Tutaj opisujemy zoptymalizowaną i efektywną strategię usuwania bio-cząsteczek obecnych w próbkach 'touch DNA', wraz z ulepszonym protokołem amplifikacji obejmującym jednoetapową 5 μl mikroobjętościową lizę/amplifikację STR, aby umożliwić odzyskanie krótkich profili powtórzeń tandemowych (STR) dawcy (dawców) biocząstek.
Artykuł metodologiczny
Ulepszona analiza genetyczna pojedynczych ludzkich biocząstek odzyskanych za pomocą uproszczonej mikromanipulacji z dowodów kryminalistycznych "dotykowego DNA"
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Profile DNA można uzyskać z dowodów 'touch DNA', które zawierają mikroskopijne ślady ludzkiego materiału biologicznego. Obecne metody odzyskiwania śladowego DNA wykorzystują bawełniane waciki lub taśmę klejącą do pobierania próbek z obszaru zainteresowania. Jednak takie podejście "ślepego wymazu" spowoduje jednoczesne pobieranie próbek materiału komórkowego od różnych osób, nawet jeśli komórki tych osób znajdują się w geograficznie różnych miejscach na przedmiocie. W związku z tym niektóre mieszaniny DNA napotkane w kontaktowych próbkach DNA są sztucznie tworzone przez samo pobranie wymazu. W niektórych przypadkach DNA ofiary może zostać znalezione w znacznym nadmiarze, maskując w ten sposób DNA potencjalnego sprawcy.
Aby obejść wyzwania związane ze standardowymi metodami odzyskiwania i analizy, opracowaliśmy tańszą, 'inteligentną analizę' metodę, która skutkuje ulepszoną analizą genetyczną dowodów DNA dotykowego. Opisujemy zoptymalizowaną i wydajną strategię odzyskiwania mikromanipulacji do zbierania biocząstek obecnych w kontaktowych próbkach DNA, a także ulepszoną strategię amplifikacji obejmującą jednoetapową lizę mikroobjętości 5 μl/amplifikację STR, aby umożliwić odzyskanie profili STR od dawcy (dawców) biocząstek. Wykorzystanie pojedynczych lub kilku ("grudek") biocząstek skutkuje możliwością uzyskania profili z jednego źródła. Procedury te reprezentują alternatywne, ulepszone techniki izolacji i analizy pojedynczych biocząstek z dowodów DNA pochodzących z dotyku kryminalistycznego. Chociaż nie jest to konieczne w każdym dochodzeniu kryminalistycznym, metoda ta może być bardzo korzystna dla odzyskania profilu DNA sprawcy z jednego źródła w przypadkach związanych z napaścią fizyczną (np. uduszeniem), co może nie być możliwe przy użyciu standardowych technik analizy. Ponadto opracowane w ramach projektu strategie dają możliwość uzyskania informacji genetycznej na poziomie pojedynczej komórki z wielu innych śladowych materiałów biologicznych o charakterze niekryminalistycznym.
Wprowadzenie
Dotyk DNA jest formą śladowego dowodu biologicznego, który jest bezpośrednim transferem materiału komórkowego (np. zrzuconych komórek skóry) od osoby do obiektu lub innej osoby podczas kontaktu fizycznego1. Możliwość uzyskania profili DNA z różnych dotykanych przedmiotów (dokumentów, pościeli, butów, broni palnej, pojemników do picia, długopisów, uchwytów teczek) opisano w literaturze2-9.
Kluczowym czynnikiem w analizie dowodów DNA dotyku jest pomyślne odzyskanie śladowego materiału biologicznego. Dowody DNA w dotyku są zwykle pobierane przez pobranie wymazu z podejrzanego obszaru za pomocą sterylnego wacika (określanego jako "ślepy wacik"). Stosując to podejście, charakter pobranego materiału biologicznego nie jest znany i pobiera się próbki z uogólnionego obszaru. Obecność bruzd lub szczelin powierzchniowych może utrudniać pomyślne odzyskanie często już niewielkiej ilości obecnego materiału biologicznego. Dodatkowo, podejście "ślepego wymazu" z konieczności spowoduje jednoczesne pobieranie próbek materiału komórkowego od różnych osób, których komórki są obecne na przedmiocie, nawet jeśli komórki tych osób znajdują się w przestrzennie różnych miejscach na przedmiocie. Odzyskiwanie mieszanych profili DNA, które często są trudne do rozwiązania, szczególnie w przypadku próbek DNA o niskiej matrycy, jest często obserwowane8,10,11 i w wielu przypadkach będzie konsekwencją samego procesu pobierania wymazów. Jeśli od jednego z dawców obecna była tylko niewielka ilość materiału, standardowe techniki ekstrakcji i analizy mogą nie być w stanie odzyskać profilu od małoletniego darczyńcy. Dodatkowo rodzaj wymazu lub to, czy był on używany na sucho czy na mokro (wstępnie zwilżony sterylną wodą) może mieć wpływ na ilość pobieranego materiału biologicznego ze względu na różnice w chłonności i adsorpcji oraz skuteczności uwalniania materiału biologicznego12. Standardowe metody ekstrakcji mogą powodować dodatkową utratę próbki ze względu na wymaganą fizyczną manipulację próbką lub etapami przenoszenia próbki.
Jak opisano powyżej, proste techniki pobierania wymazów w celu odzyskania materiału biologicznego mogą spowodować utratę śladowych ilości próbki biologicznej, jak również zwiększoną częstość występowania profili mieszanych z powodu niepowodzenia w oddzieleniu poszczególnych składników biologicznych. W związku z tym staraliśmy się opracować bardziej selektywne i wydajne strategie odzyskiwania mikrocząstek komórkowych obecnych na dotykanych przedmiotach. Opracowana strategia analizy materiału biologicznego na podstawie dotykowych dowodów DNA (określanych tutaj jako "biocząstki" ze względu na fakt, że jądro nie zawsze jest widoczne, ponieważ większość komórek znajdujących się w zewnętrznej warstwie naskórka skóry to martwe lub umierające keratynocyty13) obejmuje: 1) pobranie materiału biologicznego (tj. biocząstki) za pomocą filmu żelowego z dotykanych przedmiotów i powierzchni, noszonych elementów odzieży lub bezpośrednio ludzkiej skóry, 2) badanie mikroskopowe odzyskanego materiału biologicznego w celu zapewnienia pobrania potencjalnego ludzkiego materiału biologicznego, oraz 3) mikromanipulacja pojedynczymi lub kilkoma biocząstkami przy użyciu rozpuszczalnego w wodzie kleju, oraz 4) autosomalne profilowanie DNA-STR pobranych biocząstek przy użyciu mikroobjętościowej (5 μl) jednoetapowej reakcji lizy/amplifikacji.
