Artykuł metodologiczny

Ulepszona analiza genetyczna pojedynczych ludzkich biocząstek odzyskanych za pomocą uproszczonej mikromanipulacji z dowodów kryminalistycznych "dotykowego DNA"

DOI:

10.3791/52612

⸱

9 marca 2015

 ,  , 
1Forensic Science Graduate Program, Biochemistry Track, University of Central Florida, 2Department of Chemistry, University of Central Florida, 3National Center for Forensic Science, University of Central Florida

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj opisujemy zoptymalizowaną i efektywną strategię usuwania bio-cząsteczek obecnych w próbkach 'touch DNA', wraz z ulepszonym protokołem amplifikacji obejmującym jednoetapową 5 μl mikroobjętościową lizę/amplifikację STR, aby umożliwić odzyskanie krótkich profili powtórzeń tandemowych (STR) dawcy (dawców) biocząstek.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Profile DNA można uzyskać z dowodów 'touch DNA', które zawierają mikroskopijne ślady ludzkiego materiału biologicznego. Obecne metody odzyskiwania śladowego DNA wykorzystują bawełniane waciki lub taśmę klejącą do pobierania próbek z obszaru zainteresowania. Jednak takie podejście "ślepego wymazu" spowoduje jednoczesne pobieranie próbek materiału komórkowego od różnych osób, nawet jeśli komórki tych osób znajdują się w geograficznie różnych miejscach na przedmiocie. W związku z tym niektóre mieszaniny DNA napotkane w kontaktowych próbkach DNA są sztucznie tworzone przez samo pobranie wymazu. W niektórych przypadkach DNA ofiary może zostać znalezione w znacznym nadmiarze, maskując w ten sposób DNA potencjalnego sprawcy.

Aby obejść wyzwania związane ze standardowymi metodami odzyskiwania i analizy, opracowaliśmy tańszą, 'inteligentną analizę' metodę, która skutkuje ulepszoną analizą genetyczną dowodów DNA dotykowego. Opisujemy zoptymalizowaną i wydajną strategię odzyskiwania mikromanipulacji do zbierania biocząstek obecnych w kontaktowych próbkach DNA, a także ulepszoną strategię amplifikacji obejmującą jednoetapową lizę mikroobjętości 5 μl/amplifikację STR, aby umożliwić odzyskanie profili STR od dawcy (dawców) biocząstek. Wykorzystanie pojedynczych lub kilku ("grudek") biocząstek skutkuje możliwością uzyskania profili z jednego źródła. Procedury te reprezentują alternatywne, ulepszone techniki izolacji i analizy pojedynczych biocząstek z dowodów DNA pochodzących z dotyku kryminalistycznego. Chociaż nie jest to konieczne w każdym dochodzeniu kryminalistycznym, metoda ta może być bardzo korzystna dla odzyskania profilu DNA sprawcy z jednego źródła w przypadkach związanych z napaścią fizyczną (np. uduszeniem), co może nie być możliwe przy użyciu standardowych technik analizy. Ponadto opracowane w ramach projektu strategie dają możliwość uzyskania informacji genetycznej na poziomie pojedynczej komórki z wielu innych śladowych materiałów biologicznych o charakterze niekryminalistycznym.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dotyk DNA jest formą śladowego dowodu biologicznego, który jest bezpośrednim transferem materiału komórkowego (np. zrzuconych komórek skóry) od osoby do obiektu lub innej osoby podczas kontaktu fizycznego1. Możliwość uzyskania profili DNA z różnych dotykanych przedmiotów (dokumentów, pościeli, butów, broni palnej, pojemników do picia, długopisów, uchwytów teczek) opisano w literaturze2-9.

Kluczowym czynnikiem w analizie dowodów DNA dotyku jest pomyślne odzyskanie śladowego materiału biologicznego. Dowody DNA w dotyku są zwykle pobierane przez pobranie wymazu z podejrzanego obszaru za pomocą sterylnego wacika (określanego jako "ślepy wacik"). Stosując to podejście, charakter pobranego materiału biologicznego nie jest znany i pobiera się próbki z uogólnionego obszaru. Obecność bruzd lub szczelin powierzchniowych może utrudniać pomyślne odzyskanie często już niewielkiej ilości obecnego materiału biologicznego. Dodatkowo, podejście "ślepego wymazu" z konieczności spowoduje jednoczesne pobieranie próbek materiału komórkowego od różnych osób, których komórki są obecne na przedmiocie, nawet jeśli komórki tych osób znajdują się w przestrzennie różnych miejscach na przedmiocie. Odzyskiwanie mieszanych profili DNA, które często są trudne do rozwiązania, szczególnie w przypadku próbek DNA o niskiej matrycy, jest często obserwowane8,10,11 i w wielu przypadkach będzie konsekwencją samego procesu pobierania wymazów. Jeśli od jednego z dawców obecna była tylko niewielka ilość materiału, standardowe techniki ekstrakcji i analizy mogą nie być w stanie odzyskać profilu od małoletniego darczyńcy. Dodatkowo rodzaj wymazu lub to, czy był on używany na sucho czy na mokro (wstępnie zwilżony sterylną wodą) może mieć wpływ na ilość pobieranego materiału biologicznego ze względu na różnice w chłonności i adsorpcji oraz skuteczności uwalniania materiału biologicznego12. Standardowe metody ekstrakcji mogą powodować dodatkową utratę próbki ze względu na wymaganą fizyczną manipulację próbką lub etapami przenoszenia próbki.

Jak opisano powyżej, proste techniki pobierania wymazów w celu odzyskania materiału biologicznego mogą spowodować utratę śladowych ilości próbki biologicznej, jak również zwiększoną częstość występowania profili mieszanych z powodu niepowodzenia w oddzieleniu poszczególnych składników biologicznych. W związku z tym staraliśmy się opracować bardziej selektywne i wydajne strategie odzyskiwania mikrocząstek komórkowych obecnych na dotykanych przedmiotach. Opracowana strategia analizy materiału biologicznego na podstawie dotykowych dowodów DNA (określanych tutaj jako "biocząstki" ze względu na fakt, że jądro nie zawsze jest widoczne, ponieważ większość komórek znajdujących się w zewnętrznej warstwie naskórka skóry to martwe lub umierające keratynocyty13) obejmuje: 1) pobranie materiału biologicznego (tj. biocząstki) za pomocą filmu żelowego z dotykanych przedmiotów i powierzchni, noszonych elementów odzieży lub bezpośrednio ludzkiej skóry, 2) badanie mikroskopowe odzyskanego materiału biologicznego w celu zapewnienia pobrania potencjalnego ludzkiego materiału biologicznego, oraz 3) mikromanipulacja pojedynczymi lub kilkoma biocząstkami przy użyciu rozpuszczalnego w wodzie kleju, oraz 4) autosomalne profilowanie DNA-STR pobranych biocząstek przy użyciu mikroobjętościowej (5 μl) jednoetapowej reakcji lizy/amplifikacji.

