Artykuł metodologiczny

Badanie dyskryminacji i habituacji zapachowej u myszy

18.1K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/52615

⸱

5 maja 2015

 ,  ,  , 
1Institute of Biomedical Studies, Baylor University, 2Department of Psychology and Neuroscience, Baylor University

W tym artykule

Podsumowanie

Ten manuskrypt opisuje protokół badania układu węchowego gryzoni. Test przyzwyczajenia/dezhabituacji węchowej pozwoli badaczom określić, czy mysz przyzwyczaja się do wielokrotnie prezentowanego zapachu i czy mysz wykazuje nieprzyzwyczajenie, gdy przedstawia się jej nowy zapach.

Streszczenie

Ten film demonstruje technikę ustalania obecności normalnie funkcjonującego układu węchowego u myszy. Test pomaga określić, czy mysz potrafi odróżnić zapachy niespołeczne od zapachów społecznych, czy mysz przyzwyczaja się do wielokrotnie prezentowanego zapachu i czy mysz wykazuje nieprzyzwyczajenie, gdy ma do czynienia z nowym zapachem. Ponieważ wiele testów zachowań społecznych mierzy reakcję zwierzęcia doświadczalnego na znaną lub nową mysz, można uniknąć wyników fałszywie dodatnich, ustalając, że zwierzęta mogą wykrywać i rozróżniać zapachy społeczne. Podobne rozważania istnieją w testach uczenia się, takich jak warunkowanie strachu, które wykorzystują zapach do tworzenia nowego środowiska lub sygnały węchowe jako bodziec asocjacyjny. Deficyty w układzie węchowym upośledzają zdolność rozróżniania kontekstów i tworzenia skojarzeń z wskazówką węchową podczas warunkowania strachu.

W teście zamieszkiwania/przyzwyczajania zapachu, mysz wielokrotnie doświadcza kilku zapachów. Każdy zapach jest prezentowany trzy razy przez dwie minuty. Badacz rejestruje czas wąchania skierowany w stronę zapachu jako miarę reakcji węchowej. Typowa mysz wykazuje zmniejszenie reakcji na zapach przy powtarzających się prezentacjach (przyzwyczajenie). Następnie eksperymentator prezentuje nowy zapach, który wywołuje zwiększone wąchanie w kierunku nowego zapachu (przyzwyczajenie). Po wielokrotnym zaprezentowaniu nowego zapachu zwierzę ponownie wykazuje przyzwyczajenie. Protokół ten obejmuje prezentację wody, dwóch lub więcej zapachów niespołecznych i dwóch zapachów społecznych. Oprócz zmniejszenia eksperymentalnych zakłóceń, test ten może dostarczyć informacji na temat funkcji układów węchowych nowych linii myszy z nokautem, nokautem i warunkowym nokautem.

Wprowadzenie

Myszy są zależne od węchu w poruszaniu się po nowych środowiskach, znajdowaniu pożywienia, rozpoznawaniu innych osobników i zachowaniach seksualnych1-3. Istotne jest, aby badacze ustalili, czy zwierzęta doświadczalne mają funkcjonujący zmysł węchu przed przeprowadzeniem testów behawioralnych, które obejmują jedzenie, interakcje społeczne lub jakiekolwiek zapachy mające na celu wywołanie reakcji myszy. Anosmia lub niezdolność do rozróżnienia różnych zapachów może skutkować fałszywie dodatnimi lub ujemnymi wynikami w wielu różnych paradygmatach behawioralnych, dlatego zdolność myszy do wykrywania i rozróżniania zapachów powinna zostać ustalona przed wykonaniem innych rodzajów testów behawioralnych.

