Artykuł metodologiczny

Ogólnoustrojowe infekcje bakteryjne i fenotypy obrony immunologicznej u Drosophila melanogaster

27.5K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/52613

⸱

13 maja 2015

 ,  ,  , 
1Department of Entomology, Cornell University

W tym artykule

Podsumowanie

Drosophila melanogaster to wybitny organizm modelowy do badania wrodzonego układu odpornościowego oraz fizjologicznych konsekwencji infekcji i chorób. Protokół ten opisuje, w jaki sposób dostarczyć D. melanogaster solidne i ilościowo powtarzalne infekcje bakteryjne, a następnie jak zmierzyć nasilenie infekcji i określić ilościowo odpowiedź immunologiczną gospodarza.

Streszczenie

Muszka owocowa Drosophila melanogaster jest jednym z głównych organizmów modelowych do badania funkcji i ewolucji obrony immunologicznej. Wiele aspektów odporności wrodzonej jest zachowanych między owadami i ssakami, a ponieważ Drosophila może być łatwo manipulowana genetycznie i eksperymentalnie, są one potężne w badaniu funkcji układu odpornościowego i fizjologicznych konsekwencji choroby. Zademonstrowana tutaj procedura pozwala na zakażenie much poprzez wprowadzenie bakterii bezpośrednio do jamy ciała, omijając bariery nabłonkowe i bardziej pasywne formy obrony oraz pozwalając skupić się na infekcji ogólnoustrojowej. Procedura obejmuje protokoły pomiaru wskaźników śmiertelności gospodarza, ogólnoustrojowego obciążenia patogenami i stopnia indukcji układu odpornościowego gospodarza. Ta procedura infekcji jest niedroga, solidna i ilościowo powtarzalna i może być stosowana w badaniach genetyki funkcjonalnej, ewolucyjnej historii życia i fizjologii.

Wprowadzenie

Muszka owocowa Drosophila melanogaster jest jednym z głównych organizmów modelowych do badania funkcji i ewolucji obrony immunologicznej. Drosophila są niedrogie i łatwe w hodowli, są bardzo podatne na eksperymentalne manipulacje i są wspierane przez rozległą społeczność naukową, która opracowała szeroki wachlarz narzędzi badawczych. Wiele aspektów odporności wrodzonej jest zachowanych między owadami i ssakami, w tym transdukcja sygnału, w której pośredniczą receptory Toll-podobne i czynniki transkrypcyjne rodziny NF-kB, sygnalizacja JAK/STAT i odpowiedzi szlaku JNK. 1,2 Funkcję tych genów i szlaków można badać u D. melanogaster za pomocą mutacji lub knockdownów RNAi, które zwiększają lub zmniejszają aktywność szlaku. 3–6 Ponadto Drosophila może być wykorzystywana do badania fizjologicznych konsekwencji infekcji i chorób, w tym w kontekście ewolucyjnej teorii historii życia. 7–9 Wszystkie takie badania zależą jednak od zdolności do wiarygodnego infekowania eksperymentalnych muszek w określonych warunkach leczenia. Opisana tutaj procedura przedstawia ramy metodologiczne do dostarczania silnych i powtarzalnych infekcji bakteryjnych do Drosophila melanogaster, a następnie pomiaru ciężkości infekcji i ilościowego określenia odpowiedzi immunologicznej gospodarza.

Drosophila może być naturalnie i eksperymentalnie zainfekowana przez różnorodne pasożyty i patogeny, w tym bakterie, grzyby, wirusy, nicienie i pasożytnicze osy. Obecny protokół koncentruje się na dostarczaniu ogólnoustrojowych infekcji bakteryjnych. Do infekowania much można wykorzystać wiele różnych bakterii, a wybór eksperymentatora powinien opierać się na precyzyjnych pytaniach naukowych, które są mu zadawane. Na przykład ludzkie izolaty kliniczne mogą być stosowane do badania mechanizmów wirulencji bakterii10 lub izolaty istotne dla środowiska mogą być preferowane do badań ewolucyjnych. 11 Niektóre bakterie są kompetentnymi patogenami D. melanogaster, namnażając się po zakażeniu i powodując chorobę lub śmierć gospodarza. Inne bakterie są skutecznie kontrolowane przez układ odpornościowy gospodarza i usuwane w ciągu kilku dni. W tej demonstracji Providencia rettgeri zostanie wykorzystana jako patogen proliferacyjny, który może powodować śmiertelność gospodarza i utrzymuje się u żywicieli, którzy przeżyli. Escherichia coli będzie używana jako niepatogen, który jest usuwany przez układ odpornościowy gospodarza.

Infekcja zostanie stwierdzona przez wprowadzenie bakterii bezpośrednio do jamy ciała muchy. Takie podejście omija bariery nabłonkowe i zachowania ochronne, umożliwiając badanie infekcji ogólnoustrojowej niezależnie od naturalnego sposobu przenoszenia. Istnieją dwie podstawowe metody eksperymentalnego ustalania infekcji ogólnoustrojowej. W pierwszym z nich nanoiniektor i ciągnięte szklane igły kapilarne są używane do wstrzykiwania precyzyjnej liczby bakterii do muchy. Zaletą tej metody jest to, że pozwala na duży zakres dynamiczny dawek infekcji i jest ilościowo wysoce powtarzalna. Drugim podejściem jest dostarczenie infekcji za pomocą septycznego ukłucia szpilką. Takie podejście ma tę zaletę, że jest szybkie i nie wymaga specjalnego sprzętu. Po ustaleniu infekcji możliwe staje się zmierzenie ogólnoustrojowego obciążenia patogenami, śmiertelności gospodarza i indukowalnej aktywności układu odpornościowego. Oczywiście, u zakażonego D. melanogaster można by zmierzyć dowolną liczbę dodatkowych fenotypów, w tym płodność po infekcji12, zdolność uczenia się13, stan metaboliczny14 lub praktycznie każdą inną cechę, którą można sobie wyobrazić.

