Artykuł metodologiczny

Immunohistochemia i wielokrotne znakowanie przeciwciałami od tego samego gatunku gospodarza w celu zbadania neurogenezy hipokampa u dorosłych

DOI:

10.3791/52551

⸱

22 kwietnia 2015

 ,  ,  , 
1Hans Berger Department of Neurology, Jena University Hospital

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten artykuł wideo ilustruje kompleksowy protokół do wykrywania i ilościowego określania wszystkich etapów neurogenezy dorosłego hipokampa w obrębie tego samego odcinka tkanki. Opracowaliśmy metodę przezwyciężania ograniczeń pośredniej immunofluorescencji mnogiej, które powstają, gdy odpowiednie przeciwciała od różnych gatunków gospodarzy są niedostępne.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Neurogeneza dorosłych to wysoce regulowany, wieloetapowy proces, w którym nowe neurony są generowane z aktywowanej nerwowej komórki macierzystej poprzez coraz bardziej zaangażowane pośrednie podtypy progenitorowe. Każdy z tych podtypów wyraża zestaw specyficznych markerów molekularnych, które wraz z określonymi kryteriami morfologicznymi można wykorzystać do ich identyfikacji. Zazwyczaj stosuje się techniki immunofluorescencyjne obejmujące przeciwciała specyficzne dla podtypu w połączeniu z egzo- lub endogennymi markerami proliferacji. Opisujemy tutaj metody znakowania immunologicznego do wykrywania i kwantyfikacji wszystkich etapów neurogenezy hipokampa u dorosłych. Obejmują one zastosowanie analogów tymidyny, perfuzję przezsercową, przetwarzanie tkanek, odzyskiwanie epitopów pod wpływem ciepła, immunohistochemię ABC, wielokrotną immunofluorescencję pośrednią, mikroskopię konfokalną i kwantyfikację komórek. Ponadto przedstawiamy sekwencyjny protokół immunofluorescencji mnogiej, który pozwala uniknąć problemów wynikających zwykle z konieczności stosowania przeciwciał pierwotnych wyhodowanych u tego samego gatunku gospodarza. Pozwala na dokładną identyfikację wszystkich podtypów progenitorów hipokampa wraz z markerem proliferacji w obrębie jednej sekcji. Techniki te są potężnym narzędziem do badania równoległej regulacji różnych podtypów progenitorów, ich udziału w patologiach mózgu i ich roli w określonych funkcjach mózgu.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dwa regiony mózgu konstytutywnie generują nowe neurony przez całe życie, strefa podkomorowa komór bocznych i strefa subziarnista (SGZ) zakrętu zębatego hipokampa (DG). Nowo narodzone neurony wywodzą się z nerwowych komórek progenitorowych i przechodzą przez różne etapy rozwoju morfologicznego i fizjologicznego, zanim osiągną dojrzałość1,2. Z wolno dzielącej się promienistej komórki macierzystej podobnej do gleju (typ 1) powstają kolejne etapy tranzytu, wzmacniające pośrednie komórki progenitorowe. Bardziej niezróżnicowane podtypy (typ 2a i typ 2b) mają nieregularny kształt z krótkimi, stycznymi wyrostkami. Generują neuroblasty (typ 3), które stopniowo opuszczają cykl komórkowy, aby stać się niedojrzałymi neuronami (z dendrytami rozciągniętymi w kierunku warstwy molekularnej) i ostatecznie integrują się z siecią hipokampa jako dojrzałe komórki ziarniste. Ze względu na swoje szczególne cechy fizjologiczne, komórki te zapewniają obwodom zwiększoną plastyczność3, co sugeruje wyjątkową rolę w funkcjonowaniu hipokampa. W rzeczywistości badania z ostatniej dekady dostarczyły istotnych dowodów na to, że neurogeneza dorosłych przyczynia się do pamięci przestrzennej, separacji wzorców i zachowań emocjonalnych.

