Wizualizacja Streptococcus pneumoniae w obrębie mikrouszkodzeń serca i późniejsza przebudowa serca

Podsumowanie

Streptococcus pneumoniae tworzy dyskretne, nieropne, mikroskopijne zmiany w sercu. Przedstawiono protokół mysiego modelu powstawania mikrouszkodzeń serca. Prowadzone są szkolenia dotyczące wizualizacji mikrozmian za pomocą mikroskopii, rozróżniania wczesnych i późnych mikrouszkodzeń oraz metod wykrywania przebudowy serca w sercach rekonwalescentów.

Streszczenie

Podczas bakteriemii Streptococcus pneumoniae może przemieszczać się przez śródbłonek naczyń krwionośnych do mięśnia sercowego i tworzyć dyskretne, wypełnione bakteriami mikroskopijne zmiany (mikrouszkodzenia), które są niezwykłe ze względu na brak infiltrujących komórek odpornościowych. Uważa się, że ze względu na uwalnianie produktów kardiotoksycznych, S. pneumoniae w obrębie mikrozmian przyczynia się do niewydolności serca, która jest często obserwowana podczas piorunującej inwazyjnej choroby pneumokokowej u dorosłych. W tym artykule przedstawiono protokół eksperymentalnego zakażenia myszy, który prowadzi do powtarzalnego tworzenia się mikrouszkodzeń serca w ciągu 30 godzin. Podano instrukcje dotyczące identyfikacji mikrouszkodzeń w wycinkach serca barwionych hematoksyną i eozyną oraz podkreślono różnice morfologiczne między wczesnymi i późnymi mikrouszkodzeniami. Przedstawiono instrukcję dotyczącą protokołu weryfikacji S. pneumoniae w obrębie mikrozmian przy użyciu przeciwciał przeciwko polisacharydowi otoczkowemu pneumokokom i mikroskopii immunofluorescencyjnej. Na koniec przedstawiono protokół interwencji antybiotykowej, która ratuje zakażone myszy oraz wykrywania i oceny tworzenia się blizn w sercach rekonwalescentów. Łącznie protokoły te ułatwią badanie mechanizmów molekularnych leżących u podstaw inwazji pneumokoków serca, śmierci kardiomiocytów, przebudowy serca w wyniku ekspozycji na S. pneumoniae oraz odpowiedzi immunologicznej na pneumokoki w sercu.

Wprowadzenie

Hospitalizacja dorosłych z powodu pozaszpitalnego zapalenia płuc (CAP) niesie ze sobą udokumentowane ryzyko wystąpienia niepożądanych zdarzeń sercowych, które przyczyniają się do śmiertelności^1-4. W niedawnym badaniu przeprowadzonym przez Corrales-Medina i wsp. stwierdzono, że powikłania sercowe są związane z i/lub odpowiedzialne za 27% zgonów związanych z zapaleniem płuc³. Streptococcus pneumoniae (pneumokoki), najczęstsza przyczyna CAP i sepsy⁵, jest bezpośrednio związana z niepożądanymi zdarzeniami sercowymi aż u 19% przyjętych dorosłych pacjentów⁶. Niepożądane zdarzenia sercowe związane z zapaleniem płuc obejmują nową lub nasiloną zastoinową niewydolność serca, zaburzenia rytmu serca i zawał mięśnia sercowego w kolejności malejącej częstości⁶.