Protokół

1. Zbieraj i przygotuj muchy

  1. Tylny D. melanogaster w pożądanych warunkach doświadczalnych. Należy uważać, aby nie przeludnić much podczas odchowu i upewnić się, że zagęszczenie larw jest spójne we wszystkich zabiegach, ponieważ warunki środowiskowe w stadium larwalnym mogą głęboko wpływać na fenotypy obrony immunologicznej w stadium dorosłym. 15
  2. Zebrać eksperymentalne muchy 0 - 3 dni po eklozji z puszki poczwarki i przenieść je na świeże podłoże.
  3. Zebrane muchy należy przechowywać w żądanej temperaturze (zazwyczaj odpowiednie są temperatury od 22 °C do 28 °C) do osiągnięcia wieku 5 - 7 dni po ekluzji.
    UWAGA: Daje to muchom wystarczająco dużo czasu na zakończenie metamorfozy i osiągnięcie dojrzałych osobników dorosłych, ale jest to na długo przed rozpoczęciem starzenia.
  4. Przed zakażeniem należy posortować żądaną liczbę much do osobnej fiolki, ponownie uważając, aby uniknąć przepełnienia.
    UWAGA: W tej demonstracji zarażane są tylko samce, ale równie możliwe jest zarażenie samic przy użyciu opisanej procedury.

2. Hodowla i przygotowanie bakterii

  1. Przygotuj płytkę wzorcową z wybranymi bakteriami co najmniej 2 dni przed zakażeniem. Usunąć bakterie z 15% glicerolu przechowywanego przez czas nieokreślony w temperaturze -80 °C. Płytkę wzorcową należy przechowywać w temperaturze 4 °C przez okres do 2 tygodni. Płytki główne należy zawsze nakładać bezpośrednio z zamrożonego wywaru glicerynowego. Należy unikać seryjnego przechodzenia bakterii z płytki na płytkę, ponieważ powtarzające się przechodzenie w kulturze może spowodować ewolucję bakterii w osłabionej zjadliwości.
    UWAGA: W tym przykładzie wykorzystano Providencia rettgeri i Escherichia coli.
  2. Należy postępować zgodnie z poniższą procedurą, aby przygotować zawiesinę bakteryjną do wstrzykiwań.
    1. Wyhodować 2 ml kultury bakterii, zaszczepiając sterylne podłoże pojedynczą kolonią wyizolowaną z płytki wzorcowej. Wyhodować bakterie do fazy stacjonarnej (np. wzrost O/N w temperaturze 37 °C).
      UWAGA: Zarówno P. retggeri, jak i E. coli dobrze rosną w bulionie Luria w temperaturach od 20 do 37 °C z delikatnym wstrząsaniem.
    2. Gdy hodowla osiągnie fazę stacjonarną, delikatnie osadzać komórki z ok. 600 μl kultury w wirówce stołowej (3 min przy 5 000 x g), odrzucać supernatant i ponownie zawiesić bakterie w ok. 1 000 μl sterylnego roztworu soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS; 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2PO4, 1,8 mM KH2PO4, pH = 7,4).
    3. Rozcieńczyć zawieszone komórki w sterylnym PBS w celu uzyskania gęstości optycznej (OD) odpowiedniej dla używanej bakterii, mierzonej za pomocą spektrofotometru jako absorbancji przy 600 nm. Użyj tej zawiesiny, aby zarazić muchy.
      UWAGA: A600 = 0,1 lub 1,0 odpowiada odpowiednio około 10,8 i 10,9 Providencia rettgeri lub E. coli na ml. Ponieważ zarówno żywe, jak i martwe bakterie przyczyniają się do gęstości optycznej, ważne jest, aby zbierać kultury na wczesnym etapie stacjonarnym, zanim nagromadzą się zwłoki bakteryjne i zniekształcą związek między gęstością optyczną a liczbą żywych bakterii wprowadzonych podczas infekcji.

3. Zainfekuj muchy

UWAGA: Ponieważ na odporność Drosophila wpływa rytm okołodobowy, ważne jest, aby przeprowadzać infekcje o podobnej porze dnia w eksperymentalnych powtórzeniach. 16

3.1) Korzystanie z Nanoinjectora

  1. Przygotuj szklane igły na infekcję.
    1. Przygotuj szklaną igłę, pociągając kapilarnę ze szkła borokrzemianowego za pomocą ściągacza do mikropipet.
    2. Za pomocą kleszczy odłamać końcówkę igły, aby utworzyć otwór o średnicy około 50 μm, aby umożliwić wyrzucenie płynu.
  2. Zamontuj wtryskiwacz.
    1. Umieść O-ring uszczelniający, a następnie białą przekładkę (duże wgłębienie skierowane na zewnątrz) na metalowym tłoku.
    2. Napełnić szklaną igłę olejem mineralnym za pomocą strzykawki z igłą 30 G.
    3. Przełóż wypełnioną szklaną igłę przez tuleję zaciskową, a następnie umieść większy O-ring wokół jej podstawy, około 1 mm od końca igły.
    4. Wsuń igłę na metalowy tłok i delikatnie przykręć tuleję zaciskową, aż będzie bezpieczna.
    5. Wyrzuć większość oleju mineralnego z wtryskiwacza, ale upewnij się, że w igle nadal znajduje się niewielka objętość oleju, która działa jako bariera między wstrzykiwaczem a zawiesiną bakteryjną. Upewnij się, że w zawiesinie oleju mineralnego lub bakteryjnej ani między tymi dwoma płynami nie ma pęcherzyków powietrza.
    6. Ustawić wtryskiwacz na żądaną objętość do wstrzyknięcia (od 9 nl do 50 nl).
  3. Generuj kontrolki zranień.
    1. Napełnij igłę iniektora sterylnym PBS, ostrożnie wkładając końcówkę igły kapilarnej do probówki z pożywką i naciskając przycisk "napełnij" na wtryskiwaczu.
      UWAGA: Sterylne bakteryjne podłoża wzrostowe mogą być również używane do kontroli ran, jeśli eksperyment wymaga wstrzyknięcia bakterii zawieszonych w ich pożywce wzrostowej. Ponieważ jednak pożywka bakteryjna zawiera składniki, które mogą stymulować układ odpornościowy lub mieć inny wpływ na gospodarza, preferowany jest obojętny nośnik, taki jak PBS.
    2. Znieczulić żądaną liczbę much pod lekkim przepływem CO2 .
    3. Wstrzyknąć muchy w przednią część brzucha na brzuszno-boczną powierzchnię za pomocą sterylnego PBS.
      UWAGA: Możliwe jest również wstrzykiwanie much w inne miejsca, takie jak płytka mostkowo-opłucnowa klatki piersiowej, ale ważne jest, aby miejsce wstrzyknięcia było spójne w każdym eksperymencie. 17
    4. Umieść wstrzyknięte muchy w świeżych fiolkach z nowym podłożem, kładąc fiolki na boku, aż wszystkie muchy wyzdrowieją ze znieczulenia, aby zapobiec przyklejeniu się much do pokarmu.
      UWAGA: Zaleca się wstrzyknięcie muszek kontrolnych PBS przed wstrzyknięciem bakterii muszkom eksperymentalnym, aby ta sama igła mogła być użyta do obu zabiegów. Nie zawsze będzie możliwe użycie tej samej igły do całego eksperymentu. W takim przypadku pożądane może być odnotowanie, która igła została użyta z którymi muchami i uwzględnienie tożsamości igły jako czynnika eksperymentalnego w analizie statystycznej.
  4. Wstrzyknij patogen bakteryjny.
    1. Wysunąć pozostałą sterylną pożywkę z wstrzykiwacza i ponownie napełnić tę samą igłę zawiesiną bakteryjną.
    2. Powtórzyć powyższą procedurę (3.1.3), teraz wstrzykując muszkom zawiesinę bakteryjną przygotowaną w procedurze 2.2.

