka systemów mikroprzepływowych do hodowli tkankowych ^5,6. Stosunek tkanki do płynu w tych układach odgrywa szczególnie istotną rolę w symulacji fizjologicznie istotnych przesłuchów komórkowych. Jednak ze względu na ograniczenia techniczne, takie jak stosowanie zewnętrznych pomp i zbiorników pożyw, całkowita objętość krążących mediów w większości systemów jest zbyt duża w porównaniu z objętościami tkanek. Grupa Shulera i wsp. była pierwszą, która opracowała system zapewniający prawidłowy czas przebywania substancji w przedziałach hodowli komórkowej oraz istotne in vivo proporcje tkanek do płynów ^7,8. Osiągnięto to poprzez zmniejszenie zewnętrznego zbiornika do 96-dołkowej płytki, która również reprezentuje przedział "innych tkanek". Aby zminimalizować objętość krążących mediów w naszej platformie MOC, zintegrowaliśmy perystaltyczną mikropompę na chipie, eliminując potrzebę stosowania zewnętrznych obwodów mediów. Ta mikropompa jest w stanie pracować z systemem przy wybranej liczbie prędkości przepływu mediów i szybkości naprężeń ścinających ⁹. System kanałów mikroprzepływowych o szerokości 500 μm i wysokości 100 μm łączy ze sobą dwie znormalizowane przestrzenie do hodowli tkankowych, z których każda ma wielkość pojedynczego dołka na płytce 96-dołkowej. Przestrzeganie rozmiarów standardowych płytek dołkowych pozwala na integrację już istniejących modeli tkanek wyprodukowanych w formacie transwell. Co więcej, pionowe położenie wkładek do hodowli komórkowych transwell jest regulowane, co umożliwia hodowlę modeli tkankowych, które są nie tylko bezpośrednio wystawione na przepływ płynu, ale mogą być również podnoszone i osłonięte przed prądem znajdującym się poniżej. Podobnie, przy użyciu tego systemu możliwe są hodowle na granicy faz powietrze-ciecz.

Platforma MOC jest wykonana z warstwy polidimetylosiloksanu (PDMS) o wysokości 2 mm i szklanego szkiełka mikroskopowego o wymiarach 75 x 25 mm², które są trwale połączone przez utlenianie plazmowe pod niskim ciśnieniem, tworząc szczelny dla płynów obwód mikroprzepływowy. Warstwa PDMS zawierająca odpowiednie kanały i przedziały kultur komórkowych jest wytwarzana przez standardową miękką litografię i formowanie replik ⁹. Konstrukcja mikroprzepływowa MOC użyta podczas tego badania składała się z dwóch oddzielnych obwodów mikroprzepływowych na chip, z których każdy zawierał dwa przedziały hodowli komórkowej połączone ze sobą systemem kanałów o wysokości 100 μm. Pozwoliło to na przeprowadzenie dwóch indywidualnych dwutkankowych kokultur przy użyciu jednego wielonarządowego chipa. Częstotliwości pompowania dostosowano tak, aby uzyskać natężenie przepływu medium na poziomie 40 μl/min.

Ten dwutkankowy projekt MOC umożliwił kokulturację sferoidu wątroby i biopsji stempla skóry w oddzielnych przestrzeniach hodowlanych, aczkolwiek w połączonym obiegu pożywek w warunkach przepływu fizjologicznego. Zróżnicowane komórki HepaRG agregowano razem z ludzkimi komórkami gwiaździstymi wątroby (HHSteC) w stosunku 24:1, tworząc jednorodne sferoidy. Stosunek ten okazał się optymalny, jak zaobserwowano w poprzednich eksperymentach ¹⁰, mimo że użyto prawie dwukrotnie większej liczby hepatocytów w porównaniu z sytuacją in vivo. Skóra była hodowana na granicy faz powietrze-ciecz wewnątrz wkładki do hodowli komórkowej transwell, co umożliwiło miejscową ekspozycję na substancję. Te modele tkankowe były współhodowane przez 28 dni w MOC, aby zademonstrować kompleksowość tego systemu. Co więcej, obwód kanału mikroprzepływowego chipów został w pełni pokryty ludzkimi komórkami śródbłonka mikrokrążenia skóry (HDMEC), aby dokładniej symulować układ naczyniowy.

Protokół

UWAGA: Ludzki napletek młodzieńczy został pobrany za świadomą zgodą i zgodą etyczną (Komisja Etyki Charité University Medicine, Berlin, Niemcy), zgodnie z odpowiednimi przepisami, z operacji dziecięcej po rutynowym obrzezaniu.