Ta procedura oferuje wiele zalet w porównaniu z tradycyjnie stosowanymi metodami analizy. Odzysk biocząstek za pomocą filmu żelowego pozwala na mikroskopowe badanie materiału biologicznego obecnego w próbce przed analizą. Podczas gdy większość biocząstek odzyskanych z dotykowych dowodów DNA może nie być komórkami jądrzastymi, co utrudnia określenie, które lub ile biocząstek należy wybrać, badanie mikroskopowe tych próbek przed analizą daje możliwość poszukiwania komórek jądrzastych, maksymalizując w ten sposób prawdopodobieństwo odzyskania profilu DNA. Zbieranie biocząstek za pomocą rozpuszczalnej w wodzie mikromanipulacji wspomaganej klejem pozwala na bezpośrednie przeniesienie docelowych biocząstek do probówek reakcyjnych. Procedura ta jest wizualizowana pod mikroskopem, aby zapewnić pomyślny transfer materiału biologicznego. Reakcja zredukowana lub mikroobjętościowa zwiększa czułość, jednocześnie zmniejszając koszt analizy na próbkę. Pozwala to na analizę zwiększonej liczby próbek z pojedynczego materiału dowodowego. Ze względu na rozpiętość stanu genetycznego biocząsteczek w kontaktach z dowodami DNA, zaleca się wielokrotne pobieranie próbek z poszczególnych elementów.

Tutaj pokazujemy udane wykorzystanie opracowanych protokołów do uzyskania wysoce wiarygodnych profili genetycznych dawców materiału biologicznego w styku dowodów DNA. Opracowane metody zbierania biocząsteczek i profilowania DNA zapewniają kompleksowe, "inteligentne" (tj. konkretne, mierzalne, osiągalne, realistyczne i terminowe) molekularne podejście do charakteryzacji, analizy i interpretacji śladowego materiału biologicznego. Chociaż pierwotnie zostały opracowane do zastosowania w kryminalistycznej analizie dowodów DNA dotyku, opracowane tutaj strategie mogą być stosowane do innych źródeł materiału biologicznego i oferują możliwość uzyskania indywidualnych informacji identyfikujących na poziomie pojedynczej komórki.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

UWAGA: Płyny ustrojowe zostały pobrane od ochotników przy użyciu procedur zatwierdzonych przez Institutional Review Board Uniwersytetu Centralnej Florydy. Od każdego dawcy uzyskano świadomą pisemną zgodę.

1. Zbieranie biocząsteczek z dotykanych przedmiotów i powierzchni

  1. Przytnij folię żelową do żądanego rozmiaru. Upewnij się, że ma odpowiedni rozmiar dla szklanego szkiełka mikroskopowego używanego jako solidne podparcie. Na przykład w przypadku szkiełka o wymiarach 3" x 1" użyj folii żelowej o rozmiarze 2" x 0,75".
    UWAGA: W razie potrzeby długość i szerokość materiału można zmniejszyć, ale nie należy przekraczać tego rozmiaru.
  2. Usuń biały podkład z folii żelowej i przymocuj folię żelową do szkiełka mikroskopu (Rysunek 1A). Mocno dociśnij, aby zapewnić pełne mocowanie.
    UWAGA: Istnieje przezroczysta górna warstwa ochronna, której nie należy usuwać, aby umożliwić wywieranie nacisku wzdłuż kawałka folii żelowej bez zanieczyszczenia powierzchni filmu żelowego. Przygotowane szkiełka żelowo-filmowe (z dołączoną warstwą ochronną) można przechowywać w temperaturze pokojowej do czasu ich potrzebowania.
  3. Usuń przezroczystą górną folię ochronną z folii żelowej za pomocą sterylnej pęsety, gdy jest gotowa do użycia (Rysunek 1B) próbki filmu żelowego. Umieść powierzchnię filmu żelowego w bezpośrednim kontakcie z żądanym dotykanym przedmiotem lub powierzchnią (Rysunek 2). Zastosuj niewielki nacisk, aby zapewnić skuteczne przenoszenie biocząsteczek do filmu żelowego.
    UWAGA: Jeśli zostanie przyłożony zbyt duży nacisk, szkiełko może pęknąć.
    UWAGA: Na tym samym kawałku filmu żelowego można pobrać wiele próbek z tego samego obiektu lub powierzchni.
  4. Potwierdzić przeniesienie biocząstek na film żelowy (ryc. 3), umieszczając szkiełko na mikroskopie stereoskopowym (można zastosować trans- lub epi-oświetlenie). Użyj powiększenia ~20X, aby najlepiej zobaczyć większe obszary filmu żelowego, i powiększenia ~200X, aby jak najlepiej zobaczyć poszczególne biocząsteczki.
  5. Szkiełko z próbką żelowej folii należy przechowywać w temperaturze pokojowej w zakrytym pudełku na szkiełka lub natychmiast użyć do barwienia i/lub zbierania biocząstek.

2. Opcjonalne barwienie biocząsteczek w celu ułatwienia wizualizacji

  1. Umieść szkiełko z folią żelową przygotowane w kroku 1 na stojaku do barwienia szkiełek nad zlewem.
  2. Za pomocą jednorazowej pipety transferowej pokryj całą powierzchnię filmu żelowego niebieską plamą trypanową (Rysunek 4A). Inkubować w temperaturze pokojowej przez 1-2 minuty.
  3. Usuń nadmiar plamy, przechylając suwak, aby plama mogła spłynąć do zlewu (Rysunek 4B).
    UWAGA: W razie potrzeby szkiełko można przepłukać poprzez delikatne zalanie sterylną wodą za pomocą jednorazowej pipety transferowej (Rysunek 4C).
  4. Pozostaw szkiełko do wyschnięcia na powietrzu przed przystąpieniem do izolacji biocząstek. Obejrzyj szkiełko za pomocą mikroskopu stereoskopowego (~20X dla ogólnego oglądania i ~200-300X, aby zobaczyć poszczególne biocząstki), aby zapewnić prawidłowe barwienie (Rysunek 4D-E).
    UWAGA: Szkiełko można przechowywać w temperaturze pokojowej w zakrytym pudełku na szkiełka.