Ta procedura oferuje wiele zalet w porównaniu z tradycyjnie stosowanymi metodami analizy. Odzysk biocząstek za pomocą filmu żelowego pozwala na mikroskopowe badanie materiału biologicznego obecnego w próbce przed analizą. Podczas gdy większość biocząstek odzyskanych z dotykowych dowodów DNA może nie być komórkami jądrzastymi, co utrudnia określenie, które lub ile biocząstek należy wybrać, badanie mikroskopowe tych próbek przed analizą daje możliwość poszukiwania komórek jądrzastych, maksymalizując w ten sposób prawdopodobieństwo odzyskania profilu DNA. Zbieranie biocząstek za pomocą rozpuszczalnej w wodzie mikromanipulacji wspomaganej klejem pozwala na bezpośrednie przeniesienie docelowych biocząstek do probówek reakcyjnych. Procedura ta jest wizualizowana pod mikroskopem, aby zapewnić pomyślny transfer materiału biologicznego. Reakcja zredukowana lub mikroobjętościowa zwiększa czułość, jednocześnie zmniejszając koszt analizy na próbkę. Pozwala to na analizę zwiększonej liczby próbek z pojedynczego materiału dowodowego. Ze względu na rozpiętość stanu genetycznego biocząsteczek w kontaktach z dowodami DNA, zaleca się wielokrotne pobieranie próbek z poszczególnych elementów.
Tutaj pokazujemy udane wykorzystanie opracowanych protokołów do uzyskania wysoce wiarygodnych profili genetycznych dawców materiału biologicznego w styku dowodów DNA. Opracowane metody zbierania biocząsteczek i profilowania DNA zapewniają kompleksowe, "inteligentne" (tj. konkretne, mierzalne, osiągalne, realistyczne i terminowe) molekularne podejście do charakteryzacji, analizy i interpretacji śladowego materiału biologicznego. Chociaż pierwotnie zostały opracowane do zastosowania w kryminalistycznej analizie dowodów DNA dotyku, opracowane tutaj strategie mogą być stosowane do innych źródeł materiału biologicznego i oferują możliwość uzyskania indywidualnych informacji identyfikujących na poziomie pojedynczej komórki.
Protokół
UWAGA: Płyny ustrojowe zostały pobrane od ochotników przy użyciu procedur zatwierdzonych przez Institutional Review Board Uniwersytetu Centralnej Florydy. Od każdego dawcy uzyskano świadomą pisemną zgodę.
1. Zbieranie biocząsteczek z dotykanych przedmiotów i powierzchni
- Przytnij folię żelową do żądanego rozmiaru. Upewnij się, że ma odpowiedni rozmiar dla szklanego szkiełka mikroskopowego używanego jako solidne podparcie. Na przykład w przypadku szkiełka o wymiarach 3" x 1" użyj folii żelowej o rozmiarze 2" x 0,75".
UWAGA: W razie potrzeby długość i szerokość materiału można zmniejszyć, ale nie należy przekraczać tego rozmiaru. - Usuń biały podkład z folii żelowej i przymocuj folię żelową do szkiełka mikroskopu (Rysunek 1A). Mocno dociśnij, aby zapewnić pełne mocowanie.
UWAGA: Istnieje przezroczysta górna warstwa ochronna, której nie należy usuwać, aby umożliwić wywieranie nacisku wzdłuż kawałka folii żelowej bez zanieczyszczenia powierzchni filmu żelowego. Przygotowane szkiełka żelowo-filmowe (z dołączoną warstwą ochronną) można przechowywać w temperaturze pokojowej do czasu ich potrzebowania. - Usuń przezroczystą górną folię ochronną z folii żelowej za pomocą sterylnej pęsety, gdy jest gotowa do użycia (Rysunek 1B) próbki filmu żelowego. Umieść powierzchnię filmu żelowego w bezpośrednim kontakcie z żądanym dotykanym przedmiotem lub powierzchnią (Rysunek 2). Zastosuj niewielki nacisk, aby zapewnić skuteczne przenoszenie biocząsteczek do filmu żelowego.
UWAGA: Jeśli zostanie przyłożony zbyt duży nacisk, szkiełko może pęknąć.
UWAGA: Na tym samym kawałku filmu żelowego można pobrać wiele próbek z tego samego obiektu lub powierzchni. - Potwierdzić przeniesienie biocząstek na film żelowy (ryc. 3), umieszczając szkiełko na mikroskopie stereoskopowym (można zastosować trans- lub epi-oświetlenie). Użyj powiększenia ~20X, aby najlepiej zobaczyć większe obszary filmu żelowego, i powiększenia ~200X, aby jak najlepiej zobaczyć poszczególne biocząsteczki.
- Szkiełko z próbką żelowej folii należy przechowywać w temperaturze pokojowej w zakrytym pudełku na szkiełka lub natychmiast użyć do barwienia i/lub zbierania biocząstek.
2. Opcjonalne barwienie biocząsteczek w celu ułatwienia wizualizacji
- Umieść szkiełko z folią żelową przygotowane w kroku 1 na stojaku do barwienia szkiełek nad zlewem.
- Za pomocą jednorazowej pipety transferowej pokryj całą powierzchnię filmu żelowego niebieską plamą trypanową (Rysunek 4A). Inkubować w temperaturze pokojowej przez 1-2 minuty.
- Usuń nadmiar plamy, przechylając suwak, aby plama mogła spłynąć do zlewu (Rysunek 4B).
UWAGA: W razie potrzeby szkiełko można przepłukać poprzez delikatne zalanie sterylną wodą za pomocą jednorazowej pipety transferowej (Rysunek 4C). - Pozostaw szkiełko do wyschnięcia na powietrzu przed przystąpieniem do izolacji biocząstek. Obejrzyj szkiełko za pomocą mikroskopu stereoskopowego (~20X dla ogólnego oglądania i ~200-300X, aby zobaczyć poszczególne biocząstki), aby zapewnić prawidłowe barwienie (Rysunek 4D-E).
UWAGA: Szkiełko można przechowywać w temperaturze pokojowej w zakrytym pudełku na szkiełka.
3. Izolacja biocząstek będących przedmiotem zainteresowania do analizy
- Umieść odpowiednią liczbę probówek PCR o pojemności 0,2 ml w stojaku i odpowiednio oznacz probówki.
