Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Wykorzystanie komórek nowotworowych sutka myszy do nauczania podstawowych pojęć biologicznych: prosty moduł laboratoryjny

12.6K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/52528

⸱

18 czerwca 2015

 ,  , 
1Department of Natural Sciences, Marymount Manhattan College

W tym artykule

Podsumowanie

Opisany jest wykonalny moduł laboratoryjny dla studentów biologii, który bada zaawansowane koncepcje komórkowe i molekularne przy użyciu hodowli komórek zwierzęcych. Studenci hodują, charakteryzują i manipulują modelem komórkowym raka piersi poprzez ekspozycję na środki chemioterapeutyczne. Żywotność komórek jest oznaczana poprzez zliczanie komórek przy użyciu zarówno metody standardowej, jak i nowatorskiej.

Streszczenie

Studenci studiów licencjackich z biologii są zobowiązani do nauki, zrozumienia i zastosowania różnych koncepcji i technik biologii komórkowej i molekularnej w ramach przygotowań do studiów biomedycznych, magisterskich i zawodowych lub kariery naukowej. Aby rozwiązać ten problem, opracowano prosty moduł laboratoryjny, który ma na celu nauczanie pojęć związanych z podziałem komórek, komunikacją komórkową i rakiem poprzez zastosowanie technik hodowli komórek zwierzęcych. W tym przypadku linia komórkowa guza sutka myszy (MMT) jest używana do modelowania raka piersi. Studenci uczą się hodować i charakteryzować te komórki zwierzęce w hodowli oraz testować wpływ tradycyjnych i nietradycyjnych środków chemioterapeutycznych na proliferację komórek. W szczególności studenci określają optymalne stężenie komórek do posiewu i wzrostu komórek, uczą się, jak przygotowywać i rozcieńczać roztwory leków, określają najlepsze dawkowanie i czas leczenia środkami antyproliferacyjnymi oraz ustalają szybkość śmierci komórek w odpowiedzi na różne zabiegi. Moduł wykorzystuje zarówno standardową technikę zliczania komórek za pomocą hemocytometru, jak i nowatorską metodę zliczania komórek przy użyciu oprogramowania mikroskopowego. Procedura eksperymentalna umożliwia otwarte dochodzenie, ponieważ studenci mogą modyfikować krytyczne etapy protokołu, w tym testowanie środków homeopatycznych i leków dostępnych bez recepty. Krótko mówiąc, ten moduł laboratoryjny wymaga od studentów wykorzystania procesu naukowego do zastosowania swojej wiedzy na temat cyklu komórkowego, szlaków sygnalizacji komórkowej, raka i sposobów leczenia, a wszystko to przy jednoczesnym rozwijaniu szeregu umiejętności laboratoryjnych, w tym hodowli komórkowej i analizy danych eksperymentalnych, które nie są rutynowo nauczane w klasie licencjackiej.

Wprowadzenie

Często na kursach biologii ogólnej, tematy regulacji cyklu komórkowego i raka są poruszane, ale nie są szczegółowo eksplorowane, ponieważ zakres treści na tych kursach pozostawia niewiele czasu na głębię. Ponadto studenci biologii na studiach licencjackich zazwyczaj nie są narażeni na zaawansowane techniki związane z hodowlą komórek zwierzęcych. Aby pomóc uczniom w głębszym zrozumieniu tych koncepcji, jednocześnie stosując i analizując to, czego się nauczyli, opracowano ćwiczenie laboratoryjne jako modyfikację rozszerzonego ćwiczenia laboratoryjnego Walter Reed Army Institute of Research (WRAIR)1. Moduł laboratoryjny wykorzystuje krokową, eksperymentalną strategię, która obejmuje hodowlę i charakterystykę modelu komórki nowotworowej, opracowywanie i wykonywanie metod zliczania komórek, ustalanie optymalnego przebiegu czasowego i dawek do leczenia komórek środkami antyproliferacyjnymi oraz identyfikację nieprawidłowych szlaków sygnalizacji komórkowej. Eksperyment pozwala również na otwarte dociekania.

