Wykorzystanie sortowania komórek aktywowanego fluorescencją do zbadania ekspresji genów specyficznych dla typu komórki w tkance mózgowej szczura

Summary

Celem tego protokołu jest użycie techniki sortowania komórek aktywowanych fluorescencją (FACS) do sortowania określonych typów komórek nerwowych w celu późniejszej analizy ekspresji genów specyficznych dla typu komórki, markerów epigenetycznych i/lub ekspresji białek.

Abstract

Mózg składa się z czterech podstawowych typów komórek, w tym neuronów, astrocytów, mikrogleju i oligodendrocytów. Chociaż nie są one najliczniejszym typem komórek w mózgu, neurony są najczęściej badanymi z tych typów komórek, biorąc pod uwagę ich bezpośrednią rolę w wpływaniu na zachowania. Inne typy komórek w mózgu również wpływają na funkcje i zachowanie neuronów poprzez wytwarzane przez nie cząsteczki sygnałowe. Neurobiolodzy muszą zrozumieć interakcje między typami komórek w mózgu, aby lepiej zrozumieć, w jaki sposób te interakcje wpływają na funkcje neuronalne i chorobę. Do tej pory najpowszechniejszą metodą analizy ekspresji białek lub genów jest homogenizacja próbek całych tkanek, zwykle z krwią i bez względu na typ komórki. Podejście to jest informacyjnym podejściem do badania ogólnych zmian w ekspresji genów lub białek, które mogą wpływać na funkcje i zachowanie neuronów; Jednak ta metoda analizy nie pozwala na lepsze zrozumienie ekspresji genów specyficznych dla typu komórki i wpływu komunikacji międzykomórkowej na funkcje neuronalne. Analiza epigenetyki behawioralnej jest obszarem rosnącego zainteresowania, który bada, w jaki sposób modyfikacje struktury kwasu dezoksyrybonukleinowego (DNA) wpływają na długoterminową ekspresję i zachowanie genów; Jednak informacje te mogą być istotne tylko wtedy, gdy są analizowane w sposób specyficzny dla typu komórki, biorąc pod uwagę różnicującą linię, a tym samym markery epigenetyczne, które mogą być obecne w niektórych genach poszczególnych typów komórek nerwowych. Opisana poniżej technika sortowania komórek aktywowanych fluorescencją (FACS) zapewnia prosty i skuteczny sposób izolowania pojedynczych komórek nerwowych w celu późniejszej analizy ekspresji genów, ekspresji białek lub epigenetycznych modyfikacji DNA. Technika ta może być również zmodyfikowana w celu wyizolowania bardziej specyficznych typów komórek nerwowych w mózgu w celu późniejszej analizy specyficznej dla typu komórki.

