Artykuł metodologiczny

Ocena funkcji nerek danio pręgowanego za pomocą fluorescencyjnego testu klirensu

DOI:

10.3791/52540

⸱

20 lutego 2015

 ,  , 
1Genetics and Genomic Medicine, Institute of Child Health, University College London, 2Molecular Cell Science Research Centre, St. George's University of London

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Danio pręgowany jest popularnym narzędziem do modelowania przewlekłej choroby nerek (PChN). Jednak ich niewielkie rozmiary uniemożliwiają ocenę funkcji nerek tradycyjnymi metodami. Opisujemy fluorescencyjny test usuwania nerekbarwnika 1, który umożliwia analizę ilościową funkcji nerek danio pręgowanego w PChN.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zarodek danio pręgowanego stanowi łatwy do wykonania model do badania organogenezy i modelowania chorób genetycznych człowieka. Pomimo swojej względnej prostoty nerka danio pręgowanego rozwija się i funkcjonuje prawie tak samo jak ludzie. Główną różnicą w budowie ludzkiej nerki jest obecność milionów nefronów w porównaniu z danio pręgowanym, który ma tylko dwa. Jednak uproszczenie tak złożonego systemu do podstawowych jednostek funkcjonalnych pomogło nam zrozumieć, jak rozwija się i działa nerka. U danio pręgowanego kłębuszki nerkowy znajdujący się w linii środkowej jest odpowiedzialny za początkową filtrację krwi do dwóch kanalików przednerczowych, które rozchodzą się, biegnąc dwustronnie w dół osi zarodka, zanim zrośnią się ze sobą w kloace. Kanaliki pronefriczne są silnie zaludnione przez ruchliwe rzęski, które ułatwiają ruch filtratu wzdłuż segmentowanego kanalika, umożliwiając wymianę różnych substancji rozpuszczonych przed ostatecznym wyjściem przez kloakę2-4. Wiele genów odpowiedzialnych za PChN, w tym te związane z ciliogenezą, badano u danio pręgowanego5. Jednak główną wadą jest trudność w ocenie funkcji nerek danio pręgowanego po manipulacji genetycznej. Tradycyjne testy do pomiaru dysfunkcji nerek u ludzi okazały się nietranslacyjne dla danio pręgowanego, głównie ze względu na ich środowisko wodne i niewielkie rozmiary. Na przykład fizycznie nie jest możliwe pobranie krwi od ryb w stadium zarodkowym w celu analizy zawartości mocznika i kreatyniny, ponieważ są one zbyt małe. Ponadto danio pręgowany nie wytwarza wystarczającej ilości moczu do badania na prostym wskaźniku białkomoczu, który często wykonuje się podczas wstępnych badań pacjenta. Opisujemy test fluorescencyjny, który wykorzystuje przezroczystość optyczną danio pręgowanego do ilościowego monitorowania klirensu barwnika fluorescencyjnego w czasie z układu krwionośnego i na zewnątrz przez nerki, aby uzyskać odczyt funkcji nerek1,6-9.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ludzka nerka odgrywa kluczową rolę w filtrowaniu odpadów metabolicznych z krwi i odzyskiwaniu wymaganych substancji rozpuszczonych do utrzymania homeostazy komórkowej. Istnieje wiele chorób genetycznych człowieka, które powodują dysfunkcję nerek. Najczęstszą dziedziczną chorobą nerek jest autosomalna dominująca wielotorbielowatość nerek (ADPKD), charakteryzująca się rozwojem wypełnionych płynem worków w kanalikach nerkowych; Uszkodzenia spowodowane cystogenezą są szkodliwe dla funkcji nerek10. ADPKD występuje w stosunku 1:800 - 1:1 000 i stanowi 8 - 10% pacjentów ze schyłkową niewydolnością nerek (ESRF)11. Za ADPKD uważa się kilka genów, w tym policystynę-1 (PKD1) i -2 (PKD2), co stanowi odpowiednio około 85% i 15% przypadków12,13. Ponadto produkty genów PKD1 i -2 lokalizują się w rzęsce i mają fundamentalne znaczenie dla ciliogenezy14,15. Obecnie istnieje uznana rodzina chorób genetycznych u ludzi, znanych jako ciliopaty, które wpływają na funkcję rzęsek i prowadzą do PChN16.