Większość technik wymaganych do tej aktywności można wykonać w typowym laboratorium biologiczno-dydaktycznym. Ćwiczenie rozpoczyna się od scharakteryzowania przez uczniów morfologii i tempa wzrostu linii komórkowej mysiego guza sutka (MMT), modelu ludzkiego raka piersi2 . Rak piersi został wybrany jako rak modelowy ze względu na jego rozpowszechnienie w populacji, znajomość ze studentami w wieku studenckim oraz szeroko rozpowszechnione dostępne dane. Linia komórkowa MMT została specjalnie wybrana, ponieważ jest łatwo dostępna, dobrze scharakteryzowana, ma krótki czas podwojenia i jest łatwa w uprawie. Ponadto komórki MMT są zależne od estrogenów, co jest zgodne z większością kobiecych nowotworów piersi. Następnie studenci identyfikują nieprawidłowe szlaki sygnalizacji komórkowej w komórkach MMT, lecząc komórki lekami chemioterapeutycznymi, których mechanizm działania jest dobrze poznany. Stężenie leków i czas trwania leczenia są zróżnicowane, co pozwala studentom ocenić wpływ tych zmiennych na szybkość podziału komórek. Kluczowym testem dla tej aktywności jest określenie żywotności komórek, co po prostu wymaga zliczenia komórek przy użyciu jednej z dwóch metod. Każda metoda zależy od silnych umiejętności mikroskopowych. Studenci określają żywotność komórek za pomocą standardowej metody hemocytometru i nowatorskiej metody fotomikroskopii i proponują. Na podstawie swoich ustaleń mogą proponować i testować modyfikacje ćwiczenia. Następnie uczniowie reprezentują swoje dane i interpretują wyniki, aby doprecyzować swoją hipotezę i opracować nowe strategie eksperymentalne.

Ta aktywność laboratoryjna jest odpowiednia dla studentów pierwszego lub drugiego roku na kierunku nauk biologicznych. Jest skondensowany w tygodniowym module laboratoryjnym, który można ukończyć na pierwszym roku biologii ogólnej lub na drugim roku kursu biologii komórkowej / molekularnej. Umiejętności potrzebne do prawidłowego wykonania ćwiczenia obejmują podstawową arytmetykę i algebrę, znajomość szeregu podstawowych umiejętności laboratoryjnych (np. pipetowanie, sporządzanie roztworów, technika sterylna), analizę danych, podstawową mikroskopię świetlną i zarządzanie czasem, a także wiedzę instruktora na temat hodowli komórkowych i oprogramowania do arkuszy kalkulacyjnych. Wymagane odczynniki obejmują zwierzęcy model linii komórkowej w kierunku raka (np. mysie komórki guza sutka, MMT2), środki chemioterapeutyczne (np. tamoksyfen, kurkumina, metformina i aspiryna), błękit trypanowy i pożywki do hodowli komórkowych (np. Eagle's Minimum Essential Medium; EMEM) z odpowiednimi suplementami (np. surowicą końską i bydlęcą dawcy). Potrzebne instrumenty obejmują mikroskop światła odwróconego z mocowaniem kamery cyfrowej, komputer, 100 mm i 24-dołkowe płytki do hodowli tkankowych, inkubator CO2 (lub jego odpowiednik), komorę bezpieczeństwa biologicznego (BSC; Klasa II), hemocytometr i oprogramowanie do mikroskopii cyfrowej.

Istnieją dobre przykłady konkretnych działań laboratoryjnych, które polegają na hodowli komórek zwierzęcych, aby uczyć studentów studiów licencjackich o pojęciach z zakresu biologii komórki3. Jednak wiele z nich wymaga materiałów lub technik, które nie są łatwo dostępne (np. izotopy promieniotwórcze, żywe tkanki zwierzęce, zaawansowany sprzęt do obrazowania1,4,5), opisują protokoły, które są dość zaawansowane (np. odpowiednie dla kursu na poziomie 4006) lub wymagają wielotygodniowych lub semestralnych projektów6,7. Opisane tutaj ćwiczenie laboratoryjne jest proste i można je przeprowadzić w ciągu jednego tygodnia przy użyciu zwykłego sprzętu laboratoryjnego.

Podsumowując, ten moduł laboratoryjny skutecznie wprowadza lub wzmacnia koncepcje cyklu komórkowego, szlaków sygnalizacji komórkowej i raka, jednocześnie ucząc podstawowych i zaawansowanych umiejętności laboratoryjnych, analizy danych eksperymentalnych, metody hodowli komórek zwierzęcych i procesu naukowego. Moduł laboratoryjny jest prosty i ekonomicznie dostępny i zapewnia zarówno elastyczność, jak i możliwość otwartego zadawania pytań. Ćwiczenie zachęca uczniów do kreatywności, dostarczając szablon strategii eksperymentalnej, który działa jako przewodnik, a nie przepis. Co najważniejsze, ćwiczenie spełnia wszystkie dziedziny uczenia się TaksonomiiBlooms 8, ponieważ wymaga zapamiętywania, rozumienia, stosowania, analizowania, oceniania i tworzenia poprzez angażowanie uczniów w proces, który wyciąga ich z podręcznika do świata badań naukowych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Uwagi: Całą pracę z komórkami i odczynnikami do hodowli komórkowych przeprowadzaj w komorze bezpieczeństwa biologicznego klasy II (BSC)9. Komórki MMT są klasyfikowane jako I poziom bezpieczeństwa biologicznego, ponieważ stanowią niskie lub umiarkowane ryzyko biologiczne. Stosuj odpowiednie procedury czyszczenia i odkażania BSC między użyciami (np. światło ultrafioletowe, przecieranie 70% etanolem).

