Obrazowanie dynamiki Ca2+ w zakończeniach aksonów fotoreceptorów stożkowych siatkówki myszy

Podsumowanie

Opisujemy protokół monitorowania dynamiki Ca²⁺ w zakończeniach aksonów fotoreceptorów czopków za pomocą preparatu ex-vivo siatkówki myszy. Protokół ten umożliwia kompleksowe badania sygnalizacji stożka Ca^{2 +} w ważnym systemie modelowym ssaków, myszy.

Streszczenie

Fotoreceptory (czopki) stożków siatkówki służą do widzenia w świetle dziennym i są podstawą rozróżniania kolorów. Ulegają zwyrodnieniom, co często prowadzi do ślepoty w wielu chorobach siatkówki. Zaproponowano, że wapń (Ca²⁺), kluczowy drugi przekaźnik w sygnalizacji i metabolizmie fotoreceptorów, jest pośrednio związany ze zwyrodnieniem fotoreceptorów w różnych modelach zwierzęcych. Systematyczne badanie tych aspektów fizjologii i patofizjologii czopków było utrudnione ze względu na trudności w elektrycznym zapisie z tych małych komórek, w szczególności u myszy, gdzie siatkówka jest zdominowana przez fotoreceptory pręcikowe. Aby obejść ten problem, opracowaliśmy protokół obrazowania dwufotonowego Ca^{2 +} przy użyciu transgenicznej linii myszy, która wyraża genetycznie kodowany bioczujnik Ca^{2 +} TN-XL wyłącznie w czopkach i może być krzyżowany z modelami myszy w celu zwyrodnienia fotoreceptorów. Opisany tutaj protokół polega na przygotowaniu pionowych odcinków ("wycinków") siatkówki od myszy i obrazowaniu optycznym wywołanych bodźcem świetlnym zmian poziomu Ca²⁺ w czopkach. Protokół umożliwia również "pomiar w warstwie" bezwzględnych stężeń Ca²⁺; ponieważ po nagraniach można przeprowadzić kalibrację. Protokół ten umożliwia badania nad funkcjonalnymi właściwościami stożków i oczekuje się, że przyczyni się do zrozumienia sygnalizacji stożka Ca^{2 +}, a także potencjalnego udziału Ca^{2 +} w śmierci fotoreceptorów i zwyrodnieniu siatkówki.

Wprowadzenie

Widzenie zaczyna się od wywołanej światłem aktywacji kaskady fototransdukcji w fotoreceptorach siatkówki. Fotoreceptory pręcikowe umożliwiają widzenie przy słabym oświetleniu, podczas gdy fotoreceptory czopkowe pośredniczą w widzeniu kolorów i wysokiej rozdzielczości w świetle dziennym. Wiele genów specyficznych dla fotoreceptorów jest podatnych na mutacje, które prowadzą do degeneracji tych komórek. Zidentyfikowano szereg markerów molekularnych związanych z utratą fotoreceptorów¹, ale jak dotąd szczegółowe mechanizmy molekularne i sekwencja zdarzeń pozostają niejasne. Spekulowano, że zmieniona homeostaza Ca^{2 +} jest wyzwalaczem śmierci komórki fotoreceptora, hipoteza wspierana przez regulację w górę aktywności proteaz typu kalpainy zależnych od Ca^{2 +} podczas procesu degeneracji^2,3. Jednak do tej pory hipoteza ta nie jest poparta fizjologicznymi pomiarami^Ca2+. Niespójności w kilku badaniach dotyczących wpływu blokerów kanału Ca^{2 +} w chorobach siatkówki dodatkowo zakwestionowały udział Ca^{2 +} w śmierci komórki^4-6, wzywając do opracowania metod bezpośredniej oceny Ca^{2 +} w fotoreceptorach czopków ssaków.

Wcześniej, większość badań nad zapisem elektrycznym i obrazowaniem Ca²⁺ była wykonywana na modelach i ze względu na łatwiejszy dostęp do stożków^7-9. Fizjologia fotoreceptorów ssaków może jednak różnić się od fizjologii zwierząt niebędących ssakami¹⁰, a zwłaszcza w kontekście dziedzicznego zwyrodnienia siatkówki u ludzi lepsze zrozumienie fizjologii fotoreceptorów ssaków jest kluczem do opracowania innowacyjnych metod leczenia. Dostępnych jest wiele modeli myszy naśladujących choroby ludzkiej siatkówki, ale niewiele wiadomo na temat dynamiki Ca^{2 +} w czopkach myszy¹¹. Techniki elektryczne nie nadają się do wysokoprzepustowych nagrań z czopków, w szczególności nie u myszy, gdzie pręciki (~97%) znacznie przewyższają liczebnie czopki (~3%)¹². Co więcej, czułe techniki elektrofizjologiczne, takie jak zapisy patch-clamp całych komórek, zaburzają środowisko wewnątrzkomórkowe i dostarczają danych o prądach^Ca2+, ale nie o bezwzględnych wewnątrzkomórkowych stężeniach^Ca2+. W związku z tym, pomimo niższej rozdzielczości czasowej, obrazowanie jest metodą z wyboru przy rozwiązywaniu problemów dotyczących dynamiki stożka Ca²⁺. Kluczową kwestią związaną z obrazowaniem jest to, jak selektywnie oznaczyć czopki fluorescencyjnym barwnikiem wskaźnikowym Ca²⁺. Właściwa kompartmentalizacja i specyficzność komórkowa jest trudna do osiągnięcia poprzez "masowe ładowanie" syntetycznych barwników wskaźnikowych Ca^{2 +} do tkanki. W związku z tym nie można wiarygodnie odróżnić znakowanych czopków, pręcików^13,14 i komórek glejowych Müllera. Ponadto syntetyczne barwniki mają tendencję do wyciekania z komórek, co zapobiega długotrwałym zapisom w stałych warunkach. Ponadto ładowanie syntetycznych wskaźników Ca²⁺ w postaci estrów AM jest problematyczne, ponieważ wymaga detergentów (np. DMSO) i generuje formaldehyd¹⁵. W przypadku pomiarów bezwzględnych Ca²⁺ wskaźniki ratiometryczne są obowiązkowe. Jednak najlepszy obecnie dostępny syntetyczny wskaźnik ratiometryczny Fura-2 wymaga światła wzbudzającego w zakresie od 700 do 760 nm (dla wzbudzenia dwufotonowego), które w zależności od jego intensywności może samo w sobie stymulować czopki, a tym samym utrudniać badania dynamiki stożka Ca²⁺ w fizjologicznych warunkach oświetlenia.

