Ocena funkcji nerek danio pręgowanego za pomocą fluorescencyjnego testu klirensu

Summary

Danio pręgowany jest popularnym narzędziem do modelowania przewlekłej choroby nerek (PChN). Jednak ich niewielkie rozmiary uniemożliwiają ocenę funkcji nerek tradycyjnymi metodami. Opisujemy fluorescencyjny test usuwania nerek^{barwnika 1}, który umożliwia analizę ilościową funkcji nerek danio pręgowanego w PChN.

Abstract

Zarodek danio pręgowanego stanowi łatwy do wykonania model do badania organogenezy i modelowania chorób genetycznych człowieka. Pomimo swojej względnej prostoty nerka danio pręgowanego rozwija się i funkcjonuje prawie tak samo jak ludzie. Główną różnicą w budowie ludzkiej nerki jest obecność milionów nefronów w porównaniu z danio pręgowanym, który ma tylko dwa. Jednak uproszczenie tak złożonego systemu do podstawowych jednostek funkcjonalnych pomogło nam zrozumieć, jak rozwija się i działa nerka. U danio pręgowanego kłębuszki nerkowy znajdujący się w linii środkowej jest odpowiedzialny za początkową filtrację krwi do dwóch kanalików przednerczowych, które rozchodzą się, biegnąc dwustronnie w dół osi zarodka, zanim zrośnią się ze sobą w kloace. Kanaliki pronefriczne są silnie zaludnione przez ruchliwe rzęski, które ułatwiają ruch filtratu wzdłuż segmentowanego kanalika, umożliwiając wymianę różnych substancji rozpuszczonych przed ostatecznym wyjściem przez kloakę^2-4. Wiele genów odpowiedzialnych za PChN, w tym te związane z ciliogenezą, badano u danio pręgowanego⁵. Jednak główną wadą jest trudność w ocenie funkcji nerek danio pręgowanego po manipulacji genetycznej. Tradycyjne testy do pomiaru dysfunkcji nerek u ludzi okazały się nietranslacyjne dla danio pręgowanego, głównie ze względu na ich środowisko wodne i niewielkie rozmiary. Na przykład fizycznie nie jest możliwe pobranie krwi od ryb w stadium zarodkowym w celu analizy zawartości mocznika i kreatyniny, ponieważ są one zbyt małe. Ponadto danio pręgowany nie wytwarza wystarczającej ilości moczu do badania na prostym wskaźniku białkomoczu, który często wykonuje się podczas wstępnych badań pacjenta. Opisujemy test fluorescencyjny, który wykorzystuje przezroczystość optyczną danio pręgowanego do ilościowego monitorowania klirensu barwnika fluorescencyjnego w czasie z układu krwionośnego i na zewnątrz przez nerki, aby uzyskać odczyt funkcji nerek^1,6-9.

Introduction

Ludzka nerka odgrywa kluczową rolę w filtrowaniu odpadów metabolicznych z krwi i odzyskiwaniu wymaganych substancji rozpuszczonych do utrzymania homeostazy komórkowej. Istnieje wiele chorób genetycznych człowieka, które powodują dysfunkcję nerek. Najczęstszą dziedziczną chorobą nerek jest autosomalna dominująca wielotorbielowatość nerek (ADPKD), charakteryzująca się rozwojem wypełnionych płynem worków w kanalikach nerkowych; Uszkodzenia spowodowane cystogenezą są szkodliwe dla funkcji nerek¹⁰. ADPKD występuje w stosunku 1:800 - 1:1 000 i stanowi 8 - 10% pacjentów ze schyłkową niewydolnością nerek (ESRF)¹¹. Za ADPKD uważa się kilka genów, w tym po....

Protocol

Oświadczenie etyczne: Utrzymanie zwierząt, hodowla i procedury są zdefiniowane i kontrolowane przez Ustawę o zwierzętach (procedury naukowe) z 1986 roku. Wszystkie eksperymenty na zwierzętach zostały przeprowadzone na podstawie licencji udzielonych przez Ministra Spraw Wewnętrznych (PIL nr 70/7892) zgodnie z Biological Services Management Group i Biological Services Ethical Committee, SGUL, Londyn, Wielka Brytania. Dołożono wszelkich starań, aby zmniejszyć liczbę wykorzystywanych zwierząt i udoskonalić zarówno procedury, jak i hodowlę, aby zminimalizować cierpienie i poprawić dobrostan.

1. Przygotowanie instrumentów, środka znieczulającego i ....

Results

Zespół Bardeta-Biedla (BBS) to rzadka heterogeniczna ciliopatia, która dotyka około 1:160 000 osób na całym świecie¹⁶. Pacjenci zgłaszają się z szeregiem powiązanych problemów, w tym z wielotorbielowatością nerek, w związku z czym pacjenci często wymagają dializy lub przeszczepu nerki²⁴. ESRF jest najczęstszą przyczyną zgonów w BBS, a u około 30% pacjentów rozwija się PChN¹⁶. Obecnie 20 niepowiązanych genów jest zaangażowanych w BBS bez opublikowanego związku genotyp z fenotypem. Białka B.......

Discussion

Danio pręgowany stanowi cenne narzędzie do modelowania chorób genetycznych człowieka, a ich wykorzystanie jako instrumentu naukowego do badań in vivo umożliwiło szczegółowe badania genetycznego rozkładu wielu układów biologicznych, w tym nerek. Obecnie wiele wiadomo o tym, jak rozwija się i funkcjonuje nerka danio pręgowanego. Uderzające podobieństwa do ludzkiej nefrostenezy i homologii z genami powodującymi chorobę²¹ zilustrowały, w jaki sposób danio pręgowany stał się fundamentalny w zrozumieniu, w .......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
P-97 SUTTER Ściągacz do mikropipet typu płomieniowego/brązowego	Intracel	P-97
kapilary borokrzemianowe o standardowych ściankach	Aparat Harvarda	30-0017
Szkiełka mikroskopowe	VWR International	631-0109
Klej do żywicy epoksydowej	Evo-Stik
Rodamina B 10 000 MW z oznaczeniem Dextran	Life technologies	D-1824
N-fenylotiomocznik	Sigma-Aldrich	P7629
Blues metylenowy	Sigma-Aldrich	M9140
Sól metanosulfonianu etylu 3-aminobenzoesanu	Sigma-Aldrich	A5040
metyloceluloza	Sprężarka powietrza Sigma-Aldrich	M0512
	Jun-Air	OF302-15
Picospritzer III	Instrumenty Parker	051-0500-900
Kompaktowy 3-osiowy mikromanipulator sterujący	Marzhauser	MM33
Mikroskop preparacyjny stereoskopowy	Nikon	SMZ1000
końcówki do mikroładowarek	Eppendorf	5242956003
Dumont #5 kleszcze	Mikrometr stopniowy Sigma-Aldrich	F6521
	Pyser- SGI	02A00404