Artykuł metodologiczny

Nowatorski biopanning oparty na mikroskopii sił atomowych do izolacji odczynników specyficznych dla morfologii przeciwko wariantom TDP-43 w stwardnieniu zanikowym bocznym

DOI:

10.3791/52584

⸱

12 lutego 2015

 ,  ,  ,  ,  , 
1School for Engineering of Matter, Transport and Energy, Arizona State University, 2Department of Neurology, Georgetown University Medical Center, 3Department of Pathology, Georgetown University Medical Center

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Korzystając z mikroskopii sił atomowych w połączeniu z technologią biopanoramowania, stworzyliśmy negatywny i pozytywny system biopanowania, aby uzyskać przeciwciała przeciwko specyficznym dla choroby wariantom białek obecnym w dowolnym materiale biologicznym, nawet w niskich stężeniach. Udało nam się uzyskać przeciwciała przeciwko wariantom białka TDP-43 zaangażowanym w stwardnienie zanikowe boczne.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ponieważ warianty białek odgrywają kluczową rolę w wielu chorobach, w tym TDP-43 w stwardnieniu zanikowym bocznym (ALS), alfa-synukleina w chorobie Parkinsona oraz beta-amyloid i tau w chorobie Alzheimera, niezwykle ważne jest opracowanie odczynników specyficznych dla morfologii, które mogą selektywnie celować w te specyficzne dla choroby warianty białek, aby zbadać rolę tych wariantów w patologii choroby oraz do potencjalnych zastosowań diagnostycznych i terapeutycznych. Opracowaliśmy nowatorskie techniki biopanoramowania oparte na mikroskopii sił atomowych (AFM), które umożliwiają izolację odczynników, które selektywnie rozpoznają warianty białek specyficzne dla choroby. W proces ten zaangażowane są dwie kluczowe fazy, negatywna i pozytywna faza panoramowania. Podczas ujemnej fazy płukania fagi, które są reaktywne na antygeny poza celem, są eliminowane przez wiele rund subtraktywnego panoramowania przy użyciu serii starannie dobranych antygenów poza celem. Kluczową cechą ujemnej fazy panoramowania jest wykorzystanie obrazowania AFM do monitorowania procesu i potwierdzenia, że wszystkie niepożądane cząstki fagów zostały usunięte. W przypadku dodatniej fazy panoramowania docelowy antygen będący przedmiotem zainteresowania jest utrwalany na powierzchni miki, a związane fagi są eluowane i poddawane badaniom przesiewowym w celu zidentyfikowania fagów, które selektywnie wiążą docelowy antygen. Docelowy wariant białka nie musi być oczyszczany, pod warunkiem że zastosowano odpowiednie kontrole ujemne. Nawet docelowe warianty białek, które są obecne tylko w bardzo niskich stężeniach w złożonym materiale biologicznym, mogą być wykorzystane w dodatnim etapie płukania. Dzięki zastosowaniu tej technologii uzyskaliśmy przeciwciała przeciwko wariantom białkowym TDP-43, które są selektywnie znajdowane w tkance mózgowej ludzkiego ALS. Oczekujemy, że protokół ten powinien mieć zastosowanie do generowania odczynników, które selektywnie wiążą warianty białek obecne w wielu różnych procesach biologicznych i chorobach.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Obecność wariantów białek została uznana za czynnik powodujący postęp wielu chorób, w tym chorób neurodegeneracyjnych, takich jak choroba Alzheimera, Parkinsona, ALS i otępienie czołowo-skroniowe (FTD)1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11. Uważa się, że oligomeryczne formy białek beta-amyloidu i alfa-synukleiny są gatunkami toksycznymi odpowiedzialnymi odpowiednio za chorobę Alzheimera i Parkinsona2,3,4,5. Agregaty białka wiążącego DNA TAR 43 (TDP-43) zostały połączone z ALS i FTD12,13,14. Dlatego odczynniki, takie jak przeciwciała, które mogą selektywnie celować w różne warianty białka, mogą być potężnymi narzędziami służącymi jako markery diagnostyczne i potencjalne terapie. W tym badaniu skupiliśmy się na opracowaniu odczynników, które selektywnie wiążą warianty białka TDP-43 zaangażowane w ALS, jednak technika opisana w tym artykule powinna mieć zastosowanie do izolacji odczynników przeciwko szerokiemu zakresowi wariantów białek.

Cytoplazmatyczna agregacja TDP-43 została zidentyfikowana jako cecha patologiczna w ALS15,16,17,18,19. Zazwyczaj TDP-43 znajduje się w jądrze wszystkich komórek od normalnego osobnika, chociaż ma tendencję do przemieszczania się między cytozolem a jądrem15,17. Jednak w ALS zagregowane formy TDP-43 są wykrywane w cytoplazmie wybranych neuronów i gleju, a niższe stężenia znajdują się w jądrze, co sugeruje ruch TDP-43 z jądra do cytoplazmy podczas progresji choroby16,20. Chociaż agregacja TDP-43 występuje w większości przypadków ALS, nie obejmuje wszystkich przypadków, ponieważ 1%-2% wszystkich przypadków ALS (lub 15%-20% rodzinnych przypadków ALS) jest związanych z mutacjami w genie dysmutazy ponadtlenkowej 1 (SOD1)15,17. Ze względu na ważną rolę TDP-43 w zdecydowanej większości przypadków ALS, tutaj skupiamy się na opracowaniu odczynników na bazie przeciwciał, które mogą selektywnie wiązać się z wariantami TDP-43 obecnymi w ludzkiej tkance mózgowej ALS, wykorzystując nasze nowatorskie techniki biopanoramowania oparte na AFM.

