Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Oprzyrządowanie owiec w okresie bliskim donoszonego do wielowymiarowych przewlekłych nagrań bez znieczulenia

8.5K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/52581

⸱

25 października 2015

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Département de sciences cliniques, CHUV, Université de Montréal, St-Hyacinthe, QC, 2Département d'obstetriques et de gynécologie, CHU Ste-Justine Research Centre, Université de Montréal, 3Département de neurosciences, CHU Ste-Justine Centre de recherche, Université de Montréal, 4Centre de recherche en reproduction animale (CRRA), Université de Montréal, St-Hyacinthe, QC

W tym artykule

Podsumowanie

Chronicznie znieczulony model owcy bez znieczulenia jest używany do badania rozwoju ludzkiego płodu w zdrowiu i chorobie, ponieważ pozwala na chirurgiczne zakładanie i konserwację cewników i elektrod, powtarzalne pobieranie krwi, wstrzykiwanie substancji, rejestrowanie aktywności bioelektrycznej i obrazowanie in vivo. Opisujemy procedury wymagane do ustanowienia tego modelu.

Streszczenie

Przewlekle oprzyrządowane ciężarne owce były używane jako model rozwoju ludzkiego płodu i reakcji na bodźce patofizjologiczne, takie jak endotoksyny, bakterie, niedrożność pępowiny, niedotlenienie i różne metody leczenia farmakologicznego. W tym modelu opracowano ratujące życie praktyki kliniczne leczenia glikokortykosteroidami u płodów zagrożonych przedwczesnym porodem oraz hipotermię terapeutyczną. Wynika to z wyjątkowej podatności nieznieczulonych płodów owiec na chirurgiczne zakładanie i konserwację cewników i elektrod, umożliwiając powtarzalne pobieranie krwi, wstrzykiwanie substancji, rejestrowanie aktywności bioelektrycznej, stosowanie stymulacji elektrycznej i obrazowanie narządów in vivo. W tym miejscu opisujemy procedurę instrumentacji chirurgicznej wymaganą do uzyskania stabilnego, przewlekle oprzyrządowanego, nieznieczulonego modelu płodu owcy, w tym charakterystykę powrotu do zdrowia po gazometrii krwi, metabolizmie i stanie zapalnym.

Wprowadzenie

Istnieje wiele modeli zwierzęcych do badania zarówno ciąż normalnych, jak i zagrożonych, w tym gryzonie laboratoryjne, naczelne inne niż ludzkie i domowe przeżuwacze. 1,2,3,4,5 Przewlekle oprzyrządowane ciężarne owce są szeroko stosowane od 50 lat jako model rozwoju ludzkiego płodu i odpowiedzi na bodźce patofizjologiczne, takie jak lipopolisacharyd (LPS). 6-10 Zmiany chorobowe po ekspozycji na LPS dokładnie naśladują to, co obserwuje się u wcześniaków z leukomalacją okołokomorową, co wynika z podobnego profilu dojrzewania obu gatunków. 11, 12

Inne komplikacje ciążowe również zostały szczegółowo zbadane, takie jak odkrycie, że glikokortykosteroidy przedporodowe sprzyjają rozwojowi płuc 13-15 i zrozumienie wpływu wewnątrzmacicznego ograniczenia wzrostu (IUGR) na płód 16,17.

Szerokie zastosowanie modelu płodu owiec wynika z unikalnej podatności nieznieczulonych płodów owiec na chirurgiczne zakładanie i konserwację cewników i elektrod, umożliwiając powtarzalne pobieranie krwi, rejestrowanie aktywności bioelektrycznej, stosowanie stymulacji elektrycznej i obrazowanie mózgu in vivo. 18 Telemetria jest również możliwa, choć jeszcze rzadziej używana ze względu na większą zaawansowanie konfiguracji, a także koszty początkowe i konserwacyjne. Rozdział 19

Ponadto, model owca płodu jest bardzo wszechstronny, ponieważ możliwe jest wiele wariantów oprzyrządowania, w zależności od interesujących nas miar. Na przykład możliwe jest rejestrowanie w ciągu kilku dni lub tygodni sygnałów wielowymiarowych w czasie rzeczywistym, takich jak ruchy oddechowe płodu, elektryczna aktywność mózgu, reakcje sercowo-naczyniowe, elektrokardiogram, regionalny przepływ krwi do szeregu narządów za pomocą sond przepływu lub mikrosfer itp. Dzięki tej wszechstronności przeprowadzono szeroki zakres badań, w tym nad rozwojem układu sercowo-naczyniowego20,21, osią podwzgórze-przysadka-nadnercza (HPA)22, rozwojem mózgu23 i rozwojem stanów snu w szczególności24, skutkami niedotlenienia/asfiksji25, hipotermią terapeutyczną 26, stanem zapalnym6-11, połączeniem obu27, glikokortykosteroidami28,29, lekami przeciwdepresyjnymi30, dysplazja oskrzelowo-płucna (BPD) 31,32, programowanie płodu33,34,35,36,37,38,39 lub opracowanie nowych metod monitorowania płodu przed i w trakcie porodu, aby wymienić tylko kilka obszarów badań. 40,41,42,43

Ogólnym celem przedstawionej metody jest pokazanie podstawowej implementacji tego wszechstronnego modelu. Pozwala to na ustanowienie szerokiej gamy ostrych i przewlekłych protokołów eksperymentalnych badających fizjologię i patofizjologię płodu na poziomie integracyjnym, narządowym, komórkowym i molekularnym.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Opieka nad zwierzętami była zgodna z wytycznymi Kanadyjskiej Rady ds. Opieki nad Zwierzętami oraz zatwierdzeniem przez Radę ds. Opieki nad Zwierzętami (protokół #10-Rech-1560). Szczegółowe informacje na temat zastosowanych materiałów i metod znajdują się w tabeli 1.