3.2) Z septycznym pinprickiem

  1. Przygotować igłę do nakłucia.
    1. Stopić końcówkę końcówki mikropipety o pojemności 200 μl i włożyć szpilkę do pomiaru owadów o średnicy 0,15 mm w stopiony plastik. Poczekaj, aż plastik zastygnie w taki sposób, aby szpilka była utrzymywana na miejscu z około 0.5 cm szpilki wystającej z plastiku.
  2. Generuj kontrolki zranień.
    1. Znieczulić żądaną liczbę much pod lekkim przepływem CO2 .
    2. Nakłuj igłą muchy w płytce mostkowo-opłucnej klatki piersiowej, unikając miejsc przyczepu skrzydeł i nóg. W razie potrzeby delikatnie usuń muchy z szpilki za pomocą miękkich kleszczy.
      UWAGA: Możliwe jest również nakłucie much w innych miejscach, takich jak przedni brzuch na powierzchni brzuszno-bocznej, ale ważne jest, aby miejsce wstrzyknięcia było spójne w każdym eksperymencie. 17 Nakłuwanie przez naskórek brzucha jest zwykle trudniejsze niż nakłuwanie klatki piersiowej i dlatego jest mniej powszechne.
    3. Umieść ukłute muchy w świeżej fiolce z nowym podłożem na muchy, kładąc fiolkę na boku, aż wszystkie muchy wyzdrowieją ze znieczulenia, aby zapobiec przyklejeniu się much do pokarmu.
  3. Wprowadź infekcję bakteryjną.
    1. Znieczulić żądaną liczbę much pod lekkim przepływem CO2 .
    2. Nakłuć każdą muchę w tym samym miejscu, w którym znajdują się kontrole pożywki, zanurzając końcówkę szpilki w zawiesinie bakteryjnej przygotowanej w procedurze 2.2 przed nakłuciem każdej muchy.
    3. Umieść ukłute muchy w świeżej fiolce z nowym podłożem na muchy, kładąc fiolkę na boku, aż wszystkie muchy wyzdrowieją ze znieczulenia, aby zapobiec przyklejeniu się much do pokarmu.

3.3) Oceń dostarczoną dawkę zakaźną

  1. Zakażoną grupę much należy zainfekować w sposób opisany powyżej w procedurze 3.1 lub 3.2, tylko zamiast wracać muchom do fiolki z jedzeniem w celu wyzdrowienia ze znieczulenia, umieścić każdą muchę w probówce mikrowirówkowej na lodzie.
  2. Dodać 250 μl PBS do każdej probówki i homogenizować muchy za pomocą tłuczka lub trzepaczki do kulek.
  3. Umieścić homogenat na płytce agarowej LB, używając spiralnego płytki lub seryjnego rozcieńczania.
    1. Na płytkę przy użyciu rozcieńczenia seryjnego, przenieść każdy homogenat muchy do pierwszego rzędu płytki 96-dołkowej.
    2. Wypełnić każdą studzienkę w pozostałych rzędach 90 μl PBS.
    3. Za pomocą pipety wielokanałowej pobrać 10 μl z pierwszego rzędu zawierającego homogenat muchowy i dozować do drugiego rzędu.
    4. Pipetować w górę i w dół co najmniej 10 razy, aby dokładnie wymieszać, a następnie pobrać 10 μl i przenieść do trzeciego rzędu. Powtórz tę procedurę, używając pozostałych wierszy.
    5. Zaczynając od dolnego rzędu (zawiesina większości rozcieńczonych bakterii), za pomocą pipety wielokanałowej pobrać 10 μl z każdej studzienki i umieścić ją na płytce LB, uważając, aby próbki były dozowane jako dyskretne miejsca, które nie stykają się ze sobą. Powtarzać tę czynność, aż zostaną pobrane próbki ze wszystkich studzienek z każdego rzędu, dozując je w malejącej kolejności rozcieńczenia na płytce LB.
    6. Pozostaw płytkę w pozycji RT, aż plamki całkowicie wsiąkną w płytkę LB.
      UWAGA: Zaleca się suszenie płytki LB przez kilka dni w temperaturze pokojowej przed użyciem, aby zapewnić łatwe wchłanianie płynu, minimalizując ryzyko przypadkowego kontaktu między plamkami próbki.
  4. Inkubuj płytki O/N, uważając, aby nie przerosły płytek, aby kolonie pozostały małe i dyskretne.
    UWAGA: W zależności od zastosowanej pożywki do wzrostu bakterii i temperatury inkubacji, na płytce mogą w końcu pojawić się kolonie pochodzące z endogennej mikrobioty jelitowej muchy. Jednak większość bakterii wykorzystywanych do infekcji patogennych rośnie znacznie szybciej niż mikrobiota jelitowa na agarze LB w temperaturze 37 °C.
  5. Wyjąć płytki z inkubatora, gdy eksperymentalne bakterie wytworzą widoczne kolonie (zwykle 8-12 godzin), ale przed pojawieniem się kolonii mikrobioty jelitowej Drosophila (około 36 godzin). W przypadku wolno rosnących bakterii eksperymentalnych należy użyć selektywnego antybiotyku w agarze LB, aby usunąć wszelkie kolonie z mikrobioty jelitowej.
  6. Policz liczbę kolonii dla każdego homogenatu.
    1. W przypadku płytek spiralnych należy policzyć kolonie, które rosną za pomocą automatycznego licznika kolonii, który może oszacować obciążenie bakteryjne na ml homogenatu na podstawie liczby i położenia kolonii na płytce.
      UWAGA: Zliczanie spiralne jest najdokładniejsze, gdy stężenie bakterii mieści się w zakresie od 5 x 102 do 5 x 104 bakterii na ml.
    2. W przypadku płytek punktowych należy ręcznie policzyć kolonie dla każdej muchy z dowolnego rozcieńczenia zawierającego 30 - 300 kolonii i obliczyć liczbę bakterii na ml oryginalnego homogenatu.