Introduction

Celem opisanego poniżej protokołu jest izolowanie poszczególnych typów komórek z heterogenicznej populacji tkanki nerwowej w celu późniejszej analizy ekspresji genów specyficznych dla typu komórki, ekspresji białek, a nawet markerów epigenetycznych. Mózg składa się z wielu typów komórek, które pochodzą z odrębnych komórek progenitorowych i które mają właściwości i funkcje specyficzne dla typu komórki. Pomimo tych różnic, te odrębne typy komórek nerwowych mogą wyrażać podobne receptory i wewnątrzkomórkowe cząsteczki sygnałowe, co sprawia, że analiza tych bardziej wszechobecnych białek jest trudna do zmierzenia lub interpretacji w sposób specyficzny dla typu komórki przy użyciu konwencjonalnych metod. Neurobiolodzy muszą zidentyfikować funkcję i aktywację tych odrębnych typów komórek w mózgu oraz sposób, w jaki mogą one indywidualnie wpływać na zachowanie, ponieważ ostatecznie będzie to pierwszy krok do zidentyfikowania bardziej specyficznych leków i celów terapeutycznych w chorobach neurologicznych i neuropsychiatrycznych. Pomimo tego nadrzędnego celu badań neurobiologicznych, wyizolowanie poszczególnych typów komórek nerwowych z mózgu w celu analizy ekspresji genów lub białek, aktywacji cząsteczek sygnałowych lub modyfikacji markerów epigenetycznych na DNA może być trudne. Spośród obecnie stosowanych technik, immunohistochemia może zidentyfikować ekspresję białek w sposób specyficzny dla typu komórki w połączeniu z dodatkowym barwieniem markera specyficznego dla typu komórki, chociaż opiera się to na specyficznych przeciwciałach, które mogą odpowiednio barwić białka będące przedmiotem zainteresowania i może być trudne do określenia ilościowego. Hybrydyzacja in situ może zidentyfikować specyficzną lokalizację informacyjnego kwasu rybonukleinowego (mRNA) w poszczególnych komórkach mózgu, ale jest to pracochłonny proces, który ogranicza również koanalizę określonych typów komórek i pozwala na analizę tylko jednego lub może kilku interesujących genów. Mikrodyssekcja wychwytywania laserowego wykorzystuje laser do izolowania subpopulacji komórek, które są wizualizowane za pomocą mikroskopii; jednak czasochłonny charakter tego procesu i stosunkowo niska wydajność mogą znacznie ograniczyć późniejszą analizę poziomów białek lub mRNA, zwłaszcza jeśli ekspresja tych cząsteczek jest na początku niska. Sortowanie komórek aktywowane fluorescencją (FACS) jest stosunkowo nową techniką w dziedzinie neurobiologii, służącą do izolowania poszczególnych typów komórek z mózgu w celu późniejszej analizy ekspresji genów¹ i/lub celów epigenetycznych². Proces ten może być również wykorzystany do sortowania określonych typów komórek nerwowych w celu późniejszej analizy ekspresji genów specyficznych dla typu komórki, ekspresji białek lub markerów epigenetycznych. FACS jest od dziesięcioleci stosowany w wielu dziedzinach badań medycznych, takich jak rak i immunologia, do liczenia i sortowania różnych komórek na podstawie cech fizycznych lub biochemicznych³. Ponadto cytometria przepływowa jest klasycznie stosowana do analizy ekspresji białek w przeliczeniu na komórkę, przy użyciu specyficznych przeciwciał. Opisana poniżej procedura wykorzystuje klasyczne techniki cytometrii przepływowej do izolowania poszczególnych typów komórek w celu późniejszej analizy punktów końcowych biologii molekularnej. Cytometr przepływowy może przeanalizować kilka tysięcy komórek w ciągu sekundy, co czyni go szybką i wydajną alternatywą dla opisanych powyżej technik. Ponadto komórki można izolować na podstawie ekspresji komórkowej określonego białka (na przykład receptora neuroprzekaźnika) lub kombinacji dwóch lub więcej białek (kolokalizacja wielu białek w określonym typie komórki). Dzięki temu użytkownik może wyizolować bardzo selektywne typy komórek nerwowych na podstawie ich właściwości molekularnych w celu zidentyfikowania ich funkcji w mózgu.

Aby wykonać FACS, komórki nerwowe są przygotowywane do jednokomórkowego zawieszenia, które jest przepuszczane przez komórkę przepływową, która przenosi i wyrównuje komórki tak, że przechodzą pojedyncze file przez wiązkę światła i lasery do analizy. Komputer pobiera dane z każdej komórki i nanosi je na histogram w celu analizy określonych parametrów (rozmiaru, ziarnistości i fluorescencji). Na podstawie tych parametrów komórki można natychmiast posortować do oddzielnych probówek w celu ich zapamiętania, a następnie analizy dowolnego pożądanego punktu końcowego. Opisany poniżej protokół wykorzystuje trzy przeciwciała do sortowania neuronów (przy użyciu antygenu tymocytowego 1, przeciwciała Thy1), astrocytów (przy użyciu transportera glutaminianu gleju, przeciwciała GLT1) i mikrogleju (przy użyciu klastra cząsteczki różnicującej 11B, przeciwciała CD11b). Protokół ten może być stosowany w sposób opisany poniżej lub modyfikowany różnymi przeciwciałami w zależności od typu komórki, którą chciałoby się wyizolować do własnych eksperymentów.