Rosnąca liczba chorób genetycznych człowieka wpływających na rozwój i funkcję rzęsek przyciąga globalne zainteresowanie tą niegdyś uważaną za szczątkową organellę. Rzęska, przypominająca włos wypukłość komórkowa, jest wzbogacona o receptory i kanały jonowe niezbędne do transdukcji kluczowych zdarzeń sygnalizacji komórkowej. Rzęska składa się z aksonemu opartego na mikrotubulach, zwykle zbudowanego z dziewięciu promieniście ułożonych dubletów mikrotubul z centralną parą mikrotubul lub bez niej. Struktura aksonemna określa rodzaj i sposób działania rzęsek. Układ mikrotubul 9+2 nadaje ruchliwość rzęsce, gdzie jest wykorzystywany w ruchu płynów po powierzchniach nabłonka. Konfiguracja 9+0 jest nieruchoma, ale uważa się, że działa głównie w zdarzeniach sygnalizacji komórkowej17. Oprócz PChN, konsekwencjami dysfunkcji rzęsek jest zespół charakterystycznych cech ciliopatii, które obejmują otyłość, zwyrodnienie siatkówki, polidaktylię i upośledzenie funkcji poznawczych16. Przewlekła choroba nerek jest jednak jedną z najbardziej szkodliwych dla jakości życia pacjenta i dlatego jest główną siłą napędową rozwoju odpowiednich modeli in vivo PChN związanych z rzęskami.

Danio pręgowany jest doskonałym modelem do zrozumienia etiologii chorób genetycznych człowieka. Ich szybki rozwój, produkcja dużej liczby jaj, przezroczystości tkanek i wzrost ex utero pozwala na wizualizację procesów rozwojowych danio pręgowanego i manipulowanie zdarzeniami biologicznymi ze znaczną łatwością. Geny mogą być modyfikowane genetycznie za pomocą niedawnych sukcesów narzędzi do edycji genomu (CRISPR18 i TALENS19), niszczone za pomocą technologii antysensownej morfoliny20 lub regulowane farmakologicznie przez dodawanie związków do ich środowiska wodnego. Rzeczywiście, danio pręgowany oferuje platformę do przeprowadzania eksperymentów, które nie są dopuszczalne w innych modelach zwierzęcych. Chociaż danio pręgowany jest stosunkowo prostym kręgowcem (w porównaniu z ludźmi), mają wiele funkcjonalnie zachowanych narządów, genów i procesów sygnalizacyjnych wspólnych z ludźmi. Na przykład nerka danio pręgowanego jest niezwykle podobna pod względem budowy i funkcji w porównaniu z ludźmi21,22. Jednak w przeciwieństwie do nerki ssaków, która rozwija się poprzez szereg faz, z których każda charakteryzuje się bardziej rozwiniętą nerką (pronephros, mesonephros i metanephros), embrionalny danio pręgowany rozwija tylko przednercze, najbardziej niedojrzałą formę nerki. Podczas gdy miliony nefronów można znaleźć jako elementy budulcowe nerki ssaków, zarodek danio pręgowanego posiada tylko dwa. Kłębuszki nerkowe, które pozwalają na początkowy przesącz krwi, są zrośnięte w linii środkowej tuż brzusznie do aorty. Krew filtruje się przez kłębuszki nerkowe do kanalików pronerkowych, które biegną doogonowo wzdłuż osi, łącząc się przed wyjściem przez kloakę. Kanaliki nerczowe są silnie orzęsione ruchliwymi rzęskami, które są przepuszczalne dla przepływu filtratu w kierunku wyjścia ogonowego3,4. Ta prosta struktura pronefryczna utrzymuje homeostazę danio pręgowanego przez kilka tygodni wzrostu larw, gdzie ostatecznie rozwijają się w bardziej złożoną strukturę śródnercza21. Jednak danio pręgowany nigdy nie rozwija metanephros21. Pomimo specyfiki danio pręgowanego, nefron danio pręgowanego jest podzielony na segmenty z profilami ekspresji genów równymi profilom obserwowanym u ssaków, a zatem stanowi niezrównany model nefrostenezy in vivo 3,22.

