Ten artykuł opisuje pomiar funkcji lewej komory myszy za pomocą analizy ciśnienia/objętości przy różnych częstościach akcji serca.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Cewnikowanie serca u myszy w celu pomiaru zależności objętości ciśnienia: badanie efektu Bowditcha
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Stworzono modele zwierzęce, które naśladują ludzkie zaburzenia kardiologiczne, aby przetestować potencjalne strategie terapeutyczne. Kluczowym elementem oceny tych strategii jest zbadanie ich wpływu na czynność serca. Istnieje kilka technik pomiaru mechaniki serca in vivo (np. echokardiografia, relacje ciśnienie/objętość itp.). W porównaniu z echokardiografią, analiza ciśnienia/objętości lewej komory (LV) w czasie rzeczywistym za pomocą cewnikowania jest bardziej precyzyjna i wnikliwa w ocenie funkcji lewej komory. Dodatkowo, analiza ciśnienia/objętości lewej kompresji daje możliwość natychmiastowego rejestrowania zmian podczas manipulacji kurczliwością (np. stymulacja β-adrenergiczna) i patologicznych zniekształceń (np. uszkodzenie niedokrwienne/reperfuzyjne). Oprócz maksymalnej (+dP/dt) i minimalnej (-dP/dt) szybkości zmiany ciśnienia w LV, można uzyskać dokładną ocenę funkcji lewej komory za pomocą kilku wskaźników niezależnych od obciążenia (np. zależność objętości ciśnienia skurczowego na końcu i praca skokowa przy obciążeniu wstępnym). Częstość akcji serca ma znaczący wpływ na kurczliwość lewej komory serca, tak że wzrost częstości akcji serca jest głównym mechanizmem zwiększania pojemności minutowej serca (tj. Efekt Bowditcha). Tak więc, porównując hemodynamikę między grupami eksperymentalnymi, konieczne jest posiadanie podobnego tętna. Ponadto cechą charakterystyczną wielu modeli kardiomiopatii jest zmniejszenie rezerwy skurczowej (tj. zmniejszony efekt Bowditcha). W związku z tym ważne informacje można uzyskać, określając wpływ zwiększenia częstości akcji serca na kurczliwość. Nasze i inne dane wykazały, że neuronalna syntaza tlenku azotu (NOS1) ma zmniejszoną kurczliwość. W tym miejscu opisujemy procedurę pomiaru ciśnienia/objętości lewej komory wraz ze wzrostem tętna przy użyciu modelu myszy nokautującej NOS1.
Wprowadzenie
Celem serca jest pompowanie krwi w całym ciele, aby sprostać wymaganiom metabolicznym organizmu. Ponieważ wymagania te stale się zmieniają (np. podczas ćwiczeń), serce musi się przystosować (tj. zwiększyć pojemność minutową serca). Serce wymyśliło wiele ścieżek, aby dokonać tego wyczynu. Głównym sposobem, w jaki serce to osiąga, jest zwiększenie częstości akcji serca (tj. efekt Bowditcha)1. Oznacza to, że wraz ze wzrostem częstości akcji serca powoduje to wzrost kurczliwości i wzrost pojemności minutowej serca. W związku z tym czynność serca jest w ogromnym stopniu zależna od tętna. Niestety, choroby serca (np. zawał mięśnia sercowego, przerost itp.) skutkują słabą pracą serca, w której serce w konsekwencji nie będzie w stanie sprostać wymaganiom metabolicznym organizmu. Choroby serca są główną przyczyną zachorowalności i śmiertelności w społeczeństwie zachodnim. Modele zwierzęce, które podsumowują wiele ludzkich kardiomiopatii, są wykorzystywane do badania mechanizmów molekularnych i testowania potencjalnych terapii. Aby dostrzec te mechanizmy i określić, czy terapia może być opłacalna, badacze muszą ocenić czynność serca in vivo.