1. Produkcja ekwiwalentów tkankowych do uprawy w MOC

1. Agreguj HepaRG i HHSteC w wiszących płytkach kroplowych, aby wygenerować sferoidy wątroby.
   1. W celu uzyskania trypsynizacji komórek HepaRG hodowanych w kolbach do hodowli komórkowych (75 cm²), należy usunąć pożywkę z napływających, zróżnicowanych kultur jednowarstwowych, dwukrotnie przemyć PBS i dodać 3 ml 0,05% trypsyny/EDTA. Inkubować przez 3-5 minut w temperaturze 37 °C i zatrzymać reakcję przez dodanie 6 ml inhibitora trypsyny.
   2. Odwirować komórki HepaRG przy 150 x g przez 5 minut, usunąć supernatant, ponownie zawiesić osad komórkowy w 1 ml pożywki do hodowli komórkowych HepaRG i policzyć komórki. Żywotność komórek powinna wynosić >90%.
   3. W celu uzyskania trypsynizacji komórek HHSteC należy usunąć pożywkę z kultur jednowarstwowych, dwukrotnie przemyć PBS i dodać 3 ml 0,05% trypsyny/EDTA. Inkubować przez 5 minut w temperaturze 37 °C i zatrzymać reakcję przez dodanie 6 ml inhibitora trypsyny.
   4. Odwirować komórki HHSteC przy sile 150 x g przez 5 minut, usunąć supernatant, ponownie zawiesić osad komórkowy w 1 ml pożywki do hodowli komórkowych HepaRG i policzyć komórki.
   5. Połącz HepaRG i HHSteC w stosunku 24:1 w pożywce do hodowli komórkowych HepaRG. Aby to zrobić, dostosuj liczbę komórek, rozcieńczając zawiesiny komórek w pożywce do hodowli komórek HepaRG i dodaj 1 x 10⁵ komórek/ml HHSteC do 4,8 x 10⁶ komórek/ml komórek HepaRG. Dokładnie wymieszaj.
   6. Przygotować wiszącą płytkę kroplową, dodając 2 ml PBS do wiszącej kropli i płytki odbiorczej.
   7. Odpipetować pipetą 20 μl zawiesiny komórek do każdego dołka wiszącej płytki kroplowej. Zawsze przygotuj około 10% więcej zwisających kropli niż potrzebujesz do odzyskania kruszywa, ponieważ niektóre kruszywa giną podczas zabiegu. Ostrożnie umieścić płytkę w inkubatorze o temperaturze 37 °C. Odczekaj 48 godzin, aż uformują się sferoidy.
   8. W celu wyjęcia sferoid należy użyć końcówek do pipet z szerokimi końcówkami lub odciąć końcówki końcówek do pipet o pojemności 1 ml sterylnym nożem, aby poszerzyć otwór do około 2 do 3 mm. Użyj tych końcówek do pipet, aby obchodzić się ze sferoidami bez ich naruszania.
   9. Ostrożnie zmyć sferoidy z wiszącej płytki kroplowej, kilkakrotnie dodając 1 ml pożywki do górnej części dołków wiszącej płytki kroplowej za pomocą pipety. Myj płytkę, aż wszystkie sferoidy odpadną. Sferoidy mają lekko dyskowaty kształt o średniej średnicy od 300 do 400 μm i wysokości od 200 do 300 μm w tym miejscu.
   10. Zbierz sferoidy z płytki odbiorczej i przenieś je do 24-dołkowych płytek o bardzo niskim mocowaniu z maksymalnie 20 sferoidami na studzienkę za pomocą przygotowanych końcówek do pipet. Dostosuj objętość podłoża w każdym dołku do 0,5 ml. Użyj 20 agregatów do zaszczepienia jednego obwodu MOC, aby uzyskać współczynnik miniaturyzacji 1/100 000 w odniesieniu do liczby komórek in vivo.
   11. Inkubować sferoidy w temperaturze 37 °C i 5% CO₂ aż do dalszego wykorzystania w MOC. Nie przechowuj sferoidów dłużej niż trzy dni przed użyciem, aby zapewnić porównywalność. Agregaty należy uprawiać przez co najmniej jeden dzień na bardzo niskich płytach mocujących, aby uzyskać jednorodne sferoidy.
2. Należy zastosować jedno z dwóch podejść w celu uzyskania ekwiwalentów tkanki skórnej: zastosowanie biopsji dziurkowej (1.2.1) lub użycie gotowych modeli tkanek in vitro (1.3.1).
   1. Pokrój transwelle za pomocą żarowego noża poniżej wspornika, aby przygotować 96-dołkowe wkładki do hodowli komórkowych i przechowuj w sterylnych warunkach do dalszego użycia.
   2. Sterylizuj próbki napletka w 80% etanolu przez 30 sekund i rozetnij pierścień. Próbki powinny mieć średnią wysokość 2 mm.
   3. Użyj stempla do biopsji, aby wyciąć biopsje o średnicy 4,5 mm, aby uzyskać równy współczynnik miniaturyzacji zarówno wątroby, jak i skóry. Załaduj biopsje do przygotowanych 96-dołkowych wkładek transwell za pomocą kleszczy. Należy zwrócić uwagę, aby ułożyć biopsje stroną naskórkową skierowaną do góry.
   4. Umieścić wkładki do hodowli komórkowych z biopsjami na płytce odbiorczej zawierającej pożywkę do hodowli komórkowych HepaRG i przechowywać w temperaturze 37 °C i 5% CO₂ do czasu dalszego użycia w MOC. Nie przechowuj próbek dłużej niż 2 do 3 godzin.
3. Zintegruj gotowe modele skóry in vitro, zakupione od różnych dostawców, z MOC, upewniając się, że są one w formacie transwell 96-dołkowym. Należy użyć pożywki do hodowli komórkowej dostarczonej przez sprzedawcę lub, jeśli w dalszym etapie przewiduje się kohodowlę z inną tkanką, użyć minimalnej pożywki podtrzymującej obie tkanki. Zbadać odpowiednią minimalną pożywkę w poprzednich eksperymentach statycznych pod kątem jej zdolności do podtrzymywania tkanek.
   1. Wyjmij modele skóry z płyty uchwytu i wytnij 96-dołkowe wkładki poniżej wspornika za pomocą żarowego noża.
   2. Umieść wkładki z powrotem w płycie odbiornika i przechowuj w temperaturze 37 °C i 5% CO₂ do dalszego użycia w MOC. Nie przechowuj próbek dłużej niż jeden dzień.