Jest kilka zastrzeżeń do rozważenia przy ustalaniu, czy ten protokół jest odpowiedni dla konkretnych eksperymentów. Jedno poważne zastrzeżenie może dotyczyć konkretnego typu komórki, którą chciałoby się wyizolować. W tym protokole trzy przeciwciała, które są stosowane, to przeciwciała zewnątrzkomórkowe, które pozwalają eksperymentatorowi utrzymać typy komórek w stanie nienaruszonym podczas procedury barwienia, zachowując w ten sposób integralność RNA, DNA i białek wewnątrz. Możliwe, że ktoś może chcieć wyizolować określony typ komórek nerwowych za pomocą przeciwciała, które identyfikuje białko, które ulega ekspresji tylko wewnątrz tej konkretnej komórki. Na przykład, można chcieć wyizolować neurony dopaminergiczne za pomocą przeciwciała przeciwko hydroksylazie tyrozynowej lub wyizolować neurony acetylocholiny za pomocą przeciwciała przeciwko acetylotransferazie choliny. Białka te są wewnątrzkomórkowe, a zatem wymagałyby utrwalenia i przepuszczalności błony komórkowej w celu późniejszego barwienia odpowiednimi przeciwciałami. Chociaż zostało to zrobione przed ^4,5, proces ten może znacznie zmniejszyć wydajność RNA lub DNA z tych przepuszczalnych komórek. Kolejnym zastrzeżeniem może być to, że nie wszystkie przeciwciała są odpowiednie dla FACS. Na przykład, można obecnie użyć przeciwciała, które działa bardzo dobrze w przypadku western blot, techniki, która wymaga denaturacji białek. Przeciwciało to niekoniecznie musi być odpowiednie do identyfikacji tych typów komórek za pomocą FACS, biorąc pod uwagę, że białka nie są denaturowane w żadnym momencie tego protokołu, a zatem przeciwciało może nie mieć możliwości związania się z nieodłącznym antygenem. Przedsiębiorstwa dostarczają arkusze specyfikacji, które identyfikują zastosowania, dla których przeciwciało zostało zatwierdzone. Jeśli przeciwciało nie zostało zatwierdzone do cytometrii przepływowej, nie powinno to zniechęcać do wypróbowania tego protokołu z określonym przeciwciałem; należy jednak pamiętać, że nie ma gwarancji, że będzie działać w przypadku FACS. Trzecie zastrzeżenie tego protokołu dotyczy liczby komórek, które próbuje się wyizolować. FACS jest doskonałą techniką pozwalającą uzyskać jak najwięcej komórek nawet z małego kawałka tkanki, ale możliwe jest również, że jeśli ktoś chciałby wyizolować stosunkowo rzadką populację komórek ze stosunkowo małego obszaru mózgu, wydajność z jednego zwierzęcia będzie z natury niska. W takim przypadku może być konieczne połączenie tkanki mózgowej kilku zwierząt z tej samej grupy poddanej działaniu substancji w celu uzyskania liczby komórek niezbędnej do późniejszej analizy; jednak w niedawnej publikacji wykorzystano ukierunkowaną na geny wstępną amplifikację cDNA do późniejszej analizy ekspresji genów z niewielkiej liczby aktywowanych neuronów (5-6%) z większego zestawu posortowanych neuronów, co wskazuje, że możliwe jest analizowanie ekspresji genów nawet z małych podzbiorów komórek nerwowych bez łączenia dużej liczby zwierząt⁶Ostatnim zastrzeżeniem tej techniki jest to, że należy mieć dostęp do sortera komórek, który nie jest zbyt daleko. Sortownik komórek to skomplikowana maszyna, która wymaga znacznego przeszkolenia, aby prawidłowo z niej korzystać. W związku z tym maszyny te są często obsługiwane przez wykwalifikowanego technika w głównym obiekcie. Ponadto celem tej procedury jest dysocjacja tkanki nerwowej, wybarwienie jej pod kątem określonych przeciwciał i natychmiastowe zabranie tych próbek do sortera w krótkim czasie (być może pół dnia). Takie ramy czasowe pomogą zwiększyć przeżywalność i wydajność izolowanych komórek oraz utrzymać integralność komórek do późniejszego przetwarzania i analizy. Jeśli wszystkie te parametry opisane powyżej są spełnione, FACS jest doskonałą metodą do analizy specyficznej dla typu komórki ekspresji genów i białek z tkanki nerwowej.

Wszystkie eksperymenty zostały przeprowadzone zgodnie z Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) Uniwersytetu Delaware oraz National Institutes of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals.