1. Znieczulenie

  1. Wprowadzić cewnik jednokanałowy do żyły szyjnej.
  2. Uspokoić owcę za pomocą acepromazyny (Atravet 10 mg / ml) 2 mg dożylnie około 30 minut przed indukcją znieczulenia w celu zmniejszenia stresu związanego z zabiegiem, co z kolei obniża poziom kortyzolu.
  3. Podawać dożylnie diazepam (Diazepam 5 mg/ml) 20 mg, ketaminę (Ketalar 100 mg/ml) 4-5 mg/kg i propofol (propofol 10 mg/ml) 0,5 do 1 mg/kg dożylnie w celu wywołania znieczulenia ogólnego.
  4. Wprowadzić cewnik do wymiany dróg oddechowych do tchawicy za pomocą laryngoskopu z ostrzem typu Wisconsin (bardzo długie ostrze leworęczne 350 mm), aby pomóc w intubacji. Zsuń silikonową rurkę dotchawiczą (średnica wewnętrzna od 9 do 12 mm) z cewnika do wymiany dróg oddechowych do tchawicy. Technika ta ułatwia proces intubacji. Ostrożnie napompuj mankiet rurki dotchawiczej, aby uniknąć owrzodzenia tchawicy wywołanego ciśnieniem i przymocuj rurkę do głowy owcy.
  5. Podłączyć rurkę dotchawiczą do obwodu oddechowego aparatu anestezjologicznego i natychmiast rozpocząć wentylację mechaniczną. Dostosuj ustawienia wentylatora, aby utrzymać PaCO2 w normalnych granicach od 35 do 45 mmHg.
  6. Wprowadzić cewnik do tętnicy usznej (22 do 20 G; 1 cal [0,9 x 25 mm] do 1,16 cala [1,1 x 30 mm]) i podłączyć do niezgodnego przewodu w celu monitorowania bezpośredniego ciśnienia tętniczego krwi.
  7. Użyj wieloparametrowego monitora fizjologicznego, aby rejestrować elektrokardiogram, bezpośrednie ciśnienie tętnicze krwi, saturację tlenem (SpO2), kapnografię (PETCO 2) i temperaturę co 5 minut. Przesyłaj wszystkie dane fizjologiczne za pomocą szeregowego do centralnego komputera zbierającego dane fizjologiczne. Utrzymuj normalną temperaturę ciała za pomocą koca z krążącą wodą.
  8. Podawać zrównoważony roztwór polijonowy w stężeniu 10 ml/kg przez pierwszą godzinę znieczulenia ogólnego, a następnie zmniejszyć do 5 ml/kg/h.
  9. Trimetoprim-sulfadoksyna w dawce 5 mg/kg dożylnie należy podawać macicy tuż przed nacięciem skóry w ramach profilaktyki antybiotykowej.
  10. Stosuj standardowe techniki aseptyczne przy wszystkich manipulacjach chirurgicznych owcy i płodu.
  11. Bariera pielęgnuje owce przez cały czas. Dotyczy to również personelu niechirurgicznego. Zminimalizuje to potencjał enzootyczny np. Coxiella burnetii. Przez cały czas używaj rękawiczek i masek (typ N-95).