Początkowo potrzebujemy zróżnicowanego repertuaru domen wiążących przeciwciała. Połączyliśmy trzy różne biblioteki fragmentów przeciwciał o zmiennym łańcuchu z pojedynczym łańcuchem (scFvs) (biblioteki Tomlinson I i J oraz Sheets21). Proces panoramowania jest podzielony na ujemną i dodatnią fazę panoramowania. Fagi z bibliotek są najpierw poddawane negatywnemu procesowi panoramowania, podczas którego fagi reagujące na wiele antygenów poza celem są wykluczane. Po zakończeniu każdej rundy ujemnego panoramowania względem każdego antygenu poza celem, proces jest monitorowany za pomocą obrazowania AFM, aby upewnić się, że wszystkie fagi wiążące antygeny poza celem zostały usunięte. Dopiero po sprawdzeniu za pomocą obrazowania AFM, że wszystkie reaktywne fagi zostały usunięte, przechodzimy do następnego celu. Aby wyizolować odczynniki przeciwko wariantom TDP-43 związanym z ALS, wykorzystaliśmy następujące ujemne antygeny panoramujące: 1) BSA do usunięcia fagów, które wiążą się słabo lub niespecyficznie z białkami; 2) zagregowana alfa-synukleina w celu usunięcia fagów, które wiążą się z ogólnymi elementami strukturalnymi zagregowanych białek; 3) homogenaty ludzkiej tkanki mózgowej w celu usunięcia fagów, które wiążą się z jakimikolwiek białkami lub innymi składnikami obecnymi w próbkach pośmiertnych zdrowej ludzkiej tkanki mózgowej; 4) immunoprecypitowane TDP-43 ze zdrowego ludzkiego mózgu w celu usunięcia fagów, które wiążą się ze wszystkimi formami TDP-43 związanymi ze zdrowym ludzkim mózgiem; i 5) immunoprecypitowany TDP-43 wyizolowany z homogenatów mózgu FTD w celu usunięcia faga, który wiąże warianty TDP-43 związane z patologią inną niż ALS. Po usunięciu wszystkich fagów reagujących na wszystkie antygeny poza celem, przeszliśmy do fazy dodatniego płukania, podczas której izolowane są fragmenty przeciwciał wiążące interesujący nas antygen, w tym przypadku TDP-43 immunoprecypitowane z ludzkiej tkanki mózgowej ALS. Te wyizolowane przeciwciała mogą reagować na zagregowane lub zmodyfikowane formy TDP-43.

Konwencjonalne biopanowanie fagów skupia się głównie na dodatniej fazie płukania22,23. Zwykle cel zainteresowania jest unieruchomiony, dodawana jest biblioteka fagów i związane fagi są eluowane. Fagi są następnie amplifikowane i ponownie dodawane do celu. Ten proces amplifikacji i inkubacji jest zwykle powtarzany kilka razy w celu zwiększenia procentu faga pozytywnie wiążącego. Chociaż odmiany tego procesu były szeroko stosowane do izolowania odczynników przeciwciał przeciwko szerokiej gamie antygenów docelowych, na ogół wymagają one dużych ilości oczyszczonego antygenu docelowego24,25,26,27, podczas gdy nasz proces wymaga tylko śladowych ilości docelowego antygenu. Opisany tutaj protokół może być stosowany do izolowania odczynników, które selektywnie wiążą docelowe antygeny, które są obecne w bardzo niskich stężeniach, bez konieczności oczyszczania, a płukanie można przeprowadzić bezpośrednio przeciwko antygenowi obecnemu w złożonych próbkach tkanek. Stosowanie wyczerpujących protokołów płukania ujemnego, zweryfikowanych przez AFM, zapewnia, że klony wyizolowane przeciwko dodatniemu antygenowi powinny selektywnie wiązać cel, nawet jeśli nie są oczyszczone ani wzbogacone.

Kasturirangan i współpracownicy (2003) przeprowadzili podobny negatywny i pozytywny proces biopanowania, aby wyizolować przeciwciała reagujące na oligomeryczny beta-amyloid przy użyciu stężenia nanogramów celu5. W tym miejscu rozwijamy ten proces, aby umożliwić generowanie odczynników, które selektywnie wiążą specyficzne dla choroby warianty białek bezpośrednio z próbek tkanek ludzkich. W przyszłych badaniach zamierzamy dalej badać nie tylko wartość diagnostyczną wyizolowanych tu odczynników, ale także ocenić ich znaczenie terapeutyczne w leczeniu ALS.

Ogólnie rzecz biorąc, nasza nowatorska technologia biopanowania oparta na AFM powinna być stosowana do izolacji dowolnego wariantu białka specyficznego dla choroby w dowolnym materiale biologicznym bez potrzeby oczyszczania lub modyfikacji białka, nawet jeśli docelowe stężenia antygenu są bardzo niskie.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Produkcja fagów