W przeciwieństwie do barwników syntetycznych, genetycznie kodowane wskaźniki Ca²⁺ mogą być wyrażane w sposób selektywny pod względem typu komórki. Nie wyciekają one z komórek, dlatego też, jeśli unika się wybielania, możliwe są długotrwałe i wiarygodne pomiary ratiometryczne. Selektywna ekspresja biosensorów Ca^{2 +} w połączeniu z mikroskopią dwufotonową stanowi potężne narzędzie do oceny i badania subkomórkowego Ca^{2 +} w warunkach w dużej mierze fizjologicznych^13,16,17. W tym miejscu opisujemy protokół badania dynamiki stożka Ca^{2 +} wywołanego bodźcem świetlnym w transgenicznej linii myszy biosensora Ca^{2 +} (HR2.1: TN-XL), która selektywnie wyraża bioczujnik Ca^{2 +} TN-XL¹⁸ oparty na FRET w stożkach, pod ludzkim promotorem czerwonej opsyny HR2.1¹⁹. Aby uzyskać dostęp do końcówek stożkowych, zastosowano preparat do plastrów ex-vivo ²⁰. Protokół został już z powodzeniem zastosowany w trzech badaniach nad funkcją czopków u zdrowych myszy^10,21,22. Ponadto protokół umożliwia badanie sygnalizacji stożkowej Ca^{2 +} w określonych warunkach genetycznych, np. poprzez krzyżowanie modeli myszy pod kątem dziedzicznego zwyrodnienia siatkówki z myszami HR2.1: TN-XL.

Protokół

Wszystkie procedury z użyciem zwierząt zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi i przepisami dotyczącymi ochrony zwierząt określonymi przez rząd federalny Niemiec oraz zatwierdzonymi przez instytucjonalny komitet ds. dobrostanu zwierząt Uniwersytetu w Tübingen.

1. Modele zwierzęce

1. Mysz z biosensorem Ca²⁺ HR2.1:TN-XL
   1. Należy użyć transgenicznej linii myszy HR2.1:TN-XL wykazującej ekspresję biosensora Ca²⁺ TN-XL selektywnie w fotoreceptorach czopkowych¹⁰. Należy wykorzystać myszy obu płci w wieku od 3 do 6 tygodni, utrzymywane w standardnym 12-godzinnym cyklu dzień/noc.

