Wysokoprzepustowe badania przesiewowe pod kątem chemicznych modulatorów genów regulowanych potranskrypcyjnie

Summary

Tutaj opisujemy komórkowy test genu reporterowego jako cenne narzędzie do badania bibliotek chemicznych pod kątem związków modulujących mechanizmy kontroli potranskrypcyjnej wywieranej przez 3' UTR.

Abstract

Zarówno regulacja transkrypcyjna, jak i potranskrypcyjna mają ogromny wpływ na ekspresję genów. Jednak powszechnie stosowane testy przesiewowe oparte na komórkach koncentrują się na regulacji transkrypcji, mając zasadniczo na celu identyfikację cząsteczek ukierunkowanych na promotor. W rezultacie, mechanizmy potranskrypcyjne są w dużej mierze odkrywane dzięki ukierunkowanemu opracowywaniu leków na ekspresję genów. Tutaj opisujemy test komórkowy mający na celu zbadanie roli regionu 3' bez translacji (3' UTR) w modulacji losu jego mRNA i identyfikacji związków zdolnych do jego modyfikacji. Test opiera się na wykorzystaniu konstruktu reporterowego lucyferazy zawierającego 3' UTR interesującego genu, stabilnie zintegrowanego z linią komórkową istotną dla choroby. Protokół jest podzielony na dwie części, przy czym początkowo skupiono się na pierwotnym badaniu przesiewowym mającym na celu identyfikację cząsteczek wpływających na aktywność lucyferazy po 24 godzinach leczenia. Druga część protokołu opisuje kontr-badania przesiewowe niezbędne do rozróżnienia związków modulujących aktywność lucyferazy specyficznie poprzez 3' UTR. Oprócz szczegółowego protokołu i reprezentatywnych wyników, przedstawiamy ważne kwestie dotyczące rozwoju testu i walidacji trafienia (trafień) na celu endogennym. Opisany test genu reporterowego opartego na komórce pozwoli naukowcom zidentyfikować cząsteczki modulujące poziom białka za pomocą mechanizmów potranskrypcyjnych zależnych od 3' UTR.

Introduction

Przez długi okres uważano, że regulacja ekspresji genów odgrywa główną, jeśli nie wyłączną rolę w kontrolowaniu produkcji białek. Coraz więcej dowodów wskazuje jednak, że regulacja potranskrypcyjna przyczynia się w takim samym stopniu, jeśli nie większym, niż regulacja transkrypcji do określenia obfitości białek komórkowych^1,2. Potranskrypcyjna kontrola ekspresji genów jest znacznie bardziej złożona i skomplikowana, niż początkowo sądzono. W rzeczywistości okazało się, że wszystkie różne etapy kontroli potranskrypcyjnej są regulowane, w tym przetwarzanie mRNA, lokalizacja, obrót, translacja3, a także nowo opisana odwracalna metylacja RNA⁴. Spośród wielu procesów regulacji potranskrypcyjnej, na które potencjalnie może mieć wpływ, opisany poniżej test koncentruje się na tych, które obejmują nieulegający translacji region mRNA 3' (3' UTR). 3' UTR szeroko wpływa na los mRNA, głównie poprzez specyficzną interakcję białek wiążących RNA i niekodujących RNA z jego sekwencjami regulatorowymi i/lub strukturami drugorzędowymi⁵. Dlatego małe cząsteczki, które zmieniają te interakcje lub zakłócają szlaki transdukcji sygnału, zmienią równowagę, która reguluje obfitość białek. To podejście terapeutyczne ma szczególne znaczenie w przypadku patologii u ludzi, w przypadku których istnieją dowody wskazujące, że geny istotne dla choroby podlegają regulacji potranskrypcyjnej, co w związku z tym stanowi potencjalny cel interwencji farmakologicznej. W związku z tym systemy pozwalające na badania przesiewowe modulatorów poziomu mRNA poprzez interferencję z mechanizmami kontroli potranskrypcyjnej w formacie wysokoprzepustowym mogą stać się cennymi narzędziami w identyfikacji potencjalnych nowych metod leczenia.

