Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Immunohistochemia i wielokrotne znakowanie przeciwciałami od tego samego gatunku gospodarza w celu zbadania neurogenezy hipokampa u dorosłych

26.4K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/52551

⸱

22 kwietnia 2015

 ,  ,  , 
1Hans Berger Department of Neurology, Jena University Hospital

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Ten artykuł wideo ilustruje kompleksowy protokół do wykrywania i ilościowego określania wszystkich etapów neurogenezy dorosłego hipokampa w obrębie tego samego odcinka tkanki. Opracowaliśmy metodę przezwyciężania ograniczeń pośredniej immunofluorescencji mnogiej, które powstają, gdy odpowiednie przeciwciała od różnych gatunków gospodarzy są niedostępne.

Streszczenie

Neurogeneza dorosłych to wysoce regulowany, wieloetapowy proces, w którym nowe neurony są generowane z aktywowanej nerwowej komórki macierzystej poprzez coraz bardziej zaangażowane pośrednie podtypy progenitorowe. Każdy z tych podtypów wyraża zestaw specyficznych markerów molekularnych, które wraz z określonymi kryteriami morfologicznymi można wykorzystać do ich identyfikacji. Zazwyczaj stosuje się techniki immunofluorescencyjne obejmujące przeciwciała specyficzne dla podtypu w połączeniu z egzo- lub endogennymi markerami proliferacji. Opisujemy tutaj metody znakowania immunologicznego do wykrywania i kwantyfikacji wszystkich etapów neurogenezy hipokampa u dorosłych. Obejmują one zastosowanie analogów tymidyny, perfuzję przezsercową, przetwarzanie tkanek, odzyskiwanie epitopów pod wpływem ciepła, immunohistochemię ABC, wielokrotną immunofluorescencję pośrednią, mikroskopię konfokalną i kwantyfikację komórek. Ponadto przedstawiamy sekwencyjny protokół immunofluorescencji mnogiej, który pozwala uniknąć problemów wynikających zwykle z konieczności stosowania przeciwciał pierwotnych wyhodowanych u tego samego gatunku gospodarza. Pozwala na dokładną identyfikację wszystkich podtypów progenitorów hipokampa wraz z markerem proliferacji w obrębie jednej sekcji. Techniki te są potężnym narzędziem do badania równoległej regulacji różnych podtypów progenitorów, ich udziału w patologiach mózgu i ich roli w określonych funkcjach mózgu.

Wprowadzenie

Dwa regiony mózgu konstytutywnie generują nowe neurony przez całe życie, strefa podkomorowa komór bocznych i strefa subziarnista (SGZ) zakrętu zębatego hipokampa (DG). Nowo narodzone neurony wywodzą się z nerwowych komórek progenitorowych i przechodzą przez różne etapy rozwoju morfologicznego i fizjologicznego, zanim osiągną dojrzałość1,2. Z wolno dzielącej się promienistej komórki macierzystej podobnej do gleju (typ 1) powstają kolejne etapy tranzytu, wzmacniające pośrednie komórki progenitorowe. Bardziej niezróżnicowane podtypy (typ 2a i typ 2b) mają nieregularny kształt z krótkimi, stycznymi wyrostkami. Generują neuroblasty (typ 3), które stopniowo opuszczają cykl komórkowy, aby stać się niedojrzałymi neuronami (z dendrytami rozciągniętymi w kierunku warstwy molekularnej) i ostatecznie integrują się z siecią hipokampa jako dojrzałe komórki ziarniste. Ze względu na swoje szczególne cechy fizjologiczne, komórki te zapewniają obwodom zwiększoną plastyczność3, co sugeruje wyjątkową rolę w funkcjonowaniu hipokampa. W rzeczywistości badania z ostatniej dekady dostarczyły istotnych dowodów na to, że neurogeneza dorosłych przyczynia się do pamięci przestrzennej, separacji wzorców i zachowań emocjonalnych.