1. Rozwijaj komórki MMT

  1. Hoduj komórki w 10-centymetrowych szalkach do hodowli tkankowych zawierających 10 ml pożywki bogatej w składniki odżywcze, która składa się z pożywki Eagles Minimum Essential Medium (EMEM) uzupełnionej 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS), 2 mM glutaminy i 1% leku przeciwgrzybiczego/antybiotyku (10 jednostek penicyliny, 100 μg streptomycyny, 0,25 μg amfoterycyny B). Hodować komórki w nawilżonej komorze o stężeniu 5%CO2 w temperaturze 37 °C. Płytki komórkowe o gęstości 3,6 x 106 komórek/cm2 (patrz Liczenie komórek w kroku 2).
  2. Połowę pożywki do hodowli komórkowych należy wymieniać na świeże pożywki co 48 godzin, chyba że wskazano inaczej. Sprawdź żywotność i morfologię komórek poprzez badanie mikroskopem świetlnym z odwróconym kontrastem fazowym.
    1. Zanotuj i scharakteryzuj komórki pod względem rozmiaru, struktury, kształtu, organizacji i szacowanej liczby pod powiększeniem 100 - 200X. Przy tej gęstości komórki powinny pojawiać się w jednej płaszczyźnie, nie zlepione jedna na drugiej i w bliskiej odległości. Każda komórka składa się z grubego, kulistego rdzenia z cienkimi, długimi, przypominającymi gałęzie przedłużeniami wyrastającymi z niego, które dochodzą do punktu (patrz rysunek 1).
  3. Podziel komórki, gdy osiągną gęstość komórek 7,2 x 106 komórek/cm2. Komórki wykazują szybkość podwajania 1,8 x 106 komórek/cm2 na 24 godziny. Oznacz komórki Przejście X (Px), aby wskazać, ile razy zostały podzielone.
    1. Przy generacji 3 (tj. po trzech pasażach, P3) zbierz, policz i umieść komórki na 24-dołkowej płytce do hodowli tkankowej o gęstości 3,6 x 106 komórek/cm2.
  4. Przeglądaj komórki każdego dnia i nagrywaj cyfrowe mikrofotografie. Zanotuj i opisz morfologię komórki (tj. wielkość, kształt, właściwości odbijające światło). Określ czas podwajania komórek, regularnie licząc komórki i odnosząc upływający czas do numeru komórki.

2. Policz komórki MMT

Uwaga: Policz komórki, aby określić, czy komórki muszą być subhodowane, aby przygotować się do eksperymentu lub określić żywotność komórek. Przedstawione są tutaj dwie metody.