Neurogeneza dorosłych może być badana przy użyciu różnych metod. Analogi tymidyny włączają się do DNA podczas fazy S cyklu komórkowego i umożliwiają datowanie urodzenia, kwantyfikację i analizę losu nowo narodzonych komórek6-8. Sekwencyjne stosowanie różnych analogów tymidyny (np. CldU, EdU lub IdU) można wykorzystać do badania obrotu komórkowego lub populacji komórek urodzonych w różnych punktach czasowych w trakcie eksperymentu9. Alternatywnym, endogennym markerem proliferacji komórek jest Ki67. Ulega ekspresji w dzielących się komórkach podczas wszystkich faz cyklu komórkowego (G1, S, G2, M) z wyjątkiem fazy spoczynku (G0) i początku G1 10,11. Do analizy fenotypu populacji komórek noworodka w dorosłym zakręcie zębatym można użyć kilku markerów molekularnych specyficznych dla danego etapu, takich jak GFAP, nestyna, DCX i NeuN1,6. GFAP jest markerem dojrzałych astrocytów, ale ulega również ekspresji w promienistych komórkach glejowych w dorosłym przodomózgowiu. Nestyna jest włóknem pośrednim specyficznym dla promienistych komórek glejowych i wczesnych pośrednich komórek progenitorowych. DCX jest białkiem związanym z mikrotubulami, ulegającym ekspresji w pośrednich przodkach, neuroblastach i niedojrzałych neuronach. Na podstawie (ko)ekspresji tych trzech markerów i cech morfologicznych znakowanych komórek można zidentyfikować cztery odrębne podtypy komórek progenitorowych: typ 1 (GFAP+, nestin+, DCX-), typ 2a (GFAP-, nestin+, DCX-), typ 2b (GFAP-, nestin+, DCX+) i typ 3 (GFAP-,nestin-, DCX+)1. Znakowanie DCX razem z NeuN, który ulega ekspresji w neuronach postmitotycznych, umożliwia różnicowanie niedojrzałych (DCX+, NeuN+) i dojrzałych (DCX-, NeuN+) neuronów ziarnistych.

Wyżej wymienione markery są często używane do immunofluorescencyjnego znakowania i późniejszej mikroskopii konfokalnej do analizy liczby i tożsamości nowo narodzonych komórek. Zazwyczaj wymaga to przeciwciał od różnych gatunków gospodarzy, aby zapobiec niepożądanej reaktywności krzyżowej przeciwciał. Jednak większość pierwotnych przeciwciał nadających się do badań neurogenezy jest hodowana u królików lub myszy (np. mysz α-BrdU, mysz α-NeuN, królik α-Ki67, królik α-GFAP). Prowadzi to do poważnych ograniczeń w liczbie i kombinacji antygenów, które można ocenić w jednym wycinku. To z kolei nie tylko zwiększa wysiłek związany z barwieniem, ponieważ konieczne jest wykonanie wielu barwień, ale może również zagrozić wiarygodności wyników. Ponadto niektóre antygeny są podatne na maskowanie epitopów wywołane wiązaniem formaliny (np. Ki67, nestyna). Opisujemy tutaj modyfikacje klasycznych protokołów pojedynczego i wielokrotnego znakowania immunologicznego (np. Pobieranie epitopów, wielokrotne sekwencyjne barwienie immunologiczne, użycie myszy transgenicznych nestin-GFP12), które przezwyciężają wiele z tych problemów. W szczególności sekwencyjny protokół wielokrotnej immunofluorescencji umożliwia barwienie przeciwko maksymalnie czterem różnym antygenom, nawet jeśli część przeciwciał pochodzi od tego samego gospodarza. Umożliwia to jednoczesne wykrywanie komórek progenitorowych typu 1, typu 2a, typu 2b i typu 3, a także ich aktywności proliferacyjnej w obrębie jednego przekroju.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

UWAGA: Wszystkie procedury z udziałem żywych zwierząt zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi dyrektywy WE 86/609/EWG w sprawie opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych i zatwierdzone przez lokalną komisję etyki (Thüringer Landesamt für Lebensmittelsicherheit und Verbraucherschutz).

1. Dootrzewnowe wstrzyknięcie analogów tymidyny

  1. Zważ zwierzęta dzień przed wstrzyknięciem. Należy obliczyć ilość analogu tymidyny wymaganą do wszystkich wstrzyknięć zaplanowanych na następny dzień, jak również dla poszczególnych objętości iniekcji 10 mg/ml roztworu podstawowego o dostosowanej masie ciała.
  2. Przygotować 10 mg/ml roztworu podstawowego tymidyny. (UWAGA! Analogi tymidyny są toksyczne. Postępuj zgodnie ze szczegółowymi kartami charakterystyki substancji niebezpiecznej (MSDS) dostarczonymi przez dostawców, tj. noś fartuch laboratoryjny i rękawice, używaj okapu przeciw oparom chemicznym).
    1. Wziąć analog tymidyny z zamrażarki i doprowadzić go do temperatury pokojowej ok. 21 °C. Odważyć 10 mg i dodać jałową sól fizjologiczną (dla BrdU i CldU) lub 0,04 N NaOH (w sterylnym roztworze soli fizjologicznej; dla IdU), wirować. Umieścić na co najmniej 10 - 15 minut w łaźni wodnej o temperaturze 50 °C i wirować co 2 - 3 minuty do rozpuszczenia proszku.
      UWAGA: Roztwory należy stosować do 24 godzin w przypadku przechowywania w temperaturze pokojowej i przez kilka tygodni w temperaturze -20 °C. Roztwory należy chronić przed światłem (przykryć folią aluminiową). Zawsze sprawdzaj, czy nie ma osadów i w razie potrzeby ponownie rozpuść.
  3. Unieruchomić mysz za kark i dootrzewnowo wstrzyknąć odpowiednią, dostosowaną do masy objętość roztworu podstawowego (przy temperaturze pokojowej) za pomocą strzykawki o drobnym dozowaniu z igłą 30 G.
    UWAGA: W przypadku, gdy CldU i IdU muszą być podawane sekwencyjnie temu samemu zwierzęciu, należy rozważyć wstrzyknięcie stężeń równomolowych (np. 42,5 mg/kg CldU i 57,5 mg/kg IdU, co odpowiada 50 mg/kg BrdU). W związku z tym należy odpowiednio dostosować objętość wstrzyknięć roztworów podstawowych o stężeniu 10 mg/ml.

