Artykuł metodologiczny

Mozaikowa transgeneza danio pręgowanego do funkcjonalnej analizy genomowej kandydujących genów kooperacyjnych w patogenezie nowotworu

DOI:

10.3791/52567

⸱

31 marca 2015

 ,  ,  ,  , 
1Department of Molecular Pharmacology & Experimental Therapeutics, Mayo Clinic College of Medicine, Center for Individualized Medicine, 2Tufts University School of Medicine, 3Department of Biochemistry and Molecular Biology, Mayo Clinic

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Celem tego badania jest pokazanie, jak strategia transgenezy mozaiki może być wykorzystana u danio pręgowanego, aby szybko i skutecznie ocenić względny wkład wielu onkogenów w inicjację i progresję guza in vivo.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kompleksowa analiza genomiczna odkryła zaskakująco dużą liczbę zmian genetycznych w różnych typach nowotworów. Solidna i skuteczna identyfikacja onkogennych "czynników" wśród tych nowotworów i zdefiniowanie ich złożonych relacji z równoczesnymi zmianami genetycznymi podczas patogenezy nowotworu pozostaje trudnym zadaniem. Ostatnio danio pręgowany stał się ważnym modelem zwierzęcym do badania chorób ludzkich, głównie ze względu na ich łatwość utrzymania, wysoką płodność, oczywiste zalety obrazowania in vivo, wysoką ochronę onkogenów i ich szlaków molekularnych, podatność na nowotworzenie i, co najważniejsze, dostępność technik transgenicznych odpowiednich do stosowania u ryb. Transgeniczne modele raka danio pręgowanego są szeroko stosowane do analizy szlaków onkogennych w różnych typach nowotworów. Jednak opracowanie stabilnego modelu ryb transgenicznych jest zarówno żmudne, jak i czasochłonne, a jeszcze trudniejsze i bardziej czasochłonne jest przeanalizowanie współpracy wielu genów w patogenezie choroby przy użyciu tego podejścia, co wymaga wytworzenia wielu linii transgenicznych z nadekspresją poszczególnych genów będących przedmiotem zainteresowania, a następnie skomplikowanej hodowli tych stabilnych linii transgenicznych. W związku z tym zastosowanie mozaikowego przejściowego podejścia transgenicznego u danio pręgowanego oferuje wyjątkowe korzyści w funkcjonalnej analizie genomu in vivo. Krótko mówiąc, potencjalne transgeny mogą być wstrzykiwane do jednokomórkowych zarodków danio pręgowanego typu dzikiego lub transgenicznego i mogą integrować się razem z każdą komórką somatyczną w mozaikowy wzór, który prowadzi do mieszanych genotypów u tego samego, pierwotnie wstrzykniętego zwierzęcia. Pozwala to na szybsze i tańsze zbadanie, czy i w jaki sposób geny kandydujące mogą ze sobą współpracować, aby napędzać nowotworzenie nowotworów. Poprzez przejściową nadekspresję aktywowanego ALK w transgenicznych rybach z nadekspresją MYCN, wykazujemy tutaj współpracę tych dwóch onkogenów w patogenezie nowotworu dziecięcego, nerwiaka zarodkowego, który oparł się większości form współczesnego leczenia.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nowotwory są postępującymi chorobami, charakteryzującymi się kumulacją patologicznych mutacji, delecji i przyrostów chromosomów w czasie. Te nieprawidłowości genetyczne mogą wpływać na wiele procesów komórkowych, począwszy od cyklu komórkowego, śmierci komórki, metabolizmu energetycznego i montażu cytoszkieletu, a skończywszy na reakcjach stresowych, takich jak niedotlenienie. W związku z tym nowotworzenie odzwierciedla zbiorowe działania wielu aberracji genetycznych w całym spektrum procesów biologicznych. Ostatnie integracyjne badania genomiczne, w tym sekwencjonowanie całego genomu, sekwencjonowanie egzomu, sekwencjonowanie celowane, głębokie sekwencjonowanie i badania asocjacyjne całego genomu, zidentyfikowały rosnącą liczbę nowych zmian genetycznych w zasadniczo wszystkich typach nowotworów 1-4. W wielu przypadkach zmiany genetyczne występują razem w sposób nielosowy 5-8, co sugeruje ich współpracę w patogenezie choroby. Analiza onkogennych ról szerokiego wachlarza genów o nieprawidłowej ekspresji wynikających z tych zmian genomowych jest niezbędna do opracowania nowych strategii terapeutycznych i zrozumienia reakcji komórek nowotworowych na te czynniki, ale okazało się to zniechęcającym zadaniem, wymagającym bardzo solidnych systemów modeli zwierzęcych do przeprowadzenia wysokoprzepustowej funkcjonalnej analizy genomowej in vivo.