3. Izolacja biocząstek będących przedmiotem zainteresowania do analizy

  1. Umieść odpowiednią liczbę probówek PCR o pojemności 0,2 ml w stojaku i odpowiednio oznacz probówki.
  2. Przygotuj mieszaninę amplifikacyjną STR (patrz Lista materiałów) w przeznaczonym do tego celu okapie do amplifikacji PCR lub komorze bezpieczeństwa biologicznego. Dobrze zmieszaj mieszankę główną i krótko odwiruj w mini-wirówce.
    1. Objętość mieszaniny amplifikacyjnej potrzebna na próbkę wynosi 3,5 μl; należy przygotować odpowiednią objętość mieszanki wzorcowej dla żądanej liczby próbek.
  3. Odpipetować 3,5 μl mieszaniny amplifikacyjnej do każdej probówki o pojemności 0,2 ml. Luźno zakryj każdą tubkę.
  4. Umieść kawałek podwójnej taśmy klejącej na czystym szklanym szkiełku mikroskopowym lub bezpośrednio na szklanym pustaku.
    UWAGA: Będzie on używany do utrzymywania probówki o pojemności 0,2 ml na miejscu podczas pobierania próbki.
  5. Umieść kawałek podwójnej taśmy klejącej na czystym szklanym szkiełku mikroskopowym. Umieść kawałek rozpuszczalnej w wodzie taśmy lutowniczej na fali na wierzchu podwójnej taśmy klejącej.
    UWAGA: Szkiełko to można przechowywać w eksykatorze do wykorzystania w przyszłości.
  6. Umieść pierwszą probówkę o pojemności 0,2 ml na szkiełku lub bloku z podwójną taśmą szkiełkową przygotowaną w kroku 3.4. Odłóż tę probówkę na bok do czasu pobrania próbki.
  7. Umieść szkiełko z rozpuszczalną w wodzie taśmą lutowniczą na fali pod mikroskopem (małe powiększenie). Za pomocą końcówki igły wolframowej delikatnie zeskrobać powierzchnię taśmy, aby zebrać niewielką ilość (lub "kulkę") kleju na końcu igły (Rysunek 5A).
    UWAGA: Rozmiar kuli może być mały lub duży w zależności od liczby biocząstek, które zostaną zebrane.
  8. Ostrożnie wyjmij igłę wolframową z klejem spod mikroskopu, nie naruszając końcówki igły. W razie potrzeby igłę można umieścić w stojaku podczas umieszczania próbki.
  9. Umieścić przygotowaną próbkę filmu żelowego (z kroków 1 i 2) na stoliku mikroskopu. Dostosuj ostrość i powiększenie, aż biocząstki będą mogły być łatwo oglądane. Zidentyfikuj biocząstki, które zostaną zebrane.
    UWAGA: W razie potrzeby do podparcia zjeżdżalni można użyć pustaka szklanego.
  10. Wyjmij igłę wolframową za pomocą kulki klejącej i umieść igłę na powierzchni filmu żelowego, na której znajdują się interesujące biocząsteczki. Dociśnij końcówkę igły (z klejem) w dół, tak aby stykała się z biocząstką (Rysunek 5B). Podnieś igłę do góry, aby upewnić się, że biocząstka została zebrana. Powtarzaj ten proces, aż zostanie zebrana żądana liczba biocząstek.
  11. Umieść przygotowaną probówkę o pojemności 0,2 ml do PCR na stoliku mikroskopu. Dostosuj powiększenie tak, aby spód rurki zawierającej mieszankę amplifikacji była ostra.
  12. Ostrożnie włożyć igłę wolframową do probówki PCR o pojemności 0,2 ml, aż końcówka igły znajdzie się w mieszance amplifikacyjnej.
    UWAGA: Najlepiej jest to zrobić podczas oglądania przez mikroskop.
  13. Trzymaj igłę w mieszance amplifikacyjnej, aż klej się rozpuści, a biocząstki zostaną uwolnione do roztworu (Rysunek 5C). Wyjąć igłę, umieścić 0,2 ml w pozycji pionowej i luźno zakręcić probówkę.
  14. Powtórzyć procedurę pobierania w celu uzyskania dodatkowych próbek. Wyczyść igłę wolframową wstępnie zwilżonymi chusteczkami nasączonymi alkoholem (izopropanolem) pomiędzy próbkami.

4. Połączona izolacja kwasów nukleinowych w mikroobjętościach (bezpośrednia liza) i autosomalne krótkie powtórzenia tandemowe (STR)

  1. Przygotuj bufor do lizy (patrz Materiały) w przeznaczonym do tego celu kapturze do amplifikacji PCR lub komorze bezpieczeństwa biologicznego. Dodać 1,5 μl buforu do lizy do każdej probówki, aby uzyskać całkowitą objętość reakcyjną 5 μl. Zamknij szczelnie pokrywy tuby.
    UWAGA: Probówki o pojemności 0,2 ml zawierają już 3,5 μl mieszanki amplifikacyjnej i biocząstek z Kroku 3.
  2. Umieścić próbki w termocyklerze i amplifikować próbki, stosując następujące warunki cykliczne: 75 °C przez 15 minut, 95 °C przez 11 minut, 34 cykle w temperaturze 94 °C przez 20 sekund i 59 °C przez 3 minuty, 60 °C przez 10 minut i 4 °C w temperaturze 4 °C.
    1. Produkty wzmacniające należy przechowywać w temperaturze 4 °C w celu krótkotrwałego przechowywania.