Neurogeneza dorosłych może być badana przy użyciu różnych metod. Analogi tymidyny włączają się do DNA podczas fazy S cyklu komórkowego i umożliwiają datowanie urodzenia, kwantyfikację i analizę losu nowo narodzonych komórek6-8. Sekwencyjne stosowanie różnych analogów tymidyny (np. CldU, EdU lub IdU) można wykorzystać do badania obrotu komórkowego lub populacji komórek urodzonych w różnych punktach czasowych w trakcie eksperymentu9. Alternatywnym, endogennym markerem proliferacji komórek jest Ki67. Ulega ekspresji w dzielących się komórkach podczas wszystkich faz cyklu komórkowego (G1, S, G2, M) z wyjątkiem fazy spoczynku (G0) i początku G1 10,11. Do analizy fenotypu populacji komórek noworodka w dorosłym zakręcie zębatym można użyć kilku markerów molekularnych specyficznych dla danego etapu, takich jak GFAP, nestyna, DCX i NeuN1,6. GFAP jest markerem dojrzałych astrocytów, ale ulega również ekspresji w promienistych komórkach glejowych w dorosłym przodomózgowiu. Nestyna jest włóknem pośrednim specyficznym dla promienistych komórek glejowych i wczesnych pośrednich komórek progenitorowych. DCX jest białkiem związanym z mikrotubulami, ulegającym ekspresji w pośrednich przodkach, neuroblastach i niedojrzałych neuronach. Na podstawie (ko)ekspresji tych trzech markerów i cech morfologicznych znakowanych komórek można zidentyfikować cztery odrębne podtypy komórek progenitorowych: typ 1 (GFAP+, nestin+, DCX-), typ 2a (GFAP-, nestin+, DCX-), typ 2b (GFAP-, nestin+, DCX+) i typ 3 (GFAP-,nestin-, DCX+)1. Znakowanie DCX razem z NeuN, który ulega ekspresji w neuronach postmitotycznych, umożliwia różnicowanie niedojrzałych (DCX+, NeuN+) i dojrzałych (DCX-, NeuN+) neuronów ziarnistych.

Wyżej wymienione markery są często używane do immunofluorescencyjnego znakowania i późniejszej mikroskopii konfokalnej do analizy liczby i tożsamości nowo narodzonych komórek. Zazwyczaj wymaga to przeciwciał od różnych gatunków gospodarzy, aby zapobiec niepożądanej reaktywności krzyżowej przeciwciał. Jednak większość pierwotnych przeciwciał nadających się do badań neurogenezy jest hodowana u królików lub myszy (np. mysz α-BrdU, mysz α-NeuN, królik α-Ki67, królik α-GFAP). Prowadzi to do poważnych ograniczeń w liczbie i kombinacji antygenów, które można ocenić w jednym wycinku. To z kolei nie tylko zwiększa wysiłek związany z barwieniem, ponieważ konieczne jest wykonanie wielu barwień, ale może również zagrozić wiarygodności wyników. Ponadto niektóre antygeny są podatne na maskowanie epitopów wywołane wiązaniem formaliny (np. Ki67, nestyna). Opisujemy tutaj modyfikacje klasycznych protokołów pojedynczego i wielokrotnego znakowania immunologicznego (np. Pobieranie epitopów, wielokrotne sekwencyjne barwienie immunologiczne, użycie myszy transgenicznych nestin-GFP12), które przezwyciężają wiele z tych problemów. W szczególności sekwencyjny protokół wielokrotnej immunofluorescencji umożliwia barwienie przeciwko maksymalnie czterem różnym antygenom, nawet jeśli część przeciwciał pochodzi od tego samego gospodarza. Umożliwia to jednoczesne wykrywanie komórek progenitorowych typu 1, typu 2a, typu 2b i typu 3, a także ich aktywności proliferacyjnej w obrębie jednego przekroju.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

UWAGA: Wszystkie procedury z udziałem żywych zwierząt zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi dyrektywy WE 86/609/EEC dotyczącej opieki i wykorzystania zwierząt laboratoryjnych oraz zostały zatwierdzone przez lokalny komitet etyczny (Thüringer Landesamt für Lebensmittelsicherheit und Verbraucherschutz).

1. Dostrzykławe wstrzykiwanie analogów tymydyny

  1. Zważ zwierzęta w dniu poprzedzającym iniekcję. Oblicz ilość analogu tymidyny wymaganą do wszystkich iniekcji zaplanowanych na następny dzień, a także indywidualne, dostosowane do masy ciała objętości iniekcji z roztworu zapasowego o stężeniu 10 mg/ml.
  2. Przygotuj roztwór zapasowy tymidyny o stężeniu 10 mg/ml. (UWAGA! Analogi tymidyny są toksyczne. Należy przestrzegać szczegółowych kart charakterystyki materiałów (MSDS) dostarczonych przez dostawców, tj., nosić fartuch laboratoryjny i rękawiczki oraz pracować w dygestorium).
    1. Wyjmij analog tymidyny z zamrażarki i doprowadź go do temperatury pokojowej (RT), ok. 21 °C. Odważ 10 mg i dodaj jałową sól fizjologiczną (dla BrdU i CldU) lub 0,04 N NaOH (w jałowej soli fizjologicznej; dla IdU), a następnie wymieszaj w wortexie. Umieść próbkę na co najmniej 10 - 15 min w kąpieli wodnej o temperaturze 50 °C i mieszaj w wortexie co 2 - 3 min, aż proszek się rozpuści.
      UWAGA: Roztworów można używać do 24 h przy przechowywaniu w RT oraz przez kilka tygodni w temperaturze -20 °C. Należy chronić roztwory przed światłem (przykryć folią aluminiową). Zawsze sprawdzać obecność osadów i w razie potrzeby rozpuścić je ponownie.
  3. Utrzymaj mysz za kark i wstrzyknij dopaszytelną do masy ciała objętość roztworu zapasowego (w RT) drogą dosytrytonalną, używając precyzyjnej strzykawki dozującej z igłą 30 G.
    UWAGA: W przypadku konieczności sekwencyjnego podania CldU i IdU temu samemu zwierzęciu, należy rozważyć wstrzyknięcie stężeń ekwimolarnych (np., 42,5 mg/kg CldU i 57,5 mg/kg IdU, co odpowiada 50 mg/kg BrdU). W związku z tym należy odpowiednio dostosować objętości iniekcji roztworów zapasowych o stężeniu 10 mg/ml.