Opisany test genu reporterowego oparty na komórce pozwala na identyfikację związków zdolnych do modulowania losu mRNA za pomocą mechanizmów zależnych od jego 3' UTR. Składa się z kilku głównych elementów (rysunek 1) i wymaga kilku wstępnych kroków w celu walidacji wykonalności testu. Po pierwsze, konstrukt reporterowy jest zaprojektowany tak, aby zawierał 3' UTR z genu będącego przedmiotem zainteresowania. 3' UTR jest połączony z końcem genu reporterowego, takiego jak lucyferazy świetlika (ryc. 1). Wszelkie zmiany w potranskrypcyjnych mechanizmach kontrolnych wywieranych przez wstawiony 3' UTR zmienią stabilność i / lub wydajność translacji tego chimerycznego transkryptu, powodując różne poziomy lucyferazy. Dlatego zmiany w aktywności lucyferazy służą jako pośrednia miara zaburzonej regulacji potranskrypcyjnej genu będącego przedmiotem zainteresowania. Drugim składnikiem systemu jest kontrolny konstrukt reporterowy, identyczny plazmid ekspresyjny, który wyraża ten sam gen reporterowy, ale nie zawiera żadnego 3' UTR. Dwa plazmidy reporterowe można zaprojektować w laboratorium przy użyciu konwencjonalnych protokołów biologii molekularnej lub zakupić ze źródeł komercyjnych.

Wybór odpowiedniej linii komórkowej jest krytyczny dla konstrukcji testu. To, która linia komórkowa jest optymalnym modelem, zależy od wielu czynników, począwszy od wymagań klinicznych, takich jak maksymalne podobieństwo do patologii, a skończywszy na kwestiach praktycznych, takich jak dostępność, transfekcyjność i charakterystyka wzrostu. Co ważne, przed przystąpieniem do leczenia należy upewnić się, że fuzja 3' UTR z genem reporterowym ma oczekiwany wpływ na poziom chimerycznego transkryptu. Brak znaczącej różnicy w sygnale lucyferazy z konstruktów reporterowych 3' UTR i kontrolnych przejściowo transfekowanych w wybranych komórkach wskazywałby, że UTR 3' nie działa w tym modelu komórkowym, co skłania do poszukiwania alternatywnych. W przypadku formatu wysokoprzepustowego, konstrukty reporterowe 3' UTR i kontrolnej lucyferazy powinny być stabilnie zintegrowane z wybraną linią komórkową. Stosowanie stabilnie zintegrowanej nad przejściowo transfekowaną linią komórkową jest preferowane z kilku powodów. Pozwoli to poszerzyć wybór modelu komórkowego obejmującego trudne do transfekcji linie komórkowe, zmniejszyć zmienność danych wynikającą z wahań wydajności transfekcji, obniżyć koszty. Co więcej, po przejściowej transfekcji komórki są bardzo często przeciążone plazmidem DNA, co prowadzi do nasycenia systemu. W tych warunkach dalszy wzrost ekspresji reporterowej może być wyzwaniem, co skutkuje zmniejszoną wrażliwością na potencjalne związki regulujące w górę.

Na koniec, gdy wszystkie składniki testu są już ustawione, przed przejściem na format wysokoprzepustowy bardzo ważne jest określenie wykonalności testu, tj. czy aktywność lucyferazy może być rzeczywiście regulowana w górę i w dół za pomocą wstawionego 3' UTR. Najlepszymi kontrolami byłyby małe cząsteczki, o których mówi się, że modulują stabilność lub translatowalność mRNA przez 3' UTR będący przedmiotem zainteresowania. Jeśli ich posiadanie nie jest możliwe, akceptowane są zastępcze kontrole imitujące pożądany efekt. Mogą to być miRNA lub białka wiążące RNA, o których wiadomo, że wywierają swoje działanie poprzez wiązanie się z interesującym nas 3' UTR. Ocena takich kontroli przed pierwotnym badaniem przesiewowym nie tylko wskazuje na funkcjonalność opracowanego testu, ale także pozwala na oszacowanie jego zakresu dynamicznego, czułości i wydajności w formacie wysokoprzepustowym.