- Przygotuj mieszaninę amplifikacyjną STR (patrz Lista materiałów) w przeznaczonym do tego celu okapie do amplifikacji PCR lub komorze bezpieczeństwa biologicznego. Dobrze zmieszaj mieszankę główną i krótko odwiruj w mini-wirówce.
- Objętość mieszaniny amplifikacyjnej potrzebna na próbkę wynosi 3,5 μl; należy przygotować odpowiednią objętość mieszanki wzorcowej dla żądanej liczby próbek.
- Odpipetować 3,5 μl mieszaniny amplifikacyjnej do każdej probówki o pojemności 0,2 ml. Luźno zakryj każdą tubkę.
- Umieść kawałek podwójnej taśmy klejącej na czystym szklanym szkiełku mikroskopowym lub bezpośrednio na szklanym pustaku.
UWAGA: Będzie on używany do utrzymywania probówki o pojemności 0,2 ml na miejscu podczas pobierania próbki. - Umieść kawałek podwójnej taśmy klejącej na czystym szklanym szkiełku mikroskopowym. Umieść kawałek rozpuszczalnej w wodzie taśmy lutowniczej na fali na wierzchu podwójnej taśmy klejącej.
UWAGA: Szkiełko to można przechowywać w eksykatorze do wykorzystania w przyszłości. - Umieść pierwszą probówkę o pojemności 0,2 ml na szkiełku lub bloku z podwójną taśmą szkiełkową przygotowaną w kroku 3.4. Odłóż tę probówkę na bok do czasu pobrania próbki.
- Umieść szkiełko z rozpuszczalną w wodzie taśmą lutowniczą na fali pod mikroskopem (małe powiększenie). Za pomocą końcówki igły wolframowej delikatnie zeskrobać powierzchnię taśmy, aby zebrać niewielką ilość (lub "kulkę") kleju na końcu igły (Rysunek 5A).
UWAGA: Rozmiar kuli może być mały lub duży w zależności od liczby biocząstek, które zostaną zebrane. - Ostrożnie wyjmij igłę wolframową z klejem spod mikroskopu, nie naruszając końcówki igły. W razie potrzeby igłę można umieścić w stojaku podczas umieszczania próbki.
- Umieścić przygotowaną próbkę filmu żelowego (z kroków 1 i 2) na stoliku mikroskopu. Dostosuj ostrość i powiększenie, aż biocząstki będą mogły być łatwo oglądane. Zidentyfikuj biocząstki, które zostaną zebrane.
UWAGA: W razie potrzeby do podparcia zjeżdżalni można użyć pustaka szklanego. - Wyjmij igłę wolframową za pomocą kulki klejącej i umieść igłę na powierzchni filmu żelowego, na której znajdują się interesujące biocząsteczki. Dociśnij końcówkę igły (z klejem) w dół, tak aby stykała się z biocząstką (Rysunek 5B). Podnieś igłę do góry, aby upewnić się, że biocząstka została zebrana. Powtarzaj ten proces, aż zostanie zebrana żądana liczba biocząstek.
- Umieść przygotowaną probówkę o pojemności 0,2 ml do PCR na stoliku mikroskopu. Dostosuj powiększenie tak, aby spód rurki zawierającej mieszankę amplifikacji była ostra.
- Ostrożnie włożyć igłę wolframową do probówki PCR o pojemności 0,2 ml, aż końcówka igły znajdzie się w mieszance amplifikacyjnej.
UWAGA: Najlepiej jest to zrobić podczas oglądania przez mikroskop. - Trzymaj igłę w mieszance amplifikacyjnej, aż klej się rozpuści, a biocząstki zostaną uwolnione do roztworu (Rysunek 5C). Wyjąć igłę, umieścić 0,2 ml w pozycji pionowej i luźno zakręcić probówkę.
- Powtórzyć procedurę pobierania w celu uzyskania dodatkowych próbek. Wyczyść igłę wolframową wstępnie zwilżonymi chusteczkami nasączonymi alkoholem (izopropanolem) pomiędzy próbkami.
4. Połączona izolacja kwasów nukleinowych w mikroobjętościach (bezpośrednia liza) i autosomalne krótkie powtórzenia tandemowe (STR)
- Przygotuj bufor do lizy (patrz Materiały) w przeznaczonym do tego celu kapturze do amplifikacji PCR lub komorze bezpieczeństwa biologicznego. Dodać 1,5 μl buforu do lizy do każdej probówki, aby uzyskać całkowitą objętość reakcyjną 5 μl. Zamknij szczelnie pokrywy tuby.
UWAGA: Probówki o pojemności 0,2 ml zawierają już 3,5 μl mieszanki amplifikacyjnej i biocząstek z Kroku 3. - Umieścić próbki w termocyklerze i amplifikować próbki, stosując następujące warunki cykliczne: 75 °C przez 15 minut, 95 °C przez 11 minut, 34 cykle w temperaturze 94 °C przez 20 sekund i 59 °C przez 3 minuty, 60 °C przez 10 minut i 4 °C w temperaturze 4 °C.
- Produkty wzmacniające należy przechowywać w temperaturze 4 °C w celu krótkotrwałego przechowywania.
5. Wykrywanie produktu – elektroforeza kapilarna (CE)
- Do płytki 96-dołkowej dodać 10 μl mieszanki do biegania CE (9,7 μl dejonizowanego formamidu i 0,3 μl wzorca wielkości, patrz Materiały). Dodać 1 μl amplifikowanego produktu lub drabinki allelicznej do każdej studzienki.
UWAGA: Formamid jest potencjalnym mutagenem i należy obchodzić się z nim w kapturze chemicznym podczas noszenia odpowiedniego wyposażenia ochrony osobistej. - Stosować warunki elektroforetyczne określone przez producenta w instrukcji obsługi zestawu amplifikacja lub w warunkach wewnętrznie zwalidowanych.
- Analizuj surowe dane za pomocą oprogramowania do analizy STR.