2. Przygotowanie tkanki

  1. W dniu poprzedzającym perfuzję przygotować 4% formaldehyd w 0,1 M buforze fosforanowym o pH 7,4. Przechowywać w temperaturze 4 °C.
  2. Głęboko znieczulone myszy (3,5% izofluranu) poddać perfuzji transkardialnej przez lewą komorę serca, stosując 10 ml lodowatego PBS, a następnie 40 ml lodowatego formaldehydu (przepływ 5 ml/min). Wypreparować mózg i poddać postfiksacji w tym samym utrwalaczu przez 24 h w temperaturze 4°C.
  3. Mózgi przenosić sukcesywnie do 10% sacharozy (24 h w 4°C), a następnie do 30% sacharozy (aż do momentu opadnięcia mózgu na dno, ok. 48 h). W celu zamrożenia kryoprotektowane mózgi powoli zanurzyć w izopentanie o temperaturze -25 °C, aż do czasu, gdy z tkanki przestaną wydostawać się pęcherzyki powietrza. Przechowywać w temperaturze -80 °C.
  4. Wyciąć przekroje koronalne o grubości 40 µm przy użyciu mikrotomu kriostatycznego (temperatura bloku od -25 do -16 °C). Przenosić sekcje sekwencyjnie do roztworu przeciwzamrożeniowego w dołkach 24-dołkowej płytki hodowlanej (patrz Rysunek 1). Przechowywać w temperaturze -20 °C.

Układ płytki 96-dołkowej, schemat przeniesienia cieczy w eksperymencie laboratoryjnym, diagram ilustrujący metodę.
Rycina 1. Schematyczne przedstawienie przenoszenia skrawków z mikrotomu do płytki 24-dołkowej. Zacznij od pola A1 i umieszczaj kolejne skrawki w rzędzie A; po A6 przejdź do następnego rzędu B i tak dalej. Po dotarciu do D6 wróć do A1 i kontynuuj. Taki układ skrawków umożliwia kwantyfikację każdego ntego przekroju całego mózgu. W celu kwantyfikacji nowo powstałych komórek należy pobrać co 6ty przekrój mózgu (odpowiednik zawartości jednej kolumny), a dla fenotypowania immunofluorescencyjnego co 12ty przekrój (odpowiednik zawartości 2 naprzemiennych rzędów jednej kolumny).

3. Immunobarwienie

UWAGA: Przekroje są przetwarzane w formie swobodnie pływającej, zazwyczaj w płytkach 6-dołkowych wyposażonych w płytkę nośną i wkładki siatkowe. Wyjątek stanowią blokowanie, inkubacje z przeciwciałami oraz reakcja ABC, które są przeprowadzane w płytkach 12- lub 24-dołkowych bez wkładek siatkowych (wystarczy od 0,5 do 1 ml na dołek, w zależności od liczby przekrojów do zabarwienia). Podczas tych etapów należy przenosić przekroje za pomocą cienkiego pędzla (płucząc go przy każdym nowym roztworze). Wszystkie inkubacje przeprowadzane są przy ciągłym mieszaniu (maks. 150 rpm).