Korzystając z opisanego protokołu, przesiewaliśmy bibliotekę składającą się z 2 000 związków⁶. Nerwiak zarodkowy, najczęstszy pozaczaszkowy guz lity wieku niemowlęcego, został wykorzystany jako model biologiczny, a 3' UTR onkogenu MYCN, którego amplifikacja silnie przewiduje niekorzystny wynik nerwiaka zarodkowego, jako gen docelowy⁷. Rysunek 2 przedstawia układ eksperymentalny. Przesiewanie podzielono na trzy cykle, przy czym wielkość partii wynosiła 27 płyt przesiewanych w jednym przebiegu. Partia 27 płyt zawierała płyty biblioteczne Spectrum Collection nr 1-n.8+n.25 (pierwszy nakład), nr 9-n.16+n.25 (drugi nakład) i nr 16-n.24+n.25 (trzeci nakład), przy czym każda płyta została przesiana w trzech egzemplarzach. W ten sposób jedna tabliczka biblioteczna (nr 25) została oznaczona we wszystkich trzech seriach, co umożliwiło porównanie między seriami. Poniższy protokół opisuje pojedynczą serię 9 tablic bibliotecznych przetestowanych w trzech egzemplarzach.

Protocol

UWAGA: Wydajność takich systemów testowych zależy od dostępnego sprzętu laboratoryjnego HTS. Protokół ten jest ułatwiony przez robota Tecan Freedom EVO 200, który wykonuje obsługę cieczy w formacie 96-dołkowym. Możliwa jest również miniaturyzacja do formatu 384-dołkowego. Zrobotyzowany system obsługi cieczy jest umieszczony pod okapem z przepływem laminarnym w celu utrzymania warunków aseptycznych podczas wszystkich etapów eksperymentu. Jeśli nie jest dostępna automatyzacja obsługi cieczy, protokół można łatwo dostosować do formatu o niskiej przepustowości.

Główny przegląd

1. Dzień 1: Przygotowanie i nasiona komórek

UWAGA: Komórki nasienne osiągają 80% zbieżności w momencie oznaczania aktywności lucyferazy, tj. 48 godzin po wysiewie.

1. Ponownie zawiesić trypsynizowane komórki nerwiaka zarodkowego CHP134-mycn3UTR do stężenia 2 × 10⁵ komórek/ml w RPMI zawierającym 10% FBS i 1% L-glutaminy. Dla 27 płytek należy przygotować co najmniej 250 ml zawiesiny komórek, biorąc pod uwagę sposób obchodzenia się z płynami, korytka objętości martwe i powtarzające się etapy pipetowania. Wlej zawiesinę komórek do sterylnego zbiornika i umieść ją na biurku robota.
2. Umieść na biurku robota 99 białych płytek z płaskim dnem z kodami kreskowymi oraz pudełko ze sterylnymi końcówkami do pipet o pojemności 200 μl. Wymieszaj zawiesinę komórek przez pipetowanie przed każdym etapem dozowania, aby uniknąć osiadania komórek pod wpływem grawitacji. Dozuj 75 μl komórek do każdego dołka z 9 płytkami, aby uzyskać końcową gęstość 1,5 × 10⁴ komórek na dołek.
3. Przykryj płytki pokrywkami i pozostaw je na zewnątrz inkubatora na 30 minut, aby komórki mogły osiąść na dnie studzienki. Zminimalizuje to efekty krawędziowe.
4. Powtórz kroki 1.2 i 1.3 dwukrotnie, aby przygotować łączną liczbę 27 płytek.
5. Umieścić płytki w temperaturze 37 °C i 5% CO₂ i inkubować przez 24 godziny.

2. Dzień 2: Leczenie komórek związkami bibliotecznymi

UWAGA: Biblioteka małych cząsteczek Spectrum Collection składa się z 2 000 związków ułożonych w 8 rzędach i 10 kolumnach na 25 96-dołkowych płytkach o stężeniu 10 mM w DMSO. Studzienki w pierwszej i ostatniej kolumnie pozostają puste dla kontroli. Testy przesiewowe związków są zwykle wykonywane przy stężeniu związku 1–10 μM⁸. Opisany tutaj protokół przesiewowy ustala 2 μM jako stężenie robocze i 24 godziny jako punkt końcowy testu.