Chociaż ssaki, zwłaszcza gryzonie, są ulubionymi modelami w biologii raka, danio pręgowany zaczął przyciągać znaczną uwagę. Danio pręgowany teleost (Dario rerio) był używany jako organizm modelowy do badań rozwojowych od 1960 roku i po raz pierwszy został zastosowany do badania patogenezy nowotworu w 1982 roku. Łatwość konserwacji, mały rozmiar ciała i wysoka płodność sprawiają, że danio pręgowany jest solidnym modelem do przeprowadzania na dużą skalę badań genetycznych w celu identyfikacji mutacji, które nadają nieprawidłowe i patologiczne fenotypy 10. Przezroczystość optyczna zarodków danio pręgowanego jest kolejną kluczową cechą wspierającą szersze zastosowanie tego modelu nowotworu, ponieważ umożliwia ona przeprowadzanie obrazowania in vivo w celu zlokalizowania rozwoju guza w czasie rzeczywistym 9, co jest stosunkowo trudne u gryzoni 12 . Niedawna analiza genomiki porównawczej genomu referencyjnego danio pręgowanego (Zv9) ujawniła 26 206 genów kodujących białka, z których 71% ma ludzkie ortologie, z czego 82% jest skorelowanych z genami związanymi z chorobą w internetowej bazie danych dziedziczenia mendlowego u człowieka (OMIM) 13,14. W związku z tym danio pręgowany został wykorzystany do modelowania różnych typów nowotworów u ludzi, w tym nerwiaka zarodkowego 8, ostrej białaczki limfoblastycznej z komórek T (T-ALL) 15,16, czerniaka 17,18, mięsaka Ewinga 19, mięsaka prążkowanokomórkowego 20,21, raka trzustki 22, raka wątrobowokomórkowego 23 i nowotworów szpiku 24,25 i został wybrany jako model raka do badań ksenotransplantacyjnych 11,26.

Stabilne podejście transgeniczne u danio pręgowanego jest powszechnie stosowane do badania wpływu wzmocnienia funkcji genów na prawidłowy rozwój lub patogenezę choroby 27,28. Aby opracować taki model (ryc. 1A), wstrzykuje się konstrukt DNA zawierający interesujący gen napędzany przez specyficzny tkankowo promotor do jednokomórkowych zarodków typu dzikiego. Trzy do czterech miesięcy po wstrzyknięciu, gdy wstrzyknięte zarodki osiągną dojrzałość płciową, są krzyżowane z rybami typu dzikiego w celu przeprowadzenia badań przesiewowych w poszukiwaniu tych, które wykazują integrację konstruktu DNA w ich linii zarodkowej, co pozwala im być rybami założycielskimi. Wiele czynników, takich jak liczba kopii i miejsce integracji transgenu, wpływa na ekspresję transgenu w stabilnych liniach transgenicznych. Tak więc, aby opracować transgeniczny model guza, wiele stabilnych linii transgenicznych z nadekspresją pojedynczego onkogenu musi zostać najpierw wygenerowanych i przebadanych pod kątem linii wyrażającej transgen na poziomie, który może prowadzić do indukcji guza. Jeśli jednak nadekspresja kandydującego onkogenu jest toksyczna dla komórek rozrodczych, trudno jest wygenerować stabilną linię transgeniczną poprzez bezpośrednią nadekspresję transgenu 29. W związku z tym takie podejście może być czasochłonne, z dużym ryzykiem niepowodzenia w wygenerowaniu odpowiedniego modelu nowotworu.

Tutaj ilustrujemy alternatywną strategię opartą na mozaikowej transgenezie przejściowej (Rysunek 1B), która zapewnia unikalne zalety w porównaniu z tradycyjną stabilną transgenezą dla funkcjonalnych badań genomowych in vivo. W tym podejściu jeden lub więcej konstruktów transgenowych jest wstrzykiwanych do stadium jednokomórkowego zarodków transgenicznych lub dzikich. Wstrzyknięte konstrukty DNA zawierające transgeny są następnie mozaikowo i losowo integrowane z pierwotną wstrzykniętą rybą, co skutkuje mieszanymi genotypami w wielu populacjach komórek u poszczególnych ryb 30. Co więcej, koiniekcja wielu konstruktów DNA w zarodkach jednokomórkowych prowadzi do kointegracji z tą samą komórką w losowych miejscach, co pozwala na śledzenie komórek z ekspresją transgenów i badanie interakcji różnych genów podczas patogenezy choroby u zwierząt mozaikowych 31. Jako dowód zasady, przejściowo nadekspresjonowaliśmy aktywowany mutacyjnie ALK (F1174L) z genem reporterowym mCherry w obwodowym współczulnym układzie nerwowym (PSNS) pod kontrolą promotora dopaminy beta hydroksylazy (dβh) u ryb typu dzikiego i ryb transgenicznych z nadekspresją MYCN. ALK, który koduje receptorową kinazę tyrozynową, jest najczęściej zmutowanym genem w nerwiaku zarodkowym wysokiego ryzyka 5-7,32,33. ALK (F1174L), jako jedna z najczęstszych i najsilniejszych mutacji aktywujących somatykę, jest nadreprezentowany u pacjentów z nerwiakiem zarodkowym wysokiego ryzyka amplifikowanym przez MYCN i działa synergistycznie z nadekspresją MYCN w celu przyspieszenia nowotworzenia nerwiaka zarodkowego zarówno w stabilnych transgenicznych myszach, jak i transgenicznych modelach danio pręgowanego 8,34,35. Poprzez mozaikową przejściową nadekspresję ALK (F1174L) z mCherry u transgenicznych ryb MYCN, podsumowaliśmy przyspieszenie początku guza obserwowane u stabilnych ryb transgenicznych z nadekspresją zarówno ALK (F1174L), jak i MYCN, co sugeruje, że strategia transgenezy mozaiki może być wykorzystana do szybkiej i skutecznej oceny względnego wkładu wielu onkogenów w inicjację guza in vivo.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