W niedawnym artykule PLoS Pathogens autorstwa Browna i wsp.stwierdzono, że S. pneumoniae jest zdolny do translokacji przez śródbłonek naczyń sercowych, wnikania do mięśnia sercowego i tworzenia dyskretnych, nieropnych zmian mikroskopowych (mikrouszkodzeń) wypełnionych bakteriami w komorach podczas inwazyjnej choroby pneumokokowej (IPD)⁷. Dowody na powstawanie mikrouszkodzeń serca zaobserwowano w próbkach serca pobranych od naczelnych innych niż ludzie i osób, które uległy zakażeniu pneumokokiem. Podobnie, eksperymentalnie zakażone myszy w powtarzalny sposób rozwijały mikrouszkodzenia serca. U myszy wielkość i liczba mikrozmian była dodatnio skorelowana z czasem trwania i nasileniem bakteriemii, poziomem troponiny sercowej w surowicach i nieprawidłową elektrofizjologią serca. Stwierdzono, że translokacja bakteryjna do serca zachodzi poprzez te same mechanizmy, które są odpowiedzialne za translokację pneumokoków przez barierę krew-mózg i rozwój pneumokokowe zapalenie opon mózgowo-rdzeniowych, tj. inwazję komórek śródbłonka naczyniowego za pośrednictwem białka A za pośrednictwem receptora Lamininy i receptora czynnika aktywującego płytki krwi⁸. Powstawanie mikrozmian wymagało również pneumokokowej toksyny tworzącej pory, pneumolizyny, która, jak stwierdzono, zabija kardiomiocyty⁷.

Pneumokokowe mikrouszkodzenia serca różnią się od ropnych ropni tkanek miękkich i serca, które są wywoływane przez inne bakterie Gram-dodatnie, w tym Staphylococcus aureus. Charakteryzują się one pojedynczymi ogniskami bakterii otoczonymi neutrofilami i odkładaniem fibryny^9,10. Mikrouszkodzenia utworzone przez S. pneumoniae są mniejsze, rozmieszczone w chorym sercu i nie mają nacieków komórek odpornościowych. We wczesnych stadiach infekcji mikrouszkodzenia wywołane przez S. pneumoniae pojawiają się jako obszary uszkodzonej lub objętej stanem zapalnym tkanki, przypominające patologiczne objawy kardiomiopatii. W tym czasie można zaobserwować niektóre monocyty, jednak ich obecność jest krótkotrwała, a zmiany szybko stają się nekrotyczne i wypełnione bakteriami, jednocześnie kontynuując wzrost wielkości aż do śmierci zwierzęcia lub interwencji przeciwdrobnoustrojowej. Co ważne, w ciągu 3 dni od interwencji antybiotykowej obserwuje się obfity naciek komórek odpornościowych w miejscu pierwszej zmiany, któremu towarzyszy silne odkładanie kolagenu. Doniesiono, że podobna przebudowa serca występuje po zawale wraz z trwałymi konsekwencjami dla funkcji serca^11-15. W związku z tym mikrouszkodzenia są potencjalnym wyjaśnieniem niepożądanych zdarzeń sercowych, które występują podczas IChP i prawdopodobnie zwiększonej częstości występowania śmiertelności związanej z sercem u osób ozdrowieńców, którzy przeżyli epizod choroby.

Tutaj, instrukcje są podane na eksperymentalnym mysim modelu IChP i powstawania zmian w sercu oraz wizualizacji mikrouszkodzeń serca we wczesnych i późnych stadiach infekcji. Przedstawiono protokół wykrywania odkładania się kolagenu u zwierząt, które zostały uratowane przez interwencję przeciwdrobnoustrojową. Celem tego artykułu jest ułatwienie innym badaczom badań nad tą ważną i nową patologią pneumokokową.

Protokół

UWAGA: Wszystkie eksperymenty na myszach zostały sprawdzone i zatwierdzone przez Instytucjonalne Komitety ds. Opieki nad Zwierzętami i Użytkowania w Centrum Nauk o Zdrowiu Uniwersytetu Teksańskiego w San Antonio (protokół #13032-34-01C). Opieka nad zwierzętami i protokoły eksperymentalne są zgodne z prawem publicznym 89-544 (Ustawa o dobrostanie zwierząt) i jej poprawkami, wytycznymi Publicznej Służby Zdrowia oraz Przewodnikiem dotyczącym opieki i wykorzystywania zwierząt laboratoryjnych (Departament Zdrowia i Opieki Społecznej Stanów Zjednoczonych).