2. Disekcja siatkówki

1. Roztwór fizjologiczny
   1. Przygotować na świeżo 2 L roztworu zewnątrzkomórkowego zawierającego 125 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1 mM MgCl₂, 1,25 mM NaH₂PO₄, 26 mM NaHCO₃, 0,5 mM L-glutaminy oraz 20 mM (+) glukozy. Mieszać do całkowitego rozpuszczenia wszystkich składników.
   2. Napowietrzyć roztwór zewnątrzkomórkowy karboksygenem (95% O₂, 5% CO₂) przez 5-10 min. Dodać CaCl₂ do uzyskania stężenia 2 mM.
   3. Po napowietrzeniu roztworu zewnątrzkomórkowego zmierzyć jego pH. pH powinno wynosić 7,4; w przeciwnym razie prawdopodobnie podczas przygotowania roztworu popełniono błąd. Aby zapewnić stałe pH, utrzymać stałą szybkość napowietrzania i temperaturę roztworu przez cały czas trwania eksperymentu.
   4. Podzielić roztwór zapasowy do dwóch kolb: jednej do dysekcji siatkówki i drugiej do zestawu pomiarowego (perfuzji).
2. Enukleacja oka i izolacja siatkówki (5-10 min)
   1. W obszarze roboczym podczas enukleacji zachować słabe czerwone oświetlenie. Użyć diod LED o szczytowej długości fali 650 nm (lub dłuższej), aby uniknąć wybielania czopków podczas dysekcji.
   2. Adaptować mysz do ciemności przez 2 h, umieszczając jej klatkę w dobrze wentylowanym, nieprzepuszczającym światła pudełku, aby upewnić się, że czopki są w pełni uwrażliwione w momencie pomiarów.
   3. Zznieczulić mysz pod dygestorium laboratoryjnym izofluranem (5%), używając parownika i szczelnego pojemnika mieszczącego standardową klatkę dla myszy. Starannie przestrzegać instrukcji producenta podczas obsługi parownika. Stosować rękawiczki i maskę ochronną, aby zmniejszyć ekspozycję na alergeny.
   4. Do dysekcji użyć mikroskopu binokularnego z powiększeniem 10-40X.
   5. Uśmiercić znieczuloną mysz poprzez dekapitację.
   6. W celu orientacji zaznaczyć górną część każdego oka (= grzbietową) wodoodpornym pisakiem. Odnotować, czy używane jest oko lewe czy prawe.
   7. Ostrożnie usunąć oko za pomocą zakrzywionych nożyczek, przecinając nerw wzrokowy za gałką oczną. Do dysekcji przenieść gałkę oczną do szalki Petriego zawierającej świeżo napowietrzony karboksygenem roztwór zewnątrzkomórkowy. Przenosząc gałkę oczną, trzymać ją za kikut nerwu wzrokowego.
   8. Przebić oko w dowolnym punkcie wzdłuż granicy między rogówką a twardówką (tzn. w obrębie ora serrata) ostrą igłą wstrzykiwacza.
   9. Utrzymać oko za twardówkę pęsetą i delikatnie wprowadzić jedno ostrze nożyczek do otworu wykonanego w poprzednim kroku. Przeciąć wzdłuż ora serrata, aby oddzielić przednią część oka (rogówkę, soczewkę, ciało szkliste) od części tylnej (skorupa gałki ocznej). Przeciąć skorupę gałki radialnie (w kierunku tarczy nerwu wzrokowego) w miejscu zaznaczenia pisakiem, aby wskazać położenie grzbietowe siatkówki.
      Uwaga: Przygotowane w ten sposób skorupy gałek ocznych można przechowywać w stale napowietrzanym karboksygenem roztworze do późniejszego użycia.
   10. Obrócić skorupę gałki w szalce Petriego tak, aby cięcie grzbietowe było skierowane w stronę przeciwną do badacza. Chwycić twardówkę po lewej i prawej stronie skorupy gałki za pomocą dwóch pęset, wprowadzając końcówki pęset między siatkówkę a twardówkę.
   11. Oddzielić siatkówkę, delikatnie wywijając twardówkową część skorupy gałki. Na koniec przeciąć nerw wzrokowy za pomocą mikronożyczek dysekcyjnych, aby uwolnić siatkówkę z twardówki.
       Uwaga: Jest to krytyczny etap. Należy unikać uszkodzenia siatkówki (np. poprzez dotykanie jej lub ściskanie pęsetą).
   12. Przytrzymać jedną z krawędzi siatkówki pęsetą i delikatnie usunąć z jej powierzchni zanieczyszczenia i ciało szkliste za pomocą drugiej pęsety. Po oczyszczeniu powierzchni siatkówki użyć mikronożyczek dysekcyjnych do wykonania trzech dodatkowych, krótszych cięć radialnych (w odstępach około 90°). Cięcia te umożliwiają ostrożne rozprostowanie siatkówki w szalce Petriego stroną z fotoreceptorami do dołu (Rycina 1A).
3. Przygotowanie plastrów (10-15 min)
   1. Przygotować wcześniej nitrocelulozowe membrany filtracyjne do cięcia siatkówki oraz szkiełka nakrywkowe do montowania plastrów i przenoszenia ich do komory pomiarowej. Wyciąć z membrany nitrocelulozowej prostokątne kawałki o wymiarach około 10 x 5 mm za pomocą nożyczek. Wyciąć z szkiełek nakrywek prostokątne kawałki o wymiarach około 10 x 5 mm za pomocą przecinaka do szkła.
   2. Powoli zanurzyć szkiełko przedmiotowe w roztworze zewnątrzkomórkowym w pobliżu tkanki. Delikatnie naciągnąć siatkówkę na szkiełko przedmiotowe stroną z komórkami zwojowymi do góry, chwytając ją za samą krawędź pęsetą. Proces ten ogranicza uszkodzenia mechaniczne i zwijanie się tkanki.
   3. Wybrać obszar siatkówki odpowiadający danej kwestii badawczej (patrz również sekcja Dyskusja). Należy pamiętać, że długie cięcie wykonane w kroku 2.2.9 wyznacza grzbietową połowę siatkówki (Rycina 1A). Wyciąć prostokątny kawałek o wymiarach około 1 x 2 mm z wybranego obszaru siatkówki za pomocą zakrzywionego ostrza skalpela. Przetrzeć nadmiar roztworu wokół tkanki.
   4. Położyć membranę filtracyjną na kawałku siatkówki w taki sposób, aby strona z komórkami zwojowymi przylegała do membrany. Natychmiast dodać kroplę medium zewnątrzkomórkowego na membranę, aby mocno przytwierdzić tkankę do membrany.
   5. Przenieść tkankę siatkówki zamontowaną na membranie do komory do cięcia zawierającej świeży roztwór zewnątrzkomórkowy.
   6. Przeciąć siatkówkę na pionowe plastry o grubości 200 µm (Rycina 1B) za pomocą świeżego ostrza brzytwy zamontowanego w urządzeniu do cięcia tkanki (tissue chopper)²³. Wymieniać ostrze dla każdego kawałka siatkówki.
      Uwaga: Ostrze brzytwy musi być idealnie wyrównane z powierzchnią dna komory do cięcia, tak aby cała membrana rozdzieliła się jednocześnie, co objawia się słyszalnym „kliknięciem” podczas cięcia – w przeciwnym razie ostrze może się wygiąć i uszkodzić plaster.
   7. Przykleić pojedynczy plaster zamontowany na membranie do szkiełka nakrywkowe, nakładając smar wysokopróżniowy wyłącznie na krawędzie membrany (Rycina 1C). Powierzchnia szkiełka pod siatkówką musi pozostać wolna od smaru.
   8. Przechowywać plastry zamontowane na szkiełkach pod kroplą roztworu zewnątrzkomórkowego w komorze holdingowej – zamkniętym i nieprzepuszczającym światła pojemniku, np. szalce Petriego z pokrywką owiniętą folią aluminiową – w atmosferze karboksygenu w temperaturze pokojowej (RT). Wprowadzać karboksygen poprzez napowietrzanie niewielkiego zbiornika z wodą, aby utrzymać wilgotność atmosfery w komorze holdingowej; zapobiega to wysychaniu plastrów.
   9. Pozostawić plastry w komorze holdingowej na 10-15 min przed przeniesieniem ich (po kolei) do komory pomiarowej. Plastry mogą być utrzymywane w komorze holdingowej w temperaturze pokojowej (~21 °C) do 4-5 h.