Protocol

1. Przygotowanie do pobrania tkanek (15 – 30 min)

1. Wypoleruj ogniowo trzy zestawy szklanych pipet Pasteura o zmniejszających się średnicach i ponumeruj je "1" = średnica około 1 mm, "2" = średnica około 0,75 mm i "3" = średnica około 0,50 mm.
2. Ponownie zawiesić liofilizowany enzym A z całym buforem A zgodnie z protokołem dostarczonym z zestawem do dysocjacji neuronalnej (patrz tabela materiałów). Nie wirować. Podwielokrotność roztworu podzielić na 50 μl porcji i przechowywać w temperaturze -20 °C do późniejszego wykorzystania.
3. Przygotować 1 l buforu do usuwania mieliny i filtra próżniowego do sterylizacji [bufor do usuwania mieliny = 1,000 ml 0,1 M soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS), 2 ml 500 mM kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA) i 10 g albuminy surowicy bydlęcej (BSA)].
4. Pokrój arkusz siatki nylonowej na małe kwadraty o wymiarach 1 x 1 cal (2,5 x 2,5 cm), które posłużą do filtrowania resztek komórkowych i autoklawu w małej zlewce pokrytej folią aluminiową.
5. Przygotować 1 l buforu do przemywania [bufor do przemywania = 1 000 ml 0,1 M PBS, 2 ml 500 mM EDTA i 10 g BSA].

2. Pobieranie tkanek

1. Włączyć łaźnię wodną do 37 ºC.
2. Przygotować bufor X z zestawu do dysocjacji neuronalnej, dodając beta-merkaptoetanol do buforu X do końcowego stężenia 0,067 mM (dla 4 próbek dodać 13,5 μl 50 mM beta-merkaptoetanolu do 10 ml buforu X).
3. Przygotuj mieszankę enzymów 1, mieszając 50 μl enzymu P z 1 900 μl buforu X dla każdej próbki, jak opisano w protokole zestawu do dysocjacji neuronów Na przykład dla 4 próbek zmieszaj 200 μl enzymu P z 7 600 μl buforu X.
4. Umieścić bufor X w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C.
5. Umieścić 2 ml zimnego buforowanego roztworu soli Hanka (HBSS) (bez Ca⁺⁺ i Mg⁺⁺⁾ w jednym dołku sterylnej 6-dołkowej płytki hodowlanej dla każdej próbki, która zostanie pobrana i przechowywać na lodzie w celu rozbioru tkanek.

3. Sekcja tkanek (45 min – 1 godz.)

1. Wstrzyknąć zwierzęciu odpowiednią objętość roztworu do eutanazji (dostępny w handlu roztwór barbituranów, np. Euthasol), zgodnie z wytycznymi Instytucjonalnego Komitetu ds. Opieki nad Zwierzętami i Wykorzystania (IACUC) i przepłukać całą krew zimnym 0,9% roztworem soli fizjologicznej.
   1. Podawać szczurom przedawkowanie roztworu do eutanazji.
   2. Monitoruj znieczulenie poprzez oddychanie i szczypanie palców u stóp. Kiedy zwierzę jest wystarczająco znieczulone (brak reakcji na szczypanie palca u nogi i głęboki, powolny oddech), szczur może zostać poddany perfuzji.
   3. Aby przebić krew szczura, rozetnij klatkę piersiową za pomocą wytrzymałych nożyczek. Przetnij przeponę, aby umożliwić dostęp aż do serca. Przetnij żebra po obu stronach aż do górnej części klatki piersiowej, aby umożliwić pełny dostęp do serca. W tym momencie klatkę piersiową można przytrzymać na bok za pomocą pary hemostatów.
   4. Wykonać perfuzję serca, wprowadzając igłę 18 G (dla dorosłych szczurów) przymocowaną do pompy elektrycznej do lewej komory serca. Pompa pobiera zimny 0,9% roztwór soli fizjologicznej.
   5. Następnie rozetnij prawy przedsionek małymi nożyczkami, aby umożliwić spuszczenie krwi i płynu z ciała.
   6. U szczurów należy użyć około 10 ml (dla dorosłych szczurów) 0,9% soli fizjologicznej w celu usunięcia wszystkich obwodowych komórek i czynników odpornościowych.
2. Wypreparuj żądaną część obszaru mózgu za pomocą sterylnych żyletek i odpowiedniego rozwarstwienia, a następnie umieść fragmenty tkanki w zimnym HBSS bez Ca²⁺ i Mg^{2 +} < br / > UWAGA: Protokół wymaga HBSS bez Ca²⁺ i Mg²⁺ we wczesnych etapach protokołu, ponieważ jony te mogą zakłócać enzymy wymagane do dysocjacji neuronalnej.
3. Po pobraniu wszystkich próbek tkanek należy wrócić do czystej ławki lub sterylnego kaptura hodowlanego w celu przetworzenia tkanki.