1. Infekcja

1. Zdobądź myszy BALB/c obu płci w wieku 10-12 tygodni.
   UWAGA: Szczep S. pneumoniae serotyp 4 TIGR4 jest zjadliwym izolatem klinicznym, który został zsekwencjonowany¹⁶.
2. Hodować TIGR4 w bulionie Todda-Hewitta w temperaturze 37 °C w 5% CO₂ aż do osiągnięcia gęstości optycznej (OD)₆₂₀ 0,5 (co odpowiada 1,0 x 10⁸ jednostek tworzących kolonie [CFU]/ml). Osadzać kulturę pneumokokową przez wirowanie przez 10 minut przy 3 500 x g i usunąć supernatant za pomocą przewodu próżniowego. Zawiesić i rozcieńczyć bakterie sterylnym roztworem soli fizjologicznej buforowanym fosforanami (PBS) do końcowego stężenia 1,0 x 10⁴ jtk/ml.
3. Za pomocą komory indukcyjnej znieczulij myszy 2,5% odparowanym izofluranem w tlenie. Potwierdź stan znieczulenia, delikatnie szczypiąc palec u nogi pęsetą.
   1. Trzymając znieczuloną mysz za kark i pionowo jedną ręką, wstrzyknąć każdej myszy dootrzewnowo (i.p.) 100 μl zawiesiny S. pneumoniae za pomocą strzykawki z igłą o rozmiarze 27-30 (co odpowiada dawce prowokacyjnej 1,0 x 10³ CFU). Umieść mysz z powrotem w klatce. Myszy zazwyczaj budzą się 30-40 sekund po wstrzyknięciu.
4. Pozwól, aby infekcja postępowała przez co najmniej 24 (wcześnie) lub 30 (zaawansowanie) godzin.
   1. Poddać myszy eutanazji przez uduszenie CO₂ . Wykonaj zwichnięcie szyjki macicy, aby upewnić się, że mysz nie żyje. Eutanazja jest dodatkowo potwierdzana przez usunięcie serca w kroku 1.6.
5. Zdezynfekuj ogon wacikiem nasączonym alkoholem i odetnij odcinek 2-3 mm. Zebrać 2 μl krwi i seryjnie rozcieńczyć krew 10-krotnie w PBS zawierającym heparynę sodową 1 j./ml pięć razy. Umieścić seryjne rozcieńczenia na płytce z tryptyczną krwią sojową i inkubować przez noc w temperaturze 37 °C w 5% CO_{2 .} Następnego dnia ekstrapoluje się z kolonii poziom bakteriemii.
6. Unieruchomij mysz w pozycji leżącej na pozycji na platformie operacyjnej. Spryskaj klatkę piersiową 70% etanolem i osusz. Za pomocą nożyczek chirurgicznych i kleszczy otwórz jamę klatki piersiowej, usuń klatkę piersiową i przetransektuj przeponę, aby odsłonić serce i płuca. Za pomocą nożyczek przetnij naczynia krwionośne połączone z sercem i delikatnie wytnij serce, ostrożnie, aby uniknąć siniaków kleszczami.
7. Przepłucz serce PBS, a następnie umieść w kasetach do pobierania próbek tkanek tak, aby podczas cięcia tkanek uzyskano skrawki koronalne. W celu zatopienia parafiny umieść kasety w 10% buforowym roztworze formaliny i następnego dnia wyślij do zatopienia parafiny.
   1. Alternatywnie można je błyskawicznie zamrozić za pomocą związku O.C.T. w krioformie, który został umieszczony na suchym lodzie.