5. Wykrywanie produktu – elektroforeza kapilarna (CE)

  1. Do płytki 96-dołkowej dodać 10 μl mieszanki do biegania CE (9,7 μl dejonizowanego formamidu i 0,3 μl wzorca wielkości, patrz Materiały). Dodać 1 μl amplifikowanego produktu lub drabinki allelicznej do każdej studzienki.
    UWAGA: Formamid jest potencjalnym mutagenem i należy obchodzić się z nim w kapturze chemicznym podczas noszenia odpowiedniego wyposażenia ochrony osobistej.
  2. Stosować warunki elektroforetyczne określone przez producenta w instrukcji obsługi zestawu amplifikacja lub w warunkach wewnętrznie zwalidowanych.
  3. Analizuj surowe dane za pomocą oprogramowania do analizy STR.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Reprezentatywne obrazy pojedynczych i zbitych biocząstek, które zostały odzyskane z kołnierzyka koszuli (100% poliestru) noszonego przez męskiego dawcę, są pokazane na Rysunku 6 (pojedyncze biocząstki) i Rysunku 7 (zbite biocząstki). Biocząstki odzyskano z kołnierzyka koszuli przy użyciu opisanego tutaj protokołu: przeniesienie biocząstek z kołnierzyka koszuli na folię żelową poprzez bezpośredni kontakt, barwienie odzyskanych biocząstek błękitem trypanowym, pobieranie próbek biocząstek za pomocą igły wolframowej i kleju rozpuszczalnego w wodzie oraz analiza STR przy użyciu 5 μl mikroobjętościowej lizy/amplifikacji STR. Rysunki 6 i 7 przedstawiają typową próbkę biocząstek, które byłyby analizowane z pojedynczego elementu DNA dotykanego (20 pojedynczych/pojedynczych biocząstek i 20 zbitych biocząstek). Biocząstki zebrane na każdym obrazie są oznaczone pomiarami długości i szerokości (w mikronach). Procent alleli STR odzyskanych z każdej z pobranych biocząstek jest przedstawiany na każdym indywidualnym obrazie, aby pokazać zmienny stopień sukcesu, jakiego można oczekiwać od biocząstek z tego typu dowodami. Biocząstki odzyskane z dotykowych próbek DNA są w dużej mierze martwymi lub umierającymi keratynocytami, a zatem nie uzyskuje się dowodowego profilu STR z każdej pobranej biocząstki, jak widać na rysunkach 6 i 7. W przypadku tej próbki kołnierzyka koszuli profile STR uzyskano z 14/20 (70%) pojedynczych biocząstek i 15/20 (75%) zbitych biocząstek. Jednak każdy z odzyskanych profili ma wartość dowodową: 3-97% odzysku alleli dla poszczególnych profili biocząstek i 3-100% odzysku alleli dla zlepionych profili biocząstek. Ze względu na zmienność wskaźników sukcesu zaleca się pobieranie wielu biocząsteczek z każdego elementu DNA dotkniętego dotykiem. Zapewnia to większą szansę na uzyskanie wysoce wiarygodnego profilu STR.

Profil STR uzyskany z jednej z indywidualnych próbek biocząstek z kołnierzyka koszuli jest pokazany na rysunku 8 (biocząstka, z której pochodzi profil, jest pokazana po lewej stronie). Z tej pojedynczej biocząstki uzyskano prawie pełny profil STR (28 z 30 alleli, odpadnięcie jednego locus, dokładność uzyskanego profilu zweryfikowana przez porównanie z profilem referencyjnym). Uzyskany profil jest wysokiej jakości, z rozsądnie zbalansowanymi wysokościami pików międzylocus i brakiem wypadania alleli. Wypadanie alleli i niezrównoważone artefakty wysokości piku są często obserwowane w próbkach DNA o niskiej matrycy. Profil STR uzyskany z jednej z zbitych próbek biocząstek z kołnierzyka koszuli pokazano na rysunku 9. Uzyskano pełny profil STR (allele 30/30, dokładność uzyskanego profilu zweryfikowana przez porównanie z profilem referencyjnym). Jak wspomniano wcześniej, profil STR nie jest odzyskiwany z każdej pobranej biocząstki. Przykład nieudanego profilowania DNA pojedynczej biocząstki (3% odzysk alleli, 1/30 alleli) przedstawiono na rycinie 10 (pojedyncza biocząstka). Chociaż ta pojedyncza biocząstka nie zakończyła się sukcesem, wysoce wiarygodne profile STR dawcy biocząstek w tej próbce uzyskano z innych biocząstek odzyskanych z tej samej próbki. Ilustruje to potrzebę wykonania wielu próbek pojedynczych komórek/kępek z tego samego obiektu.

Opracowane tutaj "inteligentne" metody analizy dowodów DNA zostały z powodzeniem wykorzystane do odzyskania dowodów z jednego źródła z pojedynczych i "zlepionych" biocząsteczek z różnych dotykanych przedmiotów i ubrań (np. podłokietników krzeseł, kierownic samochodowych, telefonów komórkowych, kubków do kawy, papierosów, długopisów, koszul, szortów i swetrów). Jednak, co ważne, podejście to zostało również wykorzystane do wykrywania i profilowania męskiego DNA dawcy (z jednego źródła) w symulowanych próbkach mieszaniny kontaktu fizycznego/napaści (np. sprawca chwytający ofiarę za nadgarstek, szyję lub ubranie lub kontakt z pościelą ofiary, jak w przypadku napaści na tle seksualnym).

figure-results-1
Rysunek 1: Przygotowanie preparatów żelowo-filmowych do pobierania biocząstek. (A) Biała tylna osłona ochronna jest usuwana za pomocą sterylnej pęsety z kawałka folii żelowej w celu odsłonięcia kleju podkładowego. Folia żelowa jest następnie przyklejana do szklanego szkiełka mikroskopowego ze zdecydowanym naciskiem. (B) Gdy próbka żelowej folii jest gotowa do użycia do pobrania biocząstek, górna przezroczysta folia ochronna jest usuwana za pomocą sterylnej pęsety.

figure-results-2
Rysunek 2: Pobieranie biocząstek za pomocą folii żelowej z różnych substratów. Szkiełka żelowo-foliowe mogą być używane do zbierania biocząstek z różnych powierzchni. Film żelowy umieszcza się w bezpośrednim kontakcie z przedmiotem zainteresowania lub powierzchnią. Wywierany jest delikatny nacisk w celu przeniesienia biocząsteczek na powierzchnię filmu żelowego. Pokazano zbieranie biocząstek z (A) noszonych elementów odzieży (kołnierz płaszcza), (B) dotykanych przedmiotów (podróżny kubek do kawy) i (C) bezpośredniej ludzkiej skóry (męski nadgarstek).

figure-results-3
Ryc. 3: Biocząstki na noszonym ubraniu (po wewnętrznej stronie nogawki spodni). Biocząstki są przenoszone na folię żelową poprzez bezpośredni kontakt z powierzchnią przedmiotu. Biocząstki można znaleźć jako "grudki" lub pojedyncze/pojedyncze biocząstki (oznaczone czerwonymi strzałkami).