  1. Wszystkie procesy produkcji fagów i biopanacji należy wykonywać w komorze bezpieczeństwa biologicznego. Wyprodukuj cząstki fagów z różnych bibliotek (biblioteki Tomlinson I i J oraz biblioteka Arkuszy21) do procesu biopanoramowania, korzystając z instrukcji producenta (http://www.lifesciences.sourcebioscience.com/media/143421/tomlinsonij.pdf).
    UWAGA: W naszym procesie panoramowania używamy wielu bibliotek, aby zwiększyć różnorodność dostępnych przeciwciał.
  2. Krótko mówiąc, hodowle bakterii z trzech bibliotek umieszcza się w 200 ml 2xYT zawierającego 1% glukozy i 100 μg/ml ampicyliny na wytrząsarce w temperaturze 37 °C, aż OD600 wyniesie 0,4.
  3. Dodaj 8 x 1011 faga pomocniczego KM13 do 200 ml bibliotek Tomlinson I i J oraz 8 x 1011 faga pomocniczego VCSM13 do 200 ml biblioteki Sheets. Próbki biblioteczne inkubować z fagiem pomocniczym przez 30 minut w temperaturze 37 °C bez wstrząsania.
  4. Odwirować kultury przy 3 000 x g przez 10 minut i ponownie zawiesić osad komórkowy w 200 ml 2xYT z 0,1% glukozą, 100 μg/ml ampicyliny i 50 μg/ml kanamycyny.
  5. Inkubować kultury O/N w temperaturze 30 °C z wytrząsaniem, a następnie wirować przez 30 minut w temperaturze 3 300 x g następnego dnia.
  6. Dodać 50 ml glikolu polietylenowego (PEG) 8000 w 2,5 M NaCl do 200 ml supernatantu z każdej z bibliotek i inkubować na lodzie przez 1 godzinę. Po wytrąceniu PEG ponownie wirować roztwory przez 30 minut w temperaturze 3 300 x g.
  7. Dodać 1-2 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) do osadu komórkowego (w zależności od wielkości osadu) i przenieść do probówek mikrowirówek.
  8. Cząstki faga inkubować na lodzie przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C z okazjonalnym mieszaniem, a następnie odwirować przez 10 minut w temperaturze 11 600 x g. Zebrać supernatant i przechowywać w temperaturze -80 °C.
  9. Przed zamrożeniem przenieś niewielką objętość cząstek faga z trzech bibliotek do innej probówki mikrowirówki i określ miano każdej biblioteki indywidualnie za pomocą komórek TG1 w celu określenia stężenia. Poniżej znajduje się opis procesu mianowania dla jednej biblioteki.
    1. Wyhoduj komórki TG1 do OD600 0,4. Dodać 990 μl PBS do 6 probówek do mikrowirówek.
    2. Do pierwszej probówki dodać 10 μl cząstek faga. Po wymieszaniu wyjąć 10 μl z probówki pierwszej i dodać do probówki 2. Powtórz ten krok dla pozostałych 4 probówek.
    3. Dodać 200 μl komórek TG1 do 6 probówek i dodać 10 μl każdego z sześciu rozcieńczeń fagów do tych probówek. Pozostawić cząstki faga do zakażenia przez 30 minut bez wstrząsania w temperaturze 37 °C.
    4. Umieścić 100 μl komórek na płytkach agarowych Luria-Bertani ze 100 μg/ml ampicyliny (LBA). Inkubować O/N w temperaturze 37 °C, a następnie oznaczyć pfu/ml na podstawie liczby widocznych kolonii.

2. Negatywny proces biopanowania

UWAGA: Unikaj zbyt wielu zamrażalnych rozmrażania fagów podczas procesu biopanningu. Najlepiej jest wykonać jak najwięcej negatywnych etapów panoramowania w ciągu jednego dnia. Po zakończeniu rund ujemnego lub dodatniego panoramowania względem każdego celu, ważne jest, aby zachować część faga na wypadek zanieczyszczenia na dowolnym etapie.