1. Rozmrozić 9 złożonych płytek bibliotecznych w temperaturze pokojowej.
2. Przygotuj dwie koryta ze sterylnymi roztworami PBS i PBS-0,5% DMSO i umieść je na biurku robota. Dla każdej płytki bibliotecznej należy przygotować i oznaczyć odpowiednio jedną płytkę rozcieńczającą — 96-dołkową płytkę z polipropylenu z dnem w kształcie litery U o objętości roboczej co najmniej 400 μl. Napełnić każdą studzienkę w kolumnach od 2 do 11 płytek rozcieńczających 398 μl sterylnego PBS za pomocą stałych końcówek płynu. Wypełnić kolumny 1 i 12 50 μl sterylnego PBS z 0,5% DMSO w celu odtworzenia stężenia nośnika w studzienkach kontrolnych (0,02%).
3. Na pulpicie robota umieść dwie płytki biblioteczne, odpowiednio oznaczone płytki rozcieńczające, dwa pudełka ze sterylnymi końcówkami do pipet o pojemności 50 μl i płytki z sześcioma komórkami. Odsłoń płytki komórek.
4. Odmierzyć pipetą 2 μl roztworu podstawowego o stężeniu 10 mM z jednej z dwóch płytek bibliotecznych na odpowiedniej płytce rozcieńczającej i dobrze wymieszać. Spowoduje to stężenie związków pośrednich wynoszące 50 μM. Używając tego samego zestawu końcówek, dozuj 3 μl rozcieńczenia 50 μM na 3 białe 96-dołkowe płytki z kodami kreskowymi z komórkami. Ten schemat rozcieńczania daje stężenie robocze 2 μM każdego badanego związku.
   UWAGA: Aby uniknąć niepotrzebnych manipulacji z końcówkami, od początku używaj pełnego zestawu 96 końcówek, mimo że tabliczki biblioteczne zawierają tylko 80 związków. Jest to możliwe, ponieważ pierwsza i ostatnia kolumna tablic bibliotecznych jest pusta.
5. Wymień końcówki pipet i powtórz krok 2.4 dla drugiej płytki bibliotecznej.
6. Przykryj płytki komórkowe i włóż je z powrotem do inkubatora na 24 godziny.
7. Powtórz kroki 2.3-2.6 jeszcze dwa razy dla pozostałych płyt bibliotecznych.

3. Dzień 3: Wykonaj test lucyferazy

UWAGA: Przed wykonaniem testu lucyferazy, można go zwielokrotnić testem żywotności komórek opartym na redukcji resazuryny, aby uzyskać wskaźnik żywotności komórki z każdego dołka⁹. Multipleksowanie testów lucyferazy i żywotności powoduje zmniejszenie sygnału lucyferazy, który jednak można zignorować, jeśli komórki zapewniają wystarczająco wysoki poziom aktywności lucyferazy. Aktywność lucyferazy można wykryć za pomocą różnych komercyjnych i domowych odczynników do oznaczania lucyferazy^10,11 ze stabilnym sygnałem luminescencyjnym.

1. Zrównoważyć odtworzony odczynnik lucyferazy do temperatury pokojowej. Upewnij się, że objętość jest wystarczająca dla wszystkich oznaczonych płytek. Na 27 płytek wymagane będzie 170 ml odczynnika lucyferazy, biorąc pod uwagę obchodzenie się z cieczami, minimalną objętość martwą i powtarzające się etapy pipetowania. Wlej odczynnik lucyferazy do zbiornika i umieść go na biurku robota.
2. Wyjmij 9 płytek z komórkami z inkubatora, umieść je na biurku robota, odkryj i poczekaj, aż osiągną temperaturę pokojową. Dodać 50 μl odczynnika lucyferazy na dołek płytka po płytce. Pomiędzy płytkami wprowadź opóźnienie równe czasowi odczytu luminescencji jednej płytki. Zapewni to, że wszystkie płytki zostaną zmierzone w równych odstępach czasu od dodania odczynnika.
3. Po 30 minutach inkubacji umieścić pierwszą płytkę w luminometrze i zmierzyć luminescencję po krótkim etapie potrząsania. Powtórz tę czynność dla wszystkich talerzy. Zapisz kod kreskowy każdej płyty i powiąż go z odpowiednim plikiem danych, aby uniknąć błędów wynikających z dużej liczby obsługiwanych płyt.
4. Powtórz kroki 3.2-3.3 dwukrotnie dla pozostałych 18 płytek z komórkami.
5. Zebrać pozostały odczynnik lucyferazy i przechowywać go w temperaturze -20 °C.