2. Wizualizacja zmian w sercu i pneumokoków w obrębie zmian

1. Wytnij sekcje serca zatopione w parafinie tak, aby 4 komory serca były widoczne w każdym fragmencie tkanki. Cięcie szkiełek o grubości 5 μm.
2. Deparafinować i barwić szkiełka hematoksyliną i eozyną (H&E) przy użyciu standardowych metod¹⁷.
3. Oglądaj wycinki serca barwione metodą H&E za pomocą mikroskopu świetlnego przy małych (100x, 200x) i wysokich (immersja w oleju: 400x, 1,000x) powiększeniach. Scharakteryzuj serca pod kątem obecności mikrouszkodzeń w mięśniu sercowym. Tutaj można uzyskać obrazy H&E za pomocą mikroskopu Zeiss Axioskop 2 wyposażonego w obiektyw Plan-NEOFLUAR z aperturą numeryczną 100X 1,3.
   UWAGA: We wczesnych stadiach zmiany w sercu są rozróżniane na podstawie ich zróżnicowanego wyglądu, aw niektórych przypadkach obecności komórek odpornościowych (monocytów i granulocytów), które wydają się być monocytami. W zaawansowanych zmianach, szczególnie tych obserwowanych po 30 godzinach, komórki odpornościowe są nieobecne, a w ich miejsce obserwuje się duże zmiany wakuolowe. Ważne jest, aby pamiętać, że chociaż może wystąpić napływ komórek odpornościowych we wczesnych stadiach rozwoju zmian w sercu, nie wydaje się, aby był to wymóg.

3. Mikroskopia immunofluorescencyjna dla pneumokoków w mikrouszkodzeniach

1. Serce należy przeciąć w krioformach z mikrotomem do grubości 5 μm i umieścić skrawki na dodatnio naładowanych szkiełkach podstawowych. Pozostaw zamrożone skrawki serca do rozmrożenia i wyschnięcia na powietrzu. Utrwalać skrawki na 10 minut w 10% obojętnej buforowanej formalinie (pH 6,8-7,2 w 25 °C).
2. Myć szkiełka (3x) w PBS przez 5 min, przepuszczać przez 15 min w 0,2% Triton X-100 w PBS, a następnie ponownie umyć w PBS.
3. Zablokuj wycinek tkanki na szkiełkach z 10% surowicą kozią w PBS przez 1 godzinę.
4. Przepłukać szkiełka PBS, przykryć i inkubować skrawki serca surowicą przeciwko pneumokokom królika anty-serotypu 4 w stosunku 1:1 000 w PBS z 10% surowicą kozią przez 2 godziny w temperaturze 37 °C.
   UWAGA: Do kontroli ujemnych badacze powinni stosować naiwną surowicę króliczą
5. Po umyciu PBS przykryć i inkubować sekcje 10% kozią surowicą-PBS z kozim przeciwciałem anty-króliczym FITC skoniugowanym w stosunku 1:2 000 przez 30 minut w temperaturze 37 °C.
6. Postępując zgodnie z instrukcją producenta, należy użyć DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole) w dawce 5 mg/ml do wizualizacji jąder eukariotycznych. Umyj i zamontuj skrawki tkanek za pomocą FluorSave.
7. Uzyskuj obrazy fluorescencyjne za pomocą systemu mikroskopu konfokalnego zarówno przy małym, jak i dużym powiększeniu. Dostosuj odpowiednio przysłonę numeryczną, aby uzyskać optymalne wyniki. Tutaj uzyskaj obrazy fluorescencyjne za pomocą systemu konfokalnego z obiektywem o aperturze numerycznej 60X 1,42.

4. Antybiotykowe ratowanie myszy septycznych

1. Zacznij od myszy zakażonych i.p. 1,0 x 10³ CFU TIGR4, jak wskazano wcześniej w kroku 1.
2. Począwszy od 30 godzin po zakażeniu, podawać ampicylinę farmaceutyczną i.p. (80 mg/kg masy ciała) w 100 μl soli fizjologicznej co 12 godzin przez 36 godzin. Zbierz serca w żądanym punkcie czasowym i postępuj zgodnie z opisem w kroku 1.6 dla zatapiania parafiny i cięcia, tkanki.