Test węchowego przyzwyczajenia/dezhabituacji został po raz pierwszy opisany w latach 80.4. Test został zaadaptowany do stosowania u myszy przez dr Mu Yang i dr Jacqueline Crawley5. Jest to prosty i niedrogi test, który pozwala badaczowi ustalić, że mysz może wykrywać i rozróżniać zapachy. Oprócz testowania węchu, test ten pozwala badaczowi obserwować ogólne zachowanie myszy i powinien być wykonany na wczesnym etapie schematu testowego. Obserwacje jakościowe dotyczące lokomocji myszy, oznak lęku, poziomu aktywności i reakcji na zapachy społeczne w porównaniu z zapachami żywności mogą sygnalizować nowe obszary, w których można przeprowadzić testy.

W tym teście, waciki zanurzone w różnych zapachach są prezentowane myszy trzy razy z rzędu. Z każdą powtarzającą się prezentacją zapachu mysz przyzwyczai się do wacika, spędzając mniej czasu na jego badaniu przy każdej kolejnej prezentacji. Kiedy prezentowany jest nowy zapach, następuje przyzwyczajenie, a typowa mysz spędza więcej czasu na badaniu wacika, co wskazuje, że może rozróżnić obecne i poprzednie zapachy5. Ten test jest podawany jednej myszy na raz i obejmuje 45-minutowy okres aklimatyzacji, po którym następuje 45-minutowy test.

Chociaż ten test jest łatwy do przeprowadzenia, może być używany do badania skomplikowanych pytań dotyczących układu węchowego myszy. Inne popularne testy węchu, takie jak test zakopanego pokarmu, po prostu ustalają obecność lub brak anosmii. Jednak test dyskryminacji węchowej i przyzwyczajenia pozwala badaczowi ustalić, że mysz nie tylko ma zdolność wykrywania zapachów, ale może rozróżniać różne zapachy. Wzorzec habituacji i dezhabituacji został wykorzystany do ustalenia, że nowe mutanty mogą rozróżniać zapachy6,7. W zaskakującym badaniu Fadool i jego współpracownicy wykorzystali złożone mieszaniny zapachów, aby pokazać, że myszy z genową delecją kanału Kv1.3 są "super węchowcami", którzy mogą rozróżniać bardzo podobne zapachy lepiej niż normalne myszy8.

Podczas badania nowego modelu myszy nokautującej warto ustalić obecność normalnego zachowania dla podstawowych zadań sensorycznych. Test dyskryminacji i przyzwyczajenia zapachu, wykonywany na wczesnym etapie schematu testowego, daje badaczowi możliwość zaobserwowania wszelkich nietypowych zachowań. Obserwacje te mogą zapobiec fałszywie dodatnim lub ujemnym wynikom w kolejnych testach, które można przypisać mylącym cechom mutanta. W miarę jak naukowcy kontynuują badania zachowań społecznych, potrzeba weryfikacji podstawowych funkcji węchowych staje się coraz ważniejsza. Oprócz badania węchu w liniach zmutowanych, test ten może być wykorzystany do odpowiedzi na konkretne pytania, takie jak to, czy leczenie farmakologiczne specyficznie zwiększa reakcję zwierzęcia na społeczne bodźce zapachowe, czy też ich reakcja zwiększa się na wszystkie bodźce zapachowe.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Dorosłe samce myszy wykorzystane w poniższym eksperymencie zostały wygenerowane i umieszczone na Uniwersytecie Baylor w temperaturze otoczenia 22 °C, z 14-godzinnym jasnym i 10-godzinnym ciemnym (od 20:00 do 6:00) cyklem dobowym. Myszom zapewniono ad libitum dostęp do pożywienia i wody. Wszystkie procedury na myszach były zgodne z wytycznymi National Institutes of Health dotyczącymi opieki i wykorzystania zwierząt laboratoryjnych, a protokół na zwierzętach został zatwierdzony przez Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu Baylor. Myszy testowano późnym rankiem/wczesnym popołudniem. W przypadku wszystkich poniższych procedur badacz powinien nosić rękawice, aby wyeliminować zapachy i zapobiec zanieczyszczeniu.