2. Przygotowanie tkanek

  1. Przygotować 4% formaldehydu w 0,1 M buforze fosforanowym o pH 7,4 w dniu poprzedzającym perfuzję. Przechowywać w temperaturze 4 °C.
  2. Głęboko znieczulone myszy (3,5% izofluranu) perfuzji przezsercowej przez lewą komorę za pomocą 10 ml lodowatego PBS, a następnie 40 ml lodowatego formaldehydu (szybkość przepływu 5 ml / min). Wypreparować mózg i umieścić go w tym samym utrwalaczu przez 24 godziny w temperaturze 4°C.
  3. Przenieś kolejno mózg do 10% (24 godziny w 4°C) i 30% sacharozy (aż do zatonięcia mózgu, ok. 48 godzin). W celu zamrożenia powoli zanurz kriochronione mózgi w izopentanie o temperaturze -25 °C, aż z tkanki nie wydobędą się pęcherzyki. Przechowywać w temperaturze -80 °C.
  4. Wyciąć przekroje koronalne o grubości 40 μm na mikrotomie zamrażającym (temperatura bloku od -25 do -16 °C). Sekwencyjnie przenieść skrawki do roztworu niezamarzającego zawierającego studzienki 24-dołkowej płytki do hodowli komórkowej (patrz rysunek 1). Przechowywać w temperaturze -20 °C.

figure-protocol-1
Rysunek 1. Schematyczna ilustracja przedstawiająca przenoszenie wycinków mikrotomu na płytkę 24-dołkową. Zacznij od A1 i umieść kolejne plasterki w rzędzie A, po A6 przejdź do następnego rzędu B i tak dalej. Po dotarciu do D6 wróć do A1 i kontynuuj. Taki układ plasterków pozwala na ilościowe określenie każdejn-tej części całego mózgu. Do oznaczania ilościowego nowo narodzonych komórek należy przyjmować co 6kwartę mózgu (co odpowiada zawartości jednej kolumny), do fenotypowania immunofluorescencji należy przyjmować co 12 sekcję (co odpowiada zawartości 2 naprzemiennych rzędów jednej kolumny).

3. Barwienie immunologiczne

UWAGA: Sekcje są przetwarzane swobodnie pływające, zwykle w płytkach 6-dołkowych wyposażonych w płytkę nośną i wkładki siatkowe. W drodze wyjątku blokowanie, inkubacja przeciwciał i reakcja ABC odbywają się na płytkach 12- lub 24-dołkowych bez wkładek siatkowych (wystarczy 0,5 do 1 ml na dołek, w zależności od liczby plastrów, które mają zostać wybarwione). Podczas tych kroków przenieś sekcje za pomocą cienkiej szczoteczki (spłucz każdym nowym roztworem). Wszystkie inkubacje odbywają się przy ciągłym mieszaniu (maks. 150 obr./min).