  1. Użycie hemocytometru, standardowej techniki liczenia komórek.
    1. Zaopatrz się w hemocytometr z jasną linią, 0,2% roztwór niebieskiego barwnika trypanowego, złożony mikroskop świetlny, sterylne probówki, pipety i ręczny licznik komórek.
    2. Pod BSC użyj pipety o pojemności 10 ml, aby usunąć komórki z 10 cm naczynia do hodowli tkankowej. Jeśli komórki są hodowane na płytce 24-dołkowej, należy użyć pipety o pojemności 1 ml lub mikropipety o pojemności 1 000 μl, aby usunąć pożywkę.
    3. Wciągnąć pożywkę komórkową do pipety, przyłożyć końcówkę pipety do dna naczynia i wysunąć pożywkę, przesuwając końcówkę pipety po płytce. Powtórz 4-5 razy, aby pomóc w usunięciu komórek, dysocjacji grudek i doprowadzeniu do dokładniejszej liczby komórek.
    4. Umieść powstałą zawiesinę komórek w sterylnej probówce o pojemności 15 ml (lub mikrowirówce o pojemności 1 ml lub innej probówce o małej objętości). W przeciwnym razie pozostaw komórki na oryginalnej płytce/studzience do hodowli tkankowej.
    5. Pod BSC połączyć 10 μl zawiesiny komórek z 10 μl roztworu błękitu trypanowego (w stosunku 1:1) w niesterylnej mikrowirówce lub innej probówce o małej objętości.
      Uwaga: Błękit trypanowy jest istotną plamą, która nie jest wchłaniana przez zdrowe, żywotne komórki. Gdy komórki są uszkodzone lub martwe, błękit trypanowy może dostać się do komórki, umożliwiając zliczenie martwych komórek (inaczej metoda wykluczania barwnika). Dlatego pod mikroskopem martwe komórki wydają się ciemnofioletowe, podczas gdy żywe komórki mają jasny i jasny kolor.
    6. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 minut.
    7. Umieść szkiełko nakrywkowe na hemocytometrze. Nanieść 10 μl mieszaniny zawiesiny trypanowej z niebieskimi krwinkami do rowka. Wyświetl hemocytometr w powiększeniu 100 - 200X. Widoczna jest siatka w czterech rogach (patrz rysunek 2).
    8. Policz liczbę żywotnych komórek (niebarwionych) w porównaniu z całkowitą liczbą komórek w każdym obszarze z siatką. Uśrednij cztery siatki i pomnóż przez 1 x 104, aby uzyskać komórki/ml.
      1. Ekstrapoluj całkowitą liczbę komórek na naczynie (lub komórek/cm2). Użyj tej liczby, aby określić prawidłową objętość zawiesiny komórkowej, która ma zostać użyta do wysiewu nowej płytki do hodowli tkankowej o pożądanej gęstości 3,6 x 106 komórek/cm2, lub określić całkowitą liczbę żywotnych komórek na płytce lub w studzience.
        Uwaga: Dodatkowe wskazówki dotyczące korzystania z hemocytometru, patrz10.
  2. Użyj oprogramowania i aparatu cyfrowego, aby policzyć żywotne komórki.
    1. Zaopatrz się w aparat cyfrowy, towarzyszące mu oprogramowanie, 0,4% roztwór niebieskiego barwnika trypanowego, złożony mikroskop świetlny, sterylne probówki, pipety i komputer.
      Uwaga: Używany jest tutaj aparat cyfrowy Moticam 2,000 z dołączonym oprogramowaniem Motic. Każda porównywalna kamera i oprogramowanie powinny wystarczyć. Upewnij się, że oprogramowanie aparatu cyfrowego zostało wcześniej skalibrowane (zgodnie z protokołem producenta).
    2. Pod BSC należy użyć pipety o pojemności 1 ml lub mikropipety o pojemności 1 000 μl, aby usunąć pożywkę z komórek MMT rosnących w 24-dołkowym naczyniu do hodowli tkankowych. Umyć przylegające komórki, delikatnie nakładając niewielką ilość (około 500 μl) nieuzupełnionej (tj. EMEM bez żadnych dodatków) świeżej pożywki na płytkę, a następnie usuwając ją. Nanieść 10 μl 0,2% błękitu trypanowego (otrzymanego przez rozcieńczenie 1:1 z nieuzupełnionym EMEM) bezpośrednio do studzienki.
    3. Inkubować płytkę w temperaturze pokojowej przez 5 minut.
    4. Obejrzyj płytkę pod mikroskopem w powiększeniu 100 - 200X z dołączoną kamerą cyfrową. Płytkę można umyć nieuzupełnionym podłożem, jeśli barwienie 2% błękitem trypanowym jest zbyt ciemne.
    5. Otwórz oprogramowanie na komputerze isprawdź, czy oprogramowanie jest skalibrowane do używanego celu za pomocą karty ustawień. Powinien pojawić się obraz pola widzenia.
    6. Wybierz siatkę na karcie Miara. Pojawi się siatka kwadratów o szerokości około 0,005 cm. Wybierz opcję Informacje o siatce, aby potwierdzić obszar każdego kwadratu.
    7. Wybierz określony obszar siatki, aby policzyć komórki (tj. 5 kwadratów x 9 kwadratów). Wybierz opcję Prostokąt na karcie Miara. Kliknij róg kwadratu i przeciągnij kursor, aby objąć wybrane kwadraty.
      Uwaga: Odcień zieleni pokryje wybrane kwadraty, a w rogu pojawi się białe pole, które określa szerokość, wysokość, obszar i obwód wybranej sekcji siatki (patrz Rysunek 3).
    8. Policz liczbę żywotnych komórek w określonym obszarze. Zrób to samo dla dwóch innych miejsc w tej samej studzience lub płytce, przesuwając płytkę pod mikroskopem.
    9. Upewnij się, że mierzony obszar jest taki sam, a powiększenie nie uległo zmianie. Oblicz średnią liczbę żywotnych komórek w obszarze. Korzystając z powierzchni studzienki (w przypadku płytki 24-dołkowej jedna studzienka ma powierzchnię 2cm2, w przypadku płytki o długości 100 mM powierzchnia wynosi 78,6 cm2), ekstrapoluj liczbę żywotnych komórek z obszaru wyznaczonego w siatce na całkowitą liczbę komórek w studzience (komórki/cm2).