  1. Immunohistochemia (metoda ABC)
    1. Przenieść skrawki z płynu przeciwzamrażającego do TBS i dokładnie wypłukać (raz przez noc w 4 °C, 5 razy w temperaturze pokojowej przez 10 min każdy), aby całkowicie usunąć płyn przeciwzamrażający.
    2. Inkubować przez 30 min w 1,5% H2O2 w TBS-T, aby zneutralizować endogenną aktywność peroksydazy. Zwrócić uwagę na powstawanie pęcherzyków i w razie potrzeby ponownie zanurzyć skrawki. Płukać 3 razy w TBS przez 15 min każdy.
    3. Opcjonalnie: W tym czasie wstępnie podgrzać inkubator i 2 N HCl do 37 °C. Inkubować skrawki przez 30 min w 37 °C w 2 N HCl w celu denaturacji DNA. Delikatnie oddzielić skrawki za pomocą pędzla.
    4. Opcjonalnie: Neutralizować skrawki przez 10 min w 0,1 M buforze boranowym pH 8,5 w temperaturze pokojowej. Podczas przenoszenia krótko osuszyć wkładki siatkowe zawierające skrawki ręcznikiem papierowym, aby usunąć pozostałości HCl. Płukać 2 razy w TBS przez 15 min każdy.
    5. Inkubować w TBSplus w celu permeabilizacji tkanki i blokowania nieswoistych miejsc wiązania przeciwciał przez 1 h w temperaturze pokojowej.
    6. Inkubować w przeciwciałach pierwszorzędowych rozcieńczonych w TBSplus przez noc w 4 °C. Płukać 3 razy w TBS przez 15 min każdy.
    7. Inkubować w biotynylowanych przeciwciałach wtórnych rozcieńczonych w TBSplus przez 3 h w temperaturze pokojowej. Płukać 3 razy w TBS przez 15 min każdy. W międzyczasie...
    8. Przygotować kompleks ABC zgodnie z protokołem producenta (1% A + 1% B w TBS-T). Odstawić na 30 min w temperaturze pokojowej przed użyciem. Inkubować skrawki w odczynniku AB przez 1 h w temperaturze pokojowej. Płukać 3 razy w TBS przez 15 min każdy.
    9. Przygotować 50 ml 0,5 mg/ml DAB w TBS-T na płytkę 6- lub 12-dołkową, podzielić na dwie połowy i pipetować odpowiednio 4 ml lub 2 ml na dołek. Przenieść skrawki do roztworu DAB (UWAGA! DAB jest toksyczny. Należy przestrzegać specyficznych wytycznych MSDS dostarczonych przez dostawcę, np. nosić fartuch laboratoryjny i rękawiczki, pracować pod wyciągiem chemicznym).
    10. Dodać 0,5 ml 1% H2O2 do pozostałych 25 ml roztworu DAB, wymieszać i pipetować do każdego dołka objętości odpowiadające tym podanym wyżej, aby rozpocząć reakcję peroksydazy. Inkubować przez 12 min. Płukać 3 razy w TBS przez 15 min każdy.
    11. Zamontować skrawki na szkiełkach w żelatynie, wysuszyć na powietrzu przez noc. Przykryć szkiełkiem przy użyciu trwałego medium montażowego.
    12. Opcjonalnie: Wykonać przeciwbarwienie przed nałożeniem szkiełka (patrz sekcja 3.5).
      UWAGA: Jeśli stosunek sygnału do szumu jest niski z powodu wysokiego tła, powtórzyć zabieg z H2O2 po inkubacji z odczynnikiem AB (krok 3.1.8).
  2. Wielokrotna immunofluorescencja
    1. Pojedyncza lub jednoczesna wielokrotna immunofluorescencja
      1. Przenieść skrawki z płynu przeciwzamrażającego do TBS i dokładnie wypłukać (raz przez noc w 4 °C, 5 razy w temperaturze pokojowej przez 10 min każdy), aby całkowicie usunąć płyn przeciwzamrażający.
      2. Opcjonalnie: zgodnie z krokami 3.1.3 - 3.1.4.
      3. Inkubować w TBSplus w celu permeabilizacji tkanki i blokowania nieswoistych miejsc wiązania przeciwciał przez 1 h w temperaturze pokojowej.
      4. Inkubować w koktajlu przeciwciał pierwszorzędowych (np. szczur α-BrdU, świnia morska α-DCX, koza α-GFP) rozcieńczonych w TBSplus przez noc w 4 °C. Płukać 3 razy w TBS przez 15 min każdy.
      5. Inkubować w koktajlu przeciwciał wtórnych koniugowanych z fluorochromem (np. Rhodamine Red α-szczur, Alexa-647 α-świnia morska, Alexa-488 α-koza; wszystkie pochodzące od osła) rozcieńczonych w TBSplus przez 3 h w temperaturze pokojowej lub przez noc w 4 °C. Od tego momentu chronić skrawki przed światłem. Płukać 3 razy w TBS przez 15 min każdy.
      6. Zamontować skrawki na szkiełkach w żelatynie, wysuszyć na powietrzu przez noc. Przykryć szkiełkiem przy użyciu wodnego medium montażowego.
    2. Sekwencyjna wielokrotna immunofluorescencja z przeciwciałami pierwszorzędowymi od tego samego gatunku gospodarza
      1. Zgodnie z krokami 3.2.1.1 - 3.2.1.3.
      2. Inkubować w pierwszym przeciwciale pierwszorzędowym (np. królik α-antygen A) przez noc w 4 °C. Płukać 3 razy w TBS i raz w TBS-T przez 10 min każdy.
      3. Inkubować w pierwszym przeciwciale wtórnym koniugowanym z fluorochromem (np. osioł α-królik koniugowany z Rhodamine Red) przez 3 h w temperaturze pokojowej. Od tego momentu chronić skrawki przed światłem. Płukać 3 razy w TBS i raz w TBS-T przez 10 min każdy.
      4. Inkubować w 10% normalnym surowicy od tego samego gospodarza, co przeciwciała pierwszorzędowe (np. surowica królika) przez 3 h w temperaturze pokojowej, aby nasycić wolne paratopy pierwszego przeciwciała wtórnego. Płukać 3 razy w TBS i raz w TBS-T przez 10 min każdy.