1. Przygotowanie zapachów niespołecznych

  1. Przygotuj świeże, niespołeczne zapachy każdego dnia testów.
    Uwaga: Badacz powinien używać rękawiczek do przygotowania zapachów.
    1. Napełnij 3 probówki wirówkowe po 10 ml wody.
    2. Odmierzyć pipetą 100 μl ekstraktu z bananów do stożkowej probówki o pojemności 15 ml, a następnie 100 μl ekstraktu z migdałów do drugiej stożkowej probówki o pojemności 15 ml w stosunku 1:100.
      Uwaga: Trzecia tubka o pojemności 15 ml będzie zawierała tylko wodę.

2. Przygotowanie zapachów społecznych

  1. Przygotuj świeże zapachy społeczne rano, gdy odbędą się testy. Uzyskaj zapachy społeczne z dwóch klatek, które nie były czyszczone przez co najmniej trzy dni i zawierają równą liczbę myszy. Uzyskaj zapachy społeczne od myszy tej samej płci co badany.
    Uwaga: Są one przechowywane w temperaturze pokojowej i powinny być zużyte w ciągu 4-6 godzin, aby utrzymać silny i stały zapach.
    1. Określ, ile wacików bawełnianych o zapachach społecznych należy utworzyć: każda testowana mysz otrzyma trzy waciki z zapachu społecznego 1 i trzy z zapachu społecznego 2.
    2. Przygotuj zapachy towarzyskie, przecierając wacikiem zygzakowaty spód brudnej klatki. Strząśnij nadmiar pościeli przylegającej do końcówki.
    3. Waciki należy przechowywać w dużych szklanych słoikach z pokrywkami lub w zlewkach pokrytych parafilmem. Wyznacz jeden pojemnik na zapach społeczny 1, a drugi na zapach społeczny 2.
  2. Utrzymuj klatki ze źródłem zapachów poza pomieszczeniem do badań eksperymentalnych.

3. Aklimatyzacja myszy testowej

  1. Załóż rękawiczki i zważ mysz, która ma być testowana, a następnie umieść ją pojedynczo w czystej klatce z drucianą pokrywką na górze i wyjmij butelkę z wodą.
  2. Pozwól myszy zaaklimatyzować się w nowej klatce przez 45 minut w pomieszczeniu innym niż pomieszczenie do testów. Upewnij się, że w pomieszczeniu nie ma nietypowych zapachów ani dźwięków.
  3. Ponieważ testowanie trwa około 45 minut, rozłoż czas aklimatyzacji, umieszczając następną mysz do testowania w czystej klatce, aby zaaklimatyzować się tuż przed testowaniem obecnej myszy.

4. Przygotowanie pokoju testowego

  1. W pomieszczeniu testowym umieść świeże waciki, taśmę laboratoryjną, butelki zawierające waciki do usuwania zapachów społecznych, probówki z zapachami niespołecznymi, mikropipetę, dwa timery i butelkę na odpady z pokrywką.
  2. Upewnij się, że pomieszczenie testowe jest w miarę wolne od zapachów, głośnych dźwięków i jasnego światła. Nie używaj pachnących wód kolońskich ani balsamów.
    Uwaga: Obserwator nie powinien żuć gumy ani słodyczy w okresie testowania i powinien starać się ograniczyć narażenie na pokarmy o silnym zapachu.