  1. Immunohistochemia (metoda ABC)
    1. Przenieść skrawki płynu niezamarzającego do TBS i dokładnie spłukać (raz O/N w temperaturze 4 °C, 5 razy w temperaturze pokojowej przez 10 minut każde), aby całkowicie usunąć płyn niezamarzający.
    2. Inkubować przez 30 minut w 1,5% H2O2 w TBS-T w celu wygaszenia endogennej aktywności peroksydazy. Zwróć uwagę na bulgotanie i w razie potrzeby ponownie zanurz sekcje. Płucz 3 razy w TBS po 15 minut.
    3. Opcjonalnie: W międzyczasie podgrzej wstępnie komorę grzewczą i 2 N HCl do 37 °C. Inkubuj sekcje przez 30 minut w temperaturze 37 °C w 2 N HCl w celu denaturacji DNA. Delikatnie oddziel sekcje za pomocą pędzla.
    4. Opcjonalnie: Neutralizacja sekcji przez 10 minut w 0,1 M buforze boranowym pH 8,5, RT. Podczas przenoszenia krótko przetrzyj wkładki siatkowe zawierające sekcje na ręczniku papierowym, aby usunąć resztki HCl. Płukać 2 razy w TBS przez 15 minut każdy.
    5. Inkubować w TBSplus w celu przepuszczalności tkanki i zablokowania niespecyficznych miejsc wiązania przeciwciał, 1 godzina w RT.
    6. Inkubować w przeciwciałie pierwszorzędowym rozcieńczonym w TBSplus, O/N w temperaturze 4 °C. Płukać 3 razy w TBS przez 15 minut każdy.
    7. Inkubować w biotynylowanym przeciwciałie drugorzędowym rozcieńczonym w TBSplus, 3 godziny w temperaturze pokojowej. Płukać 3 razy w TBS przez 15 minut każdy. Tymczasem...
    8. Przygotuj kompleks ABC zgodnie z protokołem producenta (1% A + 1% B w TBS-T). Odstawić na 30 minut w temperaturze pokojowej przed użyciem. Inkubować skrawki w odczynniku AB przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Płukać 3 razy w TBS przez 15 minut każda.
    9. Przygotować 50 ml 0,5 mg/ml DAB w TBS-T na płytkę 6- lub 12-dołkową, podzielić na dwie połówki i pipetować odpowiednio 4 ml lub 2 ml na dołek. Przenieś sekcje do roztworu DAB (UWAGA! DAB jest toksyczny. Postępuj zgodnie z konkretną kartą charakterystyki dostarczoną przez dostawcę, tj. noś fartuch laboratoryjny i rękawice, używaj okapu do oparów chemicznych).
    10. Dodać 0,5 ml 1% H2O2 do pozostałych 25 ml roztworu DAB, wymieszać i odpipetować równoważne objętości jak powyżej do każdego dołka, aby rozpocząć reakcję peroksydazy. Inkubować przez 12 minut. Płucz 3 razy w TBS po 15 minut.
    11. Zamontuj sekcje do szkiełek w żelatynie, suche na powietrzu O/N. Szkiełko nakrywkowe ze stałym medium montażowym.
    12. Opcjonalnie: Barwienie przeciwnasadkowe przed nałożeniem szkiełka nakrywkowego (patrz sekcja 3.5).
      UWAGA: Jeśli stosunek sygnału do szumu jest niski z powodu wysokiego tła, powtórzyć zabiegH2O2po inkubacji odczynnikiem AB (krok 3.1.8).
  2. Wielokrotna immunofluorescencja
    1. Pojedyncza lub jednoczesna immunofluorescencja mnoga
      1. Przenieść skrawki płynu niezamarzającego do TBS i dokładnie spłukać (raz O/N w temperaturze 4 °C, 5 razy w temperaturze pokojowej przez 10 minut każde), aby całkowicie usunąć płyn niezamarzający.
      2. Opcjonalnie: jak w krokach 3.1.3 - 3.1.4.
      3. Inkubować w TBSplus w celu przepuszczalności tkanki i zablokowania niespecyficznych miejsc wiązania przeciwciał, 1 godzina w RT.
      4. Inkubować w koktajlu przeciwciał pierwotnych (np. szczur α-BrdU, świnka morska α-DCX, koza α-GFP) rozcieńczony w TBSplus, O/N w temperaturze 4°C. Płukać 3 razy w TBS przez 15 minut każdy.
      5. Inkubować w koktajlu z przeciwciał drugorzędowych sprzężonych z fluorochromem (np. Rhodamine Red α-szczur, Alexa-647 α-świnka morska, Alexa-488 α-koza; wszystkie pochodzące od osła) rozcieńczonych w TBSplus, 3 godziny w temperaturze pokojowej lub O/N w temperaturze 4 °C. Od teraz chroń sekcje przed światłem. Płucz 3 razy w TBS po 15 minut.
      6. Zamontuj sekcje do szkiełek w żelatynie, suche na powietrzu O/N. Szkiełko nakrywkowe z wodnym medium montażowym.
    2. Sekwencyjna immunofluorescencja mnoga z pierwszorzędowymi przeciwciałami od tego samego gatunku gospodarza
      1. Jako kroki 3.2.1.1 - 3.2.1.3.
      2. Inkubować w pierwszym przeciwciałie pierwszorzędowym (np. króliczym antygenie α A), O/N w temperaturze 4 °C. Płukać 3 razy w TBS i raz w TBS-T przez 10 minut każdy.
      3. Inkubować w pierwszym przeciwciałie drugorzędowym sprzężonym z fluorochromem (np. Rhodamine Red-conj. osioł α-królik), 3 godziny RT. Od teraz chroń sekcje przed światłem. Płukać 3 razy w TBS i raz w TBS-T przez 10 minut każde.
      4. Inkubować w 10% normalnej surowicy od tego samego gospodarza, co przeciwciała pierwszorzędowe (np. surowica królika) przez 3 godziny RT, aby nasycić otwarte paratopy na pierwszym przeciwciałie drugorzędowym. Płukać 3 razy w TBS i raz w TBS-T przez 10 minut każde.