2. Przegląd procedury chirurgicznej

  1. Wykonaj 20-centymetrowe nacięcie w linii środkowej przez dolną ścianę brzucha bezpośrednio czaszką do wymienia przez linię białą, aby zminimalizować uszkodzenie mięśni brzucha.
    1. Cofnij większą sieć czaszkowo, a rogi macicy są wyczuwane palpacyjnie ręcznie. Dotykaj palpacyjnie każdego rogu od trzonu macicy do czubka rogu, zwracając uwagę na liczbę płodów i ich wielkość. Jeśli jest więcej niż jeden płód, wybierz większy płód, ręcznie oceniając rozmiar głowy i szerokość między oczodołami.
    2. Trzymaj głowę wybranego płodu mocno przez macicę częściowo zewnętrzoną. Wykonaj 10-centymetrową histerotomię na dużej krzywiźnie za pomocą nożyczek Metzenbaum. Załóż natychmiast na głowę sterylną rękawicę chirurgiczną bez lateksu wypełnioną sterylną solą fizjologiczną, tak jakby to była ręka. Alternatywnie użyj zwilżonych 4x4, aby głowa płodu była wilgotna. Przymocuj macicę do ściany brzucha.
      1. Zewnętrznij prawą i lewą kończynę piersiową i delikatnie wyciągnij płód z macicy aż do wyrostka ksylowego.
    3. Wprowadzić cewniki z poliwinylu do prawej i lewej żyły ramiennej i tętnic przy użyciu standardowej techniki cięcia. Wprowadź kolejny cewnik poliwinylowy do jamy owodniowej, mocując jego koniec do mostka płodu.
      1. Używaj wyłącznie sterylnych cewników. Zalecamy sterylizację gazową w standardowym obiekcie. Podłącz każdy cewnik do igły, a igłę do podwójnego kranu, aby umożliwić późniejsze pobranie próbki krwi lub monitorowanie ciśnienia.
    4. Zszyj elektrody ze stali nierdzewnej do manubrium, wyrostka mieczykowatego i do każdego punktu barku w celu monitorowania elektrokardiogramu (EKG).
    5. Zwróć płód do macicy. Wszystkie cewniki i elektrody wychodzą przez małe nacięcie kłute w lewym boku.
    6. Zamknij nacięcie laparotomii za pomocą trójwarstwowego zamknięcia. Zszyj ścianę brzucha syntetycznym wchłanialnym szwem monofilamentowym USP 2 w prosty ciągły sposób. Zamknij przestrzeń podskórną syntetycznym wchłanialnym plecionym szwem USP 0 w prosty, ciągły sposób. Użyj chirurgicznych zszywek ze stali nierdzewnej, aby zamknąć nacięcie skóry.
  2. Szczegółowy opis zabiegu chirurgicznego
    1. Usuń wełnę, goląc wyrostek ksylufoidalny do gruczołu sutkowego i wzdłuż fałdu boku z każdej strony za pomocą ostrza # 40. Następnie dokładnie oczyść brzuszną część brzucha 4% glukonianem chlorheksydyny i miękką szczoteczką przez 3 minuty.
      1. Wykonaj standardowy sterylny peeling z glukonianem chlorheksydyny 4%, zaczynając od środka brzucha i postępując w sposób odśrodkowy przez 3 minuty. Wlej sterylną sól fizjologiczną na brzuch, aby usunąć mydło dezynfekujące. Ostatnim etapem przygotowania chirurgicznego jest wykonanie trzech naprzemiennych pasaży roztworu glukonianu chlorheksydyny 2% i alkoholu izopropylowego 70%.
    2. Upewnij się, że głębokość znieczulenia jest odpowiednia przed nacięciem. Wykonaj standardowe nacięcie laparotomii od pępka do czaszki do wymienia przez linię białą, aby zminimalizować uszkodzenie mięśni brzucha.
    3. Włóż długie kleszczyki z gąbką w jamę brzuszną wzdłuż lewej ściany brzucha do planowanego miejsca wyjścia cewników w okolicy przyżebrowej.
      1. Dociśnij końcówki kleszczy do ściany, aż asystent będzie mógł je zlokalizować i potwierdzić odpowiednie miejsce. Otwórz lekko (1 cm) szczęki kleszczy i pozwól asystentowi wykonać 2-centymetrowe nacięcie kłute o pełnej grubości.
      2. Zewnętrznij końcówki kleszczy przez nacięcie, otwórz ponownie i delikatnie chwyć cewniki kleszczami, które ostatecznie zostaną wyciągnięte z brzucha przez brzuszne nacięcie brzucha. Warto zauważyć, że niektóre grupy wszczepiają cewniki, a następnie uzewnętrzniają je na zewnątrz. Ma to tę wadę, że śródoperacyjne monitorowanie EKG płodu nie jest możliwe.
    4. Zbadaj palpacyjnie macicę, aby określić pozycję i liczbę płodu. Określ największy płód za pomocą odległości międzysłuchowej. Naciąć ścianę macicy na dużej krzywiźnie nad grzbietem głowy, unikając liścieni.
      1. Przełóż tępo zakończoną kaniulę przez błony łożyskowe, aby uzyskać próbkę płynu owodniowego wolną od krwotoku. Naciąć błony łożyskowe za pomocą nożyczek.
    5. Zewnętrz czaszkową połowę płodu przez to nacięcie. Umieść sterylną rękawicę chirurgiczną bez lateksu wypełnioną sterylną solą fizjologiczną w temperaturze 37 °C na głowie płodu, aby pomóc w utrzymaniu normotermii.