  1. 12 rund ujemnego płukania albuminy surowicy bydlęcej (BSA)
    1. Dodać 4 ml roztworu BSA o stężeniu 1 mg/ml w PBS do 12 immunoprobówek i inkubować O/N w temperaturze 4 °C.
    2. Połącz 1 x 1012 cząstek fagowych z każdej z trzech bibliotek (odłóż niewielką ilość tej mieszaniny fagów do przyszłej weryfikacji negatywnego procesu płukania).
    3. Wyrzuć roztwór BSA z pierwszej probówki i umyj probówkę 2-3 razy PBS, aby usunąć wszelkie niezwiązane BSA.
    4. Dodaj połączone biblioteki fagów do tej pierwszej probówki, inkubuj przez 30 minut w temperaturze pokojowej na rotatorze i zbierz niezwiązane fagi.
    5. Powtórzyć krok 2.1.3 z drugą immunoprobówką i dodać pobrany z kroku 2.1.4 do tej immunoprobówki. Powtórz krok 2.1.4.
    6. Powtórzyć kroki 2.1.3-2.1.4 z pozostałymi 10 probówkami roztworu BSA i niezwiązanym fagiem pobranymi po każdej inkubacji.
    7. Aby zweryfikować usunięcie wszystkich spoiw fagowych BSA, należy użyć AFM. Dodać oddzielnie 10 μl faga z etapu 2.1.2 i 10 μl pozostałego faga po etapie 2.1.7 do 10 μg/ml BSA związanego z rozszczepioną miką. Skrócona wersja procesu AFM została przedstawiona w sekcji 8.
    8. Ważne jest, aby zachować niewielką ilość faga po zakończeniu licznych rund ujemnego panoramowania względem każdego celu, aby zweryfikować powodzenie procesu płukania.
  2. 10 rund negatywnego panoramowania przeciwko różnym formom alfa-synukleiny
    UWAGA: W tym projekcie chcemy usunąć fagi, które mogłyby wiązać inne zagregowane formy białek, takie jak alfa-synukleina (monomer, dimer, trimer itp.), a więc wyeliminujemy dowolny z tych fagów (celem jest wyeliminowanie jak największej liczby fagów reagujących krzyżowo). Pozostawić oczyszczoną alfa-synukleinę do agregacji przez co najmniej 7 dni, tak aby obecne były zarówno formy monomeryczne, jak i oligomeryczne do ujemnego panoramowania.
    1. Przygotować 4 immunoprobówki z 500 μg/ml zagregowanej alfa-synukleiny w PBS i 4 immunoprobówki z 100 μg/ml zagregowanej alfa-synukleiny i inkubować O/N w temperaturze 4 °C.
    2. Odrzucić roztwór z jednej z probówek z 500 μg/ml zagregowanej alfa-synukleiny, przemyć PBS i dodać bibliotekę fagów zebraną po 12 rundach ujemnego płukania BSA.
    3. Inkubować probówkę przez 30 minut w temperaturze pokojowej na rotatorze i zebrać niezwiązane fagi.
    4. Powtórzyć kroki 2.2.3 i 2.2.4 dla pozostałych probówek z 500 μg/ml zagregowanej alfa-synukleiny, a następnie probówek z 100 μg/ml zagregowanej alfa-synukleiny, używając niezwiązanego faga pobranego za każdym razem po kroku 2.2.4.
    5. Powtórzyć krok 2.1.8, używając faga po pierwszym z ujemnych prób płukania na 500 μg/ml zagregowanej alfa-synukleiny i faga po ósmej rundzie ujemnego płukania na 100 μg/ml alfa-synukleiny.
    6. Aby wyeliminować wszystkie ujemne spoiwa przeciwko alfa-synukleinie, przygotuj dwie dodatkowe immunoprobówki z 500 μg/ml zagregowanej alfa-synukleiny i powtórz kroki 2.2.2-2.2.4.
  3. 10 rund negatywnego panoramowania przeciwko zdrowemu homogenatowi ludzkiej tkanki mózgowej
    1. Dodaj 1x bufor STEN (50 mM Tris (pH 7,6), 150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 0,2% NP-40, 0,2% BSA, 20 mM PMSF i inhibitor koktajlu proteazy) do ludzkiej tkanki mózgowej28. Homogenizować przy 24 000 obr./min przez 1 min, odwirować próbki z prędkością 3 000 obr./min i zebrać supernatant.
    2. Przygotować 2 immunoprobówki z 2 ml 50 μg/ml ludzkiej tkanki mózgowej w PBS i 8 immunoprobówek z 10 μg/ml ludzkiej tkanki mózgowej i inkubować O/N w temperaturze 4 °C.
    3. Powtórzyć kroki 2.2.3-2.2.5 najpierw z probówkami zawierającymi 50 μg/ml ludzkiej tkanki mózgowej, a następnie z probówkami zawierającymi 10 μg/ml ludzkiej tkanki mózgowej, używając niezwiązanego faga pobranego po ujemnym płukaniu przeciwko alfa-synukleinie.
    4. Powtórzyć krok 2.1.8, używając faga po pierwszym z ujemnych prób płukania na 50 μg/ml ludzkiej tkanki mózgowej i faga po dziesiątej rundzie ujemnego płukania na ludzkiej tkance mózgowej.
  4. 8 rund negatywnego panoramowania przeciwko zdrowemu immunoprecypitowanemu TDP-43
    1. Immunoprecypitować zdrowe białko TDP-43 ze zdrowej ludzkiej tkanki mózgowej przy użyciu protokołu opisanego w punkcie 9. Ze względu na mniejszą ilość białka immunoprecypitowanego, należy przeprowadzić te rundy ujemnego płukania za pomocą miki.
    2. Rozetnij osiem powierzchni miki.
    3. Do pierwszej miki dodać ~100 μl 5 μg/ml białka immunoprecypitowanego i inkubować przez 5-10 minut w temperaturze pokojowej.
    4. Umyj mikę 5 razy 0,1% PBS za pomocą Tween 20 (PBST).
    5. Dodaj ~100 μl faga po ujemnym płukaniu na zdrową tkankę mózgową i inkubuj przez 5-10 minut w temperaturze pokojowej.
    6. W połowie inkubacji kroku 2.4.5 przeprowadzić etap 2.4.3 przy użyciu drugiej miki.
    7. Zebrać z kroku 2.4.5 i przemyć mikę 5 razy 0,1% PBST.
    8. Umyj mikę z kroku 2.4.6 i dodaj faga z 2.4.7.
    9. Powtarzać kroki od 2.4.4 do 2.4.9, aż zostanie ujemnie przesunięty w stosunku do wszystkich ośmiu mik z białkiem wytrąconym immunologicznie. Powtórzyć krok 2.1.7 przy użyciu faga po pierwszej i ósmej rundzie ujemnego panoramowania.
  5. 2 rundy ujemnego panoramowania przeciwko immunoprecypitowanemu TDP-43 FTD
    1. Immunoprecypitacja białka TDP-43 z mózgów osób z FTD.
    2. Rozetnij 2 powierzchnie miki.
    3. Dodać 50 μl z 10 μg/ml FTD TDP-43 do jednej miki. Inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
    4. Umyj mikę 5 razy 0,1% PBST.
    5. Dodać 50 μl faga zebranego po ujemnym płukaniu w stosunku do zdrowego TDP-43. Inkubować przez 5 minut.
    6. Zbierz niezwiązane fagi.
    7. Powtarza kroki od 2.5.3 do 2.5.6 z drugą miką i niezwiązanym fagiem zebranymi w 2.5.6.