Rutynowo pacjenci są badani pod kątem czynności nerek za pomocą serii badań krwi i moczu. Zazwyczaj krew jest analizowana pod kątem rozpuszczonych soli, mocznika i kreatyniny. Wysoki poziom mocznika, kreatyniny i nieprawidłowe stężenie soli wskazują na problemy z funkcjonowaniem nerek. Analiza moczu za pomocą paska kolorymetrycznego wykrywa nieprawidłowy poziom białka, krwi, ropy, bakterii i cukru obecnych w próbkach moczu. Takie testy zwykle wymagają około 30 ml moczu lub 5 - 10 ml krwi. Trudno było przełożyć tego typu testy na małe organizmy modelowe in vivo, takie jak danio pręgowany, głównie ze względu na niemożliwy charakter zebrania wystarczającej ilości krwi lub moczu do przeprowadzenia testu. W tym miejscu zajmiemy się brakiem odpowiednich testów funkcji nerek danio pręgowanego i opiszemy innowacyjną technikę jego badania. Wstrzykując barwnik fluorescencyjny do krwiobiegu, jesteśmy w stanie monitorować i indywidualnie określać ilościowo w czasie filtrację i wydalanie aktywności fluorescencyjnej z krwi przez nerki. Metoda ta może być wykorzystana do badania uszkodzeń nerek spowodowanych chorobą, której podajemy przykład.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Oświadczenie etyczne: Utrzymanie zwierząt, hodowla i procedury są zdefiniowane i kontrolowane przez Ustawę o zwierzętach (procedury naukowe) z 1986 roku. Wszystkie eksperymenty na zwierzętach zostały przeprowadzone na podstawie licencji udzielonych przez Ministra Spraw Wewnętrznych (PIL nr 70/7892) zgodnie z Biological Services Management Group i Biological Services Ethical Committee, SGUL, Londyn, Wielka Brytania. Dołożono wszelkich starań, aby zmniejszyć liczbę wykorzystywanych zwierząt i udoskonalić zarówno procedury, jak i hodowlę, aby zminimalizować cierpienie i poprawić dobrostan.