2. Produkcja MOC

1. Wymieszaj PDMS i utwardzacz w stosunku 10:1 (v/v) i umieść mieszaninę w próżni na 15 minut, aby usunąć pęcherzyki powietrza.
2. W międzyczasie pokryć poliwęglanową płytę osłonową dodatkiem kauczuku silikonowego w temperaturze 80 °C przez 20 minut.
3. Włóż teflonowe do odpowiednich otworów w płycie pokrywy, aby utworzyć cztery komory do hodowli komórkowych wolne od PDMS i sześć membran PDMS o grubości 500 μm mikropompy.
4. Podłączyć przygotowaną pokrywę do formy głównej dwóch obwodów mikronaczyniowych i wstrzyknąć odgazowany PDMS. Należy uważać, aby nie wbudowywać pęcherzyków powietrza w system. Jeśli pojawią się bąbelki, spróbuj je usunąć, przechylając urządzenie.
5. Inkubować system w temperaturze 80 °C przez 60 minut w celu utwardzenia warstwy PDMS.
6. Wyjmij formę wzorcową i teflonowe z urządzenia i przymocuj warstwę PDMS do szkiełka o wymiarach 75 x 25^mm2 za pomocą niskociśnieniowego utleniania plazmowego.
7. Przykręć adaptery MOC ze specjalnym gwintem do wszystkich czterech komór hodowli komórkowych płyty pokrywy.
8. Podłączyć strzykawki zawierające pożywkę hodowlaną do żeńskich adapterów męskich Luer x 1/4-28 i przykręcić je do adapterów MOC na pokrywie.
9. Wstrzyknąć pożywkę do obwodu mikroprzepływowego, kilkakrotnie naciskając i pociągając w górę tłoki strzykawki.
10. Sprawdź pod mikroskopem prawidłowe wypełnienie kanałów pożywką.

3. Endotelializacja MOC

1. Przed endotelializacją MOC przepłukać każdy obwód MOC pożywką do wzrostu komórek śródbłonka i inkubować statycznie przez trzy dni w temperaturze 37 °C i 5% CO₂ .
   1. Wysterylizuj MOCs za pomocą chusteczki etanolowej i umieść je pod ławką z przepływem laminarnym. Ponadto wysterylizuj dwie pary kleszczyków i dwa klucze sześciokątne do dalszego użytku.
   2. Poluzuj nasadki komory hodowli tkankowej MOC za pomocą kluczy sześciokątnych i zdejmij nasadki za pomocą kleszczy. Po włożeniu podłoża w ten sam sposób przykręć nakrętki z powrotem do MOCów.
2. W celu uzyskania trypsynizacji ludzkich komórek mikronaczyniowych śródbłonka skóry (HDMEC), należy usunąć pożywkę z kultur jednowarstwowych, dwukrotnie przemyć PBS i dodać 3 ml 0,05% trypsyny/EDTA. Inkubować przez 5 minut w temperaturze 37 °C i zatrzymać reakcję przez dodanie 6 ml inhibitora trypsyny.
3. Odwirować HDMEC przy 220 x g przez 5 minut, usunąć supernatant, ponownie zawiesić osad komórkowy w 1 ml pożywki do wzrostu komórek śródbłonka i policzyć komórki. Żywotność komórek powinna wynosić >90%.
4. Doprowadzić liczbę komórek w zawiesinie komórkowej do końcowego stężenia 2 x 10⁷ komórek/ml, rozcieńczając ją pożywką do wzrostu komórek śródbłonka i przenieść 250 μl do strzykawki o pojemności 1 ml. Zastosuj tę koncentrację komórek do MOC, aby utrzymać szybkość miniaturyzacji 1/100 000 dla wszystkich narządów.
5. Podłączyć strzykawkę do żeńskiego adaptera męskiego Luer x 1/4-28, usunąć powietrze z tej złączki i przykręcić ją do specjalnego adaptera MOC z gwintem. Podłącz adapter do jednej z dwóch komór każdego obwodu MOC.
6. W ten sam sposób podłączyć pustą strzykawkę do drugiej komory obwodu MOC.
7. Wstrzyknąć komórki równomiernie, naciskając i pociągając w górę dwa tłoki strzykawki kilka razy z rzędu. Kontroluj napar komórek pod mikroskopem.
8. Inkubować MOC w temperaturze 37 °C i 5% CO₂ w warunkach statycznych przez 3 godziny, aby umożliwić komórkom przyleganie do ścianek kanału.
9. Wyjmij chip z inkubatora, umieść go pod stołem do laminarnego przepływu, a strzykawki i adaptery MOC zastąp specjalnymi gwintowanymi komorami do hodowli komórkowych MOC.
10. Dodać 400 μl świeżej pożywki do jednej komory każdego obwodu MOC i pozwolić mu przepłukać kanały pod ciśnieniem hydrostatycznym. Następnie zastąp pożywkę w obu komorach 300 μl świeżej pożywki.
11. Zamknąć komory za pomocą zaślepek, jak opisano w ppkt 3.1.2.
12. Podłącz chip do jednostki sterującej pompy. Dostosuj prędkość pompowania do częstotliwości 0,475 Hz i hoduj wióry w temperaturze 37 °C i 5% CO₂ .
13. Wymieniaj pożywkę w każdej komorze MOC co jeden do dwóch dni i monitoruj morfologię komórek za pomocą mikroskopii świetlnej.

4. Ładowanie chipa

1. Umieść MOC pod ławką z przepływem laminarnym i otwórz ją, jak opisano w kroku 3.1.2.
2. Usunąć pożywkę z komór kultur tkankowych i zastąpić ją 300 μl świeżej pożywki do hodowli komórkowych HepaRG.
3. Przenieść 20 wstępnie uformowanych sferoid do jednego przedziału hodowli tkankowej każdego obwodu MOC za pomocą końcówek pipet z szerokim otworem (patrz kroki 1.1.8/9). Zamknij nasadkę za pomocą kleszczy i kluczy sześciokątnych.
4. Przenieś 96-dołkowe wkładki do hodowli komórkowych zawierające odpowiedniki skóry do pozostałego przedziału hodowli tkankowej każdego obwodu MOC za pomocą kleszczy. Uważaj, aby nie tworzyć się pęcherzyków poniżej błony odpowiednika skóry. W tym celu włóż transwelle pod lekko pochylonym kątem i delikatnie dociśnij. Usunąć nadmiar pożywki wokół transwella, który jest wypychany od dołu za pomocą pipety.
5. Zamknij nasadkę za pomocą kleszczy i kluczy sześciokątnych.