4. Dzień 4: Analiza danych

1. Przetwarzanie danych doświadczalnych przy użyciu normalizacji wszystkich próbek do średniej z kontroli poddanych działaniu nośnika na płytce. Dla każdego związku bibliotecznego oblicz średnią wartość x̅ i SD w trzech powtórzeniach.
2. Wybierz trafienia regulujące w górę i w dół, ustawiając próg x̅ ± k × SD, gdzie średnia wartość x̅ i SD są obliczane dla wszystkich przetworzonych wartości testu, a k jest zdefiniowaną stałą.
3. Wybierz dowolny próg odcięcia < 20% kontroli poddanych działaniu nośnika, gdy zmniejszenie sygnału lucyferazy jest najprawdopodobniej związane z toksycznością związku. Odrzucenie trafień poniżej tego progu znacznie zmniejszy liczbę trafień fałszywie dodatnich w kontrkontroli.
   UWAGA: Zamiast normalizacji opartej na kontroli, dane eksperymentalne mogą być przetwarzane przy użyciu wyniku Z lub jego solidnego analogowego wyniku^{B 12}. Ponadto dostępne są alternatywne podejścia statystyczne do wyboru trafień¹².

5. Kontr-kontrola

UWAGA: Związki zidentyfikowane w głównym badaniu przesiewowym (oznaczone jako 'trafienia') są potwierdzane i oceniane pod kątem specyficzności przez kontr-screening.

1. Wybierz wybrane trafienia z podwielokrotności przechowywanych w pojedynczych probówkach z kodami kreskowymi 2D i utwórz nowe "tablice trafień", zapisując odpowiedni układ. Nie zapomnij zostawić wolnych miejsc dla sterujących.
   UWAGA: W przypadku braku wydajnego systemu selekcji wiśniowej, można równolegle przetestować zarówno komórki kontrolne, jak i 3' zawierające UTR w pierwotnym badaniu przesiewowym. W takim przypadku specyficzna selekcja związków o działaniu zależnym tylko od wprowadzonego 3' UTR będzie możliwa po pierwotnym badaniu przesiewowym, eliminując konieczność przeprowadzania kontrprzesiewowego. Jednak równoległe badania przesiewowe w dwóch liniach komórkowych podwoją koszty testu.
2. Postępując zgodnie z protokołem pierwotnego badania przesiewowego (sekcja "Dzień 1: Przygotowanie i komórki nasienne"), dla każdej "płytki trafionej" przygotuj trzy 96-dołkowe płytki każdej stabilnej komórki CHP134-mycn3UTR i CHP134-CTRL.
3. Postępując zgodnie z protokołem pierwotnego badania przesiewowego (sekcja "Dzień 2: Traktuj komórki związkami bibliotecznymi"), użyj każdej płytki trafionej do leczenia trzech płytek CHP134-mycn3UTR i trzech CHP134-CTRL przy stężeniu roboczym 2 μM.
   UWAGA: Podczas gdy opisany tutaj ekran przeciwkrytyczny jest wykonywany w trzech egzemplarzach przy pojedynczej dawce 2 μM, korzystne może być zastąpienie standardowych powtórzeń i przetestowanie trafień w 3 stężeniach jako 10-krotne rozcieńczenia w zakresie od 2 μM do 20 nM. Zastosowanie tego podejścia pozwoliłoby nie tylko na potwierdzenie danych z pierwotnego badania przesiewowego, ale także na uzyskanie wstępnych danych dotyczących dawka-odpowiedź na pierwotne trafienia, minimalizując odsetek wyników fałszywie dodatnich. W takim przypadku należy zastosować inny potok analizy w celu przetworzenia danych eksperymentalnych i potwierdzenia trafień.
4. Postępując zgodnie z protokołem pierwotnego badania przesiewowego (sekcja "Dzień 3: Wykonaj test lucyferazy"), zmierz aktywność lucyferazy na wszystkich płytkach CHP134-mycn3UTR i CHP134-CTRL.
5. Postępując zgodnie z protokołem wstępnego badania przesiewowego (sekcja "Dzień 4: Analiza danych"), należy znormalizować dane eksperymentalne z odwiertów poddanych działaniu substancji do średniej z kontroli poddanych działaniu nośnika na płytce i obliczyć średnią i SD w powtórzeniach. Dla każdego badanego związku oblicz krotną zmianę aktywności lucyferazy w komórkach CHP134-mycn3UTR w porównaniu z CHP134-CTRL. Wybierz dowolne odcięcia zmiany zagięcia wynoszące >1,5 i wartości p istotności <0,01,
   UWAGA: W opisanych ustawieniach testu parametrem determinującym swoistość trafienia jest znacząca krotna zmiana aktywności lucyferazy w komórkach CHP134-mycn3UTR w porównaniu z CHP134-CTRL. W razie potrzeby można również ocenić toksyczność związku, przeprowadzając jednocześnie test żywotności komórek na wybranych związkach. Może to być szczególnie korzystne, jeśli pierwotne trafienia są poddawane analizie przeciwstawnej w analizie odpowiedzi na dawkę. W przypadku pojedynczej dawki nasze doświadczenie wskazuje na silną korelację zmniejszonej aktywności lucyferazy ze zmniejszoną żywotnością komórek⁶. W związku z tym zmniejszona aktywność lucyferazy w komórkach docelowych, jak również w komórkach kontrolnych, może być uważana za wskaźnik toksyczności związku w badanym stężeniu.