3. Dodatnie płukanie przeciwko immunoprecypitowanemu TDP-43 od osób z ALS

  1. Immunoprecypitacja białka TDP-43 z mózgów osób z ALS. Rozetnij 3 powierzchnie miki. Dodać 50 μl z 10 μg/ml ALS TDP-43 do jednej miki. Inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Umyć mikę 5 razy 0,1% PBST.
  2. Dodać 50 μl faga zebranego po ujemnym płukaniu przeciwko zdrowemu TDP-43 do miki. Inkubować przez 5 minut.
  3. Zbierz niezwiązane fagi. Zbierz również związane fagi za pomocą trzech metod elucji. Ważne jest, aby wszystkie zebrane fagi w tych etapach panoramowania były oddzielone.
    1. Najpierw dodaj 50 μl trypsyny (1 mg/ml w PBS) do każdej miki i inkubuj nie dłużej niż 10 minut. Zbierz roztwór i zapisz. Następnie dodaj 50 μl 100 mM trietyloaminy (TEA) do każdej miki i inkubuj nie dłużej niż 10 minut. Zebrać roztwór, dodać równą objętość 1 M buforu Tris-HCl o pH 7,4 i zachować.
    2. Po trzecie, dodać 50 μl TG1 przy OD600 0,4 bezpośrednio do miki i inkubować przez 30 minut w temperaturze 37 °C. Dodać również fagi zebrane z dwóch metod elucji w ppkt 3.3.1 do 100 μl TG1 przy OD600 0,4 i inkubować przez 30 minut w temperaturze 37 °C.
  4. Powtórz kroki 3.1 z drugą miką.
  5. Pobrać niezwiązany zebrany w ppkt 3.3.2 przy użyciu pierwszej miki z ALS TDP-43 i dodać go do drugiej miki z ALS TDP-43. Inkubować przez 5 minut.
  6. Powtórz wszystkie kroki opisane w ppkt 3.3 dla tych drugich zestawów miki.
  7. Połącz komórki TG1 zakażone fagami eluowanymi trypsyną z dwóch mików ALS TDP-43 i płytki na płytkach LBA. Powtórz ten sam proces dla fagów eluowanych TEA i TG1 z dwóch mików ALS TDP-43, co daje w sumie trzy płytki.
    UWAGA: Ze względu na udział TDP-43 zarówno w ALS, jak i FTD, niektóre z klonów wyizolowanych w dwóch rundach pozytywnego panoramowania przeciwko ALS TDP-43 mogą być specyficzne dla tego celu, ale niektóre mogą również wiązać FTD. Aby lepiej wyizolować klony specyficzne dla ALS, weź niezwiązanego faga zebranego po 2 rundach ujemnego panoramowania przeciwko FTD TDP-43 (ponieważ te dwie rundy negatywnego panoramowania powinny usunąć każdy cel, który jest reaktywny na FTD TDP-43) i użyj tych fagów w jeszcze jednej rundzie dodatniego panoramowania przeciwko antygenowi ALS TDP-43 na mice (przygotuj mikę ALS TDP-43, jak opisano powyżej w 3.3 i 3.4).
  8. Powtórzyć wszystkie czynności opisane w ppkt 3.3 z tą trzecią miką ALS i umieścić zakażone komórki TG1 na trzech płytkach LBA O/N w temperaturze 37 °C. Następnego dnia policz liczbę kolonii na 6 płytkach LBA z potencjalnymi klonami ALS. Na trzech płytkach LBA powinno być mniej kolonii z potencjalnymi klonami ALS po trzeciej rundzie dodatniego panoramowania w porównaniu z trzema płytkami LBA po dwóch rundach dodatniego panoramowania.

4. Hodowla i produkcja fagów potencjalnych pozytywnych klonów przeciwko specyficznemu dla ALS TDP-43

  1. Hoduj każdą rodzinę z 6 płytek na 96-dołkowych płytkach zawierających 100 μl 2xYT z 1% glukozy i 100 μg/ml ampicyliny na wytrząsarce w temperaturze 37 °C O/N.
  2. Następnego dnia przenieść 10 μl z dołków zawierających klony z 3 płytek LBA po trzeciej rundzie dodatniego płukania białkiem ALS TDP-43 do probówek mikrowirówkowych zawierających 1 ml 2xYT z 1% glukozy i 100 μg/ml ampicyliny.
  3. Dodać glicerol do wszystkich kultur na płytkach 96-dołkowych do końcowego stężenia 15% i zamrozić płytki w temperaturze -80 °C. Pozostawić 1 ml kultur do wzrostu przez 2-3 godziny, wstrząsając w temperaturze 37 °C.
  4. Dodać 109 faga pomocniczego KM13 i pozwolić fagowi pomocniczemu na zakażenie przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C z wytrząsaniem. Odwirować komórki przez 10 minut przy 3 000 x g, odrzucić supernatant i dodać 1 ml 2xYT z 0,1% glukozą, 100 μg/ml ampicyliny i 50 μg/ml kanamycyny.
  5. Hodować komórki O/N w temperaturze 30 °C z wytrząsaniem. Odwirować probówki o stężeniu 3 300 x g przez 30 minut, przenieść supernatant do nowych probówek do mikrowirówek i dodać 250 μl PEG/NaCl do każdej probówki.
  6. Inkubować probówki na lodzie przez 1 godzinę. Ponownie odwirować probówki przy 3 300 x g przez 30 minut, odrzucić supernatant i dodać 100 μl PBS do każdej probówki.
  7. Inkubować probówki na lodzie przez 1 godzinę. Wirować probówki przez 10 minut w temperaturze 11 600 x g i przenieść supernatant do nowych probówek. Przechowywać fagi w temperaturze -80 °C.

5. Sekwencjonowanie potencjalnych klonów ALS

  1. Powtórzyć krok 4.2 i pozostawić kulturom do wzrostu O/N w temperaturze 37 °C, wstrząsając. Następnego dnia należy przeprowadzić przygotowanie plazmidu DNA klonów zgodnie z instrukcjami producenta. Sekwencjonuj klony za pomocą odpowiednich starterów do przodu i do tyłu.