4. Charakterystyka przetrwania infekcji

  1. Śmiertelność testu po wstrzyknięciu.
    1. Umieścić zakażone muchy i ranne kontrole w świeżych fiolkach i utrzymywać w inkubatorze w żądanej temperaturze (zalecana jest 25 °C z cyklem 12:12 światło: ciemność). Nie należy wkładać więcej niż 15 much do jednej fiolki, ponieważ trudno jest policzyć więcej niż 15 żywych much.
    2. Policz liczbę żywych i martwych much każdego dnia lub częściej, jeśli to konieczne.
    3. Aby utrzymać jakość jedzenia, regularnie przestawiaj muchy na nowe jedzenie.
      1. Jeśli fiolka zawiera tylko samce, należy je przenosić do świeżych fiolek co trzy dni. Jeśli w fiolce znajdują się samice, należy przenosić je do świeżych fiolek co dwa dni, ponieważ potomstwo larw upłynnia pokarm, zwiększając ryzyko, że dorosłe muchy mogą utknąć i powodując zawyżoną śmiertelność z powodu infekcji.
  2. Analizuj statystycznie dane.
    1. Wykreśl przeżycie jako krzywą Kaplana-Meiera, która wskazuje prawdopodobieństwo, że dana osoba przeżyje do zmierzonego punktu czasowego po wstrzyknięciu. 18 W przypadku krzywych przeżycia, które się nie przecinają, należy przeprowadzić porównania parami za pomocą testu logarytmiczno-szeregowego (zwanego również testem Mantela Coxa) lub przeprowadzić bardziej złożone analizy przy użyciu modelu proporcjonalnego hazardu Coxa, który może obejmować kilka czynników i ich interakcji. W przypadku krzyżujących się krzywych przeżycia należy przeprowadzić warstwową analizę Coxa. 17

5. Test obciążenia bakteryjnego po infekcji

  1. Zmierz obciążenie bakteryjne.
    1. W wyznaczonym czasie po wstrzyknięciu powtórzyć procedurę stosowaną do oceny dawki zakaźnej w celu określenia obciążenia bakteryjnego w trakcie infekcji (patrz protokół 3.3).
      UWAGA: W przypadku korzystania z płytki spiralnej należy rozcieńczyć homogenaty tak, aby zawiesina bakteryjna mieściła się w zakresie 1 000 - 100 000 bakterii na ml.
  2. Przeanalizuj dane.
    1. Jeśli obciążenie bakteryjne jest nienormalne, przekształć dane, aby lepiej przybliżyć rozkład normalny, lub przeanalizuj dane za pomocą nieparametrycznej analizy statystycznej (np. test U Manna-Whitneya). Użyj analizy Boxa-Coxa, aby znaleźć optymalną transformację; Transformacje logarytmu naturalnego lub logarytmu o podstawie -10 są często skuteczne. Rozdział 19
    2. Jeśli dane mają wystarczająco normalny rozkład i kontrastowane są tylko dwa zabiegi, należy wykonać test t, aby określić, czy te dwa zabiegi skutkują różnymi średnimi obciążeniami bakteryjnymi. Jeśli istnieje wiele zmiennych eksperymentalnych lub innych potencjalnie predykcyjnych czynników, użyj analizy wariancji (ANOVA), aby określić, które czynniki są istotnymi predyktorami obciążenia bakteryjnego. Rozdział 19