1. Przygotowanie instrumentów, środka znieczulającego i barwnika fluorescencyjnego

  1. Za pomocą ściągacza do mikropipet i standardowych kapilar borokrzemianowych o standardowych ściankach (bez włókien) należy wyciągnąć igły o odpowiedniej długości do mikroiniekcji (ryc. 1A).
  2. Wykonać formę agarozową do orientacji zarodków w celu łatwego wstrzyknięcia do osierdzia (ryc. 1B). Sklej ze sobą około dziesięciu szklanych szkiełek mikroskopowych, aby utworzyć "schody" z offsetowych szkiełek. Aby uzyskać najlepsze rezultaty, użyj kropli szybko wiążącego kleju z żywicy epoksydowej na środku każdego szkiełka.
  3. Wyciąć odcinek o długości około 78 mm w połowie dwóch plastikowych pipet o pojemności 10 ml za pomocą podgrzewanego skalpela z palnikiem Bunsena, w razie potrzeby usunąć końcówki pipet. Przymocuj i przyklej sekcje pipet (z żywicy epoksydowej) do ułożonych w stos szkiełek szkiełkowych, aby zapewnić stabilność i umożliwić zanurzenie formy w szalce Petriego o średnicy 90 mm. Dołożyć wszelkich starań, aby narożniki prowadnicy były wyrównane prostopadle do podłogi szalki Petriego. Poczekaj, aż klej stwardnieje.
  4. Odlewać formę w 2% roztworze agarozy wyprodukowanej w wodzie dla ryb (uzyskanej z akwarium). Wlać agarozę do szalki Petriego o średnicy 90 mm i umieścić formę na otwartej szalce Petriego, tak aby ułożone w stos krawędzie szkiełka zanurzyły się pod kątem pod powierzchnią agarozy. Pozostaw na stole laboratoryjnym na 30 minut.
  5. Zdjąć odlew szkiełka i przykryć agarozę z nadrukiem na szkiełku świeżą wodą rybną zawierającą środek znieczulający Trikaina (patrz krok 1.9) w stosunku 1:25.
  6. Przygotuj roztwory barwnika dekstranu rodaminy (RD). Ponownie zawiesić dekstran znakowany rodaminą B 10 000 MW w autoklawowanej wodzie ultraczystej, aby uzyskać stężenie wyjściowe 50 mg/ml. W przypadku mikroiniekcji należy dodatkowo rozcieńczyć materiał do końcowego stężenia 5 mg/ml w autoklawowanej wodzie ultraczystej.
    UWAGA: Pigmentowane komórki zaczynają różnicować się u danio pręgowanego od 24 godzin po zapłodnieniu (hpf); Mogą one zasłaniać markery fluorescencyjne podczas akwizycji obrazu.
  7. Hamują tworzenie melanocytów za pomocą N-fenylotiomocznika (PTU), który blokuje melanogenezę poprzez hamowanie tyrozynazy. Przygotować 0,003% roztwór podstawowy PTU, rozpuszczając proszek PTU w wodzie akwariowej, podgrzewać roztwór w temperaturze 60 °C do pełnego rozpuszczenia.
  8. Inkubuj zarodki danio pręgowanego w roztworze błękitu metylenowego, łagodnym fungicydzie, aby zapobiec zakwitom grzybów i zwiększyć przeżywalność. Dodać 2 ml roztworu podstawowego błękitu metylenowego, zawierającego 0,1% błękitu metylenowego w ultraczystej wodzie, do 1 l wody akwariowej i użyć jako standardowej pożywki dla zarodków.
  9. Uzupełnić stężenie podstawowe 15 mM soli metanosulfonianu trikainy/3-aminobenzoesanu etylu zgodnie z instrukcją zawartą w "Księdze danio pręgowanego" 23. Znieczulić zarodki, a następnie unieruchomić je w celu wykonania zabiegu mikroiniekcji.
  10. Po znieczuleniu zarodków należy je zorientować do obrazowania, wykorzystując nietoksyczne i lepkie właściwości metylocelulozy. Aby przygotować 200 ml preparatu 3% metylocelulozy, schłodzić 130 ml wody o temperaturze -20 °C przez 30 minut i umieścić na lodzie. Podgrzać 70 ml wody w szklanej zlewce do temperatury 80 °C, dodać 6 g metylocelulozy i mieszać za pomocą szklanej pałeczki aż do zwilżenia i równomiernego rozproszenia. Dodać lodowatą wodę, wymieszać i pozostawić preparat do ostygnięcia w temperaturze 4 °C przez 30 minut, a następnie rozdzielić do probówek o pojemności 50 ml.
    UWAGA: Obniżenie temperatury pozwala na rozpuszczenie metylocelulozy. Roztwór stanie się gęstszy w miarę uwodnienia proszku. 3% metylocelulozy może być przechowywana bez rozwoju bakterii przez krótkie okresy tygodnia w temperaturze 4 °C lub dłużej w temperaturze -20 °C. Przed użyciem należy upewnić się, że metyloceluloza osiągnęła temperaturę realną.
  11. Aby wykonać wstrzyknięcia barwnika fluorescencyjnego do danio pręgowanego, należy użyć standardowego zestawu do mikroiniekcji (ryc. 1C). Składa się on ze sprężarki powietrza podłączonej do systemu regulatora ciśnienia, który zasila prosty uchwyt na pipety do użytku z kapilarnami o średnicy zewnętrznej 1,0. Uchwyt na pipety powinien być umieszczony w kompaktowym 3-osiowym mikromanipulatorze MM33 przymocowanym do stalowej płyty podstawy za pomocą stojaka magnetycznego. Zarodki mogą być wizualizowane, manipulowane i wstrzykiwane za pomocą stereoskopowego mikroskopu preparacyjnego.