4. Dysocjacja neuronalna (1 godz.)

1. Pokrój każdą próbkę tkanki w kostkę na małe kawałki za pomocą sterylnych żyletek na pokrywie 6-dołkowej płytki hodowlanej. Protokół ten był stosowany do próbek tkanek o wielkości około 30 - 100 mg, ale został zatwierdzony dla próbek tkanek o wielkości do 400 mg. W przypadku próbek tkanek większych niż 400 mg objętości odczynników muszą być odpowiednio zwiększane.
2. Użyj 1 ml świeżego HBSS bez Ca²⁺ i Mg²⁺, aby przenieść pokrojone w kostkę kawałki tkanki za pomocą pipety do sterylnej probówki wirówkowej o pojemności 2 ml. Powtarzać kroki 4.1 i 4.2 dla wszystkich próbek, aż wszystkie próbki zostaną przeniesione do probówki wirówkowej o pojemności 2 ml.
3. Odwirować próbki o masie 300 x g przez 2 minuty w temperaturze pokojowej i odessać supernatant.
4. Dodać 1 900 μl ciepłej mieszanki enzymatycznej 1, przygotowanej w krokach 2.2 i 2.3, do każdej próbki i zamknąć probówki.
5. Inkubować próbki przez 15 minut w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C, kilkakrotnie odwracając probówki co 5 minut w celu ponownego zawieszenia osiadłych kawałków tkanki.
6. W międzyczasie przygotuj mieszankę enzymów 2, mieszając 20 μl buforu Y z 10 μl rozmrożonego enzymu A (dla 4 próbek zmieszać 80 μl buforu Y z 40 μl rozmrożonego enzymu A).
7. Dodać 30 μl Enzyme Mix 2 do każdej próbki i delikatnie odwrócić. Nie wirować.
8. Oddziel każdą próbkę tkanki za pomocą pipety Pasteura "1", rozcierając ją w górę iw dół 30 razy.
9. Inkubować próbki przez 15 minut w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C; odwracać probówki kilka razy co 5 minut, aby ponownie zawiesić osadzone kawałki tkanki.
10. Dysocjację każdej próbki tkanki należy wykonać za pomocą pipety Pasteura "2", trzykrotnie rozcierając ją w górę i w dół. Unikaj generowania bąbelków.
11. Dysocjację każdej próbki tkanki za pomocą pipety Pasteura "3", rozcierając w górę i w dół 30 razy. Unikaj generowania bąbelków.
12. Inkubować próbki przez 10 minut w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C; odwracać probówki kilka razy co 5 minut, aby ponownie zawiesić osadzone komórki.
13. Nałożyć zawiesinę jednokomórkową na szczep komórek o wielkości 80 mikronów umieszczony na 15 ml probówce Falcon w celu usunięcia wszelkich dużych kawałków zanieczyszczeń i umyć filtr i komórki 10 ml HBSS (z Ca²⁺ i Mg²⁺) w celu zatrzymania reakcji enzymatycznych. Powtarzać tę czynność, aż każda próbka zostanie przeniesiona do czystej probówki sokoła o pojemności 15 ml.
14. Odwirować próbki o masie 300 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej i odessać z supernatantu.

5. Wyczerpanie mieliny (45 min)

1. Dokładnie ponownie zawiesić osad komórek za pomocą 400 μl buforu do usuwania mieliny.
2. Dodaj określoną ilość kulek do usuwania mieliny i pipetę w górę iw dół, aby dokładnie wymieszać.
   UWAGA: Objętość kulek do usuwania mieliny, która jest używana, będzie zależeć od wielkości tkanki, wieku zwierzęcia i ilości mieliny oczekiwanej w tym konkretnym obszarze mózgu. Na przykład w przypadku próbki hipokampa dorosłego szczura (około 300 mg) należy inkubować próbkę ze 100 μl kulek do usuwania mieliny.
3. Inkubować przez 15 minut w lodówce w temperaturze 4 °C.
4. Przemyć każdą próbkę 5 ml buforu do usuwania mieliny.
5. Odwirować próbki o masie 300 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
6. Podczas wirowania próbek umieść 1 kolumnę dla każdej próbki w polu magnetycznym sortownika magnetycznego i umieść czysty filtr o grubości 80 mikronów na wierzchu każdej kolumny.
7. Przygotować kolumny i przefiltrować, przepłukując każdą kolumnę 1 ml buforu do usuwania mieliny, 3 razy (łącznie 3 ml). Zbierz cały przepływ do pojemnika na odpady, takiego jak dno pustego pudełka na końcówki.
8. Umieścić 5 ml polistyrenowej probówki z okrągłym dnem bezpośrednio pod każdą kolumną w celu przygotowania do pobrania próbki.
9. Gdy komórki zakończą wirowanie, odessać supernatant i dokładnie zawiesić ponownie w 500 μl buforu do usuwania mieliny. Natychmiast nałóż zawiesinę komórek na kolumnę i zbierz komórki w probówce poniżej.
10. Przemyć filtr i kolumnę 1 ml buforu do usuwania mieliny, 4 razy (łącznie 4 ml).
11. Odwirować zbiór komórek przy 300 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
12. Odessać supernatant, a komórki są teraz gotowe do barwienia.