Istnieje kilka sposobów oceny funkcji serca in vivo (np. echokardiografia, MRI, itp.), które rutynowo mierzą frakcję wyrzutową, skrócenie frakcji, pojemność minutową serca itp. Jednak te parametry są wysoce zależne od obciążenia następczego, obciążenia wstępnego i tętna, a także kurczliwości2. Pomiar kurczliwości jest niezbędny, aby zrozumieć wewnętrzne właściwości serca w jego naturalnym środowisku. Maksymalne (dP/dtmax) tempo rozwoju ciśnienia przybliża nas o krok do zrozumienia kurczliwości. Niestety, dP/dt zależy również od tętna i warunków obciążenia3. W związku z tym opracowano techniki pomiaru obciążenia (i częstości akcji serca, patrz poniżej) niezależnych wskaźników kurczliwości mięśnia sercowego (tj. zależności między objętością ciśnienia skurczowego na końcu (ESPVR) i pracy z udarem przed obciążeniem (PRSW))4-6. ESPVR opisuje maksymalne ciśnienie, które może wytworzyć komora przy dowolnej objętości lewej komory. Nachylenie ESPVR reprezentuje elastancję końcowoskurczową (Ees). PRSW to regresja liniowa pracy skokowej (obszar zamknięty przez pętlę PV) z objętością końcoworozkurczową. Procedury te są dokładniejszym i bardziej precyzyjnym pomiarem kurczliwości w porównaniu z parametrami hemodynamicznymi, takimi jak frakcja wyrzutowa, pojemność minutowa serca i objętość wyrzutowa. ESPVR i PRSW można uzyskać poprzez czasowe zablokowanie żyły głównej dolnej (IVC). Zablokowanie IVC można wykonać przy zamkniętej klatce piersiowej, aby uniknąć wpływu zmiany ciśnienia śródopłucnowego na czynność serca.
Zwiększenie częstości akcji serca również poprawia skurcze i relaksację1. Tak więc, porównując czynność serca między grupami eksperymentalnymi (np. ± dP/dt), tętno musi być podobne. Jednak podobne tętno zwykle nie występuje u każdego zwierzęcia z powodu różnych schorzeń (choroba, interwencja badawcza itp.). Należy zauważyć, że znieczulenie (iniekcyjne i wziewne) obniża częstość akcji serca. Ponieważ tętno jest głównym wyznacznikiem kurczliwości, znieczulenie znacząco wpłynie na kurczliwość. Z tego powodu opisujemy naszą procedurę. Dodatkowo cechą charakterystyczną wielu kardiomiopatii jest zmniejszona rezerwa skurczowa (tj. zmniejszony efekt Bowditcha). Dlatego czynność serca powinna być mierzona w różnym zakresie częstości akcji serca. Tutaj opisujemy, jak używać stymulatora (z zamkniętą klatką piersiową), aby osiągnąć te efekty.
Oprócz częstości akcji serca, tlenek azotu (NO) jest również ważnym modulatorem kurczliwości7. NO jest wytwarzany przez enzymy określane jako syntaza NO (NOS). My i inni wykazaliśmy, że myszy z nokautem neuronalnego NOS (NOS1-/-) mają stępiony skurcz miocytów i hemodynamikę serca in vivo 8,9. Ta mysz zostanie wykorzystana do zademonstrowania pomiaru kurczliwości lewej komory za pomocą procedury analizy ciśnienia/objętości lewej komory przeprowadzanej przy różnych częstościach akcji serca.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
UWAGA: Ten protokół dla zwierząt został zatwierdzony przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) na Uniwersytecie Stanowym Ohio. Procedura ta może być stosowana na każdej myszy, w której wewnętrzna średnica tętnicy szyjnej jest wystarczająco duża, aby wprowadzić cewnik. Używaj myszy o wadze powyżej 16 g (starsze niż ~2 miesiące).
1. Przygotowanie myszy do cewnikowania
- Zamknij wszystkie narzędzia i materiały chirurgiczne w woreczku do sterylizacji. Wysterylizuj torebkę w autoklawie. Utrzymuj sterylne pole przez cały czas trwania zabiegu i noś sterylne rękawice.
- Znieczulić myszy ketaminą (55 mg/kg) i ksylazyną (15 mg/kg) we wstrzyknięciu dootrzewnowym.
UWAGA: Cała procedura pomiaru zarówno ciśnienia/objętości przy różnych tętnach, jak i ESPRV zajmuje mniej niż 20 minut. Jeśli wymagany jest dodatkowy czas (np. więcej niż 30 minut), podawaj dodatkową 1/4 dawki znieczulenia co 30 minut. - Usuń włosy w przedniej części szyi i klatki piersiowej za pomocą balsamu do depilacji (np. Nair) i przyklej kończyny myszy do piankowej platformy. Potwierdź stan głębokiego znieczulenia przez uszczypnięcie palca u nogi.
- Włożyć sondę doodbytniczą, aby monitorować temperaturę ciała (37 ± 1 °C) i utrzymywać za pomocą termoregulowanej poduszki grzewczej (umieszczonej między serwetą chirurgiczną a platformą).