3. Dwufotonowe obrazowanie Ca²⁺

1. Mikroskopia dwufotonowa
   1. Należy użyć mikroskopu dwufotonowego typu MOM (Movable Objective Microscope). Zarówno konstrukcja MOM, jak i procedury obrazowania zostały opisane wcześniej²⁴, szczegóły znajdują się również w^10,21,25 (źródła i firmy wymieniono w Tabeli 1)^.
      Uwaga: Można użyć dowolnego pionowego mikroskopu dwufotonowego, który spełnia następujące minimalne wymagania: musi być wyposażony w (a) laser impulsowy z możliwością strojenia do ~860 nm, (b) minimum dwa kanały fluorescencji rejestrowane jednocześnie, (c) filtry dla fluorescencji eCFP i cytryny, (d) stymulator światła (możliwe konstrukcje opisano w^24,26) oraz (e) oprogramowanie umożliwiające rejestrację sekwencji obrazów w odstępach czasu (time-lapse) z częstotliwością klatek wystarczającą do rozdzielenia interesujących sygnałów Ca²⁺.
   2. Uruchomić system obrazowania dwufotonowego zgodnie z instrukcją producenta. Należy ściśle przestrzegać wytycznych dotyczących bezpieczeństwa pracy z laserem w danej placówce. Włączyć laser i nastroić go na ~860 nm.
   3. Przenieść skrawek z komory holdingowej do komory rejestracyjnej i niezwłocznie rozpocząć perfuzję nasyconym karboksygenem roztworem zewnątrzkomórkowym. W komorze rejestracyjnej należy utrzymać szybkość przepływu perfuzji na poziomie 2 ml/min oraz temperaturę 37 °C.
   4. Użyć obiektywu imersyjnego z wodą 20X 0.95 NA. Jeśli jest dostępna, należy użyć kamery CCD w połączeniu z podczerwienioną diodą LED pod komorą rejestracyjną, aby zlokalizować skrawek siatkówki (Rysunek 2). W przeciwnym razie skrawek należy zlokalizować za pomocą obrazowania dwufotonowego (patrz pkt 3.1.5).
   5. Przełączyć na obrazowanie dwufotonowe w celu sprawdzenia ekspresji biosensora. Włączyć dwa kanały detekcji dla obrazowania fluorescencyjnego eCFP i cytryny.
   6. Użyć oprogramowania do akwizycji obrazu sterującego mikroskopem dwufotonowym, aby przeskanować i wybrać rząd zakończeń czopków do rejestracji (Rysunek 3A). Ustawić akwizycję obrazu na obrazy o wymiarach 128 x 16 pikseli (31,25 Hz) lub konfigurację pokrewną. Ograniczyć obszar skanowania do zakończeń czopków, aby uniknąć blaknięcia fotopigmentów w segmentach zewnętrznych.
      Uwaga: Dla sensora wapnia TN-XL (τ = ~0,6 s dla wiązania Ca²⁺, τ = ~0,2 s dla odwiązania Ca²⁺; patrz¹⁶) zaleca się minimalną częstotliwość klatek ~8 Hz.
2. Stymulacja światłem i rejestracja
   1. Do wykonania następujących kroków należy użyć pełnopowierzchniowego stymulatora światła podstolikowego, opisanego w innych publikacjach^10,21,26.
      Uwaga: Prostym rozwiązaniem dla pełnopowierzchniowego stymulatora światła jest użycie dwóch diod LED z filtrami pasmowymi (np., „niebieska”: 360 BP 12, „zielona”: 578 BP 10), które odpowiadają czułości długości fali czopków mysich, ale jednocześnie nie nakładają się na filtry używane do detekcji fluorescencji (por. 3.2.4). Światło z diod LED jest skupiane przez kondensator przez dno komory rejestracyjnej (Rysunek 2). Szczegółowe informacje na temat konstrukcji tego stymulatora, jego kalibracji, użytych natężeń światła i wywołanych szybkości fotoizomeryzacji czopków znajdują się w^10,21,26.
   2. Włączyć laser i pozwolić czopkom zaadaptować się do lasera skanującego i tła światła stymulującego (20 - 30 s, patrz również Potencjalne trudności) przed prezentacją bodźców świetlnych (patrz 3.2.3) lub zastosowaniem środków farmakologicznych.
   3. Rozpocząć prezentację dowolnych bodźców (np., błyski światła, jak pokazano na Rysunku 3B,C). W przypadku stymulatora opisanego w kroku 3.2.1 bodźce należy generować poprzez modulację natężenia dwóch diod LED w czasie za pomocą płyty mikroprocesorowej sterowanej przez dedykowane oprogramowanie (szczegóły w^10,21,26).
   4. Rozpocząć jednoczesną rejestrację dwóch kanałów fluorescencji (np., 483 nm dla „niebieskiego” donora FRET eCFP i 535 nm dla „żółtego” akceptora FRET; specyfikacje w Tabeli 1) przy użyciu odpowiedniego oprogramowania do akwizycji obrazu (patrz również 3.1.6). Na przykład, w przypadku błysków światła (Rysunek 3B,C), należy zarejestrować co najmniej 8 - 10 prezentacji bodźców (prób).
3. Kalibracja Ca²⁺ „w skrawku”
   1. Zarejestrować sygnały Ca²⁺ w zakończeniach czopków (jak opisano w 3.1.6 i 3.2.4) i wyznaczyć bazowy poziom Ca²⁺ w zestawie czopków (jak opisano w 3.4).
   2. Przełączyć na medium zewnątrzkomórkowe „wolne od Ca²⁺” z dodatkiem 5 µM ionomycyny (rozpuszczonej w DMSO) i 10 mM EGTA (lub alternatywnie BAPTA). Ponownie rejestrować zakończenia czopków co 5 min, aby wyznaczyć minimalny stosunek fluorescencji (R_min), tzn. stosunek przy (prawie) całkowitym braku wewnątrzkomórkowego Ca²⁺. Może to zająć od 15 do 30 min.
      Uwaga: Wymagany jest system perfuzyjny umożliwiający przełączanie między różnymi zbiornikami.
   3. Przełączyć na medium zewnątrzkomórkowe z 5 µM ionomycyny (rozpuszczonej w DMSO) i 2,5 mM Ca²⁺. Po 5 min inkubacji ponownie rejestrować czopki co 5 min, aby zmierzyć maksymalny stosunek fluorescencji (R_max), tzn. stosunek przy nasycających stężeniach wewnątrzkomórkowego Ca²⁺. Po zastosowaniu ionomycyny stabilizacja stosunku Ca²⁺ może zająć od 3 do 15 min.
      Uwaga: Długotrwała ekspozycja skrawków na wysokie stężenie Ca²⁺ i ionomycynę doprowadzi w końcu do uszkodzenia komórek. Do analizy należy włączyć tylko komórki, które zachowały normalną morfologię. Stężenia (tzn. EGTA, ionomycyny) mogą wymagać dostosowania. Więcej szczegółów na temat protokołu kalibracji Ca²⁺ znajduje się w^13,17.
4. Analiza danych
    Uwaga: Należy użyć pakietu oprogramowania do przetwarzania obrazów i analizy danych, który jest kompatybilny z oprogramowaniem mikroskopu i umożliwia uruchamianie niestandardowych skryptów analizy.
   1. Wczytać plik danych obrazowania i wyznaczyć obszary zainteresowania (ROI) wokół każdego zakończenia czopka (Rysunek 3A). Dla każdej klatki obliczyć średnią intensywność fluorescencji w obrębie ROI i odjąć fluorescencję tła, a następnie obliczyć stosunek (R) między fluorescencją akceptora FRET (cytryny) a donora (eCFP) (R=F_A/F_D; Rysunek 3B,C). Stosunek ten jest zazwyczaj używany jako wskaźnik względnego stężenia wewnątrzkomórkowego Ca²⁺, ale po kalibracji (patrz 3.3) można oszacować również stężenia bezwzględne (patrz 3.4.3).
      Uwaga: Pedykle można rozpoznać po ich lokalizacji w zewnętrznej warstwie splotowej i morfologii (nieco spłaszczone „plamki” mniejsze niż soma czopka, znajdujące się na końcu aksonu czopka).
   2. Uśrednić próby stymulacji (Rysunek 4A). Z uśrednionych przebiegów (Rysunek 4B) wyznaczyć parametry odpowiedzi, takie jak bazowy poziom Ca²⁺ (R_base) przed stymulacją światłem, amplituda szczytowa (R_amp) oraz pole pod krzywą (R_A) jako miary wielkości odpowiedzi. Należy również wyznaczyć kinetykę odpowiedzi z uśrednionych przebiegów, np. czas narastania odpowiedzi (t_rise) i czas zaniku (t_decay) (= odpowiednie odstępy czasu między 20% a 80% R_amp; patrz ilustracja na Rysunku 4B). Więcej szczegółów na temat wyznaczania tych parametrów znajduje się w¹⁰.
   3. Obliczyć szacunkowe bezwzględne stężenie Ca²⁺ w czopkach na podstawie pomiarów z kroków 3.3.1-3.3.3. Użyć stosunków dla minimalnego i maksymalnego stężenia Ca²⁺, odpowiednio R_min i R_max, fluorescencji donora w stanie z wiązanym (F_D,Ca-bound) i niezwiazanym (F_D,Ca-free) Ca²⁺, a także stałej dysocjacji in-vivo (K_d = 0,77, patrz¹⁶) dla TN-XL za pomocą następującego równania (analogicznie do²⁷):