3. Leczenie komórek MMT środkami antyproliferacyjnymi

  1. Przygotować roztwory wybranych leków przeciwproliferacyjnych (tamoksyfenu, kurkuminy i metforminy) oraz opcjonalnego leku, aspiryny pod BSC.
    1. Rozpuść kurkuminę i tamoksyfen w 100% etanolu, aby uzyskać stężenie 27 mM. Rozpuścić metforminę i aspirynę w niesuplementowanym EMEM, aby uzyskać stężenie wyjściowe odpowiednio 500 mM i 15 mM.
  2. Ustalić reakcję na dawkę.
    1. Leczyć komórki MMT trzema antyproliferacyjnymi środkami terapeutycznymi (tamoksyfenem, kurkuminą i metforminą) oraz opcjonalnym lekiem (aspiryną) w różnych stężeniach przez 96 godzin, aby wygenerować krzywą dawka-odpowiedź. Początkowo należy podawać wszystkie leki w zakresie stężeń na podstawie opublikowanych raportów1,11-16, a następnie w stężeniach większych lub mniejszych niż opublikowane.
      Uwaga: Odpowiedź na dawkę określa minimalne stężenie leku niezbędne do uzyskania pożądanych rezultatów. W tym przypadku pożądanym rezultatem jest zmniejszenie proliferacji komórek w porównaniu z kontrolą.
      1. W przypadku tamoksyfenu i kurkuminy należy stosować stężenia (i odpowiadające im objętości) 0,054 mM (1 μl), 0,108 mM (2 μl), 0,162 mM (3 μl) i 0,216 mM (4 μl).
      2. W przypadku metforminy należy stosować stężenia (i odpowiadające im objętości) 2 mM (2 μl), 4 mM (4 μl), 6 mM (6 μl), 8 mM (8 μl) i 10 mM (10 μl).
      3. W przypadku aspiryny należy stosować stężenia (i odpowiadające im objętości) 0,030 mM (1 μl), 0,060 mM (2 μl), 0,099 mM (3,3 μl), 0,150 mM (5 μl) i 0,216 mM (6,7 μl).
    2. Podzielić komórki MMT z 10-centymetrowej płytki na 24-dołkową płytkę o stężeniu 3,6 x 106 komórek/cm2. Określ początkowe stężenie komórek za pomocą obu metod zliczania komórek (krok 2). Nazwij tę nową 24-dołkową płytkę komórek "Day Split".
    3. 24 godziny po posiewie komórek, potraktować komórki MMT każdym z antyproliferacyjnych środków terapeutycznych, tamoksyfenem, kurkuminą, metforminą i aspiryną, w stężeniach opisanych w kroku 3.2.1. Odnoś się do tego jako "Dzień 0".
      1. Ponieważ każda studzienka może pomieścić maksymalnie 500 μl pożywki, należy używać mikropipet ze sterylnymi końcówkami do mikropipet i nową końcówką za każdym razem, gdy nowa studzienka jest poddawana obróbce, aby uniknąć zanieczyszczenia krzyżowego. Użyć dwóch studzienek jako kontroli: komórek hodowanych przy braku jakiegokolwiek leczenia farmakologicznego (kontrola ujemna) i komórek hodowanych w obecności 100% etanolu (kontrola rozpuszczalnikiem).
    4. Hoduj komórki i ponownie podawaj leki w opisanych stężeniach, gdy komórki są karmione co drugi dzień (patrz Krok 1.2) przez 96 godzin (do 4 dnia). W dniach 1-4 leczenia należy obserwować komórki pod mikroskopem i policzyć je metodą opisaną w kroku 2.2 (patrz rycina 4).
    5. Powtórz eksperyment co najmniej trzy razy.
    6. Określ optymalne stężenie każdego leku, przedstawiając na wykresie zależność między żywotnością komórek a dawkowaniem leku w czasie trwania eksperymentu (patrz ryc. 5).
  3. Ustal kurs czasowy.
    1. Komórki MMT należy traktować trzema antyproliferacyjnymi środkami terapeutycznymi (tamoksyfenem, kurkuminą i metforminą) w ustalonym stężeniu przez różne okresy czasu. Stosować optymalne stężenie określone w doświadczeniach dotyczących odpowiedzi na dawkę (patrz krok 3.2).
      1. Stosować następujące stężenia: 0,216 mM tamoksyfenu, 0,216 mM kurkuminy i 10 mM metforminy.
        Uwaga: Przebieg czasowy określa ilość czasu potrzebną do uzyskania optymalnego pożądanego rezultatu przez lek. W tym przypadku pożądanym rezultatem jest zmniejszenie proliferacji komórek w porównaniu z kontrolą.
    2. Podzielić komórki MMT z 10-centymetrowej płytki na 24-dołkową płytkę o stężeniu 3,6 x 106 komórek/cm2. Określ początkowe stężenie komórek za pomocą obu metod zliczania komórek (krok 2). Nazwij tę nową 24-dołkową płytkę komórek "Day Split".
    3. 24 godziny po posiewie komórek, potraktuj komórki MMT każdym z antyproliferacyjnych środków terapeutycznych, tamoksyfenem, kurkuminą, metforminą i aspiryną, w optymalnych stężeniach określonych w kroku 3.2. Odnoś się do tego jako "Dzień 0".
      1. Ponieważ każda studzienka może pomieścić maksymalnie 500 μl pożywki, należy używać mikropipet ze sterylnymi końcówkami do mikropipet i nową końcówką za każdym razem, gdy nowa studzienka jest poddawana obróbce, aby uniknąć zanieczyszczenia krzyżowego.
      2. Użyć dwóch studzienek jako kontroli: komórek hodowanych przy braku jakiegokolwiek leczenia farmakologicznego (kontrola ujemna) i komórek hodowanych w obecności 100% etanolu (kontrola rozpuszczalnikiem).
  4. Hoduj komórki i ponownie podawaj leki w wybranym stężeniu, gdy komórki są karmione co drugi dzień (patrz krok 1.2) przez 96 godzin (do dnia 4). W dniach 1-4 leczenia należy obserwować komórki pod mikroskopem i policzyć je metodą opisaną w kroku 2.2 (patrz rycina 4).
  5. Powtórz eksperyment co najmniej trzy razy.
  6. Określ optymalny czas ekspozycji komórek MMT na każdy lek, przedstawiając na wykresie zależność między żywotnością komórek a długością (czasem) leczenia farmakologicznego przy wybranym stężeniu (patrz rycina 6).