Wyniki
Reprezentatywne obrazy pojedynczych i skupionych biopartykuł odzyskanych z kołnierzyka koszuli (100% poliester) noszonej przez dawcę płci męskiej przedstawiono na Rysunku 6 (pojedyncze biopartykuły) oraz Rysunku 7 (skupione biopartykuły). Biopartykuły odzyskano z kołnierzyka koszuli zgodnie z opisanym tutaj protokołem: przeniesienie biopartykuł z kołnierzyka koszuli na folię żelową poprzez bezpośredni kontakt, barwienie odzyskanych biopartykuł błękitem trypanu, pobranie próbek biopartykuł za pomocą igły wolframowej i kleju rozpuszczalnego w wodzie oraz analiza STR przy użyciu lizy mikrowolumetrycznej 5 µl/amplifikacji STR. Rysunki 6 i 7 reprezentują typową próbkę biopartykuł, które zostałyby przeanalizowane z pojedynczego przedmiotu z touch DNA (20 pojedynczych biopartykuł i 20 skupionych biopartykuł). Biopartykuły pobrane na każdym obrazie są opisane pomiarami długości i szerokości (w mikronach). Procent odzyskanych alleli STR z każdej z pobranych biopartykuł jest podany na każdym obrazie, aby zademonstrować zróżnicowany stopień sukcesu, jakiego można oczekiwać w przypadku biopartykuł stanowiących tego typu dowód. Biopartykuły odzyskane z próbek touch DNA to w przeważającej mierze martwe lub obumierające keratynocyty, w związku z czym z każdej pobranej biopartykuły nie uzyskuje się dowodowego profilu STR, co widać na Rysunkach 6 i 7. W przypadku tej próbki kołnierzyka koszuli profile STR uzyskano z 14/20 (70%) pojedynczych biopartykuł oraz 15/20 (75%) skupionych biopartykuł. Jednakże każdy z odzyskanych profili różni się pod względem wartości dowodowej: odzyskanie alleli w zakresie 3-97% dla profili pojedynczych biopartykuł oraz 3-100% dla profili skupionych biopartykuł. Ze względu na zmienność wskaźników sukcesu zaleca się pobranie licznych biopartykuł z każdego przedmiotu z touch DNA. Zapewnia to większą szansę na uzyskanie wysoce dowodowego profilu STR.
Profil STR uzyskany z jednej z pojedynczych próbek biocząsteczek z kołnierzyka koszuli przedstawiono na Rysunku 8 (biocząsteczka, z której uzyskano profil, znajduje się po lewej stronie). Z tej pojedynczej biocząsteczki uzyskano niemal pełny profil STR (28 z 30 alleli, wypadnięcie jednego locus, dokładność uzyskanego profilu zweryfikowana poprzez porównanie z profilem referencyjnym). Uzyskany profil jest wysokiej jakości, z rozsądnie zrównoważonymi wysokościami pików między locusami i bez wypadania alleli. Wypadanie alleli oraz artefakty w postaci niezrównoważonej wysokości pików są często obserwowane w próbkach z niską ilością matrycowego DNA. Profil STR uzyskany z jednej z próbek skupisk biocząsteczek z kołnierzyka koszuli przedstawiono na Rysunku 9. Uzyskano pełny profil STR (30/30 alleli, dokładność uzyskanego profilu zweryfikowana poprzez porównanie z profilem referencyjnym). Jak wspomniano wcześniej, profil STR nie jest odzyskiwany z każdej pobranej biocząsteczki. Przykład nieudanego profilowania DNA z pojedynczej biocząsteczki (odzyskanie alleli na poziomie 3%, 1/30 alleli) przedstawiono na Rysunku 10 (pojedyncza biocząsteczka). Chociaż w przypadku tej pojedynczej biocząsteczki nie odniesiono sukcesu, z innych biocząsteczek odzyskanych z tej samej próbki uzyskano wysoce dowodowe profile STR dawcy biocząsteczek. Ilustruje to konieczność przeprowadzenia wielokrotnego pobierania pojedynczych komórek/skupisk z tego samego obiektu.
Opracowane i opisane tutaj „inteligentne” metody analizy dowodów w postaci touch DNA zostały z sukcesem wykorzystane do odzyskiwania dowodowych profili z pojedynczego źródła z pojedynczych i „zgrupowanych” biopartykuł z różnych dotykanych obiektów i elementów odzieży (np. podłokietniki krzeseł, kierownice samochodowe, telefony komórkowe, kubki do kawy, papierosy, długopisy, koszule, spodenki i swetry). Co istotne, podejście to zostało również zastosowane do detekcji i profilowania DNA męskiego dawcy (z pojedynczego źródła) w symulowanych próbkach mieszanin powstałych w wyniku kontaktu fizycznego/napaści (np. chwytanie przez sprawcę nadgarstka, szyi lub odzieży ofiary, bądź kontakt z pościelą ofiary, jak w przypadku napaści seksualnych).
Rycina 1: Przygotowanie szkiełek z folią żelową do zbierania biocząstek. (A) Za pomocą sterylnej pęsety usuwa się białą tylną warstwę ochronną z kawałka folii żelowej, aby odsłonić warstwę klejącą. Następnie folię żelową przykleja się do szklanego szkiełka przedmiotowego, dociskając ją mocno. (B) Gdy próbka folii żelowej jest gotowa do zbierania biocząstek, za pomocą sterylnej pęsety usuwa się górną przezroczystą folię ochronną.
Rysunek 2: Pobieranie biocząsteczek za pomocą folii żelowej z różnych podłoży. Przeszklenia z folią żelową mogą być wykorzystywane do pobierania biocząsteczek z różnych powierzchni. Folię żelową umieszcza się w bezpośrednim kontakcie z badanym przedmiotem lub powierzchnią. Wywiera się delikatny nacisk, aby przenieść biocząsteczki na powierzchnię folii żelowej. Przedstawiono pobieranie biocząsteczek z (A) używanej odzieży (kołnierz płaszcza), (B) dotykanych przedmiotów (kubek do kawy na wynos) oraz (C) bezpośrednio z ludzkiej skóry (nadgarstek mężczyzny).
Rycina 3: Biocząstki na zużytym elemencie odzieży (wewnętrzna strona nogawki spodni). Biocząstki są przenoszone na folię żelową poprzez bezpośredni kontakt z powierzchnią obiektu. Biocząstki mogą występować w postaci „skupisk” lub jako pojedyncze biocząstki (wskazane czerwonymi strzałkami).
Rycina 4: Opcjonalne barwienie biocząsteczek na szkiełkach z filmu żelowego. W celu lepszej wizualizacji biocząsteczek próbki filmu żelowego można barwić błękitem trypanu. Całą powierzchnię filmu żelowego pokrywa się błękitem trypanu (A). Po 1-2 min barwienia szkiełko delikatnie przechyla się, aby nadmiar barwnika spłynął z jego powierzchni (B). Do usunięcia nadmiaru barwnika można zastosować delikatne przepłukanie wodą sterylną (C) . Po wysuszeniu szkiełka na powietrzu można je obejrzeć pod mikroskopem, aby upewnić się, że barwienie przebiegło prawidłowo (D, E). Uwaga: Nie wszystkie biocząsteczki będą wyglądać na zabarwione (t.j. będą miały niebieski kolor). Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.