5. Wykrywanie osadzania kolagenu

1. Za pomocą ksylenu i stopniowanego alkoholu przemywać się wodą dejonizowaną, należy odparafinować i uwodnić skrawki tkanek przy użyciu standardowych metod¹⁷. Skrawki należy traktować wodnym roztworem 0,2% kwasu fosfomolibdynowego przez 5 minut i płukać wodą dejonizowaną przez 5 minut.
2. Zabarwić skrawki 0,1% czerwieni Sirius Red w kwasie pikrynowym przez 2 godziny w temperaturze pokojowej.
3. Myć sekcje w 0,01 N kwasie solnym przez 3 minuty i płukać 70% etanolem przez 1 min.
4. Odwodnić skrawki przy użyciu identycznej, ale odwrotnej kolejności płukania do opisanej w ppkt 5.1, odwodnić skrawki serca w rosnących i stopniowanych stężeniach etanolu, a następnie ksylenu.
5. Zamontuj skrawki tkanek za pomocą roztworu montażowego do oceny mikroskopowej.
6. Aby zidentyfikować obszary odkładania się kolagenu, zbadaj barwione skrawki tkanek pod kątem obszarów głębokiego barwienia odczytem przy małym i dużym powiększeniu za pomocą mikroskopu świetlnego. Każdy obszar w komorach serca, który jest czerwony, jest obszarem, w którym został zdeponowany kolagen. Obszary bez tej czerwonej plamy to miejsca zdrowej tkanki, w których brakuje odkładania kolagenu. W tym celu uzyskaj obrazy zabarwione na czerwono Picro Sirius za pomocą mikroskopu wyposażonego w obiektyw z aperturą numeryczną 20X 0,5.
   UWAGA: Przedsionek zabarwia się na czerwono w zdrowych tkankach.

Wyniki

Wizualizacja mikrouszkodzeń przez H&E

Mikrouszkodzenia serca zaobserwowano w komorach wycinków serca podbarwionych H&E od myszy z IPD po ich prowokacji i.p. TIGR4. Rycina 1 pokazuje wzrost wielkości tych zmian między 24 a 30 godzinami po zakażeniu (hpi), przy większej liczbie pneumokoków wybarwionych hematoksyliną (tj. fioletowo-niebieskich) widocznych w obrębie zmiany. Mikrouszkodzenia charakteryzowały się morfologią podobną do wakuoli, gęstszym zaba...

Dyskusja

W niniejszym raporcie przedstawiono wysoce powtarzalną metodę indukowania mikrozmian serca za pośrednictwem S. pneumoniae u myszy podczas IChP oraz techniki ich wizualizacji. Myszy są zakażone dawką bakterii, która przekracza próg klirensu układu odpornościowego, co prowadzi do bakteriemii wysokiego stopnia, podobnej do tej, która występuje podczas sepsy u ludzi, i prowadzi do ostatecznej translokacji bakteryjnej do mięśnia sercowego. Z nieznanych jeszcze przyczyn S. pneumoniae w sercu jest w stanie rep...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Rosół Todda-Hewitta	Związek Neogen	7161A
O.C.T 	Tissue-Tek (Sakura Finetek)	4583
Tryton X-100	Fisher Scientific (Acros)	9002-93-1
Normalna surowica kozia	Abcam	ab7481
antyserotyp 4 surowica przeciw pneumokokom	Statens Serum Institut	16747
kozie przeciwciało sprzężone FITC przeciwko królikowi	Jackson ImmunoResearch	111-096-144
DAPI	Invitrogen	D1306
Fluorsave	Millipore	345789
Permount	Fisher Scientific	S70104
Ampicillin	Sigma	A9393
kwas fosfomolibdowy 0,2%	Mikroskopia elektronowa Nauki	26357-01
0,1% czerwień Syriusza w kwasie pikrynowym	Mikroskopia elektronowa	26357-02
0,01 N kwas solny	Mikroskopia elektronowa Sciences	26357-03
Szkiełka mikroskopowe do przyczepności tkanek	Polysciences, Inc	24216
Maść weterynaryjna Paralube	Dechra	12920060
Zestaw do barwienia hematoksyliny i eozyny	nieokreślony		norma