      5. Inkubować w TBSplus z 50 μg/ml niesprzężonych monowalentnych fragmentów Fab skierowanych przeciwko gospodarzowi przeciwciał pierwszorzędowych (np. IgG α-królika (H+L)) w celu pokrycia epitopów, które można rozpoznać przez drugie przeciwciało drugorzędowe, O/N w temperaturze 4 °C.
      6. Płukać co najmniej 3 razy w TBS i raz w TBS-T przez 10 minut każdy. Podczas przenoszenia pokrótce przetrzyj wkładki siatkowe zawierające sekcje na ręczniku papierowym, aby usunąć wszelkie resztki Fab.
      7. Inkubować w drugim przeciwciałie pierwszorzędowym (np. króliczym antygenie α B), O/N w temperaturze 4 °C. Płukać 3 razy w TBS i raz w TBS-T przez 10 minut każdy.
      8. Inkubować w drugim przeciwciałie drugorzędowym sprzężonym z fluorochromem (np. Alexa-488-conj. osioł α-królik), 3 godziny RT. Płukać 3 razy w TBS przez 15 minut każdy, zamontować i nakryć szkiełko jak wyżej.
        UWAGA: Aby oznaczyć antygeny przeciwciałami od różnych gatunków gospodarzy, dodaj je do kroku 3.2.2.2, a odpowiednie przeciwciała drugorzędowe do kroku 3.2.2.3.
    3. Jedno z przeciwciał drugorzędowych tego samego gatunku co jedno z przeciwciał pierwszorzędowych
      UWAGA: Ten protokół jest odpowiedni do poczwórnego barwienia przeciwko BrdU lub Ki67 razem z GFAP, nestin-GFP i DCX.
      1. Postępuj ściśle zgodnie z krokami protokołu 3.2.1.1 - 3.2.1.5. Do tego momentu w TBSplus należy stosować wyłącznie surowicę osła.
      2. Inkubować w TBSplus zawierającym 3% koziej surowicy przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Obejmuje to otwarte paratopy na przeciwciałie drugorzędowym α-kozy. Płukać 3 razy w TBS i raz w TBS-T przez 10 minut każde.
      3. Inkubować w AMCA-conj. koza α-królik rozcieńczony w TBSplus, 3 godz. RT lub O/N 4 °C. Płukać trzy razy w TBS przez 15 min każdy, zamontować i nakryć jak wyżej.
    4. Współbarwienie CldU, IdU
      1. Przepłukać, zdenaturować i zneutralizować sekcje zgodnie z opisem w sekcji 3.2.1 (kroki 3.2.1.1 - 3.2.1.2).
      2. Inkubować z 20 μg/ml niesprzężonych fragmentów Fab α-mysie IgG (H+L) w TBSplus, 1 godzinę w RT. Płukać 4 razy w TBS i raz w TBS-T przez 10 minut każdy.
      3. Inkubować w pierwotnym koktajlu przeciwciał zawierającym szczurzego α-BrdU (1:400; oczyszczone IgG2) i mysie α-BrdU (1:350) rozcieńczone w TBSplus, O/N w temperaturze 4°C. Płukać 3 razy w TBS i raz w TBS-T przez 10 minut każdy.
      4. Inkubować w wtórnym koktajlu przeciwciał zawierającym biotynylowane fragmenty Fab osła α szczura (1:500) i FITC-conj. osła α myszy (1:100). Płukać 3 razy w TBS i raz w TBS-T przez 10 minut każde.
      5. Inkubować w Rhodamine Red-conj. Streptawidyna, 2 godziny w RT. Płukać 3 razy w TBS przez 15 minut każdy, zamontować i nakryć jak wyżej.
    5. Wzmocnienie sygnału fluorescencji u myszy nestin-GFP
      1. Dodaj kozi α-GFP do pierwszorzędowego koktajlu przeciwciał.
      2. Dodaj sprzężone z fluorochromem przeciwciało drugorzędowe o właściwościach spektralnych podobnych do GFP (takie jak Alexa 488 conj. osioł α-koza) do drugorzędowego koktajlu przeciwciał.
  3. Pobieranie epitopów
    1. Przeprowadzić pobieranie epitopu po wypłukaniu płynu niezamarzającego. Rozgrzej parowar z 6- lub 12-dołkowymi płytkami zawierającymi 0,1 M bufor cytrynianu o pH 6,0 do 95 - 99 °C (około 25 min).
    2. Przenieś sekcje do gorącego bufora cytrynianu i gotuj na parze przez 30 minut (przykryj płytki folią aluminiową, ponieważ plastikowe pokrywki nie są odporne na ciepło).
    3. Natychmiast umieść płytki w łaźni lodowej, aby ostygły. Pomaga to chronić morfologię tkanek, co ma szczególne znaczenie podczas pracy z sekcjami mózgu zwierząt po urodzeniu.
    4. Płukać 3 razy w TBS przez 10 minut każdy, aby wypłukać i zneutralizować cytrynian i kontynuować barwienie.
  4. Przeciwciała myszy na tkance myszy
    1. Dodać 20 μg/ml monowalentnych fragmentów Fab α-mysich IgG (H+L; ten sam gatunek gospodarza co przeciwciało drugorzędowe) do pierwszego etapu blokowania (np. kroku 3.1.5 lub 3.2.1.3).
    2. Płukać 4 razy w TBS i raz w TBS-T przez 10 minut każde i postępować zgodnie z odpowiednim protokołem.
  5. Barwienie przeciwbarwiące fioletem krezylowym
    1. Rozgrzej roztwór fioletu krezylowego do temperatury 60 °C (w szklanym słoiku). Inkubować szkiełka w gorącym roztworze przez 3 minuty.
    2. Spłucz w odpowiedniej części i odwodnij 2 razy po 1 minutę w 70%, 96% i 100% izopropanolu.
    3. Przezroczystość przez 5 - 6 minut w ksylenie lub substytucie ksylenu i szkiełku nakrywkowym z kompatybilnym trwałym medium montażowym.