5. Procedura testowa

  1. Przynieś zaaklimatyzowaną mysz w klatce do pomieszczenia testowego i umieść klatkę na blacie na wysokości wygodnej do oglądania w pozycji siedzącej.
  2. Prezentuj każdy zapach 3 razy z rzędu przez 2 minuty za każdym razem. Użyj kolejności prezentacji, która znajduje się w tabeli 1.
    1. Odpipetuj 50 μl środka zapachowego w zapachu, który ma być przetestowany, na końcówce bawełnianego wacika i ponownie zakryj źródło zapachu. Podnieś drucianą górną część klatki i włóż bezzapachowy, drewniany koniec wacika do otworu butelki z wodą, przepychając długość od spodu drutu do góry. Unikaj dotykania bawełnianej końcówki czymkolwiek, w tym palcami, aby uniknąć zanieczyszczenia zapachem.
    2. Kontynuuj przeciąganie wacika przez otwór butelki z wodą, aż około 1 cal bawełnianego końca zwisa z klatki. Przymocuj drewniany koniec wacika z boku klatki za pomocą taśmy laboratoryjnej.
      Uwaga: Uważaj, aby pokrywka nie opadła z powrotem na klatkę, powodując głośny dźwięk, który przeszkadzałby myszy testowej.
    3. Natychmiast rozpocznij odmierzanie czasu na 2 minuty. Użyj jednego timera, aby określić czas 2-minutowej prezentacji. Zapisz łączny czas spędzony na wąchaniu zapachu podczas 2-minutowej próby. Policz zachowanie węchowe zwierzęcia za pomocą osobnego stopera. Aktywne wąchanie definiuje się, gdy nos zwierzęcia jest skierowany w stronę bawełnianej końcówki, a nos ~2 cm lub bliżej końcówki.
    4. Po zakończeniu każdej próby podnieś drucianą pokrywę i wyjmij bawełniany wacik, pociągając go w dół przez spód pokrywki (pozwala to uniknąć zanieczyszczenia zapachem, zapobiegając dotykaniu drutu przez bawełnianą końcówkę). Zamknij zużyty wacik w butelce na odpady o pojemności 500 ml.
    5. Przygotuj i włóż następny wacik i rozpocznij odmierzanie czasu. Należy odczekać około 1 minuty między kolejnymi przerwami. Kontynuuj, aż każdy zapach zostanie zaprezentowany trzy razy z rzędu, za każdym razem przez 2 minuty.
  3. Gdy mysz zakończy wszystkie próby, opróżnij butelkę na odpady zawierającą zużyte waciki do kosza na śmieci poza pomieszczeniem testowym. Umieść mysz z powrotem w klatce domowej.

6. Analiza

  1. Przeanalizuj dane dla każdej grupy według stanu zapachu za pomocą dwukierunkowej ANOVA, a następnie Newmana-Keulsa lub podobnego testu post hoc, aby określić znaczące przyzwyczajenie (mniej czasu na wąchanie kolejnych tych samych zapachów) i nienawyk (więcej czasu na wąchanie nowego zapachu).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Zgodnie z opisanym protokołem, wyniki zarejestrowano z udziałem dziesięciu dorosłych (90-120 dzień postnatalny) samców myszy C57BL/6J oraz ośmiu samców szczepu o mieszanym tle genetycznym FVB (50-70 dzień postnatalny). Testy były przeprowadzane przez jednego badacza w ciągu wielu dni. Każdy punkt na wykresach reprezentuje średni czas poświęcony na badanie zapachu.

Kiedy po raz pierwszy wprowadza się nasączony wodą patyczek kosmetyczny, myszy poświęcają dużo czasu na badanie tego nowego obiektu...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Wyniki przedstawione w tym artykule są optymalne dla myszy. Myszy wykazują silną reakcję na nowy zapach, a następnie szybko się przyzwyczajają. Jednym z kluczowych etapów tej metody jest przygotowanie zapachów. Badacz musi dołożyć wszelkich starań, aby odizolować zapachy od siebie, aby zapobiec zanieczyszczeniu. Kolejnym kluczowym aspektem jest prezentacja wacika. Badacz musi rozwiązać problem z najlepszym położeniem bawełnianej końcówki, aby mysz mogła zbadać końcówkę, ale nie rozerwała końcówki. Ważnym elementem badani...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Ta praca jest wspierana przez grant Rady Badawczej Uniwersytetu Baylor oraz przez grant badawczy z Fundacji Epilepsji.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Klatka na myszAllentownStandardowa klatka
Pokrywa drucianaAllentownBCU Mysz WBL 2500
PościelHarlan7090 Sani-Chips
Waciki bawełnianeVWR89031-2706-calowa drewniana rączka
Ekstrakt z bananaMcCormick
Ekstrakt z migdałówMcCormick
Taśma laboratoryjnaVWR89098-062
StoperVWR62374-000
Rękawice nitryloweVWR82026
Urządzenie do pomiaru czasuVWR61161-350
Probówki stożkowe 15 mlVWR89003-294
Zlewki 2 L Pyrex1003
ParafilmParafilmPM-9924" x 250'
Butelka 1 L z nakrętkąVWR89000-240
na mysz