2. Hodowla danio pręgowanego i leczenie przed iniekcją

  1. Utrzymuj danio pręgowanego zgodnie z wcześniejszym opisem23. Użyj zestawu akwariowego, który zapewnia recyrkulację wody o stałej temperaturze 28,5 °C, kondycjonowanej do pH 6,8 - 7,2 i przewodności 450-550 μS odpowiednio z wodorowęglanem sodu i natychmiastową solą morską oceaniczną. Używaj linek do danio pręgowanego typu dzikiego lub transgenicznego, stosownie do doświadczenia, utrzymując gęstość obsady od 15 samców do 15 samic na zbiornik o pojemności 8 litrów. Ustaw fotocykl w obiekcie rybackim na 14 godzin światła dziennego w godzinach od 9 do 23
    2. .
  2. Tarło danio pręgowanego rozpoczyna się na początku fotocyklu, kiedy rano włączają się światła. Aby zapewnić zebranie maksymalnej ilości ikry bez przeszkadzania rybom, wieczorem przed zbiorem zanurz zbiorniki hodowlane (zawierające wkładki siatkowe, dostępne u specjalistów od danio pręgowanego) w zbiornikach hodowlanych typu dzikiego.
  3. W dniu zbioru odczekaj 30 - 40 minut na tarło ryb, po czym zbierz i opłucz jaja za pomocą sitka do herbaty i świeżej wody akwariowej. Oczyszczone jaja umieścić na szalce Petriego o średnicy 90 mm zawierającej pożywkę dla zarodków i inkubować w temperaturze 28,5 °C.
  4. Traktuj zarodki PTU w celu zahamowania melanogenezy. Przy 8 hpf przenieść zdolne do życia zarodki w minimalnej ilości płynu na świeże szalki Petriego zawierające 1:100 PTU do pożywki dla zarodków i dalej inkubować w temperaturze 28,5 °C do temperatury 72 hpf.
    UWAGA: PTU może powodować wady rozwojowe, jeśli jest stosowany we wcześniejszych stadiach, więc powinien być ograniczony do etapów po 8 hpf, ale może być leczony dopiero po 24 hpf. Późne dodanie PTU nie blokuje w pełni pigmentacji oka, ale jest ogólnie skuteczne i hamuje tworzenie się melanocytów tułowia.

3. Mikroiniekcja

UWAGA: Osierdzie otacza serce, ale jest oddzielone dla ochrony i łatwości ruchu serca przez płyn w jamie osierdziowej. Celem tego zabiegu jest wstrzyknięcie RD do jamy osierdziowej, co pozwala na szybki wychwyt barwnika do układu naczyniowego.

  1. Załadować igły rozcieńczonym 6 μl RD za pomocą końcówek do mikroładowarki i przymocować do uchwytu igły mikromanipulatora. Złam koniec igły za pomocą kleszczyków z cienką końcówką (Rysunek 1A). Przenieś roztwór RD na końcówkę igły, maksymalizując czas trwania impulsu do ustawienia minut, a po zakończeniu przełącz z powrotem na ms.
  2. Użyj mikrometru stopniowego, regulatora ciśnienia i udoskonaleń długości końcówki igły (za pomocą kleszczy), aby dostosować rozmiar wydmuchiwanej kropli do 100 μm średnicy, co odpowiada objętości 0,5 nl (rysunek 2A).
    UWAGA: Podczas łamania igły należy uważać, aby nie odłamać jej zbyt mocno, w przeciwnym razie utrudni to kalibrację objętości wstrzyknięcia. W razie potrzeby należy dodatkowo złamać końcówkę igły, aby zwiększyć rozmiar kropli, jednak należy zachować grubość igły, która umożliwia wejście do osierdzia bez nadmiernego zginania lub uszkodzenia tkanki.
  3. Przed wstrzyknięciem należy znieczulić zarodki w pożywce zarodkowej zawierającej trikainę. Ustawić 2 szalki Petriego o średnicy 35 mm zawierające 5 ml pożywki dla zarodków, oznaczyć jedną z nich jako "Trikaina", a drugą jako "Odzyskiwanie".
  4. Do odpowiednio oznakowanego naczynia dodać 200 μl bulionu Tricaine. Gdy będzie gotowy do wstrzyknięcia, wybierz pojedynczy zarodek w temperaturze 72 hpf i przenieś w minimalnej ilości płynu do szalki Tricaine. Monitoruj aktywność zarodka, przetestuj, czy zarodek jest znieczulony i unieruchomiony przez delikatne mieszanie za pomocą ściętej końcówki mikroładowacza.
  5. Przenieś znieczulony zarodek do formy iniekcyjnej i ustaw zarodek w korycie z agarozą tak, aby lewa strona była skierowana do góry, ustawiając serce po lewej stronie pola widzenia.
  6. Aby wstrzyknąć RD do serca, przekłuć osierdzie igłą i wstrzyknąć 1 nl RD do jamy osierdziowej znieczulonego zarodka (ryc. 2B, prawy panel). Po wstrzyknięciu należy wyjąć igłę. Przenieść wstrzyknięty zarodek w minimalnej ilości płynu do "naczynia regeneracyjnego" i monitorować przez 1 minutę. Przenieść pojedynczy zarodek na 24-dołkową płytkę zawierającą 1 ml świeżej pożywki dla zarodków (zawierającej PTU) i odpowiednio oznaczyć.
    UWAGA: Osierdzie jest twarde, jednak na przecięciu znajduje się zauważalny słaby punkt, w którym osierdzie styka się z brzuszno-ogonowymi łukami gardła i grzbietowo-rostralnym woreczkiem żółtkowym (ryc. 2B). Igła powinna być skierowana do tego rowka. Gdy igła jest na swoim miejscu, mocne stuknięcie palcem w mikromanipulator ułatwi wejście do jamy osierdziowej.
  7. Powtórzyć kroki 3.2 - 3.6 dla co najmniej 10 zarodków na grupę doświadczalną, umieścić każdą rybę w oddzielnym dołku i niepowtarzalnie oznaczyć, aby umożliwić indywidualne obserwacje doświadczalne. Inkubować w temperaturze 28,5 °C przez 3 godziny.