6. Test Aktywacji Transkrypcji Genów Układu Odpornościowego

  1. Aby z grubsza zobrazować aktywację immunologiczną po infekcji, należy zainfekować transgeniczne muchy, które wykazują ekspresję białka zielonej fluorescencji (GFP) pod kontrolą promotora z genu peptydu przeciwdrobnoustrojowego, jak opisano wcześniej. Rozdział 18
  2. Zobacz zainfekowane muchy pod mikroskopem zdolnym do fluorescencji; Indukcja GFP powinna stać się widoczna w ciele tłuszczowym w ciągu pierwszych 6 - 10 godzin po zakażeniu.
  3. W celu dokładniejszego określenia ilościowego aktywacji immunologicznej należy użyć ilościowej reakcji PCR na matrycy cDNA (qRT-PCR) w celu zmierzenia obfitości transkryptów genów peptydów przeciwdrobnoustrojowych.
    UWAGA: Ekspresję genów odpornościowych można zmierzyć w dowolnym momencie po (lub przed) zakażeniem. Ogólnie rzecz biorąc, indukcja ekspresji genów immunologicznych rozpoczyna się około 4 godziny po wstrzyknięciu i zwiększa się w ciągu następnych 24 godzin.
    1. Znieczulić muchy za pomocą CO2 .
    2. Umieść 15 much w probówce do mikrofuge na każdą ekstrakcję RNA.
      UWAGA: Zaleca się pobranie co najmniej trzech powtórzonych próbek dla każdego warunku leczenia.
    3. Wyekstrahuj RNA od muszek i wygeneruj pierwszą nić cDNA przy użyciu dowolnej z wielu standardowych procedur lub zestawów komercyjnych. Przechowywać RNA w temperaturze -80 °C. Przechowywać cDNA w temperaturze -20 °C przez okres kilku tygodni i w temperaturze -80 °C w przypadku długotrwałego przechowywania. Przed ekstrakcją RNA należy przechowywać muchy w temperaturze -80 °C.
    4. Wykonaj ilościową PCR (qPCR) na docelowych genach będących przedmiotem zainteresowania, używając cDNA jako matrycy. Patrz Tabela 1, aby zapoznać się z sekwencjami starterów w celu amplifikacji genów peptydów przeciwbakteryjnych Diptericyny A, Drosomycyny, Defensyny, Attacyny A i Metchnikowiny, a także genu kontroli porządkowej rp49 (znanego również jako rpL32).
      UWAGA: Geny kodujące peptydy przeciwdrobnoustrojowe dipterycynę A i drosomycynę zapewniają bardzo dobre odczyty aktywności immunologicznej D. melanogaster indukowanej głównie odpowiednio przez szlaki Imd i Toll. W celu kontrolowania zmienności plonowania RNA między próbkami i skuteczności odwrotnej transkrypcji, należy ustandaryzować zarejestrowaną ekspresję genów docelowych w stosunku do referencyjnego genu porządkowego, którego ekspresja nie powinna ulec zmianie wraz z infekcją, takiego jak rp49 (znany również jako rpL32).
    5. Przeanalizuj dane.
      1. W celu przybliżenia różnic ekspresji należy obliczyć stosunek wartości ilości wyjściowej (SQ) uzyskanej z badanego genu (np. dipterycyny A) w stosunku do wartości SQ uzyskanej z genu odniesienia (np. rp49) dla każdej próbki (obliczonej jako SQ-DptA/SQ-rp49). Przeskaluj te współczynniki do podstawowego leczenia kontrolnego, takiego jak kontrola niezakażona. Arbitralnie ustaw poziom wyrażenia kontrolnego równy 1,0 i wizualizuj eksperymentalne zabiegi jako względne zmiany krotności. Oszacuj wartość SQ dla każdego genu w stosunku do krzywej wzorcowej wygenerowanej z serii rozcieńczeń cDNA o znanej ilości.
        UWAGA: Analiza statystyczna wskaźników może być skomplikowana, dlatego to podejście jest lepsze do szybkiego przybliżenia niż do analizy rygorystycznej. Jeśli wydajność PCR jest niska, zaprojektuj nowe startery, aby poprawić kinetykę PCR, jeśli to możliwe. W przypadku reakcji qPCR o wydajności bliskiej idealnej (podwojenie iloczynu PCR w każdym cyklu) wartość SQ można zastąpić cyklem progowym (CT).
      2. W przypadku prostych eksperymentów z optymalnie wydajnym wzmocnieniem dane mogą być analizowane przy użyciu metody ΔΔCT. 19 Dla każdej próbki należy odjąć wartość CT genu odniesienia (np. rp49) od CT badanego genu (np. dipterycyny A), aby otrzymać ΔCT. Następnie odejmuje się ΔCT podstawowej kontroli od ΔCT dla każdej próbki doświadczalnej, aby uzyskać wartość ΔΔCT dla każdej próbki; ten ΔΔCT wskazuje na względne różnice w poziomach ekspresji genów między zabiegami, gdzie 2(-ΔΔCT) przybliża zmianę krotności ekspresji.
        UWAGA: Ta analiza może źle oszacować zmianę krotności ekspresji genu docelowego, jeśli PCR genu testowego lub genu referencyjnego ma niską skuteczność.
      3. W celu uzyskania najbardziej rygorystycznej analizy należy przeprowadzić analizę wariancji (ANOVA) przy użyciu szacowanej ekspresji badanego genu (np. Diptericyny A) jako zmiennej odpowiedzi i szacowanej ekspresji genu kontrolnego (np. rp49) oraz innych czynników eksperymentalnych jako zmiennych objaśniających.
        UWAGA: To podejście jest stosunkowo odporne na nieefektywność amplifikacji PCR i umożliwia analizę bardziej skomplikowanych projektów eksperymentalnych.

Wyniki

Ta sekcja przedstawia wyniki, jakie można uzyskać po infekcji bakteryjnej Drosophila melanogaster. Rysunek 1 pokazuje, że dawka infekcyjna zmienia się wraz z gęstością optyczną zawiesiny bakteryjnej użytej do iniekcji, a dostarczoną dawkę można wiarygodnie oszacować poprzez homogenizację i wysiew much bezpośrednio po iniekcji. Jak zilustrowano na Rysunku 2, różne patogeny mogą powodować różny poziom śmiertelności gospodarza (Rysunek 2A), a śmiertelność gospodarza może być zależna od dawki (Rysunek 2B). Co istotne, niniejszy protokół pozwala na uzyskanie różnych typów infekcji: Providencia rettgeri może wywołać przewlekłą, subletalną infekcję, która utrzymuje się przez 20 dni lub dłużej (Rysunek 3A). Jednak inne bakterie, takie jak Escerichia coli, są w większości eliminowane przez muchę-gospodarza w ciągu sześciu godzin po infekcji (Rysunek 3B). Indukcję układu odpornościowego można oszacować poprzez izolację RNA i następną qRT-PCR transkryptów peptydów przeciwbakteryjnych (Rysunek 4A i B). Analogicznie, choć w sposób mniej ilościowy, do wizualizacji indukcji układu odpornościowego można wykorzystać muchy wykazujące ekspresję GFP pod kontrolą promotorów genów peptydów przeciwdrobnoustrojowych (Rysunek 4C).

figure-results-1
Rysunek 1: Wyznaczanie dawki zakaźnej. Muchom wstrzyknięto 50 nl zawiesin bakteryjnych o różnych gęstościach optycznych (0,0001 - 0,05). Muchy natychmiast poddano homogenizacji i wysiano na płytki w celu oznaczenia liczby bakterii wprowadzonych podczas wstrzykiwania. Początkowa liczba bakterii jest silnie skorelowana z początkową wstrzykniętą gęstością optyczną (r2 = 0,96)

figure-results-2
Rysunek 2: Przeżywalność po wstrzyknięciu patogenów bakteryjnych. Samcom w wieku od pięciu do siedmiu dni wstrzyknięto 50 nl zawiesiny bakteryjnej lub medium sterylnego, a następnie monitorowano ich przeżywalność. (A) Muchom typu dzikiego wstrzyknięto około 5 000 bakterii jednego z trzech różnych gatunków. Tempo śmiertelności gospodarza w znacznym stopniu zależy od gatunku bakterii użytego do zakażenia. (B) Muchom typu dzikiego wstrzyknięto trzy różne dawki Enterococcus faecalis – 50, 500 i 5 000 bakterii na muchę. Muchy giną szybciej przy zakażeniu wyższymi dawkami zakaźnymi. (C) Mutantowi układu odpornościowego oraz jego izogenicznej linii kontrolnej typu dzikiego wstrzyknięto około 500 Burkholderia cepacia. Porównanie parzyste testem Log-Rank wykazuje, że mucha typu dzikiego znacznie lepiej przeżywa zakażenie niż mutant (χ2 = 59,02, df = 1, p <0,0001).