5. Podłączanie układu scalonego do jednostki sterującej pompy

1. Ustaw parametry operacyjne w jednostkach sterujących na żądane wartości. Zmień ciśnienie powietrza od 0 do 8 000 mbar, podciśnienie od 0 do -800 mbar i częstotliwość pompowania od 0,24 do 2,4 Hz. Ustaw kierunek pompowania zgodnie z ruchem wskazówek zegara lub przeciwnie do ruchu wskazówek zegara.
2. Wyjąć MOC zawierającą ekwiwalenty tkankowe spod stołu laminarnego i podłączyć go do jednostek sterujących pompy.
3. Postępując zgodnie z numeracją na rurkach, włóż rurkę ciśnieniową powietrza do odpowiednich złączek na MOC.
4. Hodować MOC w temperaturze 37 °C i 5% CO₂ w inkubatorze lub, w przypadku obrazowania żywych tkanek, użyć nośnika MOC do podgrzania chipa do 37 °C i wyhodować go poza inkubatorem. Użyj podgrzanego podłoża do hodowli komórek w MOC pod standardowym mikroskopem.

6. Przeprowadzanie wymiany mediów, pobieranie próbek z mediów i narażenie na działanie substancji

1. Wykonuj rutynową wymianę pożywek codziennie lub co drugi dzień, biorąc pod uwagę rodzaj hodowanej tkanki i aktywność metaboliczną komórek.
   1. Wyjmij MOC z inkubatora i obserwuj go pod mikroskopem, aby kontrolować natężenie przepływu pożywki i sprawdzić, czy nie ma zanieczyszczeń.
   2. Odłącz MOC od jednostki sterującej pompy, odłączając przewód ciśnieniowy powietrza. Wysterylizuj MOC za pomocą chusteczek na etanol i umieść go pod ławką z przepływem laminarnym.
   3. Otworzyć komorę hodowli tkankowej zawierającą sferoidy wątroby, jak opisano w kroku 3.1.2.
   4. Usunąć do 200 μl z komory za pomocą pipety bez naruszania sferoid i przechowywać pożywkę w pustym dołku na płytce głębinowej. Przeprowadzić bezpośrednią analizę próbki pożywki lub zamknąć płytkę głębinową i przechowywać próbki pożywki w temperaturze -80 °C do dalszej analizy.
   5. Zastąp pożywkę MOC roztworem o objętości do 250 μl pożywki do hodowli świeżych komórek i zamknij nakrętkę. Różnica w ilości usuniętego i wymienionego nośnika odpowiada za straty spowodowane niewielkimi ilościami wyciekającymi z chipa podczas zamykania systemu.
   6. Otwórz w tym miejscu nasadkę komory hodowli tkankowej, w której znajdują się odpowiedniki skóry, aby sprawdzić, czy tkanka jest nienaruszona. Należy uważać, aby nie wprowadzać pęcherzyków powietrza do układu. Zamknij korek.
   7. Podłącz rurkę jednostki sterującej pompy do MOC, zgodnie z krokiem 5.3, i umieść MOC w inkubatorze.

7. Analizuj codzienne próbki mediów i przeprowadzaj analizę on-line

1. Analizuj wydajność hodowli tkankowych w trybie on-line za pomocą obrazowania żywych komórek lub offline, analizując codzienne próbki pożywek. Tę ostatnią należy przeprowadzić za pomocą standardowych rutynowych testów enzymatycznych (np. aktywność dehydrogenazy mleczanowej (LDH)) lub ELISA (np. stężenie albuminy). Analiza online jest opisana poniżej.
2. Usunąć pożywkę z śródbłonkowego MOC, jak opisano w krokach 6.1.1 do 6.1.4, i zastąpić go w obu przedziałach hodowli tkankowej 200 μl 10 μg/ml sprzężonego z fluoroforem roztworu acetylowanej lipoproteiny o niskiej gęstości (LDL) (rozcieńczonego w pożywce do hodowli komórkowych).
3. Zamknij zaślepki. Podłącz MOC do jednostki sterującej pompy, zgodnie z krokiem 5.3, i pompuj ją przez 30 minut z częstotliwością 0,475 Hz, aby równomiernie rozprowadzić roztwór w obwodzie mikroprzepływowym.
4. Przerwać pompowanie i inkubować MOC statycznie przez 3,5 godziny w temperaturze 37 °C i 5% CO_{2 .}
5. Podobnie jak w kroku 7.2, usuń acetylowany roztwór LDL z obu komór i zastąp go 400 μl świeżej pożywki w jednej z dwóch komór.
6. Odczekaj od 3 do 5 minut, aby ciśnienie hydrostatyczne przepuściło medium przez obwód kanału mikroprzepływowego.
7. Zastąp pożywkę, przez którą przepłynęła, 300 μl świeżej pożywki, a także wypełnij drugi przedział hodowli tkankowej 300 μl świeżej pożywki.
8. Zamknij MOC, zgodnie z krokiem 3.1.2. Umieść go pod mikroskopem fluorescencyjnym i obserwuj wzrost i żywotność komórek.
9. Umieść zabarwiony MOC z powrotem w inkubatorze, aby kontynuować uprawę. Usuń plamę wyciekającą z komórek przy każdej kolejnej wymianie nośnika.