Rysunek 5: Zbieranie i analiza biopartykuł. (A) Niewielka ilość (lub „kulka”) rozpuszczalnej w wodzie taśmy do lutowania falowego („lepiku”) jest zbierana na końcówkę igły wolframowej poprzez delikatne zdrapywanie. (B) Następnie lepik jest dotykany do powierzchni filmu żelowego w celu zebrania interesujących biopartykuł. Pojedyncze lub wielokrotne biopartykuły mogą zostać zebrane za pomocą jednej kulki lepiku. (C) Po zebraniu pożądanych biopartykuł końcówka igły jest umieszczana w mieszaninie do amplifikacji w probówce PCR o pojemności 0.2 ml. Igłę trzyma się w cieczy do momentu jej rozpuszczenia i zaobserwowania uwolnienia biopartykuł do roztworu. Wszystkie etapy procesu zbierania są wykonywane i obserwowane pod mikroskopem, aby zapewnić pomyślne zebranie i przeniesienie biopartykuł. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.
Rycina 6: Pojedyncze biopartykuły w próbce kołnierzyka koszuli. Biopartykuły odzyskano za pomocą folii żelowej z wnętrza kołnierzyka koszuli noszonej przez dawcę płci męskiej. Biopartykuły zabarwiono błękitem trypanu; przedstawiono obrazy dwudziestu różnych pojedynczych biopartykuł zidentyfikowanych w próbce. Na każdym obrazie zakreślono zebraną biopartykułę (czerwone okręgi wskazują biopartykuły, z których odzyskano profil; czarne okręgi wskazują biopartykuły, z których nie odzyskano profilu). Procent odzysku alleli (liczba zaobserwowanych alleli z możliwych 30) jest podany nad obrazem biopartykuły, z której odzyskano profil. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Rycina 7: Zlepione biopartykuły w próbce kołnierzyka koszuli. Biopartykuły odzyskano za pomocą folii żelowej z wewnętrznej strony kołnierzyka koszuli noszonej przez dawcę płci męskiej. Biopartykuły zabarwiono błękitem trypanu; przedstawiono obrazy dwudziestu różnych zlepionych biopartykuł zidentyfikowanych w próbce. Na każdym obrazie zakreślono zebraną biopartykułę (czerwone okręgi oznaczają biopartykuły, z których odzyskano profil; czarne okręgi oznaczają biopartykuły, z których nie odzyskano profilu). Dla każdej biopartykuły, z której odzyskano profil, podano procent odzyskiwania alleli (liczba zaobserwowanych alleli z możliwych 30). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Rysunek 8: Profil autosomalny STR uzyskany z pojedynczej biopartykuły z męskiego kołnierzyka koszuli. Profil autosomalny STR uzyskano z pojedynczej biopartykuły (pokazanej po lewej stronie) przy użyciu reakcji bezpośredniej lizy/amplifikacji w objętości 5 µl. Dokładność tego profilu określono poprzez porównanie z referencyjną próbką dawcy. Piętnaście autosomalnych loci STR oraz amelogenina (oznaczenie płci) są współamplifikowane w jednej reakcji i rozdzielane za pomocą elektroforezy kapilarnej. Wyniki przedstawiono tutaj w formie elektroferogramu. Numery alleli są wskazane pod każdym pikiem w każdym locus. Oś x reprezentuje wielkość fragmentu (pary zasad, bp), a oś y reprezentuje intensywność sygnału (RFU względne jednostki fluorescencji; podane pod każdym odpowiadającym numerem allela). Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.
Rycina 9: Profil autosomalnych STR uzyskany z skupionej biocząsteczki z kołnierzyka męskiej koszuli. Profil autosomalnych STR uzyskano ze skupionej biocząsteczki (widocznej po lewej stronie) przy użyciu reakcji bezpośredniej lizy/amplifikacji z wykorzystaniem 5 µl próbki. Dokładność tego profilu określono poprzez porównanie z referencyjną próbką dawcy. Piętnaście loci autosomalnych STR oraz amelogenina (oznaczanie płci) są współamplifikowane w jednej reakcji i rozdzielane za pomocą elektroforezy kapilarnej. Wyniki przedstawiono tutaj w formie elektroferogramu. Numery alleli są wskazane pod każdym pikiem dla każdego locus. Oś x reprezentuje wielkość fragmentu (pary zasad, bp), a oś y reprezentuje intensywność sygnału (RFU jednostki fluorescencji względnej; podane pod każdym odpowiadającym numerem allela). Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.
Rysunek 10: Przykład niepowodzenia w uzyskaniu autosomalnego profilu STR z pobranej biopartykuły. Pojedyncza biopartykuła pokazana po lewej stronie została pobrana z próbki żelowej folii z kołnierzyka koszuli. Jak wynika z otrzymanego profilu STR (pokazanego po prawej stronie), uzyskano tylko jeden allel (z 30 możliwych). Numery alleli są oznaczone pod każdym pikiem w każdym locus. Oś x reprezentuje wielkość fragmentu (pary zasad, bp), a oś y reprezentuje intensywność sygnału (RFU względne jednostki fluorescencji; podane pod każdym odpowiadającym numerem allelu). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
Dyskusja
W tym miejscu opisaliśmy metody zbierania i rozszerzonej analizy genetycznej biocząstek odzyskanych z dotykowych dowodów DNA. Opracowane podejście obejmuje następujące działania: 1) pobieranie materiału biologicznego (tj. biocząstek) za pomocą filmu żelowego z dotykanych przedmiotów i powierzchni, noszonych elementów odzieży lub bezpośredniej skóry ludzkiej, 2) badanie mikroskopowe odzyskanego materiału biologicznego w celu zapewnienia pobrania potencjalnego materiału biologicznego człowieka oraz 3) mikromanipulację pojedynczymi lub kilkoma biocząstkami za pomocą kleju rozpuszczalnego w wodzie, oraz 4) autosomalne profilowanie DNA-STR pobranych biocząstek przy użyciu jednoetapowej reakcji lizy/amplifikacji mikroobjętościowej (5 μl). Zastosowanie jednoetapowej reakcji w zamkniętej probówce zmniejsza ryzyko zanieczyszczenia i utraty próbki w wyniku dodatkowych manipulacji próbką lub przeniesienia do innych probówek reakcyjnych. Ulepszone jednoetapowe reakcje lizy/amplifikacji STR w mikroobjętości (5 μl) pozwalają na odzyskanie pełnych lub dowodowych profili STR dawcy pojedynczej lub kilku biocząstek. Podejście to zostało opracowane w celu uzyskania jednoźródłowych profili STR z jedno- i wieloźródłowych dowodów dotykowych DNA (np. zużytych elementów odzieży i innych artykułów gospodarstwa domowego, dotykanych/dotykanych przedmiotów i powierzchni, mieszanin skóra/skóra). Z powodzeniem zastosowano go do wykrywania dawcy płci męskiej w symulowanych próbkach mieszaniny do ataku fizycznego.