figure-results-3
Rysunek 3: Obciążenie bakteryjne po wstrzyknięciu. Muchom wstrzyknięto około (A) 5 000 P. rettgeri (B) 3 400 E. coli. Obciążenie bakteryjne oznaczano bezpośrednio po wstrzyknięciu oraz w różnych późniejszych punktach czasowych. Każdy punkt danych reprezentuje obciążenie bakteryjne pojedynczej muchy. E. coli jest szybko eliminowana z organizmów gospodarzy, podczas gdy P. rettgeri utrzymuje się przez resztę życia gospodarza.

figure-results-4
Rycina 4: Indukcja ekspresji genów odpornościowych po iniekcji. (A) Muchy wstrzyknięto 50 nl z P. rettgeri lub sterylny PBS do jamy brzusznej lub klatki piersiowej, lub pozostały niepoddane manipulacji, z wyjątkiem podania CO2 znieczulenie. Sześć godzin po zakażeniu much pobrano do izolacji RNA i analizy ekspresji Dipterycyna A ekspresję genu określono za pomocą qRT-PCR.A) Poziomy ekspresji przedstawiono na wykresie jako stosunek Dipterycyna A transkrypcja do rp49 transkrypcji i przeskalowane tak, aby współczynnik CO2 Kontrolę definiuje się jako posiadającą poziom ekspresji równy 1. Słupki przedstawiają średnią oraz błąd standardowy stosunków dla każdego stanu (n = 4).B) Poziomy ekspresji przedstawiono na wykresie jako 2ΔΔtomografia komputerowa z przeciętnym CT wartość z CO2 muchy kontrolne z kontrolowaną znieczuleniem, wykorzystane jako standardowy stan nieindukowany. Słupki przedstawiają średnią i błąd standardowy ΔΔCT z każdego stanu (n = 4). Chociaż nie stwierdzono różnic w indukcji transkrypcyjne zależnych od miejsca iniekcji, porównanie paneli A i B pokazuje, w jaki sposób ΔΔCT metoda ta może potencjalnie prowadzić do przeszacowania poziomów indukcji. (C) Muchy wykazujące ekspresję GFP pod kontrolą Dipterycyna A do promotora wstrzyknięto 50 nl z *P. rettgeri* (OD = 0,1), a następnie wykonano obrazowanie po 7 dniach. Panel GFP pokazuje ekspresję GFP w ciałku tłuszczowym odwłoka zainfekowanych much, co wskazuje na aktywację Dyptyrycyna A promotor w muchach zainfekowanych bakteriami, ale nie w kontrolach wstrzykniętych pożywką.

GenWprowadzenieOdwrócenie
rp49 (zwany również rpL32)5’ AGGCCCAAGATCGTGAAGAA 3’5’ GACGCACTCTGTTGTCGATACC 3’
Dipterycyna A5’ GCGGCGATGGTTTTGG 3’5’ CGCTGGTCCACACCTTCTG 3’
Drozomycyna5’ CTGCCTGTCCGGAAGATACAA 3’5’ TCCCTCCTCCTTGCACACA 3’
Defensyna 5’ GAGGATCATGTCCTGGTGCAT 3’5’ TCGCTTCTGGCGGCTATG 3’
Attacyna A5’ CGTTTGGATCTGACCAAGG 3’5’ AAAGTTCCGCCAGGTGTGAC 3’
Metchnikowan5’ AACTTAATCTTGGAGCGATTTTTCTG 3’5’ ACGGCCTCGTATCGAAAATG 3’

Tabela 1: Startery do qRT-PCR.

Dyskusja

Opisana tutaj procedura daje rygorystyczne i wysokiej jakości zakażenie Drosophila melanogaster. Zilustrowane przykłady koncentrowały się przede wszystkim na zakażeniu Providencia rettgeri i E. coli, ale protokół jest wysoce elastyczny i może być stosowany do zakażeń różnymi bakteriami w różnych warunkach hodowli i utrzymania gospodarza.

Szczegóły optymalnego podejścia eksperymentalnego będą zależeć od bakterii użytej do infekcji, genotypu gospodarza i ogólnych warunków eksperymentalnych. Zdecydowanie zaleca się przeprowadzenie testów pilotażowych wszelkich nowych warunków eksperymentalnych przed rozpoczęciem bardziej ambitnych projektów. Dobrym punktem wyjścia jest przetestowanie trzech dawek infekcji w 100-krotnym zakresie. Wysoce zjadliwe patogeny są często najlepiej wprowadzane w bardzo niskich dawkach zakaźnych, rzędu 10 - 100 komórek bakteryjnych na muchę. Bardziej umiarkowane patogeny mogą być wstrzykiwane w wyższych dawkach około 1000 bakterii na muchę, a niepatogeny mogą być wstrzykiwane w dawkach nawet 10 000 bakterii na muchę. Często pouczające jest zdefiniowanie kinetyki nowych infekcji poprzez śledzenie obciążenia patogenami, śmiertelności gospodarza i aktywności układu odpornościowego w podłużnych szeregach czasowych. Ponieważ pomiar obciążenia patogenem i ekspresji genów gospodarza są testami destrukcyjnymi, konieczne jest zakażenie odrębnych much na początku eksperymentu dla każdego punktu czasowego, który ma być mierzony.

Podejmując decyzję, czy zastosować iniekcję szpilkową, czy mikrokapilę, należy pamiętać, że każde podejście ma zalety i ograniczenia. Wstrzyknięcie kapilarne wprowadza do muchy objętość cieczy, która zarówno nieznacznie zwiększa ciśnienie turgoru, jak i wprowadza sole lub inne cząsteczki, które są zawieszone lub rozpuszczone w nośniku. Iniekcja kapilarna wymaga również dostępu do zakładu iniekcyjnego lub zakupu wymaganego sprzętu. Szpilka septyczna nie wymaga specjalnego sprzętu i wprowadza znikome podłoże do muchy i jest zazwyczaj bardziej skuteczna w infekowaniu dużej liczby much. Jednak infekcje po ukłuciu szpilkami nie pozwalają na precyzyjną kontrolę dawki infekcji, którą można osiągnąć za pomocą iniekcji kapilarnej. Obecny protokół koncentrował się na aparacie iniekcyjnym, który mechanicznie reguluje objętość wtrysku, ale istnieją również systemy iniekcyjne oparte na dyskretnych impulsach sprężonego powietrza. 20,21 Są one zazwyczaj droższe niż przedstawione tutaj urządzenia i wymagają kalibracji impulsu powietrza do każdej igły w celu zapewnienia stałych objętości wstrzyknięć.