      1. Podczas wyjmowania górnej części ciała płodu z macicy, poproś asystenta, aby przytrzymał babcocka, aby zapobiec utracie płynu owodniowego. Następnie, ponownie za pomocą kleszczy Babcocka, zaciśnij błony płodowe i ścianę macicy na skórze, aby zapobiec zanieczyszczeniu jamy brzusznej płynem owodniowym.
      2. Odsłonięte są tylko te części ciała płodu, które wymagają oprzyrządowania, a pozostałe części należy przechowywać w macicy lub przykryć odpowiednio wilgotnymi i ciepłymi (37 °C) sterylnymi szmatkami.
    6. Odwodzić obie kończyny piersiowe, aby ułatwić obustronne odsłonięcie tętnicy ramiennej i żyły. Naciąć wzdłuż przyśrodkowej części obu przedramienia i ostrożnie wypreparować okolice tętnicy ramiennej i żyły.
    7. Wprowadzić cewniki z poliwinylu do prawej i lewej tętnicy ramiennej oraz lewej żyły ramiennej przy użyciu standardowej techniki cięcia.
      1. Uwolnij naczynie, które ma być cewnikowane, z sąsiedniej tkanki na wysokości ponad 1 cm. Podwiąż dystalną część naczynia za pomocą plecionego syntetycznego wchłanialnego szwu USP 2-0. Umieść ligaturę w proksymalnej części naczynia, ale utrzymuj ją rozwiązaną.
        1. Za pomocą nożyczek Castroviejo przetnij naczynie poprzecznie do około 30% jego średnicy. Zatrzymaj przepływ krwi częściowo, pociągając za szew proksymalny. Wprowadzić cewnik w kierunku proksymalnym.
      2. Włóż cewnik poliwinylowy do 8 cm proksymalnie lub do momentu wykrycia oporu, a następnie lekko pociągnij do tyłu. Zabezpiecz tymczasowo proksymalny aspekt cewnika za pomocą zacisku naczyniowego. Umieść kolejny szew zarówno wokół bliższej, jak i dalszej części cewnika. Asystent w sposób ciągły zasysa i przepłukuje cewnik, aby zapewnić drożność cewnika.
      3. Zamknij skórę płodu za pomocą plecionego syntetycznego wchłanialnego szwu USP 2-0, z ciągłym wzorem szwów.
    8. Na prawym i lewym ramieniu, manubracji i wyrostku ksylowym przymocuj izolowaną elektrodę ze stali nierdzewnej, aby ułatwić monitorowanie EKG płodu.
    9. Zszyj ciśnienie owodniowe i cewnik do pobierania próbek do mostka. Ten cewnik jest fenestrowany na końcu.
    10. Zabezpiecz wszystkie cewniki na grzbiecie płodu za pomocą plecionego syntetycznego materiału do szwów USP 2-0.
    11. Przed wymianą płodu z powrotem do macicy, podawać clenbuterol 30 μg IV powoli przez 15 minut, aby uniknąć niedociśnienia i zapewnić rozluźnienie macicy.
    12. Zszyj błony płodu za pomocą plecionego syntetycznego wchłanialnego materiału szwowego USP 4-0 z ciągłym wzorem. Wkładaj tylko jeden cewnik lub elektrodę na raz do zamknięcia, aby zapewnić szczelne zamknięcie. Użyj dwuwarstwowego wzoru Cushinga z poszanowaniem zasad Halsteda, aby zamknąć warstwę mięśniową macicy za pomocą plecionego syntetycznego wchłanialnego materiału szywkowego USP 0. Ostrożnie zakop węzły chirurgiczne.
    13. Używając wzoru szwu ze sznurka w torebce, zabezpiecz wszystkie cewniki i EKG, gdy wychodzą z lewego nacięcia przyżebrowego.
    14. Za pomocą syntetycznego wchłanialnego materiału szywkowego z monofilamentu USP 2 zabezpiecz linea alba ciągłym wzorem. Zamknij tkanki podskórne za pomocą plecionego syntetycznego wchłanialnego materiału szwowego USP 2-0 z ciągłym wzorem. Zabezpiecz warstwę skóry za pomocą zszywek chirurgicznych.
    15. Podać 250 mg ampicyliny dożylnie i ponownie przez cewnik owodniowy do jamy owodniowej. Zastąp utracone płyny owodniowe ciepłym solą fizjologiczną.
    16. Umieść wszystkie zewnętrzne cewniki i elektrody EKG w torbie na miejsce, aby zachować sterylność. Umieść pończochę wokół tułowia owcy, aby przymocować wszystkie cewniki i elektrody do ciała owcy.
    17. Przerwij znieczulenie ogólne i ekstubuj maciorkę, gdy odruchy krtaniowe powrócą do normy.
    18. Umieść owcę w klatce metabolicznej, gdy ustabilizuje się po znieczuleniu ogólnym. Owca będzie przebywać w klatce metabolicznej na czas trwania eksperymentu. Owca powinna być w stanie stać, leżeć i jeść ad libitum, jednocześnie monitorując płód bez znieczulenia bez uspokajania matki.
    19. Przez kolejne trzy dni należy profilaktycznie podawać antybiotyki maciorce (trimetoprim sulfadoksyna 5 mg/kg) i płodowi (250 mg ampicyliny dożylnie i ponownie przez cewnik owodniowy).
    20. Oceń stan metaboliczny zarówno owcy, jak i płodu za pomocą analizy gazometrii krwi.