UWAGA: Wszystkie badania nad danio pręgowanymi i utrzymaniem zwierząt zostały przeprowadzone zgodnie z zatwierdzonym przez IACUC protokołem Mayo Clinic Institute # A41213.

1. Konstrukty DNA do transgenezy

  1. Amplifikuj regionpromotora 8 promotora beta-hydroksylazy dopaminy (dβh) o pojemności 5,2 kb, używając klonu CH211-270H11 BAC (z centrum zasobów BACPAC (BPRC)) jako matrycy DNA. Należy użyć systemu PCR odpowiedniego do długiej i dokładnej amplifikacji PCR długich matryc DNA oraz następujących programów cykli dla PCR: 94 °C przez 2 min, 10 cykli (94 °C, 15 sekund, 50 °C, 30 sekund, 68 °C, 8 min), a następnie 30 cykli (94 °C, 15 sekund, 53 °C, 30 sekund, 68 °C, 8 min), 68 °C, 4 min (starter do przodu 5'-GGGGAACTTTGTATAAAAGTTGGCGTACTCCCCCTTTTTAGG-3' i starter wsteczny 5'- GGGGACTGCTTTTTTTTGTACAAACTTGTTTGCTTGTCTTTTGA-3').
  2. Utwórz klon wejściowy dβh-pDONRP4-P1R 8 przy użyciu komercyjnego systemu klonowania rekombinowanego, takiego jak brama wielostanowiskowa. Wymieszaj 1 μl oczyszczonego produktu dβh PCR (172 ng/μl), 1 μl (150 ng/μl) wektora dawcy pDONRP4-P1R (wraz z innymi wektorami bramy są hojnymi prezentami od dr Chi-Bin Chien, Univ. of Utah), 4 μl buforu TE (pH 8,0) z 2 μl mieszanki enzymów klonazy BP, inkubować przez 1 godzinę w temperaturze 25 °C, a następnie przekształcić w E. coli kompetentne dla One Shot TOP10 zgodnie z protokołem producenta.
  3. Wygeneruj transgeniczny konstrukt dβh:EGFP-MYCN 8 przy użyciu rekombinowanego systemu klonowania, o którym mowa w kroku 1.2. Wymieszaj 1 μl każdego wejściowego klonu (150 ng / μl ), w tym 5,2 kb promotora dβh (konstrukt dβh-pDONR P4-P1R), EGFP bez kodonu stop (konstrukt pME-EGFP) i ludzkiego cDNA MYCN (hojny dar od dr Hogarty ze Szpitala Dziecięcego w Pensylwanii, konstrukt MYCN-pDONRP2R-P3), 1 μl (150 ng/μl ) zmodyfikowanego wektora docelowego zawierającego I-SceI miejsca rozpoznania (hojny dar od dr C. Grabhera, Instytut Technologii w Karlsruhe, Karlsruhe, Niemcy), 4 μl buforu TE (pH 8,0) z 2 μl mieszaniny enzymów LR Clonase, inkubować przez 1 godzinę w temperaturze 25 °C, a następnie przekształcić w chemicznie kompetentne E. coli, takie jak One shot top 10 i postępować zgodnie z protokołem producenta.
  4. Stwórz transgeniczny konstrukt mitf:mitf 8 poprzez trawienie wektora PNP-mitf (hojny dar od dr D. Raible'a z Uniwersytetu Waszyngtońskiego) za pomocą enzymów restrykcyjnych NotI i SalI przez 2 godziny w RT oraz przez subklonowanie uwolnionego fragmentu DNA o długości 2,65 kb, który zawiera promotor mitf i sekwencję kodującą genu mitf danio pręgowanego do miejsc NotI i MluI zmodyfikowanego wektora pBluescript zawierającego flankujące I-SceI miejsca rozpoznawania (hojny dar od dr Hui Feng z Uniwersytetu Bostońskiego), przy użyciu ligazy DNA T4 zgodnie z protokołem producenta.
    UWAGA: Aby zwiększyć wydajność generowania stabilnych linii eksprymujących MYCN, dβh:EGFP-MYCN i konstrukty DNA mitf:mitf są wstrzykiwane do jednokomórkowych zarodków masy perłowej. Masa perłowa oznacza rodzaj zmutowanej ryby, która podczas rozwoju nie ma melanoforu pochodzącego z grzebienia nerwowego 36. Tak więc pojawienie się komórek barwnikowych w wstrzykniętych zarodkach sugeruje integrację konstruktów DNA mitf:mitf z genomem. Wykazano, że dwa lub trzy współwstrzykiwane konstrukty DNA mogą być jednocześnie zintegrowane z genomem ryb 31. Tak więc pigmentacja spowodowana ekspresją mitf może służyć jako marker do integracji transgenu dβh:EGFP-MYCN i do łatwiejszej identyfikacji stabilnej linii transgenicznej MYCN.
  5. Zmieszać konstrukty DNA dβh:EGFP-MYCN i mitf:mitf w stosunku 3:1 w całkowitej objętości reakcji 15 μl z 1 μl enzymu I-SceI i 0,75 μl buforu. Upewnij się, że całkowita ilość DNA w reakcji nie przekracza 750 ng.
  6. Przeprowadzić wytrawianie I-SceI w temperaturze pokojowej przez 4 godziny lub O/N. Drugiego dnia DNA trawione przez I-SceI jest gotowe do mikroiniekcji lub może być przechowywane w temperaturze -20 °C do wstrzyknięcia w przyszłości. Enzym I-SceI należy przechowywać w temperaturze -80 °C w małych porcjach, aby utrzymać jego wydajność enzymatyczną.
  7. Subklonować ludzki ALKF1174L i gen ALK typu dzikiego z wektora PCDNA3 (hojny dar od dr George'a z Dana-Farber Cancer Institute) 7 do miejsc EcoRI i NotI wektora pENTRY1A (hojny dar od dr C. Grabhera, Karlsruhe Institute of Technology, Karlsruhe, Niemcy) za pomocą ligazy DNA T4 zgodnie z protokołem producenta.
  8. Wygeneruj transgeniczne konstrukty dβh:ALKF1174L lub dβh:ALKWT przy użyciu układu rekombinowanego, jak wspomniano w Protokole 1.2. Krótko mówiąc, połącz trzy klony wejściowe, dβh-pDONRP4-P1R, ALKF1174L-pENTRY1A (lub ALKWT-pENTRY1A) i p3E-polyA, w zmodyfikowany wektor docelowy zawierający miejsca rozpoznawania I-SceI (hojny dar od dr C. Grabhera, Karlsruhe Institute of Technology, Karlsruhe, Niemcy), używając mieszanki enzymów LR Clonase, zgodnie z protokołem producenta.
  9. Wymieszaj konstrukty DNA dβh: ALKF1174L (lub dβh:ALKWT) i dβh:mCherry w stosunku 3:1 i zlinearyzuj je enzymem I-SceI, jak opisano w PROTOKOLE 1.5-1.6.