Toczy się poważna dyskusja, ale bardzo mało danych na temat tego, w jaki sposób muchy stają się ogólnoustrojowo zakażone bakteriami na wolności. Niektórzy badacze twierdzą, że większość naturalnych infekcji występuje, gdy Drosophila połyka bakterie chorobotwórcze, a bakterie są następnie w stanie uciec z jelit, aby wywołać infekcję ogólnoustrojową. Jednak istnieje bardzo niewiele bakterii, o których wiadomo, że są w stanie przekroczyć jelito D. melanogaster, a te, które mają tę zdolność, są wysoce śmiertelne dla much22,23. Alternatywną teorią jest to, że muchy regularnie doznają uszkodzeń kutykularnych poprzez ucieczkę przed nieudanymi próbami drapieżnictwa lub atak roztoczy ektorazytów. Hipoteza ta jest wspierana przez częste zbieranie dzikich D. melanogaster zawierających plamy melanizacji, które wskazują na zagojone rany (obserwacje niepublikowane). Wykazano, że roztocza przenoszą infekcje bakteryjne u Drosophila24 , a rany pozostawione przez roztocza mogą być wtórnie zakażone przez bakterie u pszczół miodnych25. Jednak częstość występowania zakażenia D. melanogaster przez roztocza lub w inny sposób oportunistycznego poprzez naruszenie naskórka nie jest znana. Opisany tutaj protokół pozwala na wprowadzenie bakterii bezpośrednio do hemolimfy poprzez ilościowe wstrzyknięcie, które omija wszelkie bariery nabłonkowe lub odporność behawioralną. Metody podawania bakterii chorobotwórczych do D. melanogaster opisano w Vodovar i wsp.22 oraz Nehme i wsp.Lokal mieszkalny 23.

Wiele bakterii entomopatogenicznych stanowi niewielkie lub żadne zagrożenie dla zdrowia ludzkiego, co pozwala naukowcom na wygodną pracę z nimi. Co więcej, bardzo niewiele bakterii ma zdolność do zakażania Drosophila w kontakcie bez interwencji eksperymentalnej, więc ryzyko "epidemicznego" rozprzestrzeniania się infekcji bakteryjnej w laboratorium za pośrednictwem skażonych powierzchni lub zbiegłych much jest na ogół bardzo niskie. Niemniej jednak wskazane jest zapewnienie odpowiednich środków ograniczających rozprzestrzenianie się wirusa, aby zapobiec ucieczce zakażonych much i odłowieniu wszelkich zbiegłych much. Laboratorium powinno być wyposażone w poziom bezpieczeństwa biologicznego współmierny do poziomu stosowanych czynników chorobotwórczych oraz powinny być stosowane standardowe najlepsze praktyki w dziedzinie mikrobiologii.

Opisana tutaj eksperymentalna metoda infekcji pozwala na zakażenie Drosophila melanogaster dowolną dawką dowolnej bakterii. Po ustaleniu infekcji łatwo jest zmierzyć kinetykę namnażania się lub usuwania bakterii, śledzić śmiertelność gospodarza i testować indukcję układu odpornościowego gospodarza. Zakażone muchy mogą być łatwo poddane innym testom fenotypowym, w tym testom funkcji fizjologicznych, które mogą kształtować się lub być kształtowane przez infekcję. Opisane procedury są niedrogie, wymagają stosunkowo niewielkiego specjalistycznego sprzętu i są łatwe do nauczenia, dzięki czemu można je stosować w różnych projektach w różnych laboratoriach badawczych i dydaktycznych.

Oświadczenia

Żaden z autorów nie ma sprzecznych interesów ani sprzecznych interesów.

Podziękowania

Chcielibyśmy podziękować całemu laboratorium Lazzaro, a szczególnie Susan Rottschaefer, za pomoc zarówno w przeglądzie, jak i testowaniu tych protokołów. Jest to wynik ich skumulowanej wiedzy specjalistycznej. Prace w laboratorium Lazzaro są wspierane przez granty R01 AI083932 i R01 AI064950 z amerykańskich Narodowych Instytutów Zdrowia.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
InkubatorPowers Scientific, IncDROS52SD
Pędzel
CO2 FlypadsFlyStuff59-114
CO2AirgasCD FG50
Mieszanka hodowlana Drosophila 
Butelki z kwadratowym dnem o pojemności 6 uncji, polipropylenGenesee Scientific32-130
Nosterile Extra Large Bawełniane kulkimarki Fisher22-456-882
MikroskopOlympus CorporationFIOLKI SZ51
Drosophila polistyrenVWR international89092-720
Nosterylne duże wacikiMarka Fisher22-456-883
Kolba 2 LVWR international89000-370
Szalki Petriego z przezroczystymi pokrywkami, podniesiony grzbiet; 100 x 15 mm;VWR international25384-302
LB Agar, MillerDifco244520
Pętla do wnoszeniaVWR international80094-488
Pipety klasyczne Rainin w różnych rozmiarach
0,1 i mikro; l do 2 i mikro; L,
2 & mikro; l do 20 i mikro; L,
20 i mikro; l do 200 i mikro; L,
100 & mikro; l do 1,000 &mikro; l		Końcówki doPR-2
PR-20
PR-200
PR-1000
różne rozmiary)VWR international30128-376
53503-810
16466-008
Baza bulionowa Luria, MillerDifco241420
Jednorazowe probówki hodowlane Szkło borokrzemianoweVWR international47729-576
S-500 Orbital WytrząsarkaVWR international14005-830
WirówkaVWR international37001-300
PBS pH 7,4 10XInvitrogen70011044
SmartSpec 3000 SpektrofotometrBio-Rad170-2501
Kuwety półmikroobjętościoweBio-Rad223-9955
Pionowy ściągacz kapilarnyIgła Kopf Ściągacz
3,5'' Wymienne szklane kapilary do Nanojet IIDrummond Sientific Company3-000-203-G/X
Nanoject IIDrummond Sientific Company3-000-204
KleszczeFine Science Tools11255-20
10 ml StrzykawkaBD309604
Olej mineralny, biały, jasnyMacron Chemikalia wysokowartościowe6358-10
SzpilkiMinutein Fine Science Tools26002-10
1,5 ml  Probówki do mikrowirówek; Seal RiteUSA Scientific Inc.1615-5500
Zmotoryzowany tłuczek; Mieszadło laboratoryjne TalboysTroemner103
Talboys Homogenizator o wysokiej przepustowościOPS Diagnostyka 930145
Kule szlifierskie 5/32 ''Diagnostyka OPSGBSS 156-5000-01
Vortex GenieInnowacje naukowe inc.G560
(10 μ l - 300 μ l)Sartorius730360
WASP2 Whitley Automated Spiral PlaterMicrobiology International
ProtoCOL automatyczny licznik kolonii / licznik płytek / czytnik płyt Microbiology International
TRIzolLife Technologies15596-026
probówki qPCR; Niskoprofilowe paski z 8 probówkami 0,2 mlBio-RadTLS0801
kapsułki qPCR; Optyczne płaskie paski z 8 nasadkamiBio-RadTCS0803
RQ1 Bez RNaz DNazaPromegam610a
M-MLV Odwrotna transkryptazaPromegam170b
dNTPsPromegaU1240
Oligo-dTIDT
  SsoAdvanced SYBR Green SupermixBio-Rad172-5260
CFX Connect System wykrywania PCR w czasie rzeczywistymBio-Rad185-5200
Inhibitor rybonukleazy RNasinPromegaN2115
mikropipet Rainin (do pipetPipetor wielokanałowy