      5. Inkubować w TBSplus z 50 µg/ml niekoniugowanych monowalentnych fragmentów Fab skierowanych przeciwko gospodarzowi przeciwciał pierwszorzędowych (np. α-królicze IgG (H+L)) w celu zablokowania epitopów, które mogłyby zostać rozpoznane przez drugie przeciwciało wtórne, przez noc w 4 °C.
      6. Płukać co najmniej 3 razy w TBS i raz w TBS-T przez 10 min każdy. Podczas przenoszenia krótko osuszyć wkładki siatkowe zawierające skrawki ręcznikiem papierowym, aby usunąć wszelkie pozostałości fragmentów Fab.
      7. Inkubować w drugim przeciwciale pierwszorzędowym (np. królik α-antygen B) przez noc w 4 °C. Płukać 3 razy w TBS i raz w TBS-T przez 10 min każdy.
      8. Inkubować w drugim przeciwciale wtórnym koniugowanym z fluorochromem (np. osioł α-królik koniugowany z Alexa-488) przez 3 h w temperaturze pokojowej. Płukać 3 razy w TBS przez 15 min każdy, zamontować i przykryć szkiełkiem jak opisano powyżej.
        UWAGA: Aby znakować antygeny przeciwciałami od różnych gatunków gospodarzy, należy dodać je w kroku 3.2.2.2 oraz odpowiednie przeciwciała wtórne w kroku 3.2.2.3.
    3. Jedno z przeciwciał wtórnych od tego samego gatunku co jedno z przeciwciał pierwszorzędowych
      UWAGA: Protokół ten jest odpowiedni dla potrójnego barwienia przeciwko BrdU lub Ki67 wraz z GFAP, nestin-GFP i DCX.
      1. Ściśle przestrzegać kroków protokołu 3.2.1.1 - 3.2.1.5. Do tego momentu używać wyłącznie surowicy osła w TBSplus.
      2. Inkubować w TBSplus zawierającym 3% surowicy koziej przez 1 h w temperaturze pokojowej. Blokuje to wolne paratopy w przeciwciale wtórnym α-koza. Płukać 3 razy w TBS i raz w TBS-T przez 10 min każdy.
      3. Inkubować w koza α-królik koniugowany z AMCA rozcieńczonym w TBSplus przez 3 h w temperaturze pokojowej lub przez noc w 4 °C. Płukać trzy razy w TBS przez 15 min każdy, zamontować i przykryć szkiełkiem jak opisano powyżej.
    4. Współbarwienie CldU i IdU
      1. Płukać, denaturować i neutralizować skrawki zgodnie z opisem w sekcji 3.2.1 (kroki 3.2.1.1 - 3.2.1.2).
      2. Inkubować z 20 µg/ml niekoniugowanych fragmentów Fab α-mysie IgG (H+L) w TBSplus przez 1 h w temperaturze pokojowej. Płukać 4 razy w TBS i raz w TBS-T przez 10 min każdy.
      3. Inkubować w koktajlu przeciwciał pierwszorzędowych zawierającym szczur α-BrdU (1:400; oczyszczone IgG2) i mysz α-BrdU (1:350) rozcieńczonych w TBSplus przez noc w 4 °C. Płukać 3 razy w TBS i raz w TBS-T przez 10 min każdy.
      4. Inkubować w koktajlu przeciwciał wtórnych zawierającym biotynylowany osioł α-szczur (1:500) oraz fragmenty Fab osioł α-mysz koniugowane z FITC (1:100). Płukać 3 razy w TBS i raz w TBS-T przez 10 min każdy.
      5. Inkubować w Streptawidynie koniugowanej z Rhodamine Red przez 2 h w temperaturze pokojowej. Płukać 3 razy w TBS przez 15 min każdy, zamontować i przykryć szkiełkiem jak opisano powyżej.
    5. Wzmocnienie sygnału fluorescencji u myszy nestin-GFP
      1. Dodać koza α-GFP do koktajlu przeciwciał pierwszorzędowych.
      2. Dodać przeciwciało wtórne koniugowane z fluorochromem o właściwościach spektralnych podobnych do GFP (takich jak osioł α-koza koniugowany z Alexa 488) do koktajlu przeciwciał wtórnych.
  3. Uwalnianie epitopów
    1. Przeprowadzić uwalnianie epitopów po wypłukaniu płynu przeciwzamrażającego. Wstępnie podgrzać parowar z płytkami 6- lub 12-dołkowymi zawierającymi 0,1 M bufor cytrynianowy pH 6,0 do 95 - 99 °C (około 25 min).
    2. Przenieść skrawki do gorącego buforu cytrynianowego i parować przez 30 min (przykryć płytki folią aluminiową, ponieważ plastikowe pokrywki nie są odporne na wysoką temperaturę).
    3. Natychmiast umieścić płytki w łaźni lodowej w celu schłodzenia. Pomaga to chronić morfologię tkanki, co jest szczególnie istotne przy pracy ze skrawkami mózgu zwierząt postnatalnych.
    4. Płukać 3 razy w TBS przez 10 min każdy, aby wypłukać i zneutralizować cytrynian, a następnie kontynuować barwienie.
  4. Przeciwciała mysie na tkance mysiej
    1. Dodać 20 µg/ml monowalentnych fragmentów Fab α-mysie IgG (H+L; ten sam gatunek gospodarza co przeciwciało wtórne) do pierwszego etapu blokowania (np. krok 3.1.5 lub 3.2.1.3).
    2. Płukać 4 razy w TBS i raz w TBS-T przez 10 min każdy, a następnie kontynuować odpowiedni protokół.
  5. Przeciwbarwienie fioletem krezylu
    1. Wstępnie podgrzać roztwór fioletu krezylu do 60 °C (w szklanym słoiku). Inkubować szkiełka w gorącym roztworze przez 3 min.
    2. Płukać w wodzie destylowanej i odwadniać 2 razy po 1 min w 70%, 96% i 100% izopropanolu.
    3. Przejrzyścieć przez 5 - 6 min w ksylenie lub zamienniku ksylenu i przykryć szkiełkiem za pomocą kompatybilnego trwałego medium montażowego.