4. Moduł laboratoryjny

Uwaga: Poniżej znajduje się 5-dniowy harmonogram ćwiczeń dla modułu laboratoryjnego. Rysunek 7 przedstawia schemat blokowy tego, co harmonogram pociąga za sobą w ciągu 5 dni. Aby to ćwiczenie zostało wykonane w ciągu pięciu dni, generowany jest przebieg w czasie lub krzywa dawka-odpowiedź. Nie ma wystarczająco dużo czasu na wygenerowanie obu krzywych. Eksperyment z odpowiedzią na dawkę jest opisany poniżej. Eksperyment z kursem czasowym można łatwo zamienić

  1. Podziel klasę na grupy: niech jedna grupa ustali odpowiedź na dawkę, a druga kurs czasowy, wybierając stężenie pośrodku proponowanych stężeń dawka-odpowiedź.
    1. Utrzymuj wystarczającą ilość kultur i zapasów leków w odpowiednich stężeniach. O ile nie zaznaczono inaczej, wszystkie prace należy wykonywać w ramach BSC.
  2. Dzień 1
    1. Powiedz uczniom, aby przygotowali pożywkę i wyhodowali komórki (jak w kroku 1).
    2. Gdy uczniowie zdobędą zapas komórek MMT na 10-centymetrowej płytce, poinstruuj ich, aby przygotowali pożywki do hodowli komórkowych i udziel im samouczka w zakresie korzystania z hemocytometru, mikroskopii cyfrowej i oprogramowania do mikroskopii z kamerą cyfrową (jak w kroku 2).
    3. Skalibruj oprogramowanie do obiektywów używanych w mikroskopie (np. 4X, 10X, 20X), korzystając z protokołu producenta.
  3. Dzień 2
    1. Poproś uczniów, aby potwierdzili całkowitą liczbę komórek i ich żywotność (jak w kroku 2).
    2. Poproś uczniów, aby policzyły komórki na szalce o średnicy 100 mm przy użyciu zarówno oprogramowania mikroskopowego, jak i metod hemocytometru, aby potwierdzić, że uzyskano podobne wyniki.
    3. Skieruj uczniów, aby uzyskali 24-dołkową płytkę i podzielili komórki z szalki 100 mm na płytki 24-dołkowe do pożądanej początkowej gęstości posiewu komórek (jak w kroku 1). Jest to uważane za podział dnia. Umieść 24-dołkową płytkę w inkubatorze do hodowli komórkowych na 24 godziny.
  4. Dzień 3
    1. Hoduj komórki MMT przez 24 godziny na 24-dołkowej płytce. Poproś uczniów, aby obserwowali komórki pod mikroskopem i policzyli je za pomocą oprogramowania do mikroskopii (jak w kroku 2).
    2. Przekaż uczniowi/zespołowi próbki zapasów leków stosowanych w leczeniu raka. Poproś ich, aby przygotowali i rozcieńczyli oryginalny roztwór podstawowy (jak w kroku 3). Dodaj różne stężenia leków do ich komórek, aby ustalić krzywą dawka-odpowiedź. Nazywa się to Dniem 0.
    3. Inkubować komórki (krok 1.2) z lekami przez maksymalnie 48 godzin.
  5. Dzień 4
    1. Poproś uczniów, aby obserwowali leczone komórki po 24 godzinach. To jest Dzień 1.
    2. Policz każdą studzienkę za pomocą oprogramowania do mikroskopii. Zapisz zdjęcia każdej studzienki, aby liczenie można było przeprowadzić poza laboratorium (jak w kroku 2).
    3. Inkubuj komórki (krok 1.2) z lekami przez kolejne 24 godziny.
      Uwaga: Instruktor zapewnia dodatkowe samouczki i przeglądy analizy danych oraz prezentacji graficznej. Uczniowie uczą się tworzyć rysunki, wykresy i analizy statystyczne na następny dzień zbierania danych.
  6. Dzień 5
    1. Niech uczniowie potraktują komórki po 48 godzinach, dzień 2.
    2. Policz każdą studzienkę za pomocą oprogramowania do mikroskopii. Zapisz zdjęcia każdej studzienki, aby liczenie można było przeprowadzić poza laboratorium (jak w kroku 2).
    3. Zbieraj i zbieraj komórki do liczenia za pomocą tradycyjnej metody hemocytometru jako sposób weryfikacji zdolności ucznia do efektywnego korzystania z metody oprogramowania mikroskopowego (jak w kroku 2).
      Uwaga: Zbierz dane i odpowiednio wyciągnij wnioski lub zrewiduj hipotezy.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Hodowla komórek MMT i porównanie metod zliczania.