6. Badanie przesiewowe potencjalnie dodatnich klonów przeciwko specyficznemu dla ALS TDP-43 przy użyciu pośredniego testu ELISA

  1. Dodać 100 μl z 2,5 μg/ml ALS, FTD i zdrowej ludzkiej tkanki mózgowej do studzienek płytki ELISA o wysokim poziomie wiązania dla każdego potencjalnego klonu ALS. Inkubować płytki w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę, powoli wstrząsając.
  2. Umyj płytki 3 razy 0,1% PBST. Dodać 200 μl 2% mleka w proszku z PBS do dołka i inkubować płytki w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę, powoli wstrząsając.
  3. Powtórzyć etap przemywania i następnie dodać do studzienek 100 μl każdego faga rozcieńczonego co najmniej 1/100 w PBS. Po etapach inkubacji i przemywania dodać 100 μl 1/1,000 anty-M13 HRP do każdej studzienki. Umyj płytki i zwizualizuj za pomocą zestawu substratów do chemiluminescencji femto ELISA.

7. Produkcja i badanie przesiewowe scFv za pomocą pośredniego testu ELISA

  1. Hoduj komórki HB 2151 do OD600 0,4. Dodać 5 μl różnych fagów do 20 μl komórek HB 2151. Pozostawić fagi na 30 minut do zakażenia w temperaturze 37 °C bez wstrząsania. Podziel płytki LBA na siatki tak, aby na każdej z nich można było posiać około 20 klonów.
  2. Dodać 5-10 μl każdej bakterii zakażonej fagiem do płytki i inkubować O/N w temperaturze 37 °C. Następnego dnia dodać pojedyncze kolonie do 1 ml 2xYT z 0,1% glukozy i 100 μg/ml ampicyliny i wstrząsać w temperaturze 37 °C przez 3-4 godziny, aż OD600 wyniesie 0,6.
  3. Dodać 1 μl 1 M izopropylotiogalaktozydu (IPTG) do każdej probówki i inkubować O/N w temperaturze 30 °C, wstrząsając. Wirować probówki o masie 11 600 x g przez 10 minut i zebrać supernatant do testu ELISA.
  4. W przypadku testu ELISA należy postępować zgodnie z tymi samymi procedurami, co w sekcji 6, z wyjątkiem tego, że zamiast faga w 6.5 należy dodać scFv w postaci nierozcieńczonej, a w przypadku 6.6 dodać 100 μl 1/1 000 9e10 HRP.

8. Proces AFM

  1. Dodać 10-20 μl docelowego antygenu do rozszczepionej miki i inkubować przez 5-10 min. Umyć mikę 5 razy wodą. Dodać 10-20 μl fagów do miki i inkubować przez 5-10 min.
  2. Umyj mikę ponownie 5 razy wodą i pozostaw mikę do wyschnięcia na powietrzu. Wizualizacja wiązania fagów za pomocą AFM1. Wykonaj proces obrazowania AFM w trybie stukania AFM ze sterownikiem Nanoscope IIIa w powietrzu przy RT29. Krzemowe sondy AFM mają częstotliwość rezonansową 300 kHz i stałą sprężystości 40 N/m. Użyj częstotliwości skanowania 3,05 Hz i rozdzielczości skanowania 512 próbek na linię.
  3. Przetwarzaj obrazy poprzez podstawowe spłaszczanie tła, aby upewnić się, że wszystkie rozmiary cząstek są porównywalne na każdym obrazie. Szerokość faga (nie długość) może się różnić w zależności od obrazu ze względu na inne rozmiary cząstek i obszar skanowania, ale nigdy nie wpłynie to negatywnie na dokładność tego, czy wiąże się z antygenem, czy nie.
  4. Jeśli podczas weryfikacji AFM dla każdego zestawu ujemnych fagów panoramujących są widoczne na mice, przed przejściem do następnego zestawu ujemnego panoramowania należy wykonać rundy addycyjne, aż nie zostaną wykryte żadne fagi.

9. Immunoprecypitacja antygenu docelowego

  1. Aby wyizolować docelowy antygen (TDP-43), dodaj 250 μg homogenizowanej tkanki mózgowej (z kory ruchowej), 100 μl rozcieńczenia 1/100 przeciwciała poliklonalnego anty-TDP 43 i 1x bufor STEN do całkowitej objętości 700 μl do probówkiEppendorfa 28.
  2. Inkubować O/N w temperaturze 4 °C na rotatorze. Przemyj kulki agarozy A/G 1x buforem STEN 2-3 razy i dodaj 25 ml do mieszanki tkankowej. Inkubować w temperaturze 4 °C przez 1,5 godziny na rotatorze, a następnie odwirowywać przy 2 000-4 000 obr./min przez 1 min.
  3. Usunąć supernatant i przemyć osad raz 1x buforem STEN i 5 razy PBS. Dodać 40-60 μl 1x buforu STEN do granulki i gotować przez 5 minut. Po ostygnięciu próbek odwirować i zebrać supernatant. Użyj SDS-PAGE i Western blot, aby zweryfikować powodzenie procesu immunoprecypitacji30.