4. Analiza danych

  1. Policz komórki noworodkowe barwione peroksydazą w każdym 6tym przekroju wzdłuż całego zasięgu rostrokaudalnego zakrętu zębatego. Wykorzystaj mikroskop świetlny przy powiększeniu 400X.
  2. Pomnóż otrzymaną liczbę komórek przez interwał przekrojów, aby uzyskać szacunkową całkowitą liczbę komórek noworodkowych.
  3. Wykonaj obrazowanie sekcji znakowanych fluorescencyjnie za pomocą konfokalnego mikroskopu laserowego wyposażonego w odpowiednie lasery i systemy filtrów. Pobierz stosy obrazów w losowych pozycjach wzdłuż całego zasięgu zakrętu zębatego przy powiększeniu 400X i przeanalizuj co najmniej 50 losowo wybranych komórek zainteresowania na każdą półkulę pod kątem współoznakowania innymi markerami.
  4. Pomnóż otrzymane wartości procentowe komórek współoznakowanych (%/100) przez całkowitą liczbę komórek noworodkowych, aby obliczyć bezwzględną liczbę konkretnych populacji komórek noworodkowych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Opisane powyżej metody zastosowano w celu ilościowego oznaczenia i charakterystyki nowo powstałych komórek w hipokampie w okresie ponatalnym oraz u osobników dorosłych. W tym celu wykorzystano myszy typu dzikiego oraz myszy z wyłączonym genem cykliny D2 (Ccnd2KO), wykazujące niedobór neurogenezy, utrzymywane w warunkach znanych z wpływu na tempo neurogenezy (t.j. środowisko wzbogacone, EE)13,14. Immunohistochemiczne barwienie DAB przeciwko markerom Ki67, BrdU, CldU lub IdU konsekwentnie wykaz...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Kwantyfikacja i identyfikacja subpopulacji nowo narodzonych komórek jest centralnym zagadnieniem w badaniach nad neurogenezą u dorosłych. Połączenie markerów proliferacji i przeciwciał przeciwko białkom ulegającym ekspresji na określonych etapach neurogenezy u dorosłych pozwala na immunohistochemiczne wykrycie tych subpopulacji. Niektóre przeciwciała lub kombinacje przeciwciał wymagają określonych warunków barwienia.

Znakowanie dzielących się komórek syntetycznymi analogami tymidyny jest nadal...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