Results

Korzystając z opisanego podejścia, przebadaliśmy bibliotekę 2 000 związków pod kątem potencjalnych modulatorów potranskrypcyjnych mechanizmów kontrolnych wywieranych przez 3' UTR genu MYCN. Rysunek 3 przedstawia wyniki pierwotnego badania przesiewowego na przykładzie pojedynczej płytki bibliotecznej. Sygnał lucyferazy wyświetlany jako procent kontrolnych traktowanych nośnikiem uzyskano poprzez pomiar aktywności lucyferazy na potrójnych płytkach komórek CHP134-mycn3UTR traktowanych związkami z po...

Discussion

Protokół ten opisuje test genu reporterowego oparty na komórce, mający na celu identyfikację modulatorów, które celują w procesy potranskrypcyjne zależne od 3' UTR. Obejmuje on podstawowe badanie przesiewowe i badanie przesiewowe, a w razie potrzeby może mu towarzyszyć test cytotoksyczności. Wynikiem wstępnego badania przesiewowego jest szereg cennych związków kandydujących, których odtwarzalność i swoistość są dalej weryfikowane w ramach kontrbadania.

Identyfikacja pierwotnych trafień opiera ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Płytka hodowlana 96-dołkowa Biała	PerkinElmer	6005688
StorPlate 96-dołkowa U dno (płytka rozcieńczająca)	PerkinElmer	6008190
100 ml jednorazowe koryto na odczynniki	Tecan	10 613 048
300 ml jednorazowy zbiornik robotyczny	VWR	PB12001301
Końcówki robota DITI 50  μ l Sterylne	końcówki do robotów 30038607
DITI 200  μ l Sterylna	30038617		Tecan
1,4 ml z kodem kreskowym 2D z płaskim dnem Thermo	Scientific	3711
ONE-Glo Lucyferazy System testowy	Promega	E6120
RPMI	Lonza	BE12-918F
PBS-1x, bez Ca2+, Mg2+	Lonza	BE17-516F
L-Glutamina 200  mM	Lonza	BE17-605E
FBS	Lonza	DE14-801F
DMSO	Sigma-Aldrich	D8418
Kolekcja Spectrum (biblioteka złożona)	MicroSource Discovery Systems	N/A
Robot Tecan Freedom EVO200	Tecan	N/A Czytnik
wielopłytkowy Tecan F200	Tecan	N/A