    21. Przepłukać wszystkie cewniki minimalną możliwą objętością heparynizowanego roztworu soli fizjologicznej. Uwaga – nie należy przekraczać dziennej dawki heparyny i płynów dopuszczalnych dla płodu. Możliwe jest przeciążenie płodu płynem. Płukać powoli raz dziennie ~ 5 ml NaCl na linię po profilaktyce antybiotykowej.
  3. Rejestracja i analiza danych
    1. Podczas operacji opcjonalnie rejestruj EKG i tętno matki i płodu, a także ciśnienie tętnicze krwi matki i ciśnienie w drogach oddechowych (Paw) w sposób ciągły (ryc. 1). Użyj Life Window Monitor, aby uzyskać wszystkie dane matki z wyjątkiem EKG. Wprowadź te dane do przetwornika analogowo-cyfrowego wraz z sygnałami EKG płodu i matki; przekazać EKG matki i płodu najpierw do przedwzmacniacza z 1901 roku. Rejestruj i wyświetlaj wszystkie dane w oprogramowaniu producenta.
    2. Pobrać jednocześnie 1 ml próbki tętniczej od owcy i płodu do analizy gazometrii krwi tętniczej, oznaczania mleczanu, glukozy i nadmiaru zasad (w osoczu) na początku operacji płodu (bezpośrednio po wprowadzeniu pierwszego cewnika tętniczego) i po zamknięciu macicy.
    3. Podczas rekonwalescencji pooperacyjnej należy pobrać próbkę krwi płodu o objętości 3 ml, aby zmierzyć profile zapalne IL-6 i TNF-α. Odwirować osocze w temperaturze 4 °C (4 min, 4 000 x g), zdekantować i przechowywać osocze w temperaturze -80 °C do przeprowadzenia kolejnego testu ELISA.
      Uwaga: Do celów przedstawionych reprezentatywnych wyników, sześć dni po operacji zwierzęta zostały uśmiercone poprzez dożylne wstrzyknięcie 20 ml pentobarbitalu sodu. Wzrost płodu oceniano na podstawie masy ciała, mózgu, wątroby i matki. Czas trwania okresu eksperymentalnego będzie oczywiście różny w zależności od projektu wybranego dla konkretnego pytania badawczego i może sięgać ~6 tygodni.
  4. Analiza cytokin (etap opcjonalny)
    1. Określić stężenia cytokin (IL-6, TNF-α) w osoczu za pomocą specyficznego dla owiec testu ELISA. Wstępnie powleczone mysie przeciwciała monoklonalne przeciwko owcom (przeciwciało wychwytujące IL-6) lub mysie przeciwciało monoklonalne przeciwko bydłu (TNF-α) w stężeniu 4 μg/ml na płytce ELISA w temperaturze 4 °C dla O/N, po 3-krotnym przemyciu buforem płuczącym (0,05% Tween 20 w PBS, PBST).
    2. Zablokuj płytki na 1 godzinę 1% BSA w PBST. Umyj płytki buforem myjącym 3 razy.
    3. Użyj rekombinowanych białek owczych (IL-6, TNF-α) jako standardu ELISA, przygotuj seryjny zakres rozcieńczeń od wzorca 1 2,000 ng / ml do wzorca 7 31,25 pg / ml.
    4. Załadować 50 μl seryjnie rozcieńczonych wzorców białkowych i próbek do dołka i inkubować przez 2 godziny w temperaturze pokojowej, umyć płytki 3 razy. Uruchom wszystkie standardy i próbki w dwóch egzemplarzach.
    5. Zastosować 50 μl króliczych przeciwciał poliklonalnych przeciwko owcom (przeciwciało wykrywające IL-6) lub króliczego przeciwciała poliklonalnego przeciwko bydłu (TNF-α) w rozcieńczeniu 1:250 w studzienkach i inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Przemyć płytki buforem płuczącym 5 razy.
    6. Dodać 50 μl koziej anty-króliczej IgG-HRP sprzężonej (rozcieńczenie 1:5 000) przez 30 minut.
    7. Inkubować z 50 μl roztworu substratu TMB na dołek.
    8. Zatrzymać reakcję rozwoju koloru w pożądanym czasie za pomocą 25 μl 2 N kwasu siarkowego.
    9. Odczytaj płytki na czytniku płytek ELISA przy 450 nm, z korekcją długości fali 570 nm.
      Uwaga: W naszych testach czułość testu ELISA IL-6 wynosiła 16 pg/ml, czułość testu ELISA TNF-α wynosiła odpowiednio 13,9 pg/ml. Dla wszystkich testów współczynniki wariancji wewnątrz i między testami wynosiły odpowiednio <5% i <10%.
  5. Analizy statystyczne
    Uwaga: Dokładne metody statystyczne będą zależeć od pytania badawczego. W niniejszym artykule przedstawiono metody stosowane do badania wszelkich istotnych różnic w gazometrii krwi przedstawionych w Tabeli 2.
    1. Zbadać normalny rozkład danych za pomocą testu Kołmogorowa-Smirnowa, a następnie testów parametrycznych lub nieparametrycznych z dostosowaniem do wielokrotnych porównań, w zależności od potrzeb.
    2. Użyj analizy skupień K-średnich, aby zidentyfikować płody w kohorcie, które były spontanicznie niedotlenione i określić odpowiednie wartości pO2 i O2Sat (rozważ pO2 < 20 mmHg lub O2Sat < 55% jako niedotlenienie płodu). 44-48 Rozdział 44
    3. Do analiz należy używać oprogramowania statystycznego, takiego jak SPSS.
    4. Przedstaw dane jako Mean±SD z różnicami statystycznymi na poziomie p<0,05 uważanymi za istotne.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