figure-results-4
Rysunek 4: Opcjonalne barwienie biocząstek na szkiełkach z folii żelowej. Dla lepszej wizualizacji biocząstek, próbki żelu można barwić niebieskim barwnikiem trypanowym. Cała powierzchnia filmu żelowego pokryta jest błękitem trypanowym (A). Po 1-2 minutach barwienia szkiełko delikatnie się przechyla, aby nadmiar plamy mógł spłynąć ze szkiełka (B). Delikatne zalanie sterylną wodą (C) może być użyte do usunięcia nadmiaru plam. Po wysuszeniu szkiełka na powietrzu, szkiełko można oglądać pod mikroskopem, aby zapewnić prawidłowe barwienie (D, E). Uwaga: Nie wszystkie biocząstki będą wyglądały na poplamione (tj. w kolorze niebieskim). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-5
Rysunek 5: Zbieranie i analiza biocząstek. (A) Niewielka ilość (lub "kulka") rozpuszczalnej w wodzie taśmy lutowniczej na fali ("kleju") jest zbierana na końcówce igły wolframowej przez delikatne skrobanie. (B) Klej jest następnie dotykany powierzchnią filmu żelowego w celu zebrania interesujących biocząstek. Pojedyncze lub wiele biocząsteczek można zebrać za pomocą jednej kulki klejącej. (C) Po zebraniu pożądanych biocząstek, końcówkę igły umieszcza się w mieszance amplifikacyjnej w probówce PCR o pojemności 0,2 ml. Igłę trzyma się w płynie, aż się rozpuści i obserwuje się uwalnianie biocząstek do roztworu. Wszystkie etapy procesu pobierania są wykonywane i oglądane pod mikroskopem, aby zapewnić pomyślne pobranie i transfer biocząstek. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-6
Ryc. 6: Pojedyncze biocząstki w próbce kołnierzyka koszuli. Biocząstki odzyskano za pomocą folii żelowej z wewnętrznej strony kołnierzyka koszuli noszonego przez dawcę płci męskiej. Biocząstki wybarwiono przy użyciu błękitu trypanowego i pokazano obrazy dwudziestu różnych pojedynczych biocząstek zidentyfikowanych w próbce. Na każdym obrazie biocząstka, która została zebrana, jest zakreślona (czerwone kółka oznaczające biocząstki, w których profil został odzyskany; czarne kółka oznaczające biocząstki, w których profil nie został odzyskany). Procentowy odzysk alleli (liczba obserwowanych alleli z możliwych 30) jest pokazany powyżej obrazu biocząstki, z której odzyskano profil. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-7
Ryc. 7: Zbite biocząstki w próbce kołnierzyka koszuli. Biocząstki odzyskano za pomocą folii żelowej z wewnętrznej strony kołnierzyka koszuli noszonego przez dawcę płci męskiej. Biocząstki wybarwiono przy użyciu błękitu trypanowego i pokazano obrazy dwudziestu różnych zbitych biocząstek zidentyfikowanych w próbce. Na każdym obrazie biocząstka, która została zebrana, jest zakreślona (czerwone kółka oznaczające biocząstki, w których profil został odzyskany; czarne kółka oznaczające biocząstki, w których profil nie został odzyskany. Procentowy odzysk alleli (liczba obserwowanych alleli z możliwych 30) jest pokazany dla każdej biocząstki, z której odzyskano profil. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-8
Rycina 8: Autosomalny profil STR uzyskany z pojedynczej biocząstki z męskiego kołnierzyka koszuli. Autosomalny profil STR uzyskano z pojedynczej biocząstki (pokazanej po lewej) przy użyciu 5 μl bezpośredniej reakcji lizy/amplifikacji. Dokładność tego profilu określono przez porównanie z próbką referencyjną dawcy. Piętnaście autosomalnych loci STR i amelogeniny (determinacja płci) są koamplifikowane w jednej reakcji i rozdzielane przez elektroforezę kapilarną. Wyniki są tutaj wyświetlane w postaci elektroferogramu. Liczby alleli są oznaczone poniżej każdego piku w każdym locus. Oś x reprezentuje rozmiar fragmentu (pary zasad, bp), a oś y reprezentuje intensywność sygnału (względne jednostki fluorescencji RFU; podane pod każdym odpowiadającym im numerem allelu). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-9
Rycina 9: Autosomalny profil STR uzyskany ze zbitej biocząstki z męskiego kołnierzyka koszuli. Autosomalny profil STR uzyskano ze zbitej biocząstki (pokazanej po lewej) przy użyciu 5 μl bezpośredniej reakcji lizy/amplifikacji. Dokładność tego profilu określono przez porównanie z próbką referencyjną dawcy. Piętnaście autosomalnych loci STR i amelogeniny (determinacja płci) są koamplifikowane w jednej reakcji i rozdzielane przez elektroforezę kapilarną. Wyniki są tutaj wyświetlane w postaci elektroferogramu. Liczby alleli są oznaczone poniżej każdego piku w każdym locus. Oś x reprezentuje rozmiar fragmentu (pary zasad, bp), a oś y reprezentuje intensywność sygnału (względne jednostki fluorescencji RFU; podane pod każdym odpowiadającym im numerem allelu). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-10
Rysunek 10: Przykład niepowodzenia w uzyskaniu autosomalnego profilu STR uzyskanego z pobranej biocząstki. Pojedyncza biocząstka pokazana po lewej stronie została pobrana z próbki żelowej folii kołnierzyka koszuli. Jak widać z otrzymanego profilu STR (pokazanego po prawej), uzyskano tylko jeden allel (z 30 możliwych). Liczby alleli są oznaczone poniżej każdego piku w każdym locus. Oś x reprezentuje rozmiar fragmentu (pary zasad, bp), a oś y reprezentuje intensywność sygnału (względne jednostki fluorescencji RFU; podane pod każdym odpowiadającym im numerem allelu). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W tym miejscu opisaliśmy metody zbierania i rozszerzonej analizy genetycznej biocząstek odzyskanych z dotykowych dowodów DNA. Opracowane podejście obejmuje następujące działania: 1) pobieranie materiału biologicznego (tj. biocząstek) za pomocą filmu żelowego z dotykanych przedmiotów i powierzchni, noszonych elementów odzieży lub bezpośredniej skóry ludzkiej, 2) badanie mikroskopowe odzyskanego materiału biologicznego w celu zapewnienia pobrania potencjalnego materiału biologicznego człowieka oraz 3) mikromanipulację pojedynczymi lub kilkoma biocząstkami za pomocą kleju rozpuszczalnego w wodzie, oraz 4) autosomalne profilowanie DNA-STR pobranych biocząstek przy użyciu jednoetapowej reakcji lizy/amplifikacji mikroobjętościowej (5 μl). Zastosowanie jednoetapowej reakcji w zamkniętej probówce zmniejsza ryzyko zanieczyszczenia i utraty próbki w wyniku dodatkowych manipulacji próbką lub przeniesienia do innych probówek reakcyjnych. Ulepszone jednoetapowe reakcje lizy/amplifikacji STR w mikroobjętości (5 μl) pozwalają na odzyskanie pełnych lub dowodowych profili STR dawcy pojedynczej lub kilku biocząstek. Podejście to zostało opracowane w celu uzyskania jednoźródłowych profili STR z jedno- i wieloźródłowych dowodów dotykowych DNA (np. zużytych elementów odzieży i innych artykułów gospodarstwa domowego, dotykanych/dotykanych przedmiotów i powierzchni, mieszanin skóra/skóra). Z powodzeniem zastosowano go do wykrywania dawcy płci męskiej w symulowanych próbkach mieszaniny do ataku fizycznego.