2. Mikroiniekcja

  1. Do wszystkich wstrzyknięć należy używać szklanych mikropipet o średnicy 1,0 mm 37. Przed wstrzyknięciem należy odłamać końcówkę szklanych mikropipet żyletką. Skalibrować objętość wtrysku, wstrzykującH2Odo kropli oleju mineralnego. Zmierz średnicę powstałych kropelek i wyreguluj mikrowstrzykiwacz (ciśnienie lub czas trwania impulsu ciśnienia), aby upewnić się, że objętość wstrzyknięcia jest mniejsza niż 10% całkowitej objętości komórek jednego zarodka w stadium komórkowym.
  2. Dodać dodatkowe 0,5 μl świeżego enzymu I-SceI (5 jednostek/μl) do 5 μl roztworu iniekcyjnego zawierającego konstrukty DNA tuż przed wstrzyknięciem, aby zwiększyć skuteczność transgenezy 38. Wstrzyknij 50-80 pg zlinearyzowanych konstruktów DNA do cytoplazmy zarodków w stadium jednokomórkowym. Aby zapewnić powodzenie wstrzyknięcia, wymieszaj próbkę z 0,25% czerwienią fenolową w celu wizualizacji. Jeśli komórki zmienią kolor na czerwony po wstrzyknięciu, oznacza to, że mikroiniekcja się powiodła. Aby zapewnić wysoki wskaźnik sukcesu w hodowli ryb transgenicznych, zazwyczaj wstrzykujemy do 500 zarodków.
  3. Aby wygenerować transgeniczne ryby o stabilnej ekspresji MYCN, należy wstrzyknąć zlinearyzowane konstrukty DNA dβh: EGFP-MYCN i mitf: mitf (w stosunku 3: 1) do zarodków pigmentowanego zmutowanego masy perłowej danio pręgowanego w stadium jednokomórkowym. Ekspresja Mitf służy jako reporter do integracji konstruktów transgenicznych w genomie ryby.
  4. W celu mozaikowej nadekspresji ALK w transgenicznych zarodkach typu dzikiego lub MYCN, należy jednocześnie wstrzyknąć zlinearyzowaną dβh:ALK F1174L (lub dβh:ALKWT) z konstruktami DNA dβh:mCherry (w stosunku 3:1) do zarodków jednokomórkowych powstałych w wyniku hodowli heterozygotycznych ryb transgenicznych F1 Tg(dβh:EGFP-MYCN) z rybami AB typu dzikiego. Tak więc połowa potomstwa jest transgeniczna dla MCYN, a połowa jest typu dzikiego.

3. Ekran dla stabilnych lub mozaikowych ryb transgenicznych

  1. Aby zwiększyć skuteczność identyfikacji stabilnych linii wykazujących ekspresję MYCN, należy znieczulić głównie wstrzyknięte zarodki masy perłowej trikainą (0,02%) w 3-5 dniach po zapłodnieniu i przeprowadzić badanie przesiewowe pod kątem pigmentacji. Przenieś zarodki z pigmentacją na nową szalkę Petriego ze świeżą wodą z jaj i podnieś je do dojrzałości płciowej w celu dalszego badania przesiewowego dla ryb założycielskich, które przenoszą transgen dβh:EGFP-MYCN w komórkach rozrodczych.
  2. Aby zidentyfikować założyciela z transmisją EGFP-MYCN w linii zarodkowej, krzyżuj dorosłe ryby F0 z rybami AB typu dzikiego i przesiewaj zarodki EGFP-dodatnie 1-2 dni po zapłodnieniu w celu dalszego genotypowania. Umieść pojedynczy zarodek F1 z dodatnim wynikiem EGFP w probówce PCR i usuń cały płyn. Dodać 50 μl buforu ekstrakcyjnego gDNA, który zawiera 12,5 μl 4x buforu do lizy, 35 μlH2Oi 2,5 μl proteinazy K (10 mg/ml) do pojedynczego zarodka. Inkubować reakcję przez 2-3 godziny w temperaturze 55 °C, a następnie 10 minut inkubacji w temperaturze 