6. Barwienie żywych komórek dla FACS (1 godzina na barwienie)

1. Krótko zawirować (2 sekundy) komórki w celu oddzielenia osadu i natychmiast dodać 5 μl bloku Fc (antyklastry różnicowania 32, CD32), ponownie zwirować i inkubować w lodówce w temperaturze 4 ºC przez 5 minut.
2. W międzyczasie przygotuj mieszaninę przeciwciał pierwszorzędowych, dodając trzy przeciwciała pierwszorzędowe do buforu płuczącego w następujący sposób: 0,125 μl przeciwciała CD11b sprzężonego z allofikocyjaniną (APC) (1:800), 1 μl przeciwciała anty-GLT1 (1:100) i 0,4 μl izotiocyjanianu fluoresceiny (FITC) – sprzężonego przeciwciała Thy1 (1:250) na każde 100 μl buforu do płukania. Każda próbka otrzyma 100 μl mieszaniny przeciwciał pierwotnych do inkubacji; Jeśli jednak próbka jest znacznie większa niż 400 mg tkanki, można rozważyć odpowiednie zwiększenie objętości mieszaniny przeciwciał pierwotnych
3. Przygotuj probówki do pojedynczej kontroli barwienia, usuwając tylko 2 μl komórek z każdej probówki z próbką i dodając ją do każdej pojedynczej probówki do kontroli barwienia. Kontrole "pojedynczego barwienia" obejmują: tylko APC-CD11b, tylko GLT1, tylko FITC-Thy1, tylko przeciwciało wtórne PE oraz "ślepą" lub niebarwioną kontrolę.
   UWAGA: Wszystkie próbki powinny być reprezentowane we wszystkich kontrolach barwienia, dlatego do każdej probówki kontrolnej należy dodać 2 μl komórek z każdej próbki.
4. Krótko zawirować probówki (2 sekundy) i dodać 100 μl mieszaniny przeciwciał pierwszorzędowych do każdej probówki z próbką i 100 μl odpowiedniego przeciwciała pierwszorzędowego do każdej probówki kontrolnej barwienia, ponownie zawirować probówki, przykryć probówki folią aluminiową w celu ochrony przeciwciał fluorescencyjnych przed światłem i inkubować probówki w lodówce w temperaturze 4 °C przez 20 minut. Próbki powinny być przechowywane w chłodnym miejscu (w temperaturze 4 °C) przez pozostałą część procedury, aby zachować integralność próbek i przeciwciał.
5. Krótko zmieszać probówki i dodać 2 ml buforu do przemywania każdej probówki.
6. Probówki wirować o stężeniu 350 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
7. W międzyczasie należy przygotować mieszaninę przeciwciał drugorzędowych, dodając 0,2 μl sprzężonego z PE przeciwciała drugorzędowego przeciwko królikowi na każde 100 μl buforu do płukania. Każda próbka otrzyma 100 μl mieszaniny przeciwciał wtórnych; Jeśli jednak próbka jest znacznie większa niż 400 mg tkanki, możesz rozważyć odpowiednie zwiększenie objętości podstawowej mieszaniny przeciwciał.
8. Po zakończeniu wirowania zrzuć supernatant z każdej próbki do zlewu i osusz probówki do góry nogami na ręczniku papierowym.
9. Krótko zawirować probówki i dodać 100 μl mieszaniny przeciwciał wtórnych do każdej probówki z próbką i odpowiednie przeciwciało drugorzędowe do każdej kontroli barwienia, ponownie zawirować probówki, przykryć probówki folią aluminiową i inkubować probówki w lodówce w temperaturze 4 °C przez 15 min.
   UWAGA: Probówka kontrolna barwienia tylko GLT1 powinna otrzymać wtórną mieszaninę przeciwciał.
10. Po inkubacji krótko zawirować probówki i dodać 2 ml buforu do przemywania każdej probówki.
11. Odwirować probówki o sile 350 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
12. Po zakończeniu wirowania zrzuć supernatant z każdej próbki do zlewu i osusz probówki do góry nogami na ręczniku papierowym.
13. Zmieszać probówki i dodać 0,25 ml sterylnego PBS do każdej probówki. Próbki są gotowe do sortowania.
    UWAGA: Więcej komórek może wymagać 0,5 ml sterylnego PBS; Najlepiej jednak zacząć od mniejszej objętości, ponieważ próbkę zawsze można rozcieńczyć, jeśli jest zbyt skoncentrowana na komórkach.
    UWAGA: Opcjonalnie dodaj DNazę do probówki, aby zapobiec zbrylaniu się komórek, a tym samym zatykaniu sortera. Próbki mogą być również filtrowane za pomocą sterylnego filtra o średnicy 80 mikronów tuż przed sortowaniem, aby uniknąć zatkania sortownika.
14. Przenieś komórki do sortera na lodzie. Zebrać populacje komórek w 2 ml probówkach wirówkowych bez nukleaz z 0,5 ml sterylnego PBS w każdej probówce.
15. Po sortowaniu wirować komórki w temperaturze 300 x g przez 2 minuty w temperaturze 4 ºC. Odessać większość PBS i błyskawicznie zamrozić komórki w zamrażarce o temperaturze -80 ºC do czasu dalszego przetwarzania w celu ekstrakcji RNA (patrz 1 w celu uzyskania dalszych szczegółów protokołu), ekstrakcji DNA (patrz 2 w celu uzyskania dalszych szczegółów protokołu) lub lizy komórek w celu analizy białek.