8. Pobierz ekwiwalenty tkankowe z MOC i wykonaj analizy punktu końcowego

1. Pobierz ekwiwalenty tkankowe z MOC na końcu eksperymentu w celu analizy punktu końcowego.
   1. W celu pobrania odpowiedników wątroby i skóry z MOC, należy usunąć pożywkę z każdego przedziału kultury tkankowej, jak opisano w krokach 6.1.1 do 6.1.4.
   2. Usuń 96-dołkowe wkładki do hodowli komórkowych zawierające skórę z MOC za pomocą kleszczy. Ostrożnie oderwij membranę od wkładu, chwytając ją z jednej strony kleszczami i pociągając w dół. Uważaj, aby w tym momencie nie stracić odpowiednika skórnego.
   3. Zamrozić membranę zawierającą odpowiednik skóry w związku do zatapiania w krioterapii i przechowywać ją w temperaturze -80 °C do czasu dalszej analizy.
2. W podobny sposób usunąć ich odpowiedniki wątrobowe z komory hodowli tkankowej, pipetując je za pomocą odciętych końcówek pipet (patrz krok 1.1.8/9).
   1. Osadź sferoidy wątroby w związku do zatapiania w krio. Uważaj, aby nie przenieść zbyt dużej ilości płynu i usunąć nadmiar płynu za pomocą pipety. Po umieszczeniu sferoid na masie zatapiającej i usunięciu pożywki, dodaj kolejny związek kriogeniczny na wierzch sferoid, aby całkowicie je zamknąć.
   2. Zamrozić ekwiwalenty wątroby i przechowywać je w temperaturze -80 °C do czasu dalszej analizy.
3. Przeprowadzić analizę punktu końcowego, przycinając równoważniki tkankowe w kriomikrotomie do odcinków 8 μm i barwiąc w celu uzyskania markerów specyficznych dla tkanki, jak opisano w poprzednich protokołach ¹⁰.

Wyniki

Standardowe hodowle tkanek in vitro są wykonywane w warunkach statycznych, co ogranicza dyfuzję tlenu i dopływ składników odżywczych do tkanek. Systemy fluidyczne, wykazujące lepszą charakterystykę zaopatrzenia, są często hamowane przez duże zapotrzebowanie na pożywkę, o niefizjologicznie wysokich proporcjach pożywki do tkanki. W ten sposób metabolity są rozcieńczane, a komórki nie są w stanie kondycjonować swojego otoczenia. MOC przedstawiony w tym badaniu łączy dwa oddzielne przedziały hodowli tkankowej, z których każdy jest wielkości pojedynczego dołka standardowej płytki 96-dołkowej, za pomocą systemu kanałów mikroprzepływowych. Niewielka skala systemu i integracja pompy na chipie pozwala systemowi pracować przy objętościach mediów od 200 do 800 μl. Odpowiada to całkowitemu stosunkowi pożywki ogólnoustrojowej do tkanki wynoszącemu odpowiednio 8:1 do 31:1 dla kokultur wątroby i tkanki skóry (o całkowitej objętości tkanki około 26 μl). Całkowita objętość płynu zewnątrzkomórkowego u mężczyzny o wadze 73 kg wynosi 14,6 l, z czego objętość płynu międzykapilarnego wynosi 5,1 l, co prowadzi do fizjologicznego stosunku płynu zewnątrzkomórkowego do tkanki wynoszącego 1:4. W związku z tym ilość mediów w całym układzie krążenia w MOC jest jeszcze większa w porównaniu z sytuacją fizjologiczną; A jednak stanowi najmniejszy stosunek pożywki do tkanki odnotowany do tej pory dla układów wielonarządowych ⁵. Dzięki temu, że zachowane zostały standardowe formaty kultur tkankowych, naukowcy są w stanie połączyć istniejące i już zweryfikowane statyczne modele tkanek w ramach wspólnego przepływu płynów. Rysunek 1 przedstawia schemat konfiguracji doświadczalnej możliwych jednotkankowych lub wielotkankowych kokultur MOC. Biopsje tkanek pierwotnych i ekwiwalenty tkanek wytworzone in vitro z linii komórkowych lub komórek pierwotnych mogą być hodowane przy użyciu 96-dołkowych wkładek do hodowli komórkowych lub poprzez umieszczenie ich bezpośrednio w przedziałach hodowli tkankowej. Ponieważ system kanałów łączących przedziały hodowli komórkowej ma tylko 100 μm wysokości, ekwiwalenty tkanek przekraczające te wymiary będą przechowywane w komorach hodowli. Śródbłonkowanie obwodu MOC za pomocą pierwotnych HDMEC umożliwia kolejny krok naprzód w kierunku bardziej fizjologicznych warunków hodowli poprzez zapewnienie biologicznej struktury naczyniowej.

Rysunek 1: Schematyczne przedstawienie kultur MOC. Ekwiwalenty tkankowe są przygotowywane w standardowych warunkach in vitro, zaszczepiane do MOC i hodowane jako pojedyncze kultury lub kokultury w warunkach dynamicznych. Codziennie pobierane są próbki pożywek i analizy punktów końcowych. Ciśnienie powietrza do napędzania pompy jest podawane przez trzy niebieskie rurki podłączone do MOC od góry. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Zgodnie z protokołem endotelializacji, w ciągu czterech dni od dynamicznej hodowli uzyskuje się zlewające pokrycie HDMEC obwodu kanału mikroprzepływowego, jak pokazano na rysunku 2. Komórki łatwo przylegają do ścian kanału MOC, tworzą zlewającą się monowarstwę i wydłużają się wzdłuż naprężenia ścinającego (ryc. 2B). Co więcej, komórki pokrywają cały obwód kanałów, jak opisano wcześniej ⁹. Nie zaobserwowano dalszych zmian w morfologii śródbłonka po czterech dniach uprawy do końca hodowli.