98 °C w celu inaktywacji proteinazy K. Aby przygotować 50 ml 4x buforu do lizy, dodaj 500 μl 1M Tris (pH 8,4), 2,5 ml 1M KCl do 47 ml H2O. UWAGA: Po tym, jak stabilne ryby transgeniczne F0 MYCN zostaną wyhodowane z rybami AB typu dzikiego, całe potomstwo jest pigmentowane. W związku z tym pigmentacja nie może służyć jako marker do identyfikacji ryb MYCN-dodatnich. Podczas gdy w transgenicznych ryb białko fuzyjne EGFP-MYCN ulega ekspresji w PSNS, w tym w neuronach współczulnych górnych zwojów szyjnych i sekwencyjnych segmentowych zwojach łańcucha współczulnego oraz neuronach dopaminergicznych nie-PSNS, takich jak rdzeń przedłużony i zwoje czaszki 8. Tak więc ekspresja EGFP może służyć jako marker do identyfikacji stabilnych zarodków transgenicznych MYCN.
  3. Użyj 2 μl gDNA wyekstrahowanego z pigmentowanego zarodka F1 jako matrycy, startery MYCN-test F1: 5'-CTG CTT GAG AAC GAG CTG TG-3'; MYCN-R3: 5'-AGG CAT CGT TTG AGG ATC AG-3' oraz następujący program z systemem GC-RICH PCR: 1 cykl 95 °C przez 3 min, 25 cykli 95 °C przez 30 sekund, 58 °C przez 30 sekund i 72 °C przez 3 min. Zazwyczaj genotyp 14-16 pigmentowanych zarodków z pojedynczego krycia, aby potwierdzić obecność zintegrowanego transgenu MYCN w pigmentowanych zarodkach, tą metodą zidentyfikowano ponad 6 ryb założycielskich z nadekspresją mitf i MYCN.
  4. Podnieś pozostałą część zarodków F1 z dodatnim EGFP. Przytnij je płetwy i genotypuj w wieku 2-3 miesięcy przy użyciu powyższego protokołu, aby dodatkowo potwierdzić integrację transgenu MYCN z rybami. Hoduj stabilne ryby transgeniczne F1 MYCN z rybami AB typu dzikiego. Jednocześnie wstrzyknąć zlinearyzowane dβh:ALK F1174L (lub dβh:ALKWT) z konstruktami DNA dβh:mCherry do zarodków jednokomórkowych, jak opisano w PROTOKOLE 2.4.
  5. Sortować zarodki wykazujące ekspresję MYCN w eksperymencie opisanym w PROTOKOLE 2.4 za pomocą stereoskopowego mikroskopu fluorescencyjnego i badać zarodki, którym wstrzyknięto pierwotnie, w dniach 1-3 po zapłodnieniu pod kątem ekspresji EGFP-MYCN w PSNS. Następnie, w ciągu 2-5 dni po zapłodnieniu, znieczulić zarodki trikainą (0,02%) i ponownie posortować te zarodki MYCN-dodatnie lub ujemne na podstawie ekspresji mCherry w PSNS za pomocą stereoskopowego mikroskopu fluorescencyjnego. Ekspresja mCherry służy jako marker koekspresji ALK w tkankach mozaiki, której wstrzyknięto pierwotnie.
    UWAGA: ~ 600 potomstwu powstałemu w wyniku hodowli stabilnych ryb transgenicznych MYCN z rybami typu dzikiego wstrzyknięto na grupę ze zlinearyzowanymi konstruktami DNA, w tym odpowiednio dβh: ALK F1174L i dβh: mCherry, dβh: ALKWT i dβh: mCherry lub dβh: mCherry. Mozaikową ekspresję mCherry można zaobserwować u 70-90% ryb wstrzykiwanych pierwotnie. Od połowy do jednej trzeciej wstrzykniętych ryb przeżyło przez stadium larwy w celu obserwacji guza.
  6. Wyhoduj wszystkie zarodki mCherry + MYCN + i mCherry + MYCN- zgodnie ze standardowymi protokołami z książki danio pręgowanego 39 i monitoruj początek nowotworu począwszy od 5 tygodni po zapłodnieniu.