Podejście to może być dalej oceniane w dodatkowych scenariuszach mieszaniny płynów ustrojowych i tkanek, takich jak ofiara drapiąca swojego napastnika, w których tylko kilka biocząsteczek napastnika byłoby obecnych wśród przytłaczającej ilości materiału biologicznego ofiary. Ponadto, ponieważ podejście to opracowane w niniejszym badaniu pozwala na analizę na poziomie pojedynczej biocząstki, można je wykorzystać do lepszego zrozumienia charakteru i zakresu wtórnego transferu14-19, w którym pośrednik przenosi profil DNA z powierzchni, przedmiotu lub osoby na inny powierzchniowy obiekt lub osobę20. Ślepe pobieranie wymazów w analizie wtórnego transferu może nie być w stanie zidentyfikować śladowych ilości materiału od dawcy wtórnego. Opracowane tutaj podejście pozwala na analizę pojedynczych lub kilku biocząstek, a zatem wyniki nie są mylące z powodu obecności przytłaczającej ilości materiału biologicznego od pierwotnego dawcy. Metodologie opracowane w tej pracy mogą mieć również implikacje dla analizy śladowego materiału biologicznego w przypadkach napaści na tle seksualnym, takich jak te związane z cyfrową penetracją pochwy, w przypadku których pozytywna identyfikacja śladowych ilości komórek skóry sprawcy może mieć kluczowe znaczenie dla ustalenia, czy doszło do kontaktu seksualnego.

Chociaż pobieranie biocząstek z próbki żelowej nie wiąże się z trudnymi i złożonymi manipulacjami, istnieją krytyczne etapy tej procedury, które należy wykonać z dużą ostrożnością, aby zapewnić pomyślne przeniesienie biocząstek do dalszego naczynia reakcyjnego. Zbieranie biocząstek za pomocą kleju rozpuszczalnego w wodzie musi być oglądane pod mikroskopem (tj. mikroskopem stereoskopowym przy dużym powiększeniu (~ 200-300X), aby upewnić się, że zbierane są tylko interesujące biocząstki. W zależności od rozmiaru użytej "kulki" kleju, istnieje możliwość zebrania dodatkowego materiału otaczającego, który może obejmować zarówno materiał biologiczny, jak i niebiologiczny (np. włókna, inne zanieczyszczenia). Pobranie niezamierzonych dodatkowych biocząstek może spowodować odzyskanie domieszanych profili DNA. Pobranie materiału niebiologicznego może wprowadzić inhibitory do reakcji lizy mikroobjętościowej/STR. Jeśli za pomocą tej samej "kulki" kleju zostanie zebranych wiele biocząstek, istnieje możliwość, że wcześniej zebrane biocząstki zostaną odczepione od kleju. Nie jest to często obserwowane, ale może wystąpić, gdy większa liczba biocząstek (np. ponad 50) zostanie zebrana za pomocą jednej "kulki" klejącej. W przypadku celowania w dużą liczbę biocząstek, zaleca się wykonanie wielu kolekcji mniejszej liczby biocząstek, ale wszystkie przeniesione do tej samej probówki o pojemności 0,2 ml. Po zebraniu biocząstek należy zachować ostrożność podczas wyjmowania szkiełka z filmu żelowego ze stolika mikroskopowego i umieszczania probówki o pojemności 0,2 ml w taki sposób, aby końcówka igły nie została naruszona. Podczas umieszczania końcówki igły w mieszance amplifikacyjnej znajdującej się na dnie probówki o pojemności 0,2 ml, końcówka igły nie powinna stykać się z bokami probówki, aby uniknąć utraty materiału po bokach probówki. Podczas gdy rozpuszczalność kleju jest zazwyczaj szybka (~ 30 sekund lub mniej w zależności od rozmiaru "kulki" kleju) i może być monitorowana podczas badania mikroskopowego, końcówka igły powinna być powoli usuwana z mieszanki amplifikacyjnej, aby zapewnić całkowite rozpuszczenie kleju. Jeśli klej nie rozpuścił się całkowicie, igłę można ponownie umieścić w płynie, aby umożliwić całkowite rozpuszczenie.

Opisane tutaj protokoły zostały zoptymalizowane do użytku z biocząstkami i komórkami ludzkimi na podstawie dowodów biologicznych w postępowaniu sądowym. Wybrany bufor do lizy jest kompatybilny z wybranym zestawem do amplifikacji DNA-STR. Chociaż mogą istnieć odpowiednie alternatywne do lizy, ich skuteczność pod względem lizy komórek i kompatybilność z dalszą analizą muszą zostać zweryfikowane przez użytkownika. Dodatkowo, zestaw do amplifikacji STR i numer cyklu amplifikacji opisane w tym protokole zostały zoptymalizowane do użytku z pojedynczymi lub kilkoma biocząstkami. Wybrano zestaw do amplifikacji STR nowej generacji, który według doniesień charakteryzuje się zwiększoną wytrzymałością i czułością, a jego rezultatem jest odzyskiwanie wysokiej jakości profili STR z jednej lub kilku biocząstek. Chociaż dostępnych jest wiele innych zestawów STR, o różnych zalecanych numerach cykli amplifikacji, mogą one nie mieć odpowiedniej czułości i dlatego musiałyby zostać odpowiednio ocenione przed użyciem w tych protokołach.

Pomimo pomyślnego zastosowania opisanych metod do odzyskiwania profili STR z jednej lub kilku biocząstek, wskaźnik sukcesu odzyskiwania profilu nie będzie wynosił 100%. W związku z tym w przypadku niektórych próbek można zaobserwować ograniczony częściowy profil DNA lub brak profilu. Nie da się tego uniknąć ze względu na niemożność jednoznacznej wizualnej identyfikacji większości biocząstek jako materiału komórkowego, potencjalny stan degradacji materiału jądrowego w pobranych biocząstkach lub utratę materiału próbki z kleju przed przeniesieniem do naczynia reakcyjnego. W związku z tym nie zaleca się analizy pojedynczej próbki biocząstki dla każdego elementu DNA w dotyku. Często pobieramy 20 zestawów próbek z pojedynczej próbki żelowej i w razie potrzeby pobieramy dodatkowe zestawy próbek, jeśli nie zostanie uzyskany odpowiedni profil STR. Jedynym ograniczeniem w przypadku pobierania próbek jest ilość materiału biologicznego obecnego w próbce żelowej (i prawdopodobnie koszt analizy, chociaż reakcje mikroobjętościowe dają możliwość pobrania dodatkowych próbek za podobny lub niższy koszt, jak pojedyncza standardowa objętość reakcyjna (np . 25 μl).