Autorzy dziękują S. Tauschowi za doskonałą pomoc techniczną. Prace były wspierane przez BMBF (Bernstein Focus 01GQ0923) oraz DFG (FOR1738).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Podawanie analogu tymidyny
5-Bromo-2′-deoksyurydyna, BrdUSigma-AldrichB9285toksyczna (mutagenna, teratogenna)
5-Chloro-2′-deoksyurydyna, CldUSigma-AldrichC6891toksyczna (mutagenna, teratogenna)
5-Chloro-2′-deoksyurydyna, CldUMP Biomedicals2105478toksyczny (mutagenny, teratogenny)
5-Jodo-2′-deoksyurydyna, IdUMP Biomedicals2100357toksyczny (mutagenny, teratogenny)
Przygotowanie tkanki
Isoflurane-ActavisPiramal Healthcare700211
Paraformaldehyd w proszku (PFA)Riedel-De Hä en16005toksyczna, łatwopalna
Pompa perfuzyjna PD5206Heidolph Instruments523-52060-00
Rurki laboratoryjne Masterflex Tygon, Ø 0,8 mmThermo Fischer Scientific06409-13
Igła do karmienia, prosta, 21 G, 1,75 mm końcówka oliwkowa, 40 mmAgnthos1036
Mikrotom do zamrażania Microm HM 400Thermo Fischer Scientific
24-dołkowe płytki wielodołkowe do hodowli komórkowychGreiner Bio-One662160
Immunohistochemia
Parowiec Tefal vitacuisineTefalVS 4001
Netwell 24 mm wkładki z siatki poliestrowejCorning3479wstępnie załadowane w 6-dołkowe płytki hodowlane
Wkładki membranowe z siatki poliestrowej Netwell 15 mmCorning3477wstępnie załadowany w 12-dołkowe płytki hodowlane
Plastikowy zestaw nośny 6-dołkowy NetwellCorning3521do wkładów membranowych z siatki poliestrowej 24 mm Plastikowy
zestaw nośny Netwell 12-dołkowy Corning3520do wkładów membranowych z siatki poliestrowej 15 mm
Zestaw Vectastain Elite ABCVector LaboratoriesPK-6100
DAB (hydrat tetrachlorowodorku 3,3&-diaminobenzydyny)Sigma-AldrichD-5637rakotwórczy, światłoczuły
Fluoromount-GSouthernBiotech0100-01
Przeciwciała pierwotne
Rabbit IgG1 α-Ki67Novocastra/ Leica BiosystemsNCL-L-Ki67MM1DAB 1:400/IF 1:100; wymaga pobrania epitopu
Królik α-GFAP, AS-3-GFSystemy synaptyczne173 0021:500
Kozia IgG (H+L) &alfa;-GFPPrzeciwciała AcrisR1091P1:300
Mysie IgG1 &alfa;-nestinAbcamab61421:200; wymaga pobrania epitopu
IgG świnki morskiej (H+L) α-DoublecortinMerck MilliporeAB22531:500
Szczur IgG2a α- BrdU (wodobrzusze)AbD Serotec/ Bio-RadOBT0030CXdo wykrywania BrdU; DAB 1:500/IF 1:400
Szczur IgG2a α-BrdU (oczyszczony)AbD Serotec/ Bio-RadOBT0030   do wykrywania CldU; DAB 1:500/IF 1:250-400
Mysz IgG1 α-NeuNMerck MilliporeMAB3771:500
mysz IgG1κ α-BrdUBD Biosciences347580Do wykrywania IdU; DAB 1:500/IF 1:350
Przeciwciała drugorzędowe
Osioł &alfa;-świnka morska IgG (H+L)-BiotynaDianova711-065-1521:500
Osioł &alfa;-szczur IgG (H+L)-BiotynaDianova712-065-1501:500
Osioł &alfa;-mysz IgG (H+L)-BiotynaDianova715-065-1511:500
Koza &alfa;-szczur IgG (H+L)-Alexa Fluor 488Sondy molekularneA110061:250
Osioł &alfa;-koza IgG (H+L)-Alexa Fluor 488Sondy molekularneA110551:250
Osioł &alfa;-mysz IgG (H+L)-FITC, Fab-FragmentDianova715-097-0031:100
Osioł &alfa;-mysz IgG (H+L)-Alexa Fluor 647Dianova715-605-1511:250
Osioł &alfa;-świnka morska IgG (H+L)-Alexa Fluor 647Dianova706-605-1481:250
Osioł &alfa;-szczur IgG (H+L)-Rhodamina Red-XDianova712-295-1501:250
Osioł &alfa;-królik IgG (H+L)-Rodamina Red-XDianova711-295-1521:250
Osioł &alfa;-świnka morska IgG (H+L)-Rhodamina Red-XDianova706-296-1481:250
Streptawidyna-rodamina Red-XDianova016-290-0841:500
Koza &alfa;-królik IgG (H+L)-AMCADianova111-155-1441:250, działa tylko z królikiem α-GFAP
Hoechst 33342Sondy molekularneH35701:1000
Sondy molekularneDAPID13061:1000
Blokowanie
Fab-fragment osioł &alfa-mysz IgG (H+L)Dianova715-007-0031:20
Fab-fragment osioł &alfa;-królik IgG (H+L)Dianova711-007-0031:20
Normalna surowica osłaMerck MilliporeS30
Normalna surowica królikaDianova011-000-010
Normalna surowica koziaDianova005-000-001
Albumina surowicy bydlęcejSigma-AldrichA7906
Histology
krezylowySigma-AldrichC5042
Neo-ClearMerck Millipore109843nietoksyczny substytut ksylenu
Neo-MountMerck Millipore109016trwałe podłoże montażowe
mikroskopia
Axioskop 2Carl Zeiss Mikroskopia
LSM 710Carl Zeiss Mikroskopia
fiolet