Wyniki

Dzięki połączeniu przekrojów pionowych (Rysunek 1) przygotowanych z siatkówki myszy HR2.1:TN-XL z obrazowaniem dwufotonowym (Rysunek 2), możliwe było przeprowadzenie pomiarów ratiometrycznych sygnałów Ca²⁺ wywołanych bodźcem świetlnym w zakończeniach aksonów fotoreceptorów czopkowych. Podejście to stanowi znaczną poprawę w zakresie dostępu i wizualizacji czopków myszy w porównaniu do istniejących metod obrazowania optycznego z zastosowaniem syntetycznych wskaźników Ca²⁺ . Przykładowo, specyficzna dla czopków ekspresja genetycznie kodowanego ratiometrycznego biosensora Ca²⁺ TN-XL znacznie ułatwiła identyfikację zakończeń aksonów czopków (patrz. ROI na Rysunku 3A). W związku z tym nasz protokół eliminuje ryzyko rejestracji sygnałów o niejasnym pochodzeniu, takich jak na przykład sygnały „mieszane” z udziałem zakończeń aksonów zarówno czopków, jak i pręcików.

Nasze podejście pozwala na rozdzielenie odpowiedzi z pojedynczych prób na poziomie pojedynczych zakończeń aksonów czopków. Wywołana światłem ekstruzja Ca²⁺ z zakończenia czopka objawia się odpowiednio wzrostem fluorescencji donora i spadkiem fluorescencji akceptora (Rysunek 3B). Spadek stosunku fluorescencji (R) odpowiada ekstruzji Ca²⁺ z zakończenia czopka (Rysunek 3C), spowodowanej indukowaną światłem hiperpolaryzacją czopka i następującym po niej zamknięciem napięciowo zależnych kanałów Ca²⁺. Ponieważ można jednocześnie monitorować kilka zakończeń aksonów czopków (Rysunek 3A), akwizycja danych jest bardzo wydajna, a w ramach jednego eksperymentu można zebrać setki odpowiedzi Ca²⁺ w czopkach. Poprzez ilościową ocenę tych odpowiedzi (Rysunek 4), sygnały Ca²⁺ w czopkach mogą być porównywane i oceniane w różnych warunkach (patrz Dyskusja).

