Ten protokół opisuje, jak wykorzystać przejściowe ogrzewanie związane z optyczną absorpcją nanoprętów złota do stymulowania różnicowania i wewnątrzkomórkowej aktywności wapnia w komórkach neuronalnych. Wyniki te potencjalnie otwierają nowe zastosowania w protezach neuronalnych i podstawowych badaniach w neurobiologii.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Stymulacja optyczna komórek neuronalnych wspomagana złotem nanoprętami
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Ostatnie badania wykazały, że nerwy mogą być stymulowane na różne sposoby przez przejściowe ogrzewanie związane z absorpcją światła podczerwonego przez wodę w tkance neuronalnej. Technika ta ma ogromny potencjał do zastąpienia lub uzupełnienia standardowych technik stymulacji, ze względu na potencjał zwiększenia lokalizacji bodźca i zminimalizowania kontaktu mechanicznego z tkanką. Jednak podejścia optyczne są ograniczone przez niezdolność światła widzialnego do wnikania w głąb tkanek. Co więcej, modelowanie termiczne sugeruje, że skumulowane efekty ogrzewania mogą być potencjalnie niebezpieczne, gdy stosuje się wiele miejsc bodźca lub wysokie częstotliwości powtarzania lasera. Przedstawiony poniżej protokół opisuje ulepszone podejście do stymulacji komórek nerwowych w podczerwieni. Podstawowy mechanizm opiera się na przejściowym ogrzewaniu związanym z optyczną absorpcją nanoprętów złota, co może powodować wyzwalanie różnicowania komórek neuronalnych i zwiększony poziom wewnątrzkomórkowej aktywności wapnia. Wyniki te pokazują, że absorbery nanocząstek mogą usprawnić i/lub zastąpić proces stymulacji neuronalnej w podczerwieni oparty na absorpcji wody, z potencjałem do przyszłych zastosowań w protezach nerwowych i terapiach komórkowych.
Wprowadzenie
Ostatnie badania wykazały, że przejściowe ogrzewanie związane z absorpcją światła podczerwonego przez wodę (długość fali >1,400 nm) może być wykorzystane do indukowania potencjałów czynnościowych w tkance>nerwowej1 i wewnątrzkomórkowych przejściowych stanów wapnia w kardiomiocytach2. Zastosowanie światła podczerwonego wzbudziło duże zainteresowanie zastosowaniami w protezach neuronowych, ze względu na potencjalną lepszą rozdzielczość przestrzenną, brak bezpośredniego kontaktu z tkanką, minimalizację artefaktów stymulacji i wyeliminowanie potrzeby genetycznej modyfikacji komórek przed stymulacją (co jest wymagane w optogenetyce)1. Pomim....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
1. Przygotowanie nanoprętów Au
Uwaga: Au NRs można zsyntetyzować zgodnie z wieloma procedurami16 lub zakupić od dostawców komercyjnych.
- Zmierz początkową gęstość optyczną (OD) roztworu Au NR za pomocą spektroskopii UV-Vis, rejestrując wartości absorbancji w zakresie od 300 nm do 1 000 nm z rozdzielczością 0,5-2 nm. Dostosuj objętość roztworu do parametrów dostępnej kuwety.
- Oceń początkowe stężenie molowe NP odpowiednią techniką17 (np. spektroskopia UV-Vis, spektrometria mas z indukcyjnie sprzężonym plazmą dla pojedynczych cząstek, transmisyjna mikroskopia elektronowa) lub skorzystaj z war....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Stosując opisane tutaj protokoły 1, 2 i 3, zaobserwowano efekt stymulujący różnicowanie w komórkach neuronalnych NG108-15 hodowanych z Au NPs (Au NRs, Au NRs powleczone poli(styrenosulfonianem) oraz Au NRs powleczone krzemionką) po ekspozycji laserowej w zakresie od 1,25 do 7,5 W·cm−2 . Obrazy konfokalne Au NRs znakowanych rhodaminą B wykazały, że cząstki były internalizowane od 1. dnia inkubacji12. Lokalizację zaobserwowano głównie w cytoplazmie komórek, co wskazuje, że preferowanym mechanizmem pob.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Protokoły przedstawione w tej prezentacji opisują, w jaki sposób hodować, różnicować i optycznie stymulować komórki neuronalne za pomocą absorberów zewnętrznych. Charakterystyki NR (np. wymiary, kształt, długość fali rezonansu plazmonowego i skład chemiczny powierzchni) oraz parametry stymulacji laserowej (takie jak długość fali, długość impulsu, częstotliwość powtarzania itp.) mogą być zmieniane w celu dopasowania do różnych potrzeb eksperymentalnych. Wpływ na zachowanie komórek można monitorować za po.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają żadnych sprzecznych interesów, które mogliby ujawnić.
Podziękowania
Autorzy chcieliby podziękować NanoVentures Australia za wsparcie w finansowaniu podróży oraz prof. Johnowi Haycockowi za częściowe prowadzenie tych badań na Uniwersytecie w Sheffield oraz Pani Jaimee Mayne za jej pomoc podczas kręcenia filmu.
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Au NR | Sigma Aldrich | 716812 | |
| NG108-15 | Sigma Aldrich | 8811230 | |
| DMEM | Sigma Aldrich | D6546 | |
| FCS | Life Technologies | 10100147 | |
| L-glutamina | Sigma Aldrich | G7513 | |
| Penicylina/streptomycyna | Life Technologies | 15140122 | |
| Amfoterycyna B | Life Technologies | 15290018 | |
| Formaldehyd | Sigma Aldrich | F8775 | |
| Triton X-100 | BDH | T8532 | |
| BSA | Sigma Aldrich | A2058 | |
| Anti-β III-tubulina | Promega | G7121 | |
| TRITC-sprzężone przeciwciało anty-mysie IgG | Sigma Aldrich | T5393 | |
| DAPI | Invitrogen | D1306 | |
| Fluo-4 AM | Invitrogen | F14201 | |
| DMSO | Sigma Aldrich | 472301 | |
| Pluronic F-127 | Invitrogen | P6867 | |
| UV-Vis spektrometr | Varian Medical Systems Inc. | Wirówka Cary 50 Bio | |
| Mini | Eppendorf | Mini Spin | |
| Kąpiel soniczna | Unisonics Australia | FPX 10D | |
| Inkubator do hodowli komórkowych | Kendro | Hera Cell 150 | |
| Wirówka do hodowli komórkowych | Hettich | Rotofix 32A Dioda laserowa | |
| Optotech | 780 nm jednomodowa światłowód - sprzężony LD | ||
| Światłowód | Thorlabs | 780 HP | |
| Miernik mocy | Koherentny | test | |
| ImageJ | http://rsb.info.nih.gov/ij/index.html | ||
| Mikroskop epifluorescencyjny | Axon Instruments | ImageX-press 5000A | |
| μ-slide well | Ibidi | 80826 | |
| Odwrócony mikroskop konfokalny | Carl Mikroskopia Zeiss Sp. z o.o. | LSM 510 mikroskop | |
| Oscyloskop | Tektronix | TDS210 |
Bibliografia
- Richter, C. P., Matic, A. I., Wells, J. D., Jansen, E. D., Walsh, J. T. Neural stimulation with optical radiation. Laser. Photonics Rev. 5 (1), 68-80 (2011).
- Dittami, G. M., Rajguru, S. M., Lasher, R. A., Hitchcock, R. W., Rabbitt, R. D. Intracellular calcium transients evok....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