Bibliografia

  1. Lemaitre, B., Hoffmann, J. The host defense of Drosophila melanogaster. Annual review of immunology. 25, 697-743 (2007).
  2. Dionne, M. S., Schneider, D. S. Models of infectious diseases in the fruit fly Drosophila melanogaster. Disease models & mechanisms. 1 (1), 43-9 (2008).
  3. Rutschmann, S., Jung, A. C., Hetru, C., Reichhart, J. M., Hoffmann, J. A., Ferrandon, D. The Rel protein DIF mediates the antifungal but not the antibacterial host defense in Drosophila. Immunity. 12 (5), 569-580 (2000).
  4. Ayres, J. S., Freitag, N., Schneider, D. S. Identification of Drosophila mutants altering defense of and endurance to Listeria monocytogenes infection. Genetics. 178 (3), 1807-1815 (2008).
  5. Cronin, S. J. F., et al. Genome-wide RNAi screen identifies genes involved in intestinal pathogenic bacterial infection. Science. 325 (5938), 340-343 (2009).
  6. Neyen, C., Bretscher, A. J., Binggeli, O., Lemaitre, B. Methods to study Drosophila immunity. Methods. , (2014).
  7. Dionne, M. S., Pham, L. N., Shirasu-Hiza, M., Schneider, D. S. Akt and FOXO dysregulation contribute to infection-induced wasting in Drosophila. Current biology CB. 16 (20), 1977-1985 (2006).
  8. McKean, K. a, Yourth, C. P., Lazzaro, B. P., Clark, A. G. The evolutionary costs of immunological maintenance and deployment. BMC evolutionary biology. 8 (1), 76(2008).
  9. Kuo, T. -H., Pike, D. H., Beizaeipour, Z., Williams, J. A. Sleep triggered by an immune response in Drosophila is regulated by the circadian clock and requires the NFkappaB Relish. BMC neuroscience. 11, 17(2010).
  10. Panayidou, S., Ioannidou, E., Apidianakis, Y. Human pathogenic bacteria, fungi, and viruses in Drosophila: disease modeling, lessons, and shortcomings. Virulence. 5 (2), 253-269 (2014).
  11. Keebaugh, E. S., Schlenke, T. A. Insights from natural host–parasite interactions: The Drosophila model. Developmental & Comparative Immunology. 42 (1), 111-123 (2014).
  12. Howick, V. M., Lazzaro, B. P. Genotype and diet shape resistance and tolerance across distinct phases of bacterial infection. BMC evolutionary biology. 14 (1), 56(2014).
  13. Babin, A., Kolly, S., Kawecki, T. J. Virulent bacterial infection improves aversive learning performance in Drosophila. Brain, behavior, and immunity. , (2014).
  14. Chambers, M. C., Song, K. H., Schneider, D. S. Listeria monocytogenes infection causes metabolic shifts in Drosophila melanogaster. PLoS ONE. 7 (12), e50679(2012).
  15. Fellous, S., Lazzaro, B. P. Larval food quality affects adult (but not larval) immune gene expression independent of effects on general condition. Molecular ecology. 19 (7), 1462-1468 (2010).
  16. Stone, E. F., Fulton, B. O., Ayres, J. S., Pham, L. N., Ziauddin, J., Shirasu-Hiza, M. M. The circadian clock protein timeless regulates phagocytosis of bacteria in Drosophila. PLoS pathogens. 8 (1), e1002445(2012).
  17. Chambers, M. C., Jacobson, E., Khalil, S., Lazzaro, B. P. Thorax injury lowers resistance to infection in Drosophila melanogaster. Infection and immunity. , (2014).
  18. Rich, J. T., Neely, J. G., Paniello, R. C., Voelker, C. C. J., Nussenbaum, B., Wang, E. W. A practical guide to understanding Kaplan-Meier curves. Otolaryngology--head and neck surgery official journal of American Academy of Otolaryngology-Head and Neck Surgery. 143 (3), 331-336 (2010).
  19. Freeman, W. H. Biometry. , (1995).
  20. Frydman, H. Wolbachia bacterial infection in Drosophila. Journal of visualized experiments JoVE. (2), 158(2007).
  21. Kuo, T. -H., Handa, A., Williams, J. A. Quantitative measurement of the immune response and sleep in Drosophila. Journal of visualized experiments JoVE. (70), e4355(2012).
  22. Vodovar, N., et al. Drosophila host defense after oral infection by an entomopathogenic Pseudomonas species. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (32), 11414-11419 (2005).
  23. Nehme, N. T., et al. A model of bacterial intestinal infections in Drosophila melanogaster. PLoS pathogens. 3 (11), e173(2007).
  24. Jaenike, J., Polak, M., Fiskin, A., Helou, M., Minhas, M. Interspecific transmission of endosymbiotic Spiroplasma by mites. Biology. 3 (1), 23-25 (2007).
  25. Kanbar, G., Engels, W. Ultrastructure and bacterial infection of wounds in honey bee ( Apis mellifera) pupae punctured by Varroa mites. Parasitology research. 90 (5), 349-354 (2003).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Zaka enie systemicznenanowtryskiwaczmonitorowanie miertelno cipomiar adunku patogenugeny peptyd w antybakteryjnychilo ciowe okre lanie odpowiedzi immunologicznejmanipulacja genetycznaprocedura eksperymentalna
Ogólnoustrojowe infekcje bakteryjne i fenotypy obrony immunologicznej u Drosophila melanogaster
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.