4. Analiza danych

  1. Policz komórki nowonarodzone barwione peroksydazą w co 6sekcji wzdłuż całego zasięgu rostrocaudalnego zakrętu zębatego. Użyj mikroskopu świetlnego o powiększeniu 400x.
  2. Pomnóż wynikową liczbę komórek przez interwał przecięcia, aby uzyskać oszacowanie całkowitej liczby nowo narodzonych komórek.
  3. Zobrazuj skrawki znakowane fluorescencyjnie za pomocą konfokalnego mikroskopu laserowego wyposażonego w odpowiednie lasery i systemy filtrów. Weź stosy obrazów w losowych pozycjach wzdłuż całego zakresu zakrętu zębatego w powiększeniu 400X i przeanalizuj co najmniej 50 losowo wybranych komórek zainteresowania na półkulę w celu wspólnego znakowania z innymi markerami.
  4. Pomnóż otrzymane wartości procentowe współznakowanych komórek (%/100) przez całkowitą liczbę komórek nowonarodzonych, aby obliczyć bezwzględne liczby określonych populacji komórek nowonarodzonych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zastosowaliśmy metody opisane powyżej, aby określić ilościowo i scharakteryzować komórki noworodków w hipokampie po urodzeniu i u dorosłych. Dlatego użyliśmy myszy z nokautem cykliny D2 typu dzikiego i z niedoborem neurogenezy (Ccnd2KO) trzymane w warunkach, o których wiadomo, że wpływają na tempo neurogenezy (tj. Wzbogacone środowisko, EE)13,14. Immunohistochemiczne barwienie DAB przeciwko Ki67, BrdU, CldU lub IdU konsekwentnie ujawniło różnice w liczbie komórek noworodków między myszami typ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kwantyfikacja i identyfikacja subpopulacji nowo narodzonych komórek jest centralnym zagadnieniem w badaniach nad neurogenezą u dorosłych. Połączenie markerów proliferacji i przeciwciał przeciwko białkom ulegającym ekspresji na określonych etapach neurogenezy u dorosłych pozwala na immunohistochemiczne wykrycie tych subpopulacji. Niektóre przeciwciała lub kombinacje przeciwciał wymagają określonych warunków barwienia.