Podejście to może być dalej oceniane w dodatkowych scenariuszach mieszaniny płynów ustrojowych i tkanek, takich jak ofiara drapiąca swojego napastnika, w których tylko kilka biocząsteczek napastnika byłoby obecnych wśród przytłaczającej ilości materiału biologicznego ofiary. Ponadto, ponieważ podejście to opracowane w niniejszym badaniu pozwala na analizę na poziomie pojedynczej biocząstki, można je wykorzystać do lepszego zrozumienia charakteru i zakresu wtórnego transferu14-19, w którym pośrednik przenosi profil DNA z powierzchni, przedmiotu lub osoby na inny powierzchniowy obiekt lub osobę20. Ślepe pobieranie wymazów w analizie wtórnego transferu może nie być w stanie zidentyfikować śladowych ilości materiału od dawcy wtórnego. Opracowane tutaj podejście pozwala na analizę pojedynczych lub kilku biocząstek, a zatem wyniki nie są mylące z powodu obecności przytłaczającej ilości materiału biologicznego od pierwotnego dawcy. Metodologie opracowane w tej pracy mogą mieć również implikacje dla analizy śladowego materiału biologicznego w przypadkach napaści na tle seksualnym, takich jak te związane z cyfrową penetracją pochwy, w przypadku których pozytywna identyfikacja śladowych ilości komórek skóry sprawcy może mieć kluczowe znaczenie dla ustalenia, czy doszło do kontaktu seksualnego.
Chociaż pobieranie biocząstek z próbki żelowej nie wiąże się z trudnymi i złożonymi manipulacjami, istnieją krytyczne etapy tej procedury, które należy wykonać z dużą ostrożnością, aby zapewnić pomyślne przeniesienie biocząstek do dalszego naczynia reakcyjnego. Zbieranie biocząstek za pomocą kleju rozpuszczalnego w wodzie musi być oglądane pod mikroskopem (tj. mikroskopem stereoskopowym przy dużym powiększeniu (~ 200-300X), aby upewnić się, że zbierane są tylko interesujące biocząstki. W zależności od rozmiaru użytej "kulki" kleju, istnieje możliwość zebrania dodatkowego materiału otaczającego, który może obejmować zarówno materiał biologiczny, jak i niebiologiczny (np. włókna, inne zanieczyszczenia). Pobranie niezamierzonych dodatkowych biocząstek może spowodować odzyskanie domieszanych profili DNA. Pobranie materiału niebiologicznego może wprowadzić inhibitory do reakcji lizy mikroobjętościowej/STR. Jeśli za pomocą tej samej "kulki" kleju zostanie zebranych wiele biocząstek, istnieje możliwość, że wcześniej zebrane biocząstki zostaną odczepione od kleju. Nie jest to często obserwowane, ale może wystąpić, gdy większa liczba biocząstek (np. ponad 50) zostanie zebrana za pomocą jednej "kulki" klejącej. W przypadku celowania w dużą liczbę biocząstek, zaleca się wykonanie wielu kolekcji mniejszej liczby biocząstek, ale wszystkie przeniesione do tej samej probówki o pojemności 0,2 ml. Po zebraniu biocząstek należy zachować ostrożność podczas wyjmowania szkiełka z filmu żelowego ze stolika mikroskopowego i umieszczania probówki o pojemności 0,2 ml w taki sposób, aby końcówka igły nie została naruszona. Podczas umieszczania końcówki igły w mieszance amplifikacyjnej znajdującej się na dnie probówki o pojemności 0,2 ml, końcówka igły nie powinna stykać się z bokami probówki, aby uniknąć utraty materiału po bokach probówki. Podczas gdy rozpuszczalność kleju jest zazwyczaj szybka (~ 30 sekund lub mniej w zależności od rozmiaru "kulki" kleju) i może być monitorowana podczas badania mikroskopowego, końcówka igły powinna być powoli usuwana z mieszanki amplifikacyjnej, aby zapewnić całkowite rozpuszczenie kleju. Jeśli klej nie rozpuścił się całkowicie, igłę można ponownie umieścić w płynie, aby umożliwić całkowite rozpuszczenie.
Opisane tutaj protokoły zostały zoptymalizowane do użytku z biocząstkami i komórkami ludzkimi na podstawie dowodów biologicznych w postępowaniu sądowym. Wybrany bufor do lizy jest kompatybilny z wybranym zestawem do amplifikacji DNA-STR. Chociaż mogą istnieć odpowiednie alternatywne do lizy, ich skuteczność pod względem lizy komórek i kompatybilność z dalszą analizą muszą zostać zweryfikowane przez użytkownika. Dodatkowo, zestaw do amplifikacji STR i numer cyklu amplifikacji opisane w tym protokole zostały zoptymalizowane do użytku z pojedynczymi lub kilkoma biocząstkami. Wybrano zestaw do amplifikacji STR nowej generacji, który według doniesień charakteryzuje się zwiększoną wytrzymałością i czułością, a jego rezultatem jest odzyskiwanie wysokiej jakości profili STR z jednej lub kilku biocząstek. Chociaż dostępnych jest wiele innych zestawów STR, o różnych zalecanych numerach cykli amplifikacji, mogą one nie mieć odpowiedniej czułości i dlatego musiałyby zostać odpowiednio ocenione przed użyciem w tych protokołach.
Pomimo pomyślnego zastosowania opisanych metod do odzyskiwania profili STR z jednej lub kilku biocząstek, wskaźnik sukcesu odzyskiwania profilu nie będzie wynosił 100%. W związku z tym w przypadku niektórych próbek można zaobserwować ograniczony częściowy profil DNA lub brak profilu. Nie da się tego uniknąć ze względu na niemożność jednoznacznej wizualnej identyfikacji większości biocząstek jako materiału komórkowego, potencjalny stan degradacji materiału jądrowego w pobranych biocząstkach lub utratę materiału próbki z kleju przed przeniesieniem do naczynia reakcyjnego. W związku z tym nie zaleca się analizy pojedynczej próbki biocząstki dla każdego elementu DNA w dotyku. Często pobieramy 20 zestawów próbek z pojedynczej próbki żelowej i w razie potrzeby pobieramy dodatkowe zestawy próbek, jeśli nie zostanie uzyskany odpowiedni profil STR. Jedynym ograniczeniem w przypadku pobierania próbek jest ilość materiału biologicznego obecnego w próbce żelowej (i prawdopodobnie koszt analizy, chociaż reakcje mikroobjętościowe dają możliwość pobrania dodatkowych próbek za podobny lub niższy koszt, jak pojedyncza standardowa objętość reakcyjna (np . 25 μl).