Często wystarczające jest zastosowanie stosunku fluorescencji akceptora FRET (cytryny) do donora (eCFP) (F_A/F_D; szczegóły w punkcie 3.4) jako wzglomnego pomiaru wewnątrzkomórkowego poziomu Ca²⁺. Jednak w razie potrzeby stosunek ten można skalibrować, aby uzyskać bezwzględne stężenia wewnątrzkomórkowego Ca²⁺ ([Ca²⁺]) (Rycina 5). Przy oświetleniu tła zastosowanym w niniejszym protokole (szczegóły w przypisie¹⁰ oraz w legendzie do Ryciny 3), kalibracja pozwoliła oszacować bezwzględne spoczynkowe [Ca²⁺] w zakończeniach czopków myszy „dzikiego typu” HR2.1:TN-XL na 243 ± 159 nM (średnia ± S.D.), co mieści się w zakresie raportowanym dla myszy w literaturze¹¹.

Rysunek 1. Przygotowanie pionowych skrawków siatkówki. (A) Izolowana i spłaszczona siatkówka przygotowana do cięcia. (B) Prostokątny fragment siatkówki (patrz czerwona ramka w A) zamontowany na błonie z papieru filtracyjnego (ciemnoszara) po wykonaniu cięć. (C) Widok z góry na zamontowany na błonie skrawkek siatkówki, przymocowany do szkiełka nakrywkowego za pomocą smaru. (D) Schematycznie narysowany fragment skrawka siatkówki (patrz czerwona ramka w C). Fotoreceptory czopkowe zaznaczono na zielono. V, brzuszna; D, grzbietowa; N, nosowa; T, skroniowa; OS, segment zewnętrzny; ONL, zewnętrzna warstwa jądrowa; OPL, zewnętrzna warstwa splotowa; INL, wewnętrzna warstwa jądrowa; IPL, wewnętrzna warstwa splotowa; GCL, warstwa komórek zwojowych. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Rysunek 2. Obrazowanie dwufotonowe wycinków siatkówki: Ilustracja konfiguracji pomiarowej. Góra: Obiektyw z imersją wodną skupiający wiązkę skanującego lasera (czerwona strzałka w dół) na siatkówce i zbierający emitowaną fluorescencję (strzałki w górę). Soczewka zbiera również przenikające światło podczerwone z diody LED do oświetlenia zamontowanej pod kondensorem podczas obrazowania wycinka za pomocą kamery CCD. Środek: Wycinek siatkówki zamontowany w komorze pomiarowej i perfundowany roztworem zewnątrzkomórkowym. Dół: Soczewka kondensora skupiająca światło z diod LED do stymulacji (oraz diody IR dla obrazowania kamerą CCD) przez przezrozyste dno komory pomiarowej do tkanki siatkówki. IR LED, dioda emitująca światło podczerwone; CCD, urządzenie ładunkowo-sprzężone; BP, filtr pasmowy. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Rycina 3. Reakcje Ca²⁺ wywołane światłem w zakończeniach aksonów fotoreceptorów czopkowych myszy. (A) Lewo: Rejestracje skupione na zakończeniach synaptycznych (czerwona ramka) fotoreceptorów czopkowych (zielone) w skrawkach siatkówki. Prawo: Przykład zarejestrowanego obszaru z 7 pojedynczymi zakończeniami. Fluorescencję rejestrowano za pomocą dwóch kanałów: jednego dla akceptora FRET citrine (góra; 535 BP 50) i jednego dla donora FRET eCFP (dół; 480 BP 32). (B) Wywołane światłem zmiany fluorescencji citrine (F_A) i eCFP (F_D) zarejestrowane w jednym ROI. (C) Odpowiedzi Ca²⁺ (jako stosunek F_A/F_D) zakończenia czopka na serię 1 s błysków jasnego światła w odstępach 5 s. ROI, obszar zainteresowania; BP, filtr pasmowy; F, intensywność fluorescencji; a.u., jednostki dowolne; FRET, Försterowski transfer energii rezonansowej; eCFP, ulepszone białko fluorescencyjne cyjanowe. Intensywność bodźca (jako szybkość fotoizomeryzacji w 10³·P·s^-1 na czopek): odpowiednio 13,0 i 12,8 dla opsyn M i S, dodane do poziomu tła (= wyłączone diody LED, skanowanie laserem wzbudzającym) wynoszącego ~10. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Rysunek 4. Przykładowa analiza ilościowa odpowiedzi Ca²⁺ w czopkach wywołanych światłem. (A) Odpowiedzi Ca²⁺ wywołane światłem (jako ΔR) z pojedynczego zakończenia czopka (pojedyncze próby: ślad szary, n=16; średnia: ślad czarny). (B) Parametry określone dla średniej odpowiedzi Ca²⁺: spoczynkowy poziom Ca²⁺ (R_base) reprezentujący linię bazową przed stymulacją światłem, wielkość odpowiedzi jako pole pod krzywą (R_A) i amplituda szczytowa (R_amp), kinetyka narastania odpowiedzi (t_rise, odstęp czasu od 20% do 80% R_amp) i opadania (t_decay, odstęp czasu od 80% do 20% R_amp). Aby wyświetlić ten rysunek w większej wersji, kliknij tutaj.

Rysunek 5. Szacowanie bezwzględnej koncentracji Ca²⁺ . Spoczynkowa koncentracja Ca²⁺ ([Ca²⁺], jako stosunek F_A/F_D) zarejestrowana w 8 zakończeniach aksonów stożkowych u myszy TN-XL (kółka, średnia ± S.D.) dla różnych roztworów zewnątrzkomórkowych: dwukrotnie w standardowym medium zewnątrzkomórkowym (Ctrl 1 i 2), następnie przy minimalnej („zerowej”) [Ca²⁺] (10 mM EGTA) oraz przy wysokiej [Ca²⁺] (2.5 mM); dwie ostatnie warunki z zastosowaniem 5 µM jonomycyny w celu wyrównania stężeń Ca²⁺ zewnątrzkomórkowego i wewnątrzkomórkowego. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Dyskusja

Istniejące wcześniej protokoły wykorzystujące elektrofizjologiczne zapisy pojedynczych komórek lub obrazowanie Ca^{2 +} z syntetycznymi wskaźnikami fluorescencyjnymi mają trudności z rejestracją dynamiki Ca^{2 +} w fotoreceptorach czopków myszy z wielu powodów technicznych (patrz Wprowadzenie). Opisany tutaj protokół pozwala w wydajny i stosunkowo prosty sposób na pomiar sygnałów^Ca2+ , a nawet bezwzględnych poziomów Ca²⁺ w pojedynczych, zidentyfikowanych końcówkach stożkowych myszy.