U 38 ciężarnych owiec o określonym terminie porodu, w 128±2 dniu ciąży (dGA, ~0,88 okresu ciężności, termin 145 dGA), pod generalną narkozą (zarówno macicy, jak i płodu) oraz z zachowaniem technik sterylnych, wszczepiono cewniki tętnicze, żylne i owodniowe oraz elektrody do elektrokardiografii (ECG). W przypadku ciąży bliźniaczej, na podstawie palpacji i oszacowania średnicy międzyszczkowej, wybierano większego płodu; alternatywnie, aby uniknąć potencjalnego błędu systematycznego, płód do instrumentacji można było wybrać...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Przedstawiono procedury anestezjologiczne i chirurgiczne, które są niezbędne do stworzenia modelu zwierzęcego do badania fizjologii i patofizjologii płodu: przewlekle oprzyrządowanej, nieznieczulonej owcy płodowej.

Należy podkreślić cztery kluczowe kroki w ramach protokołu. Po pierwsze, przepuszczenie cewników i elektrod przez bok matki: ważne jest, aby zrobić to od razu, aby uniknąć urazów narządów wewnętrznych. Po drugie, zabezpieczenie miejsca operacji uterotomii przed eksterioryzacją płodu...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Nie ujawniono żadnych informacji.

Podziękowania

autorzy dziękują za wsparcie finansowe od Molly Towell Perinatal Research Foundation, Canadian Institutes of Health Research (CIHR) oraz Fonds de Recherche du Québec – Santé (FRQS) (do MGF) i CIHR-Quebec Training Network in Perinatal Research (QTNPR) (do LDD).

Autorzy pragną podziękować Esther Simard, Marco Bosa, Carlowi Bernardowi i Carmen Movila za pomoc techniczną.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
ACE Źródło światłaSchott-FostecA20500
Nożyczki preparacyjneFine Science Tools14060 - 11
Kątowe nożyczki preparacyjneFine Science Tools15006 - 09
Rękojeść skalpelaFine Science Tools10003 - 12naprzemienne narzędzie preparacyjne
Zakrzywione ostrza skalpela #12Fine Science Tools10012 - 00naprzemienne narzędzie do preparowania
Nożyczki do kościFine Science Tools16044 - 10
S & Kleszczyki do wiązania szwów TFine Science Tools00272 - 13
Kleszcze Dumont SS - kątoweFine Science Tools11203 - 25 
Nici jedwabne plecione rozmiar 6-0Teleflex Medical07 - 30  - 10
Taśma medycznatranspore3M
Chlorowodorek ketaminy 100 mg/mlHospiraNDC 0409 - 2051 - 05Final Does wynosi 80 mg/kg
Tranqui Ved Injection (ksylazyna 100 mg/ml)VecdoNDC 50989 - 234 - 11Final Does wynosi 10 mg/kg
Reaktywny pomarańczowy 14Sigma - AldrichR - 8254
Ringers Solution SkładnikiRoztwór jest gazem zrównoważonym z 95% O2 i 5% Co2, końcowe pH 7,4
Chlorek soduSigma - AldrichS7653Stężenie końcowe: 118 mM
Chlorek potasuFisher ScientificP217 - 3Stężenie końcowe: 4,7 mM
Dwuwodny chlorek wapniaFisher ScientificC79 - 500Stężenie końcowe: 2,5 mM
Fosforan potasu jednozasadowyFisher ScientificP -285Stężenie końcowe: 1,2 mM
Siarczan magnezuJ.T. BakerJan-00Stężenie końcowe: 0,57 mM
Kwas 4-(2-hydroksyetylo)piperazyno-1-etanosulfonowy (HEPES)Fisher ScientificBP 310 - 500Stężenie końcowe: 5,95 g/l
GlukozaSigma - AldrichG8270Stężenie końcowe: 5,5 mM
LifeWindowDigicare Biomedical Technology
CEDElectronic Design Limited,
Unit 4, Science Park,
Milton Road,
Cambridge CB4 0FE
ANGLIA.		Bioamp: 1902; Przetwornik ADC: micro1401; Oprogramowanie do akwizycji danych: Spike 2, V7.13
Biowzmacniacz sygnału analogowego NeurologDigitimer Ltd
37 Hydeway
Welwyn Garden City
Hertfordshire, AL7 3BE, Anglia		NL108A
ABL800FlexRadiometer Kanada; 200 Aberdeen Dr, Londyn, ON N5V 4N2
Eppendorf 5804REppendorf Kanada; 2810 Argentia Road, #2
Mississauga, Ontario, L5N 8L2
Zestaw do cewnikowania szyjnego ArrowInternational, Inc., 2400 Bernville Road, Reading, PA 19605 USA
Atravet10 mg/ml
Diazepam5 mg/ml
KetaminaKetalar100 mg/ml
Propofol10 mg/ml
SurgiVeTrurki dotchawicze; Smiths Medical ASD, Inc. St. Paul, MN 55112, Stany Zjednoczone
Cewnik do wymiany dróg oddechowych Cooka z adapterami RAPI-FITCook Critical Care 750, Bloomington IN 47402-0489 USA
Dispomed VentilatorDispomed Ltd., 745 Nazaire-Laurin, Joliette, Quebec J6E 0L6
BD Insyte-WBecton Dickinson, Infusion Therapy Systems Inc., 9450 S State St, Sandy Utah 84070 Stany Zjednoczoneod 22 do 20 g; 1 cal [0,9 x 25 mm] do 1,16 cala [1,1 x 30 mm]
Edwards Lifesciences Nr ref.: PX272 Zestaw do monitorowania ciśnienia z jednorazowym oknem ciśnieniowym
LifeWindow LW6000Digicare Biomedical Technology 107 Commerce Road, Boynton Beach, FL 33426-9365 USA
Cewniki
Babcock
SCI (Scientific Commodities Inc.)2 metry
2-0
Castroviejo
elektrokardiogram (EKG)LIFYY, Metrofunk-Union, Berlin, Niemcycztery elektrody miedziane w jednej osłonie, 2 metry
2-O Vicryl
PDS II USP
Trimethoprim sulfadoksyna
Ampicylina
KróciecArgon Medyczny, Kat  041220001APodwójny 4-drożny kran z męskim zamkiem luer
IgłyTyco Healthcare 8881202389Monoject aluminiowe igły piastowe, 22Gx, 0,7mmx 38,1mm: do cewników tętniczych i żylnych płodu
IgłyTyco Healthcare 8881202322Monoject aluminiowe igły piastowe, 16Gx, 1,6mmx38,1mm: do cewników owodniowych
Biowzmacniacz i przetworniki ADC Cambridge TruWave poliwinylowe Gaymar Nożyczki Vicryl 3-0 Vicryl