Opisane tutaj opracowane metody profilowania DNA zapewniają molekularne podejście do charakterystyki, analizy i interpretacji śladowego materiału biologicznego odzyskanego z dotykowych próbek DNA. Istnieje jednak dodatkowa informacja genetyczna, którą można uzyskać z odzyskanych biocząstek, oprócz określenia dawcy (tj. profilu STR) dawcy materiału biologicznego. Źródło pochodzenia tkanek lub płynów ustrojowych (np. skóra w porównaniu ze śliną) może dostarczyć kluczowych informacji kontekstowych dla dochodzenia w sprawie karnej. Bez takiego ustalenia można wykorzystać niejednoznaczność źródła pochodzenia tkanki, ponieważ można zasugerować alternatywne okoliczności przestępstwa (np. sposób, w jaki płyn ustrojowy mógł zostać zdeponowany). Opisane tutaj protokoły pobierania i izolacji biocząstek mogą być wykorzystywane do zbierania biocząstek lub innych komórek (np. policzkowych, pochwowych) do wykorzystania w strategii identyfikacji źródła tkanki (profilowanie mRNA21-30), która obejmuje reakcje odwrotnej transkrypcji mikroobjętości (RT) i amplifikacji. Dzięki dalszej optymalizacji możliwe będzie również opracowanie strategii koizolacji DNA/RNA, która umożliwi identyfikację typu komórki (RNA) i profilowanie STR z tej samej próbki, w tym biocząsteczek z dotykowych dowodów DNA.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy chcieliby również podziękować wszystkim uczestnikom, którzy przekazali próbki do tej pracy. Praca ta została sfinansowana przez Program Biura Sprawiedliwości, Narodowy Instytut Sprawiedliwości, Departament Sprawiedliwości pod numerem nagrody 2010-DN-BX-K139. Agencje finansujące nie były zaangażowane w opracowywanie badania, gromadzenie, analizę i interpretację danych ani w pisanie raportu. Punkty widzenia zawarte w tym dokumencie są poglądami autorów i niekoniecznie reprezentują oficjalne stanowisko Departamentu Sprawiedliwości Stanów Zjednoczonych.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
SealRite 1,5 ml naturalne probówki wirówkowe, sterylneUSA Scientific1615-5510dostępnych jest wielu alternatywnych dostawców, ale probówki powinny być sterylne
0,2 ml probówki PCR z płaską nakrętką, naturalnePhenix ResearchMPX-200Flub równoważne
KimwipesFisher Scientific06-666 i/lub 06-666-11C
Wkładki nasączone alkoholemFisher Scientific06-669-62alternatywą jest 06-665-24 (Fisher Sci); kanister z większymi chusteczkami nasączonymi alkoholem, a nie pojedynczymi wacikami
Sterylna woda18,2 MΩ, autoklawizowana
Szkiełka mikroskopowe szklane, matowe, 3" x 1": 1 mmDopuszczalne są alternatywne marki lub rozmiaryFisher Scientific12-544-3
Jednorazowa pipeta transferowaFisher Scientific13-711-9Dalternatywy są dopuszczalne
Roztwór błękitu trypanowegoSigmaT8154
Pipipety: 0,2-2, 2-20, 10-100, 100-1,000 μ lróżne
sterylne, odporne na aerozole końcówki do pipetróżne
mini-wirówkiróżne
mikroskopy stereoskopoweLeicaM205C, inne są odpowiednie, ale muszą być zdolne do powiększania do 350X
System GeneAmp PCR Cykl termiczny 9700 (srebrny lub złoty blok)Life TechnologiesN8050200 lub 4314878można stosować inne modele i producentów, ale wydajność z zestawem do amplifikacji STR musi zostać zweryfikowana
3130 Genetic AnalyzerLife Technologies3130-01alternatywy: 310 lub 3500 Genetyczne anlizery (Life Technologies)
Oprogramowanie GeneMapperLife Technologiesdostępne są różne wersje oprogramowania i można ich używać
WF Gel-Film, x8 poziom retencjiGel-PakWF-40-x8-A Foliawaflowa 4" x 4"; można zamówić w innych specyfikacjach rozmiarowych
Taśma dwustronnaróżne
bloki szklane, 3 "x 1,5" x 3/8 "McCrone Mikroskopy i akcesoria370-2lub równoważne
[nagłówek]
Igła wolframowa zuchwytem McCrone Mikroskopy i akcesoria106
Rozpuszczalna w wodzie taśma lutownicza 3M na fali, przezroczysta 5414Allied Electronics70113977
Bufor do lizy (kryminalistyka GEM, Zygem)VWR95043-992Bufor do lizy jest przygotowywany w 10 μ l porcje (w razie potrzeby przygotować dodatkowe porcje mieszanki wzorcowej, aby pomieścić żądaną liczbę próbek). 1,5 μ l stosuje się dla każdej próbki. Aby przygotować 10 μ l buforu do lizy (wystarczający na ~6 próbek): 6,9 μ l sterylna woda, 2,1 μ l bufor 10x - niebieski, 1 μ l kryminalistyka.
Zestaw do amplifikacji STR, zestaw do amplifikacji AmpFlSTR Identifiler Plus PCRLife Technologies4427368Można użyć alternatywnych zestawów do amplifikacji STR, ale wydajność musiałaby zostać zweryfikowana przez użytkownika. Mieszaninę amplifikacyjną przygotowuje się w następujący sposób (objętości na próbkę): 2,2 μ l Mieszanina reakcyjna PCR, 1,1 i mu; l Zestaw podkładów, 0,2 i mu; l (1U) Polimeraza DNA AmpliTaq Gold. Należy przygotować mieszankę wzorcową wystarczającą dla żądanej liczby próbek. 3,5 &m; l przygotowanej mieszaniny dodaje się do probówki o pojemności 0,2 ml w celu pobrania biocząstek.
AmpliTaq Gold DNA polimerazaLife TechnologiesN808-0245
HiDi formamidLife Technologies4311320
GeneScan 500 LIZ standard rozmiaruLife Technologies4322682
96-dołkowe optyczne płytki reakcyjneLife TechnologiesN8010560
Plate septa, 96 dołkówLife Technologies4315933
Polimer zoptymalizowany pod kątem wydajności, POP-7Life Technologies4363785Dopuszczalne są alternatywy, takie jak POP-4
, , ,