10. Analiza plam punktowych

  1. Pokrój papier nitrocelulozowy na małe prostokąty dla każdego klonu, który będzie testowany. Umieść 2 μl próbek ALS, FTD i zdrowej ludzkiej tkanki mózgowej na bibułce nitrocelulozowej i pozostaw do całkowitego wyschnięcia.
  2. Dodać 1-2 ml 5% mleka w proszku do PBS i pozostawić na 1 godzinę w temperaturze pokojowej
  3. Dodać 1 ml rozcieńczenia 1:1,000 anty-M13 HRP i pozostawić na 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Powtórzyć procedurę mycia i uwidocznić za pomocą zachodniego roztworu chemiluminescencji.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Na rysunku 1 schemat pokazuje proces ujemnego panoramowania, za pomocą którego usunęliśmy z naszej biblioteki antygeny wiążące fagi za pomocą immunotubek. Początkowo zaczęliśmy od BSA, ponieważ jest to powszechny środek blokujący, a każdy, który zareagowałby niespecyficznie z tym celem, byłby problematyczny w przyszłych testach immunologicznych. Następnie usunęliśmy spoiwa do zagregowanej alfa-synukleiny, aby wyeliminować fagi, które są reaktywne z ogólnymi strukturami zagregowanych białek (tj. ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wykazano, że warianty białek biorą udział w progresji wielu chorób neurodegeneracyjnych, takich jak choroba Alzheimera, Parkinsona, ALS i FTD1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11. Izolacja przeciwciał, które mogą selektywnie rozpoznawać te różne warianty białka, może być skutecznym odczynnikiem do badania, diagnozowania i potencjalnego leczenia takich dolegliwości. Aby wygenerować takie specyficzne dla tego wariantu przeciwciała, opracowaliśmy nowatorski proces biopanowania, który wykorzystuje mikroskopię sił atomowych do...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

To badanie było wspierane przez grant z NIH: R21AG042066. Chcielibyśmy podziękować Philipowi Schulzowi za jego wkład w tworzenie filmów z przechwytywaniem ekranu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Tomlinson I and J LibrariesMRC (Cambridge, Anglia)
Arkusze LibraryMRC (Cambridge, Anglia)
2xYTBD Sciences244020
GlukozaAmresco0188-2.5KG
AmpicylinaAmresco0339-25GSubstancja drażniąca
KM13 Helper PhageMRC (Cambridge, Anglia)
KanamycynaOmniPur5880Drażniący
glikol polietylenowy 8000OmniPur6510Drażniący
chlorek soduMacron7647-14-5
Fosforan sodu dwuzasadowyAmresco0404-1KGDrażniący
chlorek potasuEMDPX1405-1Drażniący
potas Fosforan MonobasicAmresco0781-500GDrażniące
komórki TG1 MRC(Cambridge, Anglia)
Luria-Bertani AgarEMD1.10283.0500
Albumina surowicy bydlęcejAmresco0332-100G
Bufor STENCrystalgen Inc.
ImmunotubesThermo Scientific 470319
MikaŚwierk Sosna Mika24365
Tween 20EMD
TrypsynaSigmaT-0303Substancja drażniąca
TrietyloaminaSigmaT-0886Łatwopalna
glicerolAmresco0854-1LSubstancja drażniąca
Zestaw do przygotowania plazmidu DNAqiagen27106Drażniące
beztłuszczowe mleko w proszkuGoździk
96-dołkowa wysoka wiążąca płytka ELISA Costar3590
anty-M13 HRPGE Healthcare Life Sciences27-9421-01
Zestaw substratów chemiluminescencyjnych ELISA FemtoThermo Scientific37074
Przeciwciało poliklonalne anty-TDP 43ProteinTech10782-2-AP
A/G Koraliki agarozySanta Cruz Biotechnologysc-2003
HB 2151 CellsMRC (Cambridge, Anglia)
IzopropylotiogalaktozydTeknova13325
9e10 HRPSanta Cruz Biotechnologysc-40
Membrana nitrocelulozowaBiorad162-0115Wirówka łatwopalna
Thermo ScientificSorvall RC 6 +
Nanoscope IIIa Mikroskop sił atomowych SondyVeeco
AFMVistaProbesT300R-10
33429775