- Przygotuj długość szwu 4-0 (~10 cm). Szew pętelkowy wokół górnych siekaczy i taśma do platformy. Dzięki temu szyja będzie prosta.
- Wysterylizuj obszar chirurgiczny, trzykrotnie pobierając wymaz z Betadine i 75% alkoholu.
2. Cewnikowanie
- Przygotować cewnik, zanurzając końcówkę w soli fizjologicznej lub wodzie destylowanej (37 °C) przez co najmniej 30 minut przed użyciem (zgodnie z instrukcjami producenta), aby zaaklimatyzować membranę czujnika ciśnienia do wilgotnego środowiska biologicznego i zapobiec dryftowi sygnału ciśnienia i zapisom podciśnienia.
- Wykonaj podłużne nacięcie o długości 0,8 cm między dolną szczęką a mostkiem w przedniej części szyi. Cienkimi nożyczkami oddziel tkankę łączną skórno-mięśniową, aby odsłonić tchawicę znajdującą się pod mięśniem stemohyoideus.
- Oddziel tkankę tłuszczową i mięśniową po prawej stronie tchawicy za pomocą zakrzywionych kleszczy, aby odsłonić prawą tętnicę szyjną.
UWAGA: Tętnica szyjna jest największą tętnicą w przedniej części szyi, zawiera jaskrawoczerwoną krew i jest pulna. Nie mylić z żyłą szyjną biegnącą równolegle do tętnicy szyjnej. Żyła szyjna jest ciemnoczerwona i nie ma pulpuli. Ponadto podczas izolacji tętnicy szyjnej użytkownik powinien mieć świadomość, że nie uszkadza nerwu pneummogstrowego. - Usuń tłuszcz z prawej tętnicy szyjnej za pomocą zakrzywionych kleszczy. Jeśli istnieje rozgałęzienie naczynia, które utrudni tę technikę operacyjną, przeciąć je kauteryzacją Bovie, aby oddzielić tętnicę szyjną. Oddziel jak najwięcej tkanki pod tętnicą szyjną za pomocą zakrzywionych kleszczy.
- Wytnij dwie jedwabne nici o długości 5 cm 6-0. Przełóż każdą jedwabną nić pod prawą tętnicą szyjną.
- Umieść jedną nić w pobliżu części proksymalnej, a drugą w pobliżu dystalnej części tętnicy. Zrób ciasny węzeł na nitce w dalszej części i zrób luźny węzeł na nitce w części proksymalnej .
- Zablokuj przepływ krwi, zaciskając bliższą część tętnicy za pomocą małego zacisku naczyniowego hemostatu (umieść zacisk poniżej proksymalnego gwintu). Uszczelniony obszar tętnicy zostanie wypełniony krwią, co ułatwi wykonanie kroku 2.8.
- Nakłuć mały otwór w prawej tętnicy szyjnej między dwiema nitkami (ale bliżej dystalnej nici) igłą 26 G. Wprowadzić cewnik do tętnicy szyjnej. Lekko zaciśnij luźny węzeł w bliższej części tętnicy szyjnej na cewniku, aby utrzymać go na miejscu.
UWAGA: Preferowane jest nakłucie igłą w porównaniu z nacięciem nożyczkami. Tworząc najpierw ciasny węzeł w dystalnej części tętnicy, a następnie zaciskając część proksymalną, tętnica zostanie całkowicie wypełniona krwią. To sprawia, że bardzo łatwo jest przebić się przez naczynie krwionośne. Ponadto rozmiar igły (26 G) nakłuwa tętnicę otworem, który ładnie pasuje do wielkości cewnika. W przypadku stosowania metody nacięcia nożyczkami trudniej było kontrolować wielkość nacięcia. Jednak wybrana metoda powinna zależeć od tego, z którą chirurg czuje się bardziej komfortowo. - Rozpocznij rejestrowanie sygnałów ciśnienia, jak w kroku 3.
- Poluzuj zacisk hemostatu i kontynuuj wprowadzanie cewnika do przodu do lewej komory. Jeśli podczas przesuwania cewnika wystąpi pewien opór, delikatnie odciągnij go do tyłu i spróbuj ponownie przesunąć cewnik. Dla myszy o wadze ~18-25 g szacowana długość wprowadzanego cewnika wynosi 18 mm.