Opisane tutaj opracowane metody profilowania DNA zapewniają molekularne podejście do charakterystyki, analizy i interpretacji śladowego materiału biologicznego odzyskanego z dotykowych próbek DNA. Istnieje jednak dodatkowa informacja genetyczna, którą można uzyskać z odzyskanych biocząstek, oprócz określenia dawcy (tj. profilu STR) dawcy materiału biologicznego. Źródło pochodzenia tkanek lub płynów ustrojowych (np. skóra w porównaniu ze śliną) może dostarczyć kluczowych informacji kontekstowych dla dochodzenia w sprawie karnej. Bez takiego ustalenia można wykorzystać niejednoznaczność źródła pochodzenia tkanki, ponieważ można zasugerować alternatywne okoliczności przestępstwa (np. sposób, w jaki płyn ustrojowy mógł zostać zdeponowany). Opisane tutaj protokoły pobierania i izolacji biocząstek mogą być wykorzystywane do zbierania biocząstek lub innych komórek (np. policzkowych, pochwowych) do wykorzystania w strategii identyfikacji źródła tkanki (profilowanie mRNA21-30), która obejmuje reakcje odwrotnej transkrypcji mikroobjętości (RT) i amplifikacji. Dzięki dalszej optymalizacji możliwe będzie również opracowanie strategii koizolacji DNA/RNA, która umożliwi identyfikację typu komórki (RNA) i profilowanie STR z tej samej próbki, w tym biocząsteczek z dotykowych dowodów DNA.
Oświadczenia
Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.
Podziękowania
Autorzy chcieliby również podziękować wszystkim uczestnikom, którzy przekazali próbki do tej pracy. Praca ta została sfinansowana przez Program Biura Sprawiedliwości, Narodowy Instytut Sprawiedliwości, Departament Sprawiedliwości pod numerem nagrody 2010-DN-BX-K139. Agencje finansujące nie były zaangażowane w opracowywanie badania, gromadzenie, analizę i interpretację danych ani w pisanie raportu. Punkty widzenia zawarte w tym dokumencie są poglądami autorów i niekoniecznie reprezentują oficjalne stanowisko Departamentu Sprawiedliwości Stanów Zjednoczonych.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| SealRite 1,5 ml naturalne probówki wirówkowe, sterylne | USA Scientific | 1615-5510 | dostępnych jest wielu alternatywnych dostawców, ale probówki powinny być sterylne |
| 0,2 ml probówki PCR z płaską nakrętką, naturalne | Phenix Research | MPX-200F | lub równoważne |
| Kimwipes | Fisher Scientific | 06-666 i/lub 06-666-11C | |
| Wkładki nasączone alkoholem | Fisher Scientific | 06-669-62 | alternatywą jest 06-665-24 (Fisher Sci); kanister z większymi chusteczkami nasączonymi alkoholem, a nie pojedynczymi wacikami |
| Sterylna woda | 18,2 MΩ, autoklawizowana | ||
| Szkiełka mikroskopowe szklane, matowe, 3" x 1": 1 mm | Dopuszczalne są alternatywne marki lub rozmiary | Fisher Scientific | 12-544-3 |
| Jednorazowa pipeta transferowa | Fisher Scientific | 13-711-9D | alternatywy są dopuszczalne |
| Roztwór błękitu trypanowego | Sigma | T8154 | |
| Pipipety: 0,2-2, 2-20, 10-100, 100-1,000 μ l | różne | ||
| sterylne, odporne na aerozole końcówki do pipet | różne | ||
| mini-wirówki | różne | ||
| mikroskopy stereoskopowe | Leica | M205C | , inne są odpowiednie, ale muszą być zdolne do powiększania do 350X |
| System GeneAmp PCR Cykl termiczny 9700 (srebrny lub złoty blok) | Life Technologies | N8050200 lub 4314878 | można stosować inne modele i producentów, ale wydajność z zestawem do amplifikacji STR musi zostać zweryfikowana |
| 3130 Genetic Analyzer | Life Technologies | 3130-01 | alternatywy: 310 lub 3500 Genetyczne anlizery (Life Technologies) |
| Oprogramowanie GeneMapper | Life Technologies | dostępne są różne wersje oprogramowania i można ich używać | |
| WF Gel-Film, x8 poziom retencji | Gel-Pak | WF-40-x8-A Folia | waflowa 4" x 4"; można zamówić w innych specyfikacjach rozmiarowych |
| Taśma dwustronna | różne | ||
| bloki szklane, 3 "x 1,5" x 3/8 " | McCrone Mikroskopy i akcesoria | 370-2 | lub równoważne |
| [nagłówek] | |||
| Igła wolframowa z | uchwytem McCrone Mikroskopy i akcesoria | 106 | |
| Rozpuszczalna w wodzie taśma lutownicza 3M na fali, przezroczysta 5414 | Allied Electronics | 70113977 | |
| Bufor do lizy (kryminalistyka GEM, Zygem) | VWR | 95043-992 | Bufor do lizy jest przygotowywany w 10 μ l porcje (w razie potrzeby przygotować dodatkowe porcje mieszanki wzorcowej, aby pomieścić żądaną liczbę próbek). 1,5 μ l stosuje się dla każdej próbki. Aby przygotować 10 μ l buforu do lizy (wystarczający na ~6 próbek): 6,9 μ l sterylna woda, 2,1 μ l bufor 10x - niebieski, 1 μ l kryminalistyka. |
| Zestaw do amplifikacji STR, zestaw do amplifikacji AmpFlSTR Identifiler Plus PCR | Life Technologies | 4427368 | Można użyć alternatywnych zestawów do amplifikacji STR, ale wydajność musiałaby zostać zweryfikowana przez użytkownika. Mieszaninę amplifikacyjną przygotowuje się w następujący sposób (objętości na próbkę): 2,2 μ l Mieszanina reakcyjna PCR, 1,1 i mu; l Zestaw podkładów, 0,2 i mu; l (1U) Polimeraza DNA AmpliTaq Gold. Należy przygotować mieszankę wzorcową wystarczającą dla żądanej liczby próbek. 3,5 &m; l przygotowanej mieszaniny dodaje się do probówki o pojemności 0,2 ml w celu pobrania biocząstek. |
| AmpliTaq Gold DNA polimeraza | Life Technologies | N808-0245 | |
| HiDi formamid | Life Technologies | 4311320 | |
| GeneScan 500 LIZ standard rozmiaru | Life Technologies | 4322682 | |
| 96-dołkowe optyczne płytki reakcyjne | Life Technologies | N8010560 | |
| Plate septa, 96 dołków | Life Technologies | 4315933 | |
| Polimer zoptymalizowany pod kątem wydajności, POP-7 | Life Technologies | 4363785 | Dopuszczalne są alternatywy, takie jak POP-4 |
Bibliografia
- Hanson, E. K., Ballantyne, J. Getting blood from a stone': ultrasensitive forensic DNA profiling of microscopic bio-particles recovered from 'touch DNA' evidence. Methods Mol.Biol. 1039, 3-17 (2013).