4. Akwizycja obrazowania

  1. Po 3 godzinach od wstrzyknięcia (hpi) znieczulić zarodki zgodnie z wcześniejszym opisem i przenieść na szalkę Petriego o średnicy 35 mm zawierającą 3% metylocelulozy. Delikatnie wepchnij zarodki do metylocelulozy i ustaw tak, aby można było zobrazować boczną stronę.
  2. Uzyskaj obraz zarodka w promieniowaniu UV, używając filtra do wizualizacji emitowanego światła o długości fali 570 nm (ryc. 2C). Po uzyskaniu obrazu pozwól zarodkowi zregenerować się przed umieszczeniem go w wyznaczonym dołku. Pobrać obrazy wszystkich wstrzykniętych zarodków i kontynuować inkubację w temperaturze 28,5 °C.
    UWAGA: W tym protokole użyliśmy stereoskopu fluorescencyjnego z zestawem filtrów TXR, kamerą DFC300FX i odpowiednim oprogramowaniem użytkowym. Zanotuj dokładne ustawienia akwizycji dla późniejszej akwizycji obrazu.
  3. Przy 24 hpi uzyskaj drugą rundę obrazów, jak opisano powyżej. Po uzyskaniu wszystkich obrazów, zarówno przy 3 hpi, jak i 24 hpi, humanitarnie pozbyć się zarodków lub wykorzystać je do innych środków eksperymentalnych, np. immunohistochemii.