Znakowanie dzielących się komórek syntetycznymi analogami tymidyny jest nadal...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy dziękują S. Tauschowi za doskonałą pomoc techniczną. Prace były wspierane przez BMBF (Bernstein Focus 01GQ0923) oraz DFG (FOR1738).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Podawanie analogu tymidyny
5-Bromo-2′-deoksyurydyna, BrdUSigma-AldrichB9285toksyczna (mutagenna, teratogenna)
5-Chloro-2′-deoksyurydyna, CldUSigma-AldrichC6891toksyczna (mutagenna, teratogenna)
5-Chloro-2′-deoksyurydyna, CldUMP Biomedicals2105478toksyczny (mutagenny, teratogenny)
5-Jodo-2′-deoksyurydyna, IdUMP Biomedicals2100357toksyczny (mutagenny, teratogenny)
Przygotowanie tkanki
Isoflurane-ActavisPiramal Healthcare700211
Paraformaldehyd w proszku (PFA)Riedel-De Hä en16005toksyczna, łatwopalna
Pompa perfuzyjna PD5206Heidolph Instruments523-52060-00
Rurki laboratoryjne Masterflex Tygon, Ø 0,8 mmThermo Fischer Scientific06409-13
Igła do karmienia, prosta, 21 G, 1,75 mm końcówka oliwkowa, 40 mmAgnthos1036
Mikrotom do zamrażania Microm HM 400Thermo Fischer Scientific
24-dołkowe płytki wielodołkowe do hodowli komórkowychGreiner Bio-One662160
Immunohistochemia
Parowiec Tefal vitacuisineTefalVS 4001
Netwell 24 mm wkładki z siatki poliestrowejCorning3479wstępnie załadowane w 6-dołkowe płytki hodowlane
Wkładki membranowe z siatki poliestrowej Netwell 15 mmCorning3477wstępnie załadowany w 12-dołkowe płytki hodowlane
Plastikowy zestaw nośny 6-dołkowy NetwellCorning3521do wkładów membranowych z siatki poliestrowej 24 mm Plastikowy
zestaw nośny Netwell 12-dołkowy Corning3520do wkładów membranowych z siatki poliestrowej 15 mm
Zestaw Vectastain Elite ABCVector LaboratoriesPK-6100
DAB (hydrat tetrachlorowodorku 3,3&-diaminobenzydyny)Sigma-AldrichD-5637rakotwórczy, światłoczuły
Fluoromount-GSouthernBiotech0100-01
Przeciwciała pierwotne
Rabbit IgG1 α-Ki67Novocastra/ Leica BiosystemsNCL-L-Ki67MM1DAB 1:400/IF 1:100; wymaga pobrania epitopu
Królik α-GFAP, AS-3-GFSystemy synaptyczne173 0021:500
Kozia IgG (H+L) &alfa;-GFPPrzeciwciała AcrisR1091P1:300
Mysie IgG1 &alfa;-nestinAbcamab61421:200; wymaga pobrania epitopu
IgG świnki morskiej (H+L) α-DoublecortinMerck MilliporeAB22531:500
Szczur IgG2a α- BrdU (wodobrzusze)AbD Serotec/ Bio-RadOBT0030CXdo wykrywania BrdU; DAB 1:500/IF 1:400
Szczur IgG2a α-BrdU (oczyszczony)AbD Serotec/ Bio-RadOBT0030   do wykrywania CldU; DAB 1:500/IF 1:250-400
Mysz IgG1 α-NeuNMerck MilliporeMAB3771:500
mysz IgG1κ α-BrdUBD Biosciences347580Do wykrywania IdU; DAB 1:500/IF 1:350
Przeciwciała drugorzędowe
Osioł &alfa;-świnka morska IgG (H+L)-BiotynaDianova711-065-1521:500
Osioł &alfa;-szczur IgG (H+L)-BiotynaDianova712-065-1501:500
Osioł &alfa;-mysz IgG (H+L)-BiotynaDianova715-065-1511:500
Koza &alfa;-szczur IgG (H+L)-Alexa Fluor 488Sondy molekularneA110061:250
Osioł &alfa;-koza IgG (H+L)-Alexa Fluor 488Sondy molekularneA110551:250
Osioł &alfa;-mysz IgG (H+L)-FITC, Fab-FragmentDianova715-097-0031:100
Osioł &alfa;-mysz IgG (H+L)-Alexa Fluor 647Dianova715-605-1511:250
Osioł &alfa;-świnka morska IgG (H+L)-Alexa Fluor 647Dianova706-605-1481:250
Osioł &alfa;-szczur IgG (H+L)-Rhodamina Red-XDianova712-295-1501:250
Osioł &alfa;-królik IgG (H+L)-Rodamina Red-XDianova711-295-1521:250
Osioł &alfa;-świnka morska IgG (H+L)-Rhodamina Red-XDianova706-296-1481:250
Streptawidyna-rodamina Red-XDianova016-290-0841:500
Koza &alfa;-królik IgG (H+L)-AMCADianova111-155-1441:250, działa tylko z królikiem α-GFAP
Hoechst 33342Sondy molekularneH35701:1000
Sondy molekularneDAPID13061:1000
Blokowanie
Fab-fragment osioł &alfa-mysz IgG (H+L)Dianova715-007-0031:20
Fab-fragment osioł &alfa;-królik IgG (H+L)Dianova711-007-0031:20
Normalna surowica osłaMerck MilliporeS30
Normalna surowica królikaDianova011-000-010
Normalna surowica koziaDianova005-000-001
Albumina surowicy bydlęcejSigma-AldrichA7906
Histology
krezylowySigma-AldrichC5042
Neo-ClearMerck Millipore109843nietoksyczny substytut ksylenu
Neo-MountMerck Millipore109016trwałe podłoże montażowe
mikroskopia
Axioskop 2Carl Zeiss Mikroskopia
LSM 710Carl Zeiss Mikroskopia
fiolet