- Balogh, M. K., Burger, J., Bender, K., Schneider, P. M., Alt, K. W. STR genotyping and mtDNA sequencing of latent fingerprint on paper. Forensic Sci Int. 137 (2-3), 188-195 (2003).
- Barbaro, A., Cormaci, P., Teatino, A., La, M. A., Barbaro, A. Anonymous letters? DNA and fingerprints technologies combined to solve a case. Forensic Sci Int. 146, S133-S134 (2004).
- Bright, J. A., Petricevic, S. F. Recovery of trace DNA and its application to DNA profiling of shoe insoles. Forensic Sci.Int. 145 (1), 7-12 (2004).
- Castello, A., Alvarez, M., Verdu, F. DNA from a Computer Keyboard. Forensic Science Communications. 6 (3), (2004).
- Horsman-Hall, K. M., et al. Development of STR profiles from firearms and fired cartridge cases. Forensic Sci Int. Genet. 3 (4), 242-250 (2009).
- Petricevic, S. F., Bright, J. A., Cockerton, S. L. DNA profiling of trace DNA recovered from bedding. Forensic Sci. Int. 159 (1), 21-26 (2006).
- Oorschot, R. A., Jones, M. K. DNA fingerprints from fingerprints. Nature. 387 (6635), 767(1997).
- Sewell, J., et al. Recovery of DNA and fingerprints from touched documents. Forensic Sci Int.Genet. 2 (4), 281-285 (2008).
- Raymond, J. J., van Oorschot, R. A., Gunn, P. R., Walsh, S. J., Roux, C. Trace evidence characteristics of DNA: A preliminary investigation of the persistence of DNA at crime scenes. Forensic Sci Int Genet. 4 (1), 26-33 (2009).
- Wickenheiser, R. A. Trace DNA: a review, discussion of theory, and application of the transfer of trace quantities of DNA through skin contact. J.Forensic Sci. 47 (3), 442-450 (2002).
- Sweet, D., Lorente, M., Lorente, J. A., Valenzuela, A., Villanueva, E. An improved method to recover saliva from human skin: the double swab technique. J. Forensic Sci. 42 (2), 320-322 (1997).
- Molecular Biology of the Skin - the Keratinocyte. Darmon, M. M., Blumenberg, M. M. , Academic Press. San Diego, CA. (1993).
- Daly, D. J., Murphy, C., McDermott, S. D. The transfer of touch DNA from hands to glass, fabric and wood. Forensic Sci Int Genet. 6 (1), 41-46 (2012).
- Goray, M., Eken, E., Mitchell, R. J., van Oorschot, R. A. Secondary DNA transfer of biological substances under varying test conditions. Forensic Sci Int Genet. 4 (2), 62-67 (2010).
- Goray, M., Mitchell, R. J., van Oorschot, R. A. Investigation of secondary DNA transfer of skin cells under controlled test conditions. Leg.Med.(Tokyo). 12 (3), 117-120 (2010).
- Lowe, A., Murray, C., Whitaker, J., Tully, G., Gill, P. The propensity of individuals to deposit DNA and secondary transfer of low level DNA from individuals to inert surfaces. Forensic Sci Int. 129 (1), 25-34 (2002).
- Phipps, M., Petricevic, S. The tendency of individuals to transfer DNA to handled items. Forensic Sci Int. (2-3), 168-162 (2007).
- Zoppis, S., et al. DNA fingerprinting secondary transfer from different skin areas: Morphological and genetic studies. Forensic Sci Int Genet. 11, 137-143 (2014).
- Gill, P. Misleading DNA Evidence: Reasons for Miscarriages of Justice. , Academic Press - Elsevier. (2014).
- Haas, C., Hanson, E., Ballantyne, J. Capillary electrophoresis of a multiplex reverse transcription-polymerase chain reaction to target messenger RNA markers for body fluid identification. Methods Mol. Biol. 830, 169-183 (2012).
- Hanson, E., Ballantyne, J. RNA Profiling for the Identification of the Tissue Origin of Dried Stains in Forenic Biology. Forensic Sci Rev. , 22145-22157 (2010).
- Hanson, E., Haas, C., Jucker, R., Ballantyne, J. Specific and sensitive mRNA biomarkers for the identification of skin in 'touch DNA' evidence. Forensic Sci Int Genet. 6, 548-558 (2012).
- Hanson, E. K., Ballantyne, J. Highly specific mRNA biomarkers for the identification of vaginal secretions in sexual assault investigations. Sci Justice. 53 (1), 14-22 (2013).
- Juusola, J., Ballantyne, J. Messenger RNA profiling: a prototype method to supplant conventional methods for body fluid identification. Forensic Sci Int. 135 (2), 85-96 (2003).
- Juusola, J., Ballantyne, J. Multiplex mRNA profiling for the identification of body fluids. Forensic Sci Int. 152 (1), 1-12 (2005).
- Fleming, R. I., Harbison, S. The development of a mRNA multiplex RT-PCR assay for the definitive identification of body fluids. Forensic Sci Int Genet. 4 (4), 244-256 (2010).
- Haas, C., Klesser, B., Maake, C., Bar, W., Kratzer, A. mRNA profiling for body fluid identification by reverse transcription endpoint PCR and realtime PCR. Forensic Sci Int Genet. 3 (2), 80-88 (2009).
- Lindenbergh, A., et al. A multiplex (m)RNA-profiling system for the forensic identification of body fluids and contact traces. Forensic Sci Int Genet. 6 (2), 565-577 (2012).
- Richard, M. L., et al. Evaluation of mRNA marker specificity for the identification of five human body fluids by capillary electrophoresis. Forensic Sci Int Genet. 6 (4), 452-460 (2012).
Przedruki i uprawnienia