5. Przetwarzanie obrazu

  1. Określ ilościowo intensywność fluorescencji każdego wstrzykniętego zarodka, przy 3 hpi i 24 hpi, analizując obrazy za pomocą oprogramowania ImageJ NIH. Aby zmierzyć intensywność fluorescencji, otwórz obraz w ImageJ i określ obszar zainteresowania (roi) na 100 px2 (Edytuj → zaznaczenie, → określić).
  2. Umieść serce w środku roi (Rysunek 2C), ustaw pomiary tak, aby obejmowały średnią skalę szarości i obszar (Analizuj → ustaw pomiary), wykonaj pomiar (Analizuj → zmierz). Wypełnij dla każdego zestawu obrazów, przy 3 hpi i 24 hpi, na zarodek i przenieś średnie wartości skali szarości do arkusza kalkulacyjnego w celu dalszego przetwarzania.
    UWAGA: Wybraliśmy stały rozmiar roi 100 px2, ponieważ obejmuje on poszczególne serca między zarodkami. Serce zostało wybrane do wykonywania pomiarów ze względu na jego duży rozmiar, który umożliwia dogodne miejsce do pomiaru zawartości fluorescencji krwi przed wejściem do nerki.
  3. Przeprowadzanie analiz statystycznych przy użyciu odpowiedniego oprogramowania statystycznego. Porównywanie grup pod kątem istotności statystycznej za pomocą testu t studenta.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zespół Bardeta-Biedla (BBS) to rzadka heterogeniczna ciliopatia, która dotyka około 1:160 000 osób na całym świecie16. Pacjenci zgłaszają się z szeregiem powiązanych problemów, w tym z wielotorbielowatością nerek, w związku z czym pacjenci często wymagają dializy lub przeszczepu nerki24. ESRF jest najczęstszą przyczyną zgonów w BBS, a u około 30% pacjentów rozwija się PChN16. Obecnie 20 niepowiązanych genów jest zaangażowanych w BBS bez opublikowanego związku genotyp z fenotypem. Białka B...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Danio pręgowany stanowi cenne narzędzie do modelowania chorób genetycznych człowieka, a ich wykorzystanie jako instrumentu naukowego do badań in vivo umożliwiło szczegółowe badania genetycznego rozkładu wielu układów biologicznych, w tym nerek. Obecnie wiele wiadomo o tym, jak rozwija się i funkcjonuje nerka danio pręgowanego. Uderzające podobieństwa do ludzkiej nefrostenezy i homologii z genami powodującymi chorobę21 zilustrowały, w jaki sposób danio pręgowany stał się fundamentalny w zrozumieniu, w ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pomoc techniczna świadczona przez Jaipreet Bharj. Prace te były wspierane przez granty z 7PR UE (SYSCILIA -241955) oraz Holenderskiej Fundacji Nerek (CP11.18).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
P-97 SUTTER Ściągacz do mikropipet typu płomieniowego/brązowegoIntracelP-97
kapilary borokrzemianowe o standardowych ściankachAparat Harvarda30-0017
Szkiełka mikroskopoweVWR International631-0109
Klej do żywicy epoksydowejEvo-Stik
Rodamina B 10 000 MW z oznaczeniem DextranLife technologies D-1824
N-fenylotiomocznik Sigma-Aldrich P7629
Blues metylenowy Sigma-AldrichM9140
Sól metanosulfonianu etylu 3-aminobenzoesanuSigma-AldrichA5040
metylocelulozaSprężarka powietrza Sigma-AldrichM0512
 Jun-AirOF302-15
Picospritzer III Instrumenty Parker 051-0500-900
Kompaktowy 3-osiowy mikromanipulator sterujący MarzhauserMM33 
Mikroskop preparacyjny stereoskopowyNikonSMZ1000
końcówki do mikroładowarekEppendorf5242956003
Dumont #5 kleszcze Mikrometr stopniowy Sigma-AldrichF6521
 Pyser- SGI02A00404
standardowe