Results

Znaczenie zubożenia mieliny i perfuzji tkanek

Rysunek 1 przedstawia znaczenie wyczerpania mieliny. Wyczerpanie mieliny (kroki od 5.1 do 5.12 powyższego protokołu) występuje, gdy zawiesina pojedynczej komórki jest inkubowana w kulkach do usuwania mieliny, myta, a następnie przepuszczana przez kolumnę na sortowniku magnetycznym. Celem tych kroków jest zmniejszenie ilości zanieczyszczeń komórkowych obecnych w każdej próbce. Ponieważ neurony są dysocjowane i rozdzielone, może ścin...

Discussion

Podobnie jak wiele innych tkanek i układów, mózg składa się z heterogenicznej populacji komórek, które funkcjonują razem, aby wpływać na zachowanie. Analiza ekspresji genów, ekspresji białek lub modyfikacji epigenetycznych z pojedynczych komórek w tej heterogenicznej populacji może potencjalnie ujawnić informacje o funkcji systemu jako całości, zidentyfikować procesy komórkowe regulujące zarówno normalne zachowanie, jak i procesy chorobowe, a także zapewnić specyficzne dla typu komórki cele dla potencjalnych terapii. Moż...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Zestaw do dysocjacji neuronalnej (P)	Miltenyi Biotec	130-092-628
Kulki do usuwania mieliny II	Miltenyi Biotec	130-096-733
Kolumny LS	Miltenyi Biotec	130-042-401
Separator QuadroMACS	Miltenyi Biotec	130-090-976
MACS MultiStand	Miltenyi Biotec	130-042-303
Arkusz siatki nylonowej	Amazon	CMN-0074-10YD	40 cali szerokości, siatka o rozmiarze 80 mikronów
Fc Block / anty-CD32	BD Biosciences	BDB550270	reaktywność dla szczura
Przeciwciało CD11b sprzężone z APC	Biolegend	201809	reaktywność dla szczura
Królik anty-GLT1	Novus Biologicals	NBP1-20136	reaktywność dla szczura lub człowieka
anty-królika sprzężonego z PE przeciwciało drugorzędowe	eBioscience	1037259	przeciwciało drugorzędowe dla
mysiego przeciwciała anty-szczurzego CD90 (Thy1) sprzężonego z anty-GLT1	Biolegend	202504	reaktywność u szczurów