Komórki guza gruczołu mlekowego myszy zostały pomyślnie wyhodowane i scharakteryzowane (Rycina 1), a za pomocą oprogramowania Motic Software – programu powiązanego z kamerą cyfrową do mikroskopu – opracowano nową metodę liczenia komórek. Nową metodę liczenia komórek porównano z tradycyjną metodą z wykorzystaniem komory countingowej (Rycina 2), co wykazało jej równoważną dokładność w określaniu liczby k...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Przedstawiono moduł laboratoryjny, który ma na celu nauczanie różnorodnych tematów z zakresu biologii komórki poprzez zaawansowane techniki hodowli komórek zwierzęcych. Moduł osiąga to poprzez analizę wpływu wielu antyproliferacyjnych substancji chemicznych na replikację komórek, które modelują ludzkiego raka piersi. Test podstawowy opiera się na podstawowej technice liczenia komórek i wprowadza nowatorski sposób liczenia komórek za pomocą oprogramowania mikroskopowego. Ćwiczenia wchodzące w skład modułu mogą być prowadz...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie otrzymali żadnego wsparcia finansowego ani porównywalnego ze strony Motic.

Podziękowania

Ta praca jest wspierana przez Fundację Josepha Alexandra, ASBMB Undergraduate Research Award, 2013-2014, oraz Science Award Grant, Marymount Manhattan College, 2012-2013.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Kaptur do hodowli tkankowychESCO Labculture ReliantKlasa II Typ A2 Szafa bezpieczeństwa biologicznego
Inkubator wodny CO2CEDCOModel 1510
Hemocytometr jasnej liniiAmerykański optycznyz dwiema oddzielnymi siatkami
Motic Images PlusMac OSX Verison 2.0 lub nowszy
Gilson PipetmanRainin instrument co. incP-20D, P-200D, P-1000D
CK30/CK40 Mikroskop hodowlanyOlympus4 obiektywowy mikroskop światła odwróconego z kamerą
200 i #956; l Końcówki do pipetMidSci40200C
1,000 μ l Końcówki do pipetMidSciAVR4
10 ml Pipety serologiczneTPPTP94010
24-dołkowe płytkiCoStar- Klaster kultur tkankowych352424 dołki, średnica dołka 16 mm, sterylizowany promieniowaniem
Roztwór błękitu trypanowego 0,4%SigmaT8154100 ml, badanie na kulturach komórkowych bez haz
Bright-line Hemacytometr wymienny szkiełko nakrywkowe, bez hazSigma
Komórki guza sutka myszy (MMT)ATCCCCL-51
Eagle Minimalne podłoże ssatkowe (EMEM)ATCC30-2003500 ml
Płodowa surowica bydlęcaSigmaF0926500 ml
Chlorowodorek metforminySigmaPHR1084500 mg
TamoksyfenSigmaT5648biały lub biało-żółty proszek
CurmuminSigmaC1386żółto-pomarańczowy proszek
AspirynaSigmaA2093spełnia specyfikacje testowe USP
Z375357