Bibliografia

  1. Doty, R. L. Odor-guided behavior in mammals. Experientia. 42, 257-271 (1986).
  2. Restrepo, D., Arellano, J., Oliva, A. M., Schaefer, M. L., Lin, W. Emerging views on the distinct but related roles of the main and accessory olfactory systems in responsiveness to chemosensory signals in mice. Horm Behav. 46, 247-256 (2004).
  3. Keverne, E. B. Importance of olfactory and vomeronasal systems for male sexual function. Physiol Behav. 83, 177-187 (2004).
  4. Gregg, B., Thiessen, D. D. A simple method of olfactory discrimination of urines for the Mongolian gerbil, Meriones unguiculatus. Physiol Behav. 26, 1133-1136 (1981).
  5. Yang, M., Crawley, J. N. Simple behavioral assessment of mouse olfaction. Curr Protoc Neurosci. Chapter 8 (Unit 8 24), (2009).
  6. Pan, Y. W., Kuo, C. T., Storm, D. R., Xia, Z. Inducible and targeted deletion of the ERK5 MAP kinase in adult neurogenic regions impairs adult neurogenesis in the olfactory bulb and several forms of olfactory behavior. PLoS ONE. 7, e49622(2012).
  7. Wesson, D. W., Levy, E., Nixon, R. A., Wilson, D. A. Olfactory dysfunction correlates with amyloid-beta burden in an Alzheimer's disease mouse model. J Neurosci. 30, 505-514 (2010).
  8. Fadool, D. A., et al. Kv1.3 channel gene-targeted deletion produces 'Super-Smeller Mice' with altered glomeruli, interacting scaffolding proteins, and biophysics. Neuron. 41, 389-404 (2004).
  9. Arakawa, H., Arakawa, K., Blanchard, D. C., Blanchard, R. J. Scent marking behavior in male C57BL/6J mice: sexual and developmental determination. Behav Brain Res. 182, 73-79 (2007).
  10. Baum, M. J. Sexual differentiation of pheromone processing: links to male-typical mating behavior and partner preference. Horm Behav. 55, 579-588 (2009).
  11. Ferguson, J. N., et al. Social amnesia in mice lacking the oxytocin gene. Nat Genet. 25, 284-288 (2000).
  12. Yang, M., et al. Low sociability in BTBR T+tf/J mice is independent of partner strain. Physiol Behav. 107, 649-662 (2012).
  13. Best, J. D., et al. Non-associative learning in larval zebrafish. Neuropsychopharmacology. 33, 1206-1215 (2008).
  14. Wolman, M. A., Jain, R. A., Liss, L., Granato, M. Chemical modulation of memory formation in larval zebrafish. Proc Natl Acad Sci U S A. , (2011).
  15. Sorge, R. E., et al. Olfactory exposure to males, including men, causes stress and related analgesia in rodents. Nat Methods. 11, 629-632 (2014).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Habituacja zapachowauk ad w chowyzapachy spo ecznezapachy niespo ecznezachowanie myszyzachowanie w szeniowetest habituacjidyshabituacjareaktywno w chowa

Powiązane artykuły