Protokół ten został już z powodzeniem zastosowany w trzech badaniach dotyczących różnych aspektów funkcji czopków w zdrowej siatkówce myszy. W pierwszym badaniu¹⁰ mysz HR2.1: TN-XL scharakteryzowano za pomocą immunohistochemii, zapisów ERG, obrazowania dwufotonowego Ca^{2 +} i farmakologii, wykazując, że specyficzna dla stożka ekspresja bioczujnika Ca^{2 +} nie utrudnia anatomii i funkcji czopka. W drugim badaniu²¹ chromatyczne i achromatyczne właściwości odpowiedzi czopków myszy zostały zmapowane w poprzek siatkówki, wykazując uderzające różnice w funkcji czopków między "zieloną" siatkówką grzbietową zdominowaną przez opsynę a "niebieską" brzuszną siatkówką myszy zdominowaną przez opsynę. Te regionalne różnice we właściwościach stożków odpowiadały zróżnicowanemu rozkładowi kontrastu w środowisku naturalnym (tj. niebo vs. ziemia), co sugeruje, że różne typy widmowe czopków myszy zapewniają (prawie) optymalne próbkowanie kontrastów achromatycznych, a tym samym mogą oferować ewolucyjną przewagę. W trzecim badaniu²² badano wzajemne sprzężenie zwrotne, które zakończenia aksonów stożkowych otrzymują od komórek poziomych. Ponieważ wszystkie proponowane poziome mechanizmy sprzężenia zwrotnego komórek działają na bramkowanych napięciem kanałach Ca²⁺ w zaciskach aksonów stożka²⁸, końcówka stożkowa Ca²⁺ może służyć jako proxy dla poziomych interakcji komórka-stożek. Badanie przeprowadzone przez Kemmlera i współpracowników^potwierdza pogląd, że komórki poziome wykorzystują złożony system sprzężenia zwrotnego składający się z kilku mechanizmów do kontrolowania uwalniania glutaminianu fotoreceptorów.

Badania te ilustrują wszechstronność opisanego protokołu i pokazują, że można go dostosować do szerokiego zakresu pytań dotyczących funkcji czopków i ich obwodów synaptycznych. Ponadto protokół umożliwia badanie lokalnej sygnalizacji Ca²⁺ w różnych przedziałach czopków, w celu lepszego zrozumienia fizjologii czopków. Taka wiedza jest istotna dla zrozumienia procesów patofizjologicznych zachodzących w zwyrodniałych czopkach, aby ostatecznie umożliwić racjonalne opracowanie potencjalnych podejść terapeutycznych, w szczególności w przypadku chorób zwyrodnieniowych dotykających czopki.

W linii myszy HR2.1:TN-XL bioczujnik Ca²⁺ jest wyrażany w całym stożku, z wyjątkiem segmentu zewnętrznego. Daje to możliwość bezpośredniej i ratiometrycznej oceny dynamiki Ca²⁺ w różnych przedziałach stożków. Ponieważ zmiany prądów Ca²⁺ w segmencie zewnętrznym są odbijane na zaciskach poprzez potencjał membranowy i wynikającą z tego aktywację kanałów Ca²⁺ bramkowanych napięciem, procesy w segmencie zewnętrznym można obserwować pośrednio.

Potencjalne pułapki:

Rozwarstwienie siatkówki jest krytycznym etapem: u myszy siatkówka oddziela się od muszli ocznej, zwykle między zewnętrznymi segmentami fotoreceptora a nabłonkiem barwnikowym. W związku z tym wrażliwe na światło zewnętrzne segmenty fotoreceptorów izolowanej siatkówki są odsłonięte i niezwykle wrażliwe na uszkodzenia mechaniczne. Należy zachować szczególną ostrożność, aby nie uszkodzić tkanki poprzez dotykanie jej narzędziami po stronie fotoreceptora lub przesuwanie tkanki na boki po powierzchni klejącej (np. membranie filtrującej).

Wysokiej jakości plastry siatkówki można rozpoznać pod mikroskopem po czystej powierzchni cięcia i dobrze zorganizowanej warstwie fotoreceptorów z wyraźnie zaznaczonymi segmentami zewnętrznymi. Funkcjonalną ocenę jakości plastrów można szybko przeprowadzić, jasnymi bodźcami świetlnymi i określając procent reagujących czopków (np. w polu widzenia z 10 - 20 czopkami). W tym przypadku jakość odpowiedzi należy ocenić, obliczając stosunek sygnału do szumu (S/N) (amplituda szumu wyjściowego przed bodźcem świetlnym w stosunku do amplitudy odpowiedzi świetlnej); Za minimalny próg należy uznać wartość S/N wynoszącą od 2 do 3. Zazwyczaj odrzucamy plasterki z mniej niż 50% responsywnymi stożkami. Należy również wyrzucić plastry z szyszkami, które wykazują nadmierne spontaniczne wystrzeliwanie (patrz rysunek 4 w¹⁰).

Warstwy w komorze rejestracyjnej, które spełniają wyżej wymienione kryteria anatomiczne i funkcjonalne, wykazują spójne odpowiedzi przez 1 - 2 godziny (szczegółowe informacje na temat spójności odpowiedzi znajdują się w^{punkcie 10}). Ponieważ plastry przeżywają wiele godzin w komorze przetrzymywania, udany eksperyment może trwać do 6 godzin. Warto zauważyć, że istnieją pewne ograniczenia w odniesieniu do badania dalekosiężnych interakcji przestrzennych między czopkami a komórkami poziomymi, ponieważ krojenie nieuchronnie zrywa boczne połączenia w sieciach siatkówki. Jednak zwiększenie grubości plastrów siatkówki do 300 μm łagodzi ten problem²².