4. Zegarek nowotworowy w mozaice transgenicznych ryb

  1. Monitoruj mCherry-dodatnie, głównie wstrzykiwane ryby co 2 tygodnie, począwszy od 5 tygodni po zapłodnieniu, pod kątem dowodów na początek nowotworu.
  2. Znieczulenie ryb trikainą (0,02%) i badanie przesiewowe na obecność guzów wykazujących ekspresję mCherry i EGFP w PSNS pod stereoskopowym mikroskopem fluorescencyjnym Nikon SMZ-1500 wyposażonym w cyfrowy celownik kamery DS-U1.
  3. Aby potwierdzić, czy guzy wykazują ekspresję transgenu ALK, należy wyizolować masy mCherry i EGFP dodatnie do genotypowania ALK PCR.
  4. Za pomocą PCR amplifikować genomowe DNA wyekstrahowane z rozwiniętych nowotworów za pomocą następujących starterów: ALK P7: 5'-AGG CCA GGT GTC CGG AAT GC-3' i ALK P18: 5'-TGT CTT CAG GCT GCT GAT GTT GC-3' i następująca reakcja PCR: 1 cykl w temperaturze 94 °C przez 5 min, 30 cykli (94 °C przez 30 sekund, 55 °C przez 30 sekund i 72 °C przez 60 sekund). Następnie zsekwencjonuj produkt PCR ze starterem ALK P7, aby dodatkowo potwierdzić istnienie zmutowanego lub dzikiego ALK w guzach mCherry-dodatnich.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aby zbadać, czy nadekspresja mutacjalnie aktywowanego ALKF1174L lub ALK typu dzikiego może współpracować z MYCN w indukcji nerwiaka zarodkowego, nadeksprymowaliśmy albo aktywowany ludzki ALK, albo ALK typu dzikiego pod kontrolą promotora dβh w PSNS transgenicznych ryb z nadekspresją MYCN. Każdy z następujących konstruktów, dβh-ALKF1174L lub dβh-ALKWT, wstrzykiwano jednocześnie z dβh-mCherry do jednokomórkowych zaro...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W tym reprezentatywnym badaniu zastosowaliśmy przejściową koiniekcję i koekspresję aktywowanego ALK z genem reporterowym mCherry u transgenicznych ryb eksprymujących MYCN, aby pokazać, że geny te współpracują w celu znacznego przyspieszenia wystąpienia nerwiaka zarodkowego, zgodnie z naszym poprzednim odkryciem w stabilnych złożach transgenicznych ryb koeksprymujących zarówno aktywowany ALK , jak i MYCN 8. To mozaikowe podejście transgeniczne ma kilka wyraźnych zale...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Doceniamy dr Jeong-soo Lee za podzielenie się z nami transgeniczną rybą Tg(dbh:EGFP-MYCN) w naszym badaniu. Praca ta została wsparta grantem 1K99CA178189-01 z National Cancer Institute, stypendium z Pablove Foundation i Friends for Life oraz nagrodami dla młodych badaczy od Alex's Lemonade Stand Foundation i CureSearch for Children's Cancer Foundation.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Rozwiń system PCR z długimi szablonami Roche Applied Science, IN11681834001
wektor pCR-TOPO Invitrogen, CA451641
Ligaza DNA T4New England Biolabs, MAM0202M
Brama LR Enzym klonazy II
Mix		Invitrogen, CA11791-100
Gateway® BP Klonaza® II mieszanka enzymatycznaInvitrogen, CA11789-020
System PCR BOGATY w GC Roche Applied Science, IN12 140 306 001
Meganukleaza SceI New England Biolabs, MAR0694S Stereoskopowy
mikroskop fluorescencyjny Nikon SMZ-1500 Nikon, Nowy Jork
Celownik cyfrowy Nikon DS-U1 Aparatfotograficzny Nikon, Nowy Jork