Bibliografia

  1. Kempermann, G., Jessberger, S., Steiner, B., Kronenberg, G. Milestones of neuronal development in the adult hippocampus. Trends Neurosci. 27 (8), 447-452 (2004).
  2. Ge, S., Sailor, K. A., Ming, G. L., Song, H. Synaptic integration and plasticity of new neurons in the adult hippocampus. J Physiol. 586 (16), 3759-3765 (2008).
  3. Ge, S., Yang, C. H., Hsu, K. S., Ming, G. L., Song, H. A critical period for enhanced synaptic plasticity in newly generated neurons of the adult brain. Neuron. 54 (4), 559-566 (2007).
  4. Castilla-Ortega, E., Pedraza, C., Estivill-Torrus, G., Santin, L. J. When is adult hippocampal neurogenesis necessary for learning? evidence from animal research. Rev Neurosci. 22 (3), 267-283 (2011).
  5. Deng, W., Aimone, J. B., Gage, F. H. New neurons and new memories: how does adult hippocampal neurogenesis affect learning and memory. Nat Rev Neurosci. 11 (5), 339-350 (2010).
  6. Encinas, J. M., Enikolopov, G. Identifying and quantitating neural stem and progenitor cells in the adult brain. Methods Cell Biol. 85, 243-272 (2008).
  7. Burns, K. A., Kuan, C. Y. Low doses of bromo- and iododeoxyuridine produce near-saturation labeling of adult proliferative populations in the dentate gyrus. Eur J Neurosci. 21 (3), 803-807 (2005).
  8. Cameron, H. A., McKay, R. D. Adult neurogenesis produces a large pool of new granule cells in the dentate gyrus. J Comp Neurol. 435 (4), 406-417 (2001).
  9. Vega, C. J., Peterson, D. A. Stem cell proliferative history in tissue revealed by temporal halogenated thymidine analog discrimination. Nat Methods. 2 (3), 167-169 (2005).
  10. Scholzen, T., Gerdes, J. The Ki-67 protein: from the known and the unknown. J Cell Physiol. 182 (3), 311-322 (2000).
  11. Brown, D. C., Gatter, K. C. Ki67 protein: the immaculate deception. Histopathology. 40 (1), 2-11 (2002).
  12. Yamaguchi, M., Saito, H., Suzuki, M., Mori, K. Visualization of neurogenesis in the central nervous system using nestin promoter-GFP transgenic mice. Neuroreport. 11 (9), 1991-1996 (2000).
  13. Kempermann, G., Kuhn, H. G., Gage, F. H. More hippocampal neurons in adult mice living in an enriched environment. Nature. 386 (6624), 493-495 (1997).
  14. Sicinski, P., et al. Cyclin D2 is an FSH-responsive gene involved in gonadal cell proliferation and oncogenesis. Nature. 384 (6608), 470-474 (1996).
  15. Ansorg, A., Witte, O. W., Urbach, A. Age-dependent kinetics of dentate gyrus neurogenesis in the absence of cyclin D2. BMC Neurosci. 13, 46(2012).
  16. Taupin, P. BrdU immunohistochemistry for studying adult neurogenesis: paradigms, pitfalls, limitations, and validation. Brain Res Rev. 53 (1), 198-214 (2007).
  17. Lewis Carl, S. A., Gillete-Ferguson, I., Ferguson, D. G. An indirect immunofluorescence procedure for staining the same cryosection with two mouse monoclonal primary antibodies. J Histochem Cytochem. 41 (8), 1273-1278 (1993).
  18. Burry, R. W. Controls for immunocytochemistry: an update. J Histochem Cytochem. 59 (1), 6-12 (2011).
  19. Tuttle, A. H., et al. Immunofluorescent detection of two thymidine analogues (CldU and IdU) in primary tissue. J Vis Exp. (46), 6-12 (2010).
  20. Miller, R. T., Swanson, P. E., Wick, M. R. Fixation and epitope retrieval in diagnostic immunohistochemistry: a concise review with practical considerations. Appl Immunohistochem. Mol Morphol. 8 (3), 228-235 (2000).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Sekwencyjna immunofluorescencjaanalog tymidynyprzetwarzanie tkanekmikroskopia konfokalnakwantyfikacja komórekprzeciwciała gatunków gospodarzakomórki progenitorowe neuronów
Immunohistochemia i wielokrotne znakowanie przeciwciałami od tego samego gatunku gospodarza w celu zbadania neurogenezy hipokampa u dorosłych
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.