Bibliografia

  1. Barry, J. S., Anthony, R. V. The pregnant sheep as a model for human pregnancy. Theriogenology. 69, 55-67 (2008).
  2. Morrison, J. L. Sheep models of intrauterine growth restriction: fetal adaptations and consequences. Clin Exp Pharmacol Physiol. 35, 730-743 (2008).
  3. Rees, S., Inder, T. Fetal and neonatal origins of altered brain development. Early Hum Dev. 81, 753-761 (2005).
  4. Rees, S., Harding, R., Walker, D. The biological basis of injury and neuroprotection in the fetal and neonatal brain. Int J Dev Neurosci. 29, 551-563 (2011).
  5. Moisiadis, V. G., Matthews, S. G. Glucocorticoids and fetal programming part 1: Outcomes. Nat rev Endocrinol. 10, 391-402 (2014).
  6. Wang, X., Rousset, C. I., Hagberg, H., Mallard, C. Lipopolysaccharide-induced inflammation and perinatal brain injury. Semin Fetal Neonatal Med. 11, 343-353 (2006).
  7. Gotsch, F., et al. The fetal inflammatory response syndrome. Clin Exp Obstet Gynecol. 50, 652-683 (2007).
  8. Svedin, P., Kjellmer, I., Welin, A. K., Blad, S., Mallard, C. Maturational effects of lipopolysaccharide on white-matter injury in fetal sheep. J child neurol. 20, 960-964 (2005).
  9. Nitsos, I., et al. Chronic exposure to intra-amniotic lipopolysaccharide affects the ovine fetal brain. J Soc Gynecol Investig. 13, 239-247 (2006).
  10. Yan, E., Castillo-Melendez, M., Nicholls, T., Hirst, J., Walker, D. Cerebrovascular responses in the fetal sheep brain to low-dose endotoxin. Pedia res. 55, 855-863 (2004).
  11. Dean, J. M., et al. Delayed cortical impairment following lipopolysaccharide exposure in preterm fetal sheep. Ann Neurol. 70, 846-856 (2011).
  12. Dobbing, J., Sands, J. Comparative aspects of the brain growth spurt. Early Hum Dev. 3 (1), 79-83 (1979).
  13. Liggins, G. C. Premature parturition after infusion of corticotrophin or cortisol into foetal lambs. J Endocrinol. 42, 323-329 (1968).
  14. Liggins, G. C. Premature delivery of foetal lambs infused with glucocorticoids. J Endocrinol. 45, 515-523 (1969).
  15. Liggins, G. C., Fairclough, R. J., Grieves, S. A., Kendall, J. Z., Knox, B. S. The mechanism of initiation of parturition in the ewe. Recent Prog Horm Res. 29, 111-159 (1973).
  16. Morrison, J. L. Sheep models of intrauterine growth restriction: fetal adaptations and consequences. Clin Exp Pharmacol Physiol. 35, 730-743 (2008).
  17. Robinson, J. S., Hart, I. C., Kingston, E. J., Jones, C. T., Thorburn, G. D. Studies on the growth of the fetal sheep. The effects of reduction of placental size on hormone concentration in fetal plasma. J Dev Physiol. 2, 239-248 (1980).
  18. Carmel, E., et al. Fetal brain MRI - experiences in the ovine model of cerebral inflammatory response. Repro sci. 19 (3), 347A-348A (2012).
  19. Samson, N., Dumont, S., Specq, M. L., Praud, J. P. Radio telemetry devices to monitor breathing in non-sedated animals. Respir Physiol Neurobiol. 179, 111-118 (2011).
  20. Thakor, A. S., Giussani, D. A. Effects of acute acidemia on the fetal cardiovascular defense to acute hypoxemia. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 296, R90-R99 (2009).
  21. Green, L. R., Kawagoe, Y., Homan, J., White, S. E., Richardson, B. S. Adaptation of cardiovascular responses to repetitive umbilical cord occlusion in the late gestation ovine fetus. J Physiol. 535, 879-888 (2001).
  22. Unno, N., et al. Changes in adrenocorticotropin and cortisol responsiveness after repeated partial umbilical cord occlusions in the late gestation ovine fetus. Endocrinology. 138, 259-263 (1997).
  23. Muller, T., et al. Developmental changes in cerebral autoregulatory capacity in the fetal sheep parietal cortex. J Physiol. 539, 957-967 (2002).
  24. Keen, A. E., Frasch, M. G., Sheehan, M. A., Matushewski, B., Richardson, B. S. Maturational changes and effects of chronic hypoxemia on electrocortical activity in the ovine fetus. Brain Res. 1402, 38-45 (2011).
  25. Ross, M. G., et al. Correlation of arterial fetal base deficit and lactate changes with severity of variable heart rate decelerations in the near-term ovine fetus. Am J Obstet Gynecol. 208, e281-e286 (2013).
  26. Gunn, A. J., Gunn, T. R., de Haan, H. H., Williams, C. E., Gluckman, P. D. Dramatic neuronal rescue with prolonged selective head cooling after ischemia in fetal lambs. J Clin Invest. 99, 248-256 (1997).
  27. Xu, A., Piorkowska, K., Matushewski, B., Hammond, R., Richardson, B. S. Adaptive Brain Shut-Down Counteracts Neuroinflammation in the Near-Term Ovine Fetus. 60th Meeting of the Society for Gynecologic Investigation, 20 (3), Reproductive Sci. 222A(2013).
  28. Derks, J. B., et al. A comparative study of cardiovascular, endocrine and behavioural effects of betamethasone and dexamethasone administration to fetal sheep. J Physiol Lond. 499, 217-226 (1997).
  29. Lohle, M., et al. Betamethasone effects on fetal sheep cerebral blood flow are not dependent on maturation of cerebrovascular system and pituitary-adrenal axis. J Physiol. 564, 575-588 (2005).
  30. Morrison, J. L., et al. Maternal fluoxetine infusion does not alter fetal endocrine and biophysical circadian rhythms in pregnant sheep. J Soc Gynecol Investig. 12, 356-364 (2005).
  31. Allison, B. J., et al. Ventilation of the very immature lung in utero induces injury and BPD-like changes in lung structure in fetal sheep. Pediatr Res. 64, 387-392 (2008).
  32. Rozance, P. J., et al. Intrauterine growth restriction decreases pulmonary alveolar and vessel growth and causes pulmonary artery endothelial cell dysfunction in vitro in fetal sheep. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 301, L860-L871 (2011).
  33. Fowden, A. L., Giussani, D. A., Forhead, A. J. Endocrine and metabolic programming during intrauterine development. Early hum dev. 81, 723-734 (2005).
  34. Nathanielsz, P. W., Hanson, M. A. The fetal dilemma: spare the brain and spoil the liver. J Physiol. 548, 333(2003).
  35. Manikkam, M., et al. Fetal programming: prenatal testosterone excess leads to fetal growth retardation and postnatal catch-up growth in sheep. Endocrinology. 145, 790-798 (2004).
  36. Savabieasfahani, M., et al. Fetal programming: testosterone exposure of the female sheep during midgestation disrupts the dynamics of its adult gonadotropin secretion during the periovulatory period. Biol Reprod. 72, 221-229 (2005).
  37. Bergen, N. H., et al. Fetal programming alters reactive oxygen species production in sheep cardiac mitochondria. Clin Sci (Lond). 116, 659-668 (2009).
  38. Cox, L. A., et al. A genome resource to address mechanisms of developmental programming: determination of the fetal sheep heart transcriptome. J Physiol. 590, 2873-2884 (2012).
  39. Mahoney, M. M., Padmanabhan, V. Developmental programming: impact of fetal exposure to endocrine-disrupting chemicals on gonadotropin-releasing hormone and estrogen receptor mRNA in sheep hypothalamus. Toxicol Appl Pharmacol. 247, 98-104 (2010).
  40. Blad, S., Welin, A. K., Kjellmer, I., Rosen, K. G., Mallard, C. ECG and Heart Rate Variability Changes in Preterm and Near-Term Fetal Lamb Following LPS Exposure. Reprod Sci. 15, 572-583 (2008).