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Tenesa, A., Dunlop, M. G. New insights into the aetiology of colorectal cancer from genome-wide association studies. Nat Rev Genet. 10 (6), 353-358 (2009).
  2. Maher, B. Exome sequencing takes centre stage in cancer profiling. Nature. 459 (7244), 146-147 (2009).
  3. Meyerson, M., Gabriel, S., Getz, G. Advances in understanding cancer genomes through second-generation sequencing. Nat Rev Genet. 11 (10), 685-696 (2010).
  4. Chung, C. C., Chanock, S. J. Current status of genome-wide association studies in cancer. Hum Genet. 130 (1), 59-78 (2011).
  5. Mosse, Y. P., et al. Identification of ALK as a major familial neuroblastoma predisposition gene. Nature. 455 (7215), 930-935 (2008).
  6. Janoueix-Lerosey, I., et al. Somatic and germline activating mutations of the ALK kinase receptor in neuroblastoma. Nature. 455 (7215), 967-970 (2008).
  7. George, R. E., et al. Activating mutations in ALK provide a therapeutic target in neuroblastoma. Nature. 455 (7215), 975-978 (2008).
  8. Zhu, S., et al. Activated ALK Collaborates with MYCN in Neuroblastoma Pathogenesis. Cancer Cell. 21 (3), 362-373 (2012).
  9. White, R., Rose, K., Zon, L. Zebrafish cancer: the state of the art and the path forward. Nat Rev Cancer. 13 (9), 624-636 (2013).
  10. Amatruda, J. F., Patton, E. E. Genetic models of cancer in zebrafish. Int Rev Cell Mol Biol. 271, 1-34 (2008).
  11. Konantz, M., et al. Zebrafish xenografts as a tool for in vivo studies on human cancer. Ann N Y Acad Sci. 1266, 124-137 (2012).
  12. Ellenbroek, S. I., van Rheenen, J. Imaging hallmarks of cancer in living mice. Nat Rev Cancer. 14 (6), 406-418 (2014).
  13. Kettleborough, R. N., et al. A systematic genome-wide analysis of zebrafish protein-coding gene function. Nature. 496 (7446), 494-497 (2013).
  14. Howe, K., et al. The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome. Nature. 496 (7446), 498-503 (2013).
  15. Langenau, D. M., et al. Myc-induced T cell leukemia in transgenic zebrafish. Science. 299 (5608), 887-890 (2003).
  16. Feng, H., et al. T-lymphoblastic lymphoma cells express high levels of BCL2, S1P1, and ICAM1, leading to a blockade of tumor cell intravasation. Cancer Cell. 18 (4), 353-366 (2010).
  17. Patton, E. E., et al. BRAF mutations are sufficient to promote nevi formation and cooperate with p53 in the genesis of melanoma. Current biology : CB. 15 (3), 249-254 (2005).
  18. Santoriello, C., Anelli, V., Alghisi, E., Mione, M. Highly penetrant melanoma in a zebrafish model is independent of ErbB3b signaling. Pigment Cell Melanoma Res. 25 (2), 287-289 (2012).
  19. Leacock, S. W., et al. A zebrafish transgenic model of Ewing's sarcoma reveals conserved mediators of EWS-FLI1 tumorigenesis. Dis Model Mech. 5 (1), 95-106 (2012).
  20. Le, X., et al. Heat shock-inducible Cre/Lox approaches to induce diverse types of tumors and hyperplasia in transgenic zebrafish. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (22), 9410-9415 (2007).
  21. Langenau, D. M., et al. Effects of RAS on the genesis of embryonal rhabdomyosarcoma. Genes & development. 21 (11), 1382-1395 (2007).
  22. Park, S. W., et al. Oncogenic KRAS induces progenitor cell expansion and malignant transformation in zebrafish exocrine pancreas. Gastroenterology. 134 (7), 2080-2090 (2008).
  23. Zheng, W., et al. Xmrk, kras and myc transgenic zebrafish liver cancer models share molecular signatures with subsets of human hepatocellular carcinoma. PLoS One. 9 (3), e91179(2014).