Bibliografia

  1. Hammamieh, R., et al. Students investigating the antiproliferative effects of synthesized drugs on mouse mammary tumor cells. Cell Biol Educ. 4 (3), 221-234 (2005).
  2. Sykes, J. A., Whitescarver, J., Briggs, L. Observations on a cell line producing mammary tumor virus. J Natl Cancer Inst. 41 (6), 1315-1327 (1968).
  3. Palombi, P. S. J., Snell, K. Learning about Cells as Dynamic Entities: An Inquiry-Driven Cell Culture Project. Bioscene: Journal of College Biology Teaching. 33, 27-33 (2008).
  4. Ledbetter, M. L. S., Lippert, M. J. Glucose Transport in Cultured Animal Cells: An Exercise for the Undergraduate Cell Biology Laboratory. Cell Biology Education. 1 (3), 76-86 (2002).
  5. Weaver, D. Cardiac Cells Beating in Culture: A Laboratory Exercise. American Biology Teacher. 69, 407-410 (2007).
  6. Marion, R. E., Gardner, G. E., Parks, L. D. Multiweek cell culture project for use in upper-level biology laboratories. Advances in Physiology Education. 36, 154-157 (2012).
  7. Mozdziak, P. E. P., James, N., Carson, S. usanD. An Introductory Undergraduate Course Covering Animal Cell Culture Techniques. Biochemistry and Molecular Biology Education. 32 (5), 319-322 (2004).
  8. Anderson, L. W., et al. A taxonomy for learning, teaching and assessing: A revision of Bloom's Taxonomy of educational objectives (Complete Edition). , Longman, London, England. (2001).
  9. Centers for Disease Contol and Prevention. Appendix A - Primary Containment for Biohazards: Selection, Installation and Use of Biological Safety Cabinets. , (2014).
  10. Davis, J. M. Basic Cell Culture: A Practical Approach. , 2nd edn, Oxford University Press. Oxford, UK. (2002).
  11. Algra, A. M., Rothwell, P. M. Effects of regular aspirin on long-term cancer incidence and metastasis: a systematic comparison of evidence from observational studies versus randomised trials. Lancet Oncol. 13 (5), 518-527 (2012).
  12. Anand, P., Sundaram, C., Jhurani, S., Kunnumakkara, A. B., Aggarwal, B. B. Curcumin and cancer: an 'old-age' disease with an 'age-old' solution. Cancer Lett. 267 (1), 133-164 (2008).
  13. Ararat, E., Sahin, I., Altundag, K. Mechanisms behind the aspirin use and decreased breast cancer incidence. J BUON. 16 (1), 180(2011).
  14. Ararat, E., Sahin, I., Altundag, K. Aspirin intake may prevent metastasis in patients with triple-negative breast cancer. Med Oncol. 28 (4), 1308-1310 (2011).
  15. Blandino, G., et al. Metformin elicits anticancer effects through the sequential modulation of DICER and c-MYC. Nat Commun. 3, 865(2012).
  16. Kunnumakkara, A. B., Anand, P., Aggarwal, B. B. Curcumin inhibits proliferation, invasion, angiogenesis and metastasis of different cancers through interaction with multiple cell signaling proteins. Cancer Lett. 269 (2), 199-225 (2008).
  17. Burstein, D. E., Blumberg, P. M., Greene, L. A. Nerve growth factor-induced neuronal differentiation of PC12 pheochromocytoma cells: lack of inhibition by a tumor promoter. Brain Res. 247 (1), 115-119 (1982).
  18. Nazarali, S. A., Narod, S. A. Tamoxifen for women at high risk of breast cancer. Breast Cancer (Dove Med Press). 6, 29-36 (2014).
  19. Cui, J., et al. Cross-talk between HER2 and MED1 regulates tamoxifen resistance of human breast cancer cells). Cancer Res. 72 (21), 5625-5634 (2012).
  20. Komm, B. S., Mirkin, S. An overview of current and emerging SERMs. J Steroid Biochem Mol Biol. 143C, 207-222 (2014).
  21. Kaplan, R. M., Satterfield, J. M., Kington, R. S. Building a better physician--the case for the new MCAT. N Engl J Med. 366 (14), 1265-1268 (2012).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Techniki hodowli komórektest proliferacji komórekbadanie czynników chemioterapeutycznychliczenie za pomocą hemocytometruanaliza przy użyciu oprogramowania do mikroskopiikoncepcje cyklu komórkowegoszlaki sygnalizacji komórkowejedukacja w zakresie biologii nowotworówrozwój umiejętności laboratoryjnych
Wykorzystanie komórek nowotworowych sutka myszy do nauczania podstawowych pojęć biologicznych: prosty moduł laboratoryjny
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.