Zastosowanie pionowych wycinków siatkówki pozwala uniknąć skanowania światłoczułych zewnętrznych segmentów stożków za pomocą lasera wzbudzającego, a tym samym w znacznym stopniu zapobiega wybielaniu opsyny (obszerne omówienie znajduje się w^10,21). Niemniej jednak zarejestrowane sygnały Ca²⁺ zależą nie tylko od bodźców świetlnych, ale także są pod wpływem składowej oświetlenia tła generowanej przez skaningowy laser wzbudzający. W rzeczywistości efektywne oświetlenie tła w takich eksperymentach obrazowania dwufotonowego jest kombinacją rozproszonego światła laserowego, światła fluorescencyjnego emitowanego przez zarejestrowane komórki i dowolnego składnika tła bodźca LED. W związku z tym stożki powinny mieć możliwość przystosowania się przez co najmniej 20 - 30 s do skanowania laserowego (przy włączonej składowej tła bodźca świetlnego) przed rejestracją.

Zalety i zastosowania:

Podczas gdy niektóre zastosowania tego protokołu obrazowania stożka Ca^{2 +} zostały opisane powyżej^10,21,22, można przewidzieć inne zastosowania: Badania farmakologiczne w połączeniu z obrazowaniem stożka Ca^{2 +} mogą potwierdzić szlaki sygnałowe Ca^{2 +} w czopkach i mogą być wykorzystane do testowania skuteczności i siły działania leków ukierunkowanych na różnych graczy w sygnalizacji Ca^{2 + 10}. Jednak kluczowym zastosowaniem może być badanie chorób wpływających na funkcję czopków. Dostępnych jest wiele modeli myszy ze zwyrodnieniem siatkówki naśladujących choroby ludzkie. Na przykład mysz z utratą fotoreceptora czopka 1 (cpfl1) jest pierwotnym modelem zwyrodnienia czopka cierpiącym na mutację Pde6c ²⁹. I odwrotnie, mysz z zwyrodnieniem pręcików 1 (rd1) cierpi na mutację Pde6b . Chociaż powoduje to pierwotne zwyrodnienie fotoreceptorów pręcików³⁰, po zakończeniu utraty pręcika rd1, wtórne zwyrodnienie czopka pojawia się w¹. Krzyżowanie tych zwierząt z linią HR2.1:TN-XL pozwoli na badanie i porównywanie dynamiki^Ca2+ zarówno w pierwotnym, jak i wtórnym zwyrodnieniu czopków i prawdopodobnie dostarczy cennych informacji na temat roli^Ca2+ podczas śmierci czopków. Również farmakologicznie indukowane zwyrodnienie czopków – na przykład przy użyciu selektywnych inhibitorów PDE6 – może służyć do identyfikacji dalszych mechanizmów zwyrodnienia czopków^10,29,31.

Podsumowując, opisany tutaj protokół pozwala na pomiar Ca²⁺ w subkomórkowych przedziałach fotoreceptorów czopków myszy i daje ogromne możliwości odkrycia fizjologii czopków w szerokim zakresie warunków fizjologicznych i patofizjologicznych. Ponadto protokół ten może być stosowany do badań przesiewowych środków farmakologicznych zaprojektowanych w celu zakłócania sygnalizacji stożka Ca^{2 +}, a tym samym pomocy w ustaleniu nowych terapii chorób czopków.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Smar wysokopróżniowy	Dow Corning	1018817	http://www.dowcorning.com
Szkiełka nakrywkowe	R. Langenbrinck		24 x 60 mm; http://www.langenbrinck.com
Szkiełka	R. Langenbrinck		76 x 26 mm; http://www.langenbrinck.com
Ostrza do rozdrabniacza tkanek	MARTOR KG	ARGENTAX Nr 1044	0,25 mm; http://www.martor.de
Rozdrabniacz tkanek	Zbudowany		na zamówienie Na podstawie projektu F. Werblina23, zaadaptowanego przez T. Schuberta
Nitrocelulozowa membrana filtracyjna z siatką	Merck Millipore	AABG01300	Typ filtra: 0,8 &mikro; m; http://www.emdmillipore.com
Isoflurane CP	CP pharma	AP/DRUGS/220/96	http://www.cp-pharma.de
UV/zielony stymulator pełnego pola oparty na diodach LED	Custom-build		aby uzyskać szczegółowe informacje, zobacz10
Płytka mikroprocesora Open source	Arduino		http://www.arduino.cc
Oprogramowanie do obrazowania CfNT	Napisane		opracowane przez Michaela Mü ller, MPI for Medical Research, Heidelberg, Niemcy
IgorPro	Wavemetrics		http://www.wavemetrics.com
VC3-4 System ogniskowy system perfuzyjny	ALA Instrument		z 100 μ Kolektor końcówki o średnicy M; http://www.alascience.com/
Mai Tai HP DeepSee (Ti:Sapphire laser)	Newport Spectra-Physics		http://www.spectra-physics.com
Ruchomy mikroskop obiektywowy (MOM), Zaprojektowany przez W. Denka, MPImF, Heidelberg, Niemcy	Sutter Instruments		http://www.sutter.com/MICROSCOPES/index.html
[header]
XLUMPlanFL 20X/0.95w	obiektyw Olympus		http://www.olympusamerica.com
Vaporizer 100 series	Surgivet		http://www.surgivet.com
Ionomycyna, Sól wapniowa	Life technologies	I24222	http://www.lifetechnologies.com
EGTA	Sigma-Aldrich	E3889	https://www.sigmaaldrich.com
Dimetylosulfotlenek (DMSO)	Sigma-Aldrich		101191250http://www.sigmaaldrich.com
Leica MZ95	Leica microsystems		http://www.leica-microsystems.com/