Rysunek 2: Śródbłonkowe kanały MOC. Ludzkie komórki śródbłonka mikrokrążenia skóry (HDMEC) utworzyły zlewającą się monowarstwę w obwodzie mikroprzepływowym. Komórki barwiono acetylowanym LDL po 23 dniach hodowli MOC. (A) Cały obwód mikrokrążenia był pokryty komórkami i (B) komórkami wydłużonymi wzdłuż naprężenia ścinającego. Podziałki: (A) 1 000 μm i (B) 100 μm.

W kolejnym eksperymencie, spójne sferoidy komórek wątroby w kształcie dysku są tworzone z HepaRG i HHSteC podczas dwóch dni hodowli w wiszącej kropli, ponieważ ten system modelowy był wcześniej zgłaszany jako odpowiedni do badań nad metabolizmem leków ^11–13. W celach demonstracyjnych jeden przedział hodowli tkankowej każdego obwodu MOC wysiano 20 sferoidami w 96-dołkowych wkładkach do hodowli komórkowych, a tkanki hodowano przez 14 dni w warunkach dynamicznych przy użyciu nieendotelializowanych MOC. Dowolna liczba agregatów lub ilość materiału pierwotnego może być zintegrowana bezpośrednio z komorami lub za pomocą wkładek do hodowli komórkowych. Barwienie immunofluorescencyjne sferoidów po pobraniu z MOC wykazuje silną, jednorodną ekspresję typowej dla wątroby cytokeratyny 8/18 i enzymów metabolizujących fazę I cytochromu P450, 3A4 i 7A1 (figura 3A i 3B). Barwienie białka oporności wielolekowej transportera kanałowego 2 (MRP-2) ujawniło spolaryzowany fenotyp i istnienie szczątkowych sieci przypominających kanały żółciowe (Figura 3C).

Rysunek 3:. Hodowla ludzkich sztucznych mikrotkanek wątroby w MOC. Agregaty wątrobowe hodowane przez 14 dni w MOC wybarwiono na obecność (A) cytokeratyny 8/18 (czerwonej) i (B) cytochromu P450 3A4 (czerwonej) i 7A1 (zielonej). (C) Ekspresja transportera kanałowego MRP-2 (zielony), niebieskie barwienie jądrowe. Podziałka liniowa: 100 μm.

Ponieważ produkcja albuminy jest jednym z podstawowych warunków wstępnych hodowli tkanek wątroby, została wybrana do monitorowania typowej dla wątroby aktywności w MOC. Analiza codziennych próbek pożywek pod kątem produkcji albumin wykazuje znaczny wzrost szybkości produkcji w kulturach MOC w porównaniu z kulturami statycznymi (ryc. 4) i z wartościami podawanymi w literaturze ¹¹. Wzrost szybkości syntezy albuminy można przypisać zwiększonemu zaopatrzeniu w tlen i składniki odżywcze w kulturach MOC. W związku z tym MOC jest w stanie utrzymać agregaty wątrobowe przez okres hodowli wynoszący 14 dni w stanie aktywnym metabolicznie, wzmacniając typowe dla wątroby zachowanie, takie jak produkcja albumin.

Rycina 4: Czternastodniowa wydolność sferoidów wątroby w MOC. Wytwarzanie albumin w kulturach jednotkankowych wątroby w MOC i w hodowli statycznej. Dane są średnimi ± SEM (n = 4).

Subsystemowe badanie toksyczności powtarzanej dawki chemikaliów i kosmetyków u zwierząt wymaga od 21 do 28 dni ekspozycji, zgodnie z definicją zawartą w wytycznych OECD nr 410 "Toksyczność skórna powtarzanej dawki: badanie 21/28-dniowe." Długoterminowe kokultury skóry i wątroby są tutaj zilustrowane jako trwające do 28 dni, aby sprostać wymogom regulacyjnym. Interfejs powietrze-ciecz jest zapewniony do późniejszej ekspozycji na substancję skórną poprzez hodowlę biopsji skóry w 96-dołkowych wkładkach do hodowli komórkowych. Eksperyment z kokulturą przeprowadzono wzorowo na śródbłonkowych MOCach, aby udowodnić, czy trójtkankowa kokultura w połączonym obiegu pożywki może być utrzymana przy życiu i metabolicznie aktywna przez 28 dni.

Analiza aktywności LDH w supernatantach pożywek wykazała stale malejący poziom w ciągu pierwszych ośmiu dni hodowli, który następnie utrzymywał się na stałym poziomie około 80 U/l (Rysunek 5). Wskazuje to na sztuczny, ale stabilny obrót tkanek w systemie w późniejszych punktach czasowych. Porównując kokulturę trójtkankową z eksperymentami z jednotkankową wątrobą i kokulturą śródbłonka wątroby, można było stwierdzić znacznie obniżony poziom LDH, szczególnie w pierwszych dniach w kulturach bez skóry. Śmierć komórek w tym pierwszym okresie wysokiej aktywności LDH nastąpiła głównie w przedziale kultury skórnej, jak wykazały hodowle MOC pojedynczej tkanki skóry (dane nie pokazane). Może to być spowodowane zranionym obszarem otaczającym biopsję w wyniku uderzenia w skórę.

Rycina 5: Piętnastodniowa wydajność tkanek w MOC. Aktywność LDH w pożywkach supernatantach jednotkankowych kultur wątrobowych (MOC Li), hodowlach wątroby w śródbłonkowych MOCs (MOC Li-Va) i kokulturach wątroba-skóra w śródbłonkowym MOC (MOC Li-Va-Sk). Dane są średnimi ± SEM (n = 4).