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hedieh, B., Sharareh, E., Philip, S., Michael, R. S. Isolating recombinant antibodies against specific protein morphologies using atomic force microscopy and phage display technologies. Protein Engineering Design and Selection. 19, 497-502 (2006).
  2. Emadi, S., Barkhordarian, H., Wang, M. S., Schulz, P., Sierks, M. R. Isolation of a Human Single Chain Antibody Fragment Against Oligomeric α-Synuclein that Inhibits Aggregation and Prevents α-Synuclein-induced Toxicity. Journal of Molecular Biology. 368, 1132-1144 (2007).
  3. Emadi, S., Kasturirangan, S., Wang, M. S., Schulz, P., Sierks, M. R. Detecting Morphologically Distinct Oligomeric Forms of α-Synuclein. Journal of Biological Chemistry. 284, 11048-11058 (2009).
  4. Kasturirangan, S., et al. Nanobody specific for oligomeric beta-amyloid stabilizes nontoxic form. Neurobiology of Aging. 33, 1320-1328 (2012).
  5. Kasturirangan, S., et al. Isolation and characterization of antibody fragments selective for specific protein morphologies from nanogram antigen samples. Biotechnology Progress. 29, 463-471 (2013).
  6. Zameer, A., Kasturirangan, S., Emadi, S., Nimmagadda, S. V., Sierks, M. R. Anti-oligomeric Aβ Single-chain Variable Domain Antibody Blocks Aβ-induced Toxicity Against Human Neuroblastoma Cells. Journal of Molecular Biology. 384, 917-928 (2008).
  7. Boddapati, S., Levites, Y., Sierks, M. R. Inhibiting β-Secretase Activity in Alzheimer's Disease Cell Models with Single-Chain Antibodies Specifically Targeting APP. Journal of Molecular Biology. 405, 436-447 (2011).
  8. Boddapati, S., Levites, Y., Suryadi, V., Kasturirangan, S., Sierks, M. R. Bispecific Tandem Single Chain Antibody Simultaneously Inhibits β-Secretase and Promotes α-Secretase Processing of AβPP. Journal of Alzheimer's Disease. 28, 961-969 (2012).
  9. Zhou, C., Emadi, S., Sierks, M. R., Messer, A. A Human Single-Chain Fv Intrabody Blocks Aberrant Cellular Effects of Overexpressed [alpha]-Synuclein. Mol Ther. 10, 1023-1031 (2004).
  10. Vanden Broeck, L., Callaerts, P., Dermaut, B. TDP-43-mediated neurodegeneration: towards a loss-of-function hypothesis. Trends in Molecular Medicine. 20, 66-71 (2014).
  11. Akamatsu, M., et al. A unique mouse model for investigating the properties of amyotrophic lateral sclerosis-associated protein TDP-43, by in utero electroporation. Neuroscience Research. 77, 234-241 (2013).
  12. Keage, H. A., et al. TDP-43 in the Population: Prevalence and Associations with Dementia and Age. Journal of Alzheimer's Disease. 42, 641-650 (2014).
  13. Honda, D., et al. The ALS/FTLD-related RNA-binding proteins TDP-43 and FUS have common downstream RNA targets in cortical neurons. FEBS Open Bio. 4, 1-10 (2014).
  14. Baloh, R. H. TDP-43: the relationship between protein aggregation and neurodegeneration in amyotrophic lateral sclerosis and frontotemporal lobar degeneration. FEBS Journal. 278, 3539-3549 (2011).
  15. Ling, S. -C., Polymenidou, M., Cleveland, D. W. Converging Mechanisms in ALS and FTD: Disrupted RNA and Protein. 79, 416-438 (2013).
  16. Sasaki, S., Takeda, T., Shibata, N., Kobayashi, M. Alterations in subcellular localization of TDP-43 immunoreactivity in the anterior horns in sporadic amyotrophic lateral sclerosis. Neuroscience Letters. 478, 72-76 (2010).
  17. Robertson, J., et al. Lack of TDP-43 abnormalities in mutant SOD1 transgenic mice shows disparity with ALS. Neuroscience Letters. 420, 128-132 (2007).
  18. Shan, X., Vocadlo, D., Krieger, C. Mislocalization of TDP-43 in the G93A mutant SOD1 transgenic mouse model of ALS. Neuroscience Letters. 458, 70-74 (2009).
  19. Yamashita, T., Hideyama, T., Teramoto, S., Kwak, S. The abnormal processing of TDP-43 is not an upstream event of reduced ADAR2 activity in ALS motor neurons. Neuroscience Research. 73, 153-160 (2012).
  20. Dong, H., et al. Curcumin abolishes mutant TDP-43 induced excitability in a motoneuron-like cellular model of ALS. Neuroscience. 272, 141-153 (2014).
  21. Sheets, M. D., et al. Efficient construction of a large nonimmune phage antibody library: The production of high-affinity human single-chain antibodies to protein antigens. Proceedings of the National Academy of Sciences. 95, 6157-6162 (1998).
  22. Hairul Bahara, N. H., et al. Phage display antibodies for diagnostic applications. Biologicals. 41, 209-216 (2013).
  23. Azzazy, H. M. E., Highsmith, W. E. Jr Phage display technology: clinical applications and recent innovations. Clinical Biochemistry. 35, 425-445 (2002).
  24. Zhang, X., et al. Rapid isolation of single-chain antibodies from a human synthetic phage display library for detection of Bacillus thuringiensis (Bt). Cry1B toxin. Ecotoxicology and Environmental Safety. 81, 84-90 (2012).
  25. Liu, H., et al. Selection and characterization of single-chain recombinant antibodies against spring viraemia of carp virus from mouse phage display library. Journal of Virological Methods. 194, 178-184 (2013).
  26. Cukkemane, N., Bikker, F. J., Nazmi, K., Brand, H. S., Veerman, E. C. I. Identification and characterization of a salivary-pellicle-binding peptide by phage display. Archives of Oral Biology. 59, 448-454 (2014).
  27. Adamson, C. S., et al. Novel single chain antibodies to the prion protein identified by phage display. Virology. 358, 166-177 (2007).
  28. Hebron, M. L., et al. Parkin Ubiquitinates Tar-DNA Binding Protein-43 (TDP-43) and Promotes Its Cytosolic Accumulation via Interaction with Histone Deacetylase 6 (HDAC6). Journal of Biological Chemistry. 288, 4103-4115 (2013).
  29. Wang, M. S., Zameer, A., Emadi, S., Sierks, M. R. Characterizing Antibody Specificity to Different Protein Morphologies by AFM. Langmuir. 25, 912-918 (2008).
  30. Williams, S., Sakic, B., Hoffman, S. A. Circulating brain-reactive autoantibodies and behavioral deficits in the MRL model of CNS lupus. Journal of Neuroimmunology. 218, 73-82 (2010).
  31. Jończyk, E., Kłak, M., Międzybrodzki, R., Górski, A. The influence of external factors on bacteriophages—review. Folia Microbiol. 56, 191-200 (2011).
  32. Hammers, C. M., Stanley, J. R. Antibody Phage Display: Technique and Applications. J Invest Dermatol. 134, e17(2014).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Biopanning TechniqueNegative Panning PhasePositive Panning PhasePhage Library ScreeningAFM Imaging VerificationMica Surface BindingSelective Reagent Isolation

Powiązane artykuły