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hanson, E. K., Ballantyne, J. Getting blood from a stone': ultrasensitive forensic DNA profiling of microscopic bio-particles recovered from 'touch DNA' evidence. Methods Mol.Biol. 1039, 3-17 (2013).
  2. Balogh, M. K., Burger, J., Bender, K., Schneider, P. M., Alt, K. W. STR genotyping and mtDNA sequencing of latent fingerprint on paper. Forensic Sci Int. 137 (2-3), 188-195 (2003).
  3. Barbaro, A., Cormaci, P., Teatino, A., La, M. A., Barbaro, A. Anonymous letters? DNA and fingerprints technologies combined to solve a case. Forensic Sci Int. 146, S133-S134 (2004).
  4. Bright, J. A., Petricevic, S. F. Recovery of trace DNA and its application to DNA profiling of shoe insoles. Forensic Sci.Int. 145 (1), 7-12 (2004).
  5. Castello, A., Alvarez, M., Verdu, F. DNA from a Computer Keyboard. Forensic Science Communications. 6 (3), (2004).
  6. Horsman-Hall, K. M., et al. Development of STR profiles from firearms and fired cartridge cases. Forensic Sci Int. Genet. 3 (4), 242-250 (2009).
  7. Petricevic, S. F., Bright, J. A., Cockerton, S. L. DNA profiling of trace DNA recovered from bedding. Forensic Sci. Int. 159 (1), 21-26 (2006).
  8. Oorschot, R. A., Jones, M. K. DNA fingerprints from fingerprints. Nature. 387 (6635), 767(1997).
  9. Sewell, J., et al. Recovery of DNA and fingerprints from touched documents. Forensic Sci Int.Genet. 2 (4), 281-285 (2008).
  10. Raymond, J. J., van Oorschot, R. A., Gunn, P. R., Walsh, S. J., Roux, C. Trace evidence characteristics of DNA: A preliminary investigation of the persistence of DNA at crime scenes. Forensic Sci Int Genet. 4 (1), 26-33 (2009).
  11. Wickenheiser, R. A. Trace DNA: a review, discussion of theory, and application of the transfer of trace quantities of DNA through skin contact. J.Forensic Sci. 47 (3), 442-450 (2002).
  12. Sweet, D., Lorente, M., Lorente, J. A., Valenzuela, A., Villanueva, E. An improved method to recover saliva from human skin: the double swab technique. J. Forensic Sci. 42 (2), 320-322 (1997).
  13. Molecular Biology of the Skin - the Keratinocyte. Darmon, M. M., Blumenberg, M. M. , Academic Press. San Diego, CA. (1993).
  14. Daly, D. J., Murphy, C., McDermott, S. D. The transfer of touch DNA from hands to glass, fabric and wood. Forensic Sci Int Genet. 6 (1), 41-46 (2012).
  15. Goray, M., Eken, E., Mitchell, R. J., van Oorschot, R. A. Secondary DNA transfer of biological substances under varying test conditions. Forensic Sci Int Genet. 4 (2), 62-67 (2010).
  16. Goray, M., Mitchell, R. J., van Oorschot, R. A. Investigation of secondary DNA transfer of skin cells under controlled test conditions. Leg.Med.(Tokyo). 12 (3), 117-120 (2010).
  17. Lowe, A., Murray, C., Whitaker, J., Tully, G., Gill, P. The propensity of individuals to deposit DNA and secondary transfer of low level DNA from individuals to inert surfaces. Forensic Sci Int. 129 (1), 25-34 (2002).
  18. Phipps, M., Petricevic, S. The tendency of individuals to transfer DNA to handled items. Forensic Sci Int. (2-3), 168-162 (2007).
  19. Zoppis, S., et al. DNA fingerprinting secondary transfer from different skin areas: Morphological and genetic studies. Forensic Sci Int Genet. 11, 137-143 (2014).
  20. Gill, P. Misleading DNA Evidence: Reasons for Miscarriages of Justice. , Academic Press - Elsevier. (2014).
  21. Haas, C., Hanson, E., Ballantyne, J. Capillary electrophoresis of a multiplex reverse transcription-polymerase chain reaction to target messenger RNA markers for body fluid identification. Methods Mol. Biol. 830, 169-183 (2012).
  22. Hanson, E., Ballantyne, J. RNA Profiling for the Identification of the Tissue Origin of Dried Stains in Forenic Biology. Forensic Sci Rev. , 22145-22157 (2010).
  23. Hanson, E., Haas, C., Jucker, R., Ballantyne, J. Specific and sensitive mRNA biomarkers for the identification of skin in 'touch DNA' evidence. Forensic Sci Int Genet. 6, 548-558 (2012).
  24. Hanson, E. K., Ballantyne, J. Highly specific mRNA biomarkers for the identification of vaginal secretions in sexual assault investigations. Sci Justice. 53 (1), 14-22 (2013).
  25. Juusola, J., Ballantyne, J. Messenger RNA profiling: a prototype method to supplant conventional methods for body fluid identification. Forensic Sci Int. 135 (2), 85-96 (2003).
  26. Juusola, J., Ballantyne, J. Multiplex mRNA profiling for the identification of body fluids. Forensic Sci Int. 152 (1), 1-12 (2005).
  27. Fleming, R. I., Harbison, S. The development of a mRNA multiplex RT-PCR assay for the definitive identification of body fluids. Forensic Sci Int Genet. 4 (4), 244-256 (2010).
  28. Haas, C., Klesser, B., Maake, C., Bar, W., Kratzer, A. mRNA profiling for body fluid identification by reverse transcription endpoint PCR and realtime PCR. Forensic Sci Int Genet. 3 (2), 80-88 (2009).
  29. Lindenbergh, A., et al. A multiplex (m)RNA-profiling system for the forensic identification of body fluids and contact traces. Forensic Sci Int Genet. 6 (2), 565-577 (2012).
  30. Richard, M. L., et al. Evaluation of mRNA marker specificity for the identification of five human body fluids by capillary electrophoresis. Forensic Sci Int Genet. 6 (4), 452-460 (2012).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Odzyskiwanie z mikromanipulacjianaliza pojedynczych biocz steczekamplifikacja STRpobieranie pr bek za pomoc filmu elowegomanipulacja ig wolframowliza w mikroobj to cielektroforeza kapilarnaprofilowanie DNA w kryminalistyceprofile z jednego r d a

Powiązane artykuły