Podczas 28-dniowego okresu hodowli, sferoidy wątroby przylegały do dna MOC i komórki wyrastały z nich, tworząc wielowarstwowe połączenie między sąsiednimi sferoidami. Nie zakłóciło to funkcjonalności tkanek. Analiza punktu końcowego za pomocą immunofluorescencji wykazała, że sferoidy wątroby były nadal aktywne metabolicznie po 28 dniach kokultury MOC, jak wykazano przez barwienie cytochromem P450 3A4 (Figura 6A). HHSteC rozprowadzano w całym równoważniku wątroby, jak wykazano przez barwienie wimentyną (Figura 6B). Wzrost intensywności barwienia wimentyną można było zaobserwować w obszarach, w których komórki wyrosły ze sferoid. Barwienie pod kątem czynnika von Willebranda (vWF) wykazało, że komórki śródbłonka nie wniknęły głęboko w tkankę, ale były w bezpośrednim kontakcie komórka-komórka z zewnętrznymi hepatocytami (Figura 6C).

Barwienie immunohistochemiczne biopsji skóry wykazało ekspresję tenascyny C i kolagenu IV w błonie podstawnej (Ryc. 6D), podczas gdy barwienie kontroli statycznej wykazało podwyższony poziom tenascyny C (Ryc. 6E). Wykazano, że tenascin C jest regulowana w górę podczas gojenia się ran, procesów zapalnych i zwłóknienia, co sugeruje indukowane procesy zwłóknieniowe w kulturach statycznych, ale nie w dynamicznych ^14,15.

Stabilna żywotność komórek i funkcjonalność tkanek po 28-dniowej kokulturze w MOC dowodzą, że system jest w stanie utrzymać kombinację do trzech tkanek we wspólnym obiegu pożywki. Komórki pierwotne, a także modele tkankowe i biopsje mogą być hodowane jednocześnie w systemie MOC.

Rycina 6: Wykonywanie hodowli wielotkankowych w ciągu 28 dni. Odpowiedniki wątroby i biopsje skóry hodowano w śródbłonkowym MOC, a funkcjonalność komórek wykazano przez barwienie immunologiczne (A) enzymów fazy I cytochromu P450 3A4 (czerwony), (B) wimentyny (czerwony), (C) cytokeratyny 8/18 (czerwony) i vWF (zielony) w tkance wątroby. Biopsje skóry współuprawiane przez 28 dni (D) w MOC lub (E) w warunkach statycznych wybarwiono na obecność tenascyny c (czerwonej) i kolagenu IV (zielonej), barwienie jądrowe na niebiesko. (F) Barwienie skóry metodą H&E po 28 dniach hodowli MOC. Podziałka liniowa: 100 μm.

Dyskusja

Opisana tutaj platforma MOC stanowi stabilne i wydajne narzędzie do hodowli tkanek różnego pochodzenia w warunkach dynamicznego przepływu pożywki przez przedłużone okresy hodowli ^10,16. W tym przykładzie platforma została wykorzystana do hodowli komórek pierwotnych (HDMEC), ekwiwalentów tkankowych generowanych z linii komórkowej (agregaty wątroby) oraz kokultury wyżej wymienionych komórek z biopsją tkanki. MOC był w stanie utrzymać kokulturę trójtkankową przez okres do 28 dni w połączonym obiegu pożywki. Zgodnie z najlepszą wiedzą autorów, jest to pierwszy raz, kiedy wielotkankowa kokultura, obejmująca biopsje, komórki pierwotne i linie komórkowe, została przeprowadzona w ciągu czterech tygodni.

Jedną z głównych wad układów mikroprzepływowych jest powinowactwo małych cząsteczek do przylegania do materiału powierzchniowego obwodu fluidalnego. Ponieważ stosunek powierzchni do objętości jest szczególnie wysoki w układach mikroprzepływowych, efekt ten staje się jeszcze bardziej wyraźny ¹⁷. Stabilne pokrycie kanałów HDMEC, wprowadzone tutaj, może działać jak bariera biologiczna zapobiegająca adhezji cząsteczek do MOC. Ponadto może służyć jako naczynie hemokompatybilne dla pełnego krążenia krwi, zapobiegając krzepnięciu krwi. Jednak użycie krwi pełnej jako substytucji pożywki nie jest możliwe, ponieważ nie osiągnięto jeszcze pełnego unaczynienia odpowiedników narządów. Dotychczasowe prace nad unaczynieniem tkanek powstałych in vitro są obiecujące i wytyczają drogę do dalszych badań ^18,19.

Powszechnie wiadomo, że hepatocyty mają tendencję do utraty swoich specyficznych dla wątroby funkcji w miarę upływu czasu w statycznych dwuwymiarowych warunkach hodowli in vitro ²⁰. Enzymy metabolizujące, takie jak rodzina cytochromów P450, mają szczególne znaczenie, jeśli ma być badany metabolizm określonego leku. Cytochrom P450 3A4, enzym związany z biotransformacją wielu ksenobiotyków, oraz cytochrom P450 7A, który bierze udział w syntezie kwasów żółciowych, ulegały ekspresji w agregatach wątrobowych hodowanych w MOC przez 14 dni. Wskazuje to na zachowanie metabolicznie aktywnego fenotypu, co pozwala na badania metabolizmu leków. Zwiększona szybkość produkcji albumin agregatów w MOC w porównaniu z kulturami statycznymi jest dodatkowym wskazaniem do odpowiednich warunków hodowli. Tempo produkcji albumin zaobserwowane podczas tego badania było porównywalne lub nawet wyższe niż wcześniej zgłaszane wartości uzyskane przez chipy mikroprzepływowe, w tym komórki HepG2 ^21-23, jednak wartości nie osiągnęły wartości pierwotnych ludzkich kultur hepatocytów ²⁴. Co więcej, system MOC w swoim tymczasowym układzie nie pozwala na oddzielną segregację żółci. Komórki w agregacji spolaryzowały się i utworzyły struktury podobne do kanałów żółciowych, jak wykazano barwieniem MRP-2. Kanaliki te nie były jednak podłączone do kanału technicznego zbierającego żółć. To niefizjologiczne mieszanie się żółci z przedziałem krwi musi zostać rozwiązane w ramach przyszłego przeprojektowania systemu.