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hentschel, D. M., et al. Acute renal failure in zebrafish: a novel system to study a complex disease. Am J Physiol Renal Physiol. 288 (5), 923-929 (2005).
  2. Drummond, I. Making a zebrafish kidney: a tale of two tubes. Trends Cell Biol. 13 (7), 357-365 (2003).
  3. Ma, M., Jiang, Y. J. Jagged2a-notch signaling mediates cell fate choice in the zebrafish pronephric duct. PLoS Genet. 3 (1), e18(2007).
  4. Liu, Y., Pathak, N., Kramer-Zucker, A., Drummond, I. A. Notch signaling controls the differentiation of transporting epithelia and multiciliated cells in the zebrafish pronephros. Development. 134 (6), 1111-1122 (2007).
  5. Drummond, I. A. Kidney development and disease in the zebrafish. J Am Soc Nephrol. 16 (2), 299-304 (2005).
  6. Cardenas-Rodriguez, M., et al. Characterization of CCDC28B reveals its role in ciliogenesis and provides insight to understand its modifier effect on Bardet-Biedl syndrome. Hum Genet. 132 (1), 91-105 (2013).
  7. Osborn, D. P., et al. Loss of FTO antagonises Wnt signaling and leads to developmental defects associated with ciliopathies. PLoS One. 9 (2), e87662(2014).
  8. Pearson, C. G., Osborn, D. P., Giddings, T. H., Beales, P. L., Winey, M. Basal body stability and ciliogenesis requires the conserved component Poc1. J Cell Biol. 187 (6), 905-920 (2009).
  9. Tobin, J. L., Beales, P. L. Restoration of renal function in zebrafish models of ciliopathies. Pediatr Nephrol. 23 (11), 2095-2099 (2008).
  10. Torres, V. E., Harris, P. C. Autosomal dominant polycystic kidney disease: the last 3 years. Kidney Int. 76 (2), 149-168 (2009).
  11. Bogdanova, N., Markoff, A., Horst, J. Autosomal dominant polycystic kidney disease - clinical and genetic aspects. Kidney Blood Press Res. 25 (5), 265-283 (2002).
  12. Harris, P. C., Ward, C. J., Peral, B., Hughes, J. Polycystic kidney disease. 1: Identification and analysis of the primary defect. J Am Soc Nephrol. 6 (4), 1125-1133 (1995).
  13. Reynolds, D. M., et al. Aberrant splicing in the PKD2 gene as a cause of polycystic kidney disease. J Am Soc Nephrol. 10 (11), 2342-2351 (1999).
  14. Pazour, G. J., San Agustin, ajt, Follit, J. A., Rosenbaum, J. L., Witman, G. B. Polycystin-2 localizes to kidney cilia and the ciliary level is elevated in orpk mice with polycystic kidney disease. Curr Biol. 12 (11), R378-R380 (2002).
  15. Yoder, B. K., Hou, X., Guay-Woodford, L. M. The polycystic kidney disease proteins, polycystin-1, polycystin-2, polaris, and cystin, are co-localized in renal cilia. J Am Soc Nephrol. 13 (10), 2508-2516 (2002).
  16. Baker, K., Beales, P. L. Making sense of cilia in disease: the human ciliopathies. Am J Med Genet C Semin Med Genet. 151C (4), 281-295 (2009).
  17. Veland, I. R., Awan, A., Pedersen, L. B., Yoder, B. K., Christensen, S. T. Primary cilia and signaling pathways in mammalian development, health and disease. Nephron Physiol. 111 (3), 39-53 (2009).
  18. Hruscha, A., et al. Efficient CRISPR/Cas9 genome editing with low off-target effects in zebrafish. Development. 140 (24), 4982-4987 (2013).
  19. Bedell, V. M., et al. In vivo genome editing using a high-efficiency TALEN system. Nature. 491 (7422), 114-118 (2012).
  20. Eisen, J. S., Smith, J. C. Controlling morpholino experiments: don't stop making antisense. Development. 135 (10), 1735-1743 (2008).
  21. Gerlach, G. F., Wingert, R. A. Kidney organogenesis in the zebrafish: insights into vertebrate nephrogenesis and regeneration. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 2 (5), 559-585 (2013).
  22. Wingert, R. A., et al. The cdx genes and retinoic acid control the positioning and segmentation of the zebrafish pronephros. PLoS Genet. 3 (10), 1922-1938 (2007).
  23. Westerfield, M. The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio Rerio). , 4th, Univ. of Oregon Press. Eugene. (2000).
  24. Forsythe, E., Beales, P. L. Bardet-Biedl syndrome). Eur J Hum Genet. 21 (1), 8-13 (2013).
  25. Corbetta, S., et al. High prevalence of simple kidney cysts in patients with primary hyperparathyroidism. J Endocrinol Invest. 32 (8), 690-694 (2009).
  26. Veleri, S., et al. Knockdown of Bardet-Biedl syndrome gene BBS9/PTHB1 leads to cilia defects. PLoS One. 7 (3), e34389(2012).
  27. Vize, P., Woolf, A. S., Bard, J. The Kidney: From Normal Development to Congenital Disease. , Academic Press. (2003).
  28. Chang, R. L., et al. Permselectivity of the glomerular capillary wall to macromolecules. II. Experimental studies in rats using neutral dextran. Biophys J. 15 (9), 887-906 (1975).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Iniekcja do jamy osierdziowejmikroskopia epifluorescencyjnausuwanie barwnika fluorescencyjnegoznieczulenie zarodk w danio pr gowanegokwantyfikacja w programie ImageJanaliza kanalik w pronefrycznychpomiar intensywno ci fluorescencjianaliza testem t Studenta

Powiązane artykuły