  24. Forrester, A. M., et al. NUP98-HOXA9-transgenic zebrafish develop a myeloproliferative neoplasm and provide new insight into mechanisms of myeloid leukaemogenesis. British journal of haematology. 155 (2), 167-181 (2011).
  25. Alghisi, E., et al. Targeting oncogene expression to endothelial cells induces proliferation of the myelo-erythroid lineage by repressing the Notch pathway. Leukemia. 27 (11), 2229-2241 (2013).
  26. Veinotte, C. J., Dellaire, G., Berman, J. N. Hooking the big one: the potential of zebrafish xenotransplantation to reform cancer drug screening in the genomic era. Dis Model Mech. 7 (7), 745-754 (2014).
  27. Patton, E. E., Zon, L. I. The art and design of genetic screens: zebrafish. Nat Rev Genet. 2 (12), 956-966 (2001).
  28. Lieschke, G. J., Currie, P. D. Animal models of human disease: zebrafish swim into view. Nat Rev Genet. 8 (5), 353-367 (2007).
  29. Igoucheva, O., Alexeev, V., Yoon, K. Differential cellular responses to exogenous DNA in mammalian cells and its effect on oligonucleotide-directed gene modification. Gene Ther. 13 (3), 266-275 (2006).
  30. Koster, R. W., Fraser, S. E. Tracing transgene expression in living zebrafish embryos. Dev Biol. 233 (2), 329-346 (2001).
  31. Langenau, D. M., et al. Co-injection strategies to modify radiation sensitivity and tumor initiation in transgenic Zebrafish. Oncogene. 27 (30), 4242-4248 (2008).
  32. Chen, Y., et al. Oncogenic mutations of ALK kinase in neuroblastoma. Nature. 455 (7215), 971-974 (2008).
  33. Pugh, T. J., et al. The genetic landscape of high-risk neuroblastoma. Nature genetics. , (2013).
  34. Berry, T., et al. The ALK(F1174L) mutation potentiates the oncogenic activity of MYCN in neuroblastoma. Cancer Cell. 22 (1), 117-130 (2012).
  35. Heukamp, L. C., et al. Targeted expression of mutated ALK induces neuroblastoma in transgenic mice. Sci Transl Med. 4 (141), 141ra191(2012).
  36. Lister, J. A., Robertson, C. P., Lepage, T., Johnson, S. L., Raible, D. W. nacre encodes a zebrafish microphthalmia-related protein that regulates neural-crest-derived pigment cell fate. Development. 126 (17), 3757-3767 (1999).
  37. Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. J Vis Exp. (25), (2009).
  38. Thermes, V., et al. I-SceI meganuclease mediates highly efficient transgenesis in fish. Mech Dev. 118 (1-2), 91-98 (2002).
  39. Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev Dyn. 203 (3), 253-310 (1995).
  40. Urasaki, A., Asakawa, K., Kawakami, K. Efficient transposition of the Tol2 transposable element from a single-copy donor in zebrafish. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (50), 19827-19832 (2008).
  41. Caneparo, L., Pantazis, P., Dempsey, W., Fraser, S. E. Intercellular bridges in vertebrate gastrulation. PLoS One. 6 (5), e20230(2011).
  42. Ivics, Z., Izsvak, Z. The expanding universe of transposon technologies for gene and cell engineering. Mob DNA. 1 (1), 25(2010).
  43. Tang, Q., et al. Optimized cell transplantation using adult rag2 mutant zebrafish. Nat Methods. 11 (8), 821-824 (2014).
  44. Watson, I. R., Takahashi, K., Futreal, P. A., Chin, L. Emerging patterns of somatic mutations in cancer. Nat Rev Genet. 14 (10), 703-718 (2013).
  45. Sander, J. D., et al. Targeted gene disruption in somatic zebrafish cells using engineered TALENs. Nat Biotechnol. 29 (8), 697-698 (2011).
  46. Sander, J. D., Joung, J. K. CRISPR-Cas systems for editing, regulating and targeting genomes. Nat Biotechnol. 32 (4), 347-355 (2014).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Mozaikowa transgenezaszlaki onkogennetransgeniczne modele rybek danio ostrop etwychnadekspresja gen wmodel neuroblastomaobrazowanie in vivo

Powiązane artykuły