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kempermann, G., Jessberger, S., Steiner, B., Kronenberg, G. Milestones of neuronal development in the adult hippocampus. Trends Neurosci. 27 (8), 447-452 (2004).
  2. Ge, S., Sailor, K. A., Ming, G. L., Song, H. Synaptic integration and plasticity of new neurons in the adult hippocampus. J Physiol. 586 (16), 3759-3765 (2008).
  3. Ge, S., Yang, C. H., Hsu, K. S., Ming, G. L., Song, H. A critical period for enhanced synaptic plasticity in newly generated neurons of the adult brain. Neuron. 54 (4), 559-566 (2007).
  4. Castilla-Ortega, E., Pedraza, C., Estivill-Torrus, G., Santin, L. J. When is adult hippocampal neurogenesis necessary for learning? evidence from animal research. Rev Neurosci. 22 (3), 267-283 (2011).
  5. Deng, W., Aimone, J. B., Gage, F. H. New neurons and new memories: how does adult hippocampal neurogenesis affect learning and memory. Nat Rev Neurosci. 11 (5), 339-350 (2010).
  6. Encinas, J. M., Enikolopov, G. Identifying and quantitating neural stem and progenitor cells in the adult brain. Methods Cell Biol. 85, 243-272 (2008).
  7. Burns, K. A., Kuan, C. Y. Low doses of bromo- and iododeoxyuridine produce near-saturation labeling of adult proliferative populations in the dentate gyrus. Eur J Neurosci. 21 (3), 803-807 (2005).
  8. Cameron, H. A., McKay, R. D. Adult neurogenesis produces a large pool of new granule cells in the dentate gyrus. J Comp Neurol. 435 (4), 406-417 (2001).
  9. Vega, C. J., Peterson, D. A. Stem cell proliferative history in tissue revealed by temporal halogenated thymidine analog discrimination. Nat Methods. 2 (3), 167-169 (2005).
  10. Scholzen, T., Gerdes, J. The Ki-67 protein: from the known and the unknown. J Cell Physiol. 182 (3), 311-322 (2000).
  11. Brown, D. C., Gatter, K. C. Ki67 protein: the immaculate deception. Histopathology. 40 (1), 2-11 (2002).
  12. Yamaguchi, M., Saito, H., Suzuki, M., Mori, K. Visualization of neurogenesis in the central nervous system using nestin promoter-GFP transgenic mice. Neuroreport. 11 (9), 1991-1996 (2000).
  13. Kempermann, G., Kuhn, H. G., Gage, F. H. More hippocampal neurons in adult mice living in an enriched environment. Nature. 386 (6624), 493-495 (1997).
  14. Sicinski, P., et al. Cyclin D2 is an FSH-responsive gene involved in gonadal cell proliferation and oncogenesis. Nature. 384 (6608), 470-474 (1996).
  15. Ansorg, A., Witte, O. W., Urbach, A. Age-dependent kinetics of dentate gyrus neurogenesis in the absence of cyclin D2. BMC Neurosci. 13, 46(2012).
  16. Taupin, P. BrdU immunohistochemistry for studying adult neurogenesis: paradigms, pitfalls, limitations, and validation. Brain Res Rev. 53 (1), 198-214 (2007).
  17. Lewis Carl, S. A., Gillete-Ferguson, I., Ferguson, D. G. An indirect immunofluorescence procedure for staining the same cryosection with two mouse monoclonal primary antibodies. J Histochem Cytochem. 41 (8), 1273-1278 (1993).
  18. Burry, R. W. Controls for immunocytochemistry: an update. J Histochem Cytochem. 59 (1), 6-12 (2011).
  19. Tuttle, A. H., et al. Immunofluorescent detection of two thymidine analogues (CldU and IdU) in primary tissue. J Vis Exp. (46), 6-12 (2010).
  20. Miller, R. T., Swanson, P. E., Wick, M. R. Fixation and epitope retrieval in diagnostic immunohistochemistry: a concise review with practical considerations. Appl Immunohistochem. Mol Morphol. 8 (3), 228-235 (2000).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Sekwencyjna immunofluorescencjaanalog tymidynyprzetwarzanie tkanekmikroskopia konfokalnakwantyfikacja kom rekprzeciwcia a gatunk w gospodarzakom rki progenitorowe neuron w

Powiązane artykuły