Regulacja charakterystyki przepływu ma duże znaczenie ²⁵, zwłaszcza w odniesieniu do tkanek wrażliwych na naprężenia ścinające, takich jak wątroba. Wielkość naprężeń ścinających odczuwanych przez tkankę można modyfikować na dwa sposoby: Po pierwsze, ciśnienie powietrza używane do dociskania membran pompy można obniżyć, zmniejszając szczytowe wartości naprężeń ścinających w układzie. Po drugie, tkanki mogą być osadzone w warstwie macierzy zewnątrzkomórkowej lub hodowane we wkładkach do hodowli transwell. Te ostatnie osłaniają tkanki przed leżącym poniżej prądem za pomocą porowatej membrany. Korekty te muszą być wykonane indywidualnie dla każdego równoważnika narządu przed rozpoczęciem eksperymentu MOC. Na przykład przy pulsacyjnym działaniu 2,4 Hz, co odpowiada wysokiej, ale nadal fizjologicznej aktywności serca wynoszącej 144 uderzenia/min u ludzi, naprężenie ścinające mierzone w kanałach obwodu mikronaczyniowego osiąga około 25 dyn/^cm2. Odpowiada to fizjologicznemu naprężeniu ścinającemu na górnym końcu skali w mikrokrążeniu i dlatego ma dobre zastosowanie w eksperymentach obejmujących endotelializację kanałów. Jednakże, ponieważ obecny układ mikroprzepływowy prezentowanego systemu MOC składa się tylko z jednego obwodu mediów łączącego dwa przedziały narządowe, dla całego systemu należy wybrać jedną prędkość pompowania i współczynnik naprężeń ścinających. W związku z tym dokładne dostosowanie charakterystyki przepływu do potrzeb każdego narządu z osobna nie zawsze jest wykonalne.

Ponadto należy zachować ostrożność przy dostosowaniu komórek do wspólnego podłoża. Komórki są hodowane w MOC w połączonym obiegu pożywki, dlatego nie można stosować indywidualnych pożywek do hodowli komórkowych dla każdego modelu tkankowego, jak jest to standardem w przypadku hodowli komórkowych in vitro . Minimalna formuła pożywek złożonych musi być wcześniej zdefiniowana, a komórki muszą być stopniowo dostosowywane do tego nowego podłoża. Procedura adaptacji 80%/20% starych pożywek na nowe przez dwa dni, następnie 50%/50%, a następnie 20%/80% i pełna wymiana zawsze prowadziła do rozsądnej żywotności komórek i funkcjonalności kultur w naszych rękach.

Obecny układ mikroprzepływowy systemu MOC pozwala na kokulturację do trzech tkanek. Aby osiągnąć homeostazę, potrzebna jest kokultura co najmniej dziesięciu najważniejszych organów ludzkiego ciała. W związku z tym przedstawiony system jest w stanie przewidzieć określone interakcje tkanka-tkanka, ale nie rzeczywistą odpowiedź ogólnoustrojową na substancję. Przewiduje się dalszy rozwój MOC w celu uwzględnienia większej liczby jam narządowych. Ponadto ważność systemu należy wykazać przy użyciu zestawu związków odniesienia. Najlepiej, aby związki, które zawiodły podczas badań klinicznych (takie jak troglitazon), były testowane pod kątem ich działania w MOC. Podczas gdy prawdziwa walidacja takich złożonych systemów jest nadal utrudniona ze względu na brak standaryzacji dotyczącej biomarkerów i punktów końcowych oceny funkcjonalnej, zebranie większej ilości danych na temat skuteczności toksykologicznej tego i podobnych systemów poszerzy ich wiarygodność i obszar zastosowania.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Komórki HepaRG	Biopredic International		Niezróżnicowane komórki
HHSteC	ScienCell Research Laboratories		komórki i wszystkie suplementy hodowlane
HepaRG Medium	Sigma-Aldrich		William's Medium E 10% FCS 100 U/ml penicylina 100 &mikro; g/ml streptomycyny 5 i mikro; g/ml insuliny ludzkiej 2 mM L-glutamina 5 x 10-5 M hemibursztynian hydrokortyzonu
HDMEC Medium	PromoCell Endothelial		Cell Growth Medium MV2 z pakietem uzupełniającym MV2 i 1% penicyliną-streptomycyną
Dimetylosulfotlenek Carl	Roth		dodać 2% do podłoża HepaRG
Trypsin/EDTA	Biowest
Trypsininhibitor	Carl Roth
MAXYMum Wskazówki dotyczące odzyskiwania	Corning		1,000 µ l Końcówki do pipet Wide Bore
384-well Wisząca płytka kroplowa 3D	Biomatrix		Perfecta 3D 384-well Wisząca płytka
kroplowa Kolby do hodowli tkankowych	Corning		75 cm2
Ultra-niska płytka mocująca	Corning		24-dołkowe
wkładki do hodowli komórkowych Transwell	Corning		96-dołkowa jednostka, 0,4 i mikro; m wielkość
porów Płytki głębinowe	Corning		96-dołkowy, 1 ml
Dziurkacz do biopsji	Stusche		4,5 mm
Szkiełko mikroskopowe	Menzel		Footprint 75 x 25  mm
Polidimetylosiloksan	Dow Corning		Sylgard 184
Dodatek do kauczuku silikonowego	Wacker Chemie		Wacker Primer G790
Rurki do ciśnienia powietrza	SMC Pneumatik GmbH		Poliuretan-Schlauch, metrisch
Alumin ELISA	Bethyl Laboratories		Zestaw do oznaczania ilościowego ELISA albuminy ludzkiej
dehydrogenazy	mleczanowejStanbio Laboratorium		LDH Liqui-UV zestaw
Alexa Fluor 594 acetylowany LDL	Invitrogen		1 mg/ml