  41. Frasch, M. G., et al. Heart rate variability analysis allows early asphyxia detection in ovine fetus. Reprod Sci. 16, 509-517 (2009).
  42. Frasch, M. G., Keen, A. E., Gagnon, R., Ross, M. G., Richardson, B. S. Monitoring fetal electrocortical activity during labour for predicting worsening acidemia: a prospective study in the ovine fetus near term. PLoS One. 6, e22100(2011).
  43. Durosier, L. D., et al. Sampling rate of heart rate variability impacts the ability to detect acidemia in ovine fetuses near-term. Front pedia. 2, 38(2014).
  44. Danielson, L., McMillen, I. C., Dyer, J. L., Morrison, J. L. Restriction of placental growth results in greater hypotensive response to alpha-adrenergic blockade in fetal sheep during late gestation. J Physiol. 563, 611-620 (2005).
  45. Edwards, L. J., Simonetta, G., Owens, J. A., Robinson, J. S., McMillen, I. C. Restriction of placental and fetal growth in sheep alters fetal blood pressure responses to angiotensin II and captopril. J Physiol. 515 (Pt 3), 897-904 (1999).
  46. Xu, A., et al. Adaptive brain shut-down counteracts neuroinflammation in the near-term ovine fetus. Front neurol. 5, 110(2014).
  47. Xu, A., et al. The Ovine Fetal and Placental Inflammatory Response to Umbilical Cord Occlusions With Worsening Acidosis. Reprod Sci. 22 (11), (2015).
  48. Wang, X., Durosier, L. D., Ross, M. G., Richardson, B. S., Frasch, M. G. Online detection of fetal acidemia during labour by testing synchronization of EEG and heart rate: a prospective study in fetal sheep. PLoS One. 9, e108119(2014).
  49. Reid, A., Malone, J. Q fever in Ireland A seroprevalence study of exposure to Coxiella burnettii among Department of Agriculture workers. Occ med. 54, 544-547 (2004).
  50. Roest, H. I., Bossers, A., van Zijderveld, F. G., Rebel, J. M. Clinical microbiology of Coxiella burnetii and relevant aspects for the diagnosis and control of the zoonotic disease Q fever. Vet quart. 33, 148-160 (2013).
  51. Neill, T. J., Sargeant, J. M., Poljak, Z. The effectiveness of Coxiella burnetii vaccines in occupationally exposed populations: a systematic review and meta-analysis. Zoonoses and public health. 61, 81-96 (2014).
  52. Roest, H. I., Bossers, A., Rebel, J. M. Q fever diagnosis and control in domestic ruminants. Dev biol. 135, 183-189 (2013).
  53. Frasch, M. G., et al. Fetal body weight and the development of the control of the cardiovascular system in fetal sheep. J physilo. 579, 893-907 (2007).
  54. Rurak, D., Bessette, N. W. Changes in fetal lamb arterial blood gas and acid-base status with advancing gestation. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 304, R908-R916 (2013).
  55. Frasch, M. G., et al. Fetal body weight and the development of the control of the cardiovascular system in fetal sheep. J physiol. 579, 893-907 (2007).
  56. Frasch, M. G., et al. Measures of acidosis with repetitive umbilical cord occlusions leading to fetal asphyxia in the near-term ovine fetus. Am J Obstet Gynecol. 200, 200.e1-207.e1 (2009).
  57. The ESHRE Capri Workshop Group. Multiple gestation pregnancy. Hum reprod. 15, 1856-1864 (2000).
  58. Frasch, M. G. Re The perinatal development of arterial pressure in sheep: effects of low birth weight due to twinning. Reproductive sciences (Thousand Oaks, Calif.). 15, 863-865 (2008).
  59. Hancock, S. N., Oliver, M. H., McLean, C., Jaquiery, A. L., Bloomfield, F. H. Size at birth and adult fat mass in twin sheep are determined in early gestation. J Physiol. 590, 1273-1285 (2012).
  60. Wassink, G., Bennet, L., Davidson, J. O., Westgate, J. A., Gunn, A. J. Pre-existing hypoxia is associated with greater EEG suppression and early onset of evolving seizure activity during brief repeated asphyxia in near-term fetal sheep. PLoS One. 8, e73895(2013).
  61. Mathai, S., et al. Acute on chronic exposure to endotoxin in preterm fetal sheep. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 304, R189-R197 (2013).
  62. Heuij, L. G., et al. Synergistic white matter protection with acute-on-chronic endotoxin and subsequent asphyxia in preterm fetal sheep. J neuroinflam. 11, 89(2014).
  63. Gagnon, R., Challis, J., Johnston, L., Fraher, L. Fetal endocrine responses to chronic placental embolization in the late-gestation ovine fetus. Am J Obstet Gynecol. 170, 929-938 (1994).
  64. Miller, S. L., Supramaniam, V. G., Jenkin, G., Walker, D. W., Wallace, E. M. Cardiovascular responses to maternal betamethasone administration in the intrauterine growth-restricted ovine fetus. Am J Obstet Gynecol. 201, 613.e1-613.e8 (2009).
  65. Regnault, T. R., et al. The relationship between transplacental O2 diffusion and placental expression of PlGF, VEGF and their receptors in a placental insufficiency model of fetal growth restriction. J Physiol. 550, 641-656 (2003).
  66. Wallace, J. M., Aitken, R. P., Cheyne, M. A. Nutrient partitioning and fetal growth in rapidly growing adolescent ewes. J reprod and fertil. 107, 183-190 (1996).
  67. Rakers, F., et al. Effects of early- and late-gestational maternal stress and synthetic glucocorticoid on development of the fetal hypothalamus-pituitary-adrenal axis in sheep. Stress. 16, 122-129 (2013).
  68. Jiang, Y., et al. The sheep genome illuminates biology of the rumen and lipid metabolism. Science. 344, 1168-1173 (2014).
  69. Begum, G., et al. Epigenetic changes in fetal hypothalamic energy regulating pathways are associated with maternal undernutrition and twinning. FASEB J. 26, 1694-1703 (2012).
  70. Byrne, K., et al. Genomic architecture of histone 3 lysine 27 trimethylation during late ovine skeletal muscle development. Anim Genet. 45, 427-438 (2014).
  71. Lie, S., et al. Impact of embryo number and maternal undernutrition around the time of conception on insulin signaling and gluconeogenic factors and microRNAs in the liver of fetal sheep. Am J physiol Endocrinol. 306, E1013-E1024 (2014).
  72. Nicholas, L. M., et al. Differential effects of maternal obesity and weight loss in the periconceptional period on the epigenetic regulation of hepatic insulin-signaling pathways in the offspring. FASEB J. 27, 3786-3796 (2013).
  73. Wang, K. C., et al. Low birth weight activates the renin-angiotensin system, but limits cardiac angiogenesis in early postnatal life. Physiol rep. 3, (2015).
  74. Zhang, S., et al. Periconceptional undernutrition in normal and overweight ewes leads to increased adrenal growth and epigenetic changes in adrenal IGF2/H19 gene in offspring. FASEB J. 24, 2772-2782 (2010).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Instrumentacja płodu owcywprowadzenie cewników naczyniowychimplantacja kabli elektrokardiograficznychpobieranie płynu owodnioczegomonitorowanie matki i płoduchirurgiczne zamknięcie macicyocena rekonwalescencji pooperacyjnejodpowiedź na zaburzenia fizjologiczneanaliza gazometryczna krwi
Oprzyrządowanie owiec w okresie bliskim donoszonego do wielowymiarowych przewlekłych nagrań bez znieczulenia
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.