UWAGA: Sygnał ciśnienia tętniczego będzie się wahał od 70 do 120 mm Hg. Gdy cewnik znajdzie się w lewej komorze, kształt sygnału ciśnienia zmienia się, a ciśnienie będzie się wahać od 0 do 120 mm Hg (pokazane na rysunku 1). Czynność serca ustabilizuje się w ciągu 2-3 minut po wprowadzeniu cewnika. - Stale monitoruj temperaturę ciała, poziom znieczulenia i częstość oddechów.
3. Akwizycja danych
- Użyj oprogramowania LabChartPro 7 (lub podobnego oprogramowania). Użyj opcji WorkFlow w module PV Loop LabChart. Korzystając z tego modułu, wybierz domyślne ustawienie Pętle ciśnienia i objętości.
- Ustaw trzy kanały: jeden kanał dla ciśnienia, jeden kanał dla głośności i jeden kanał dla tętna. Ustaw zakresy skali powyższych parametrów odpowiednio jako 0-150 mm Hg, 0-100 μl i 0-800 uderzeń/min.
- Naciśnij start, aby nagrywać.
4. Efekt Bowditcha
- Wykonaj 1 cm nacięcie w obszarze przedsionka równolegle do manubrium. Przetnij warstwę mięśni i odsłoń przestrzeń międzyżebrową za pomocą nożyczek.
- Za pomocą stymulatora impulsów kwadratowych ustaw następujące parametry: Napięcie 2 V, czas trwania 2 ms i włącz tryb powtarzania.
- Przytrzymaj elektrodę ujemną kleszczami i włóż ją przez czwartą przestrzeń międzyżebrową do wierzchołkowego obszaru serca. Przytrzymaj elektrodę dodatnią kleszczami i włóż ją przez drugą przestrzeń międzyżebrową do prawego obszaru przedsionka serca.
- Włącz stymulator i zmień częstotliwość, aby przyspieszyć pracę serca od 4 Hz (240 uderzeń/min) do 10 Hz (600 uderzeń/min). Przy każdym nowym tętnie stymuluj serce przez 1 minutę przed zebraniem danych.
5. Generowanie ESPVR i PRSW
- Przetnij nożyczkami skórę i tkankę mięśniową prostopadłą do manubry w okolicy brzucha. Otwórz enterocoelię i odsłoń wątrobę.
- Przeciągnij arcus costarum w kierunku głowy, używając metalowej trakcji.
- Delikatnie popchnij wątrobę w dół za pomocą bawełnianego wacika. Uważaj, aby nie naciskać zbyt mocno, aby wpłynąć na jamę klatki piersiowej. To zmieni pracę serca.
- Przetnij więzadło sierpowe wątroby nożyczkami, aby odsłonić żyłę główną nadwątrobową dolną (IVC).
- Użyj zakrzywionych kleszczy, aby szybko ścisnąć IVC przez 5 sekund, aby zablokować powrót krwi do prawego przedsionka. Ciśnienie i objętość lewej komory spadnie z powodu zmniejszonego dopływu do serca. Przy generowaniu tych wartości nie należy używać pętli poniżej 60 mm Hg. 60 mm Hg odnosi się do ciśnienia skurczowego.
UWAGA: Wartość tę ustalono na 60 mm Hg, ponieważ spowoduje to znaczny spadek ciśnienia perfuzji, co znacznie zmniejszy perfuzję wieńcową i wpłynie na kurczliwość.
6. Kalibracja objętości
- Heparynizować mysz 0,1 ml roztworu heparyny w proporcji 1:5 000 (rozcieńczonego solą fizjologiczną) we wstrzyknięciu dootrzewnowym.
- Usuń cewnik z tętnicy szyjnej. Gdy cewnik zostanie wyciągnięty z tętnicy szyjnej, heparynizowana krew będzie wyciekać z otworu, w którym został wprowadzony cewnik .
- Pobrać tę krew do kalibracji objętości za pomocą strzykawki o pojemności 1 ml. Napełnij każdą studzienkę w kuwecie kalibracyjnej.
- Usuń serce, aby poddać mysz eutanazji poprzez wykrwawienie.
- Umieść cewnik w każdej studzience i uzyskaj stałą wartość jednostki objętości względnej (RVU). Wygeneruj krzywą standardową, używając różnych standardowych objętości i wartości RVU z każdego dołka.
- Przekonwertuj zarejestrowany RVU na μl.
7. Przetwarzanie danych
- Aby zbadać efekt Bowditcha, wybierz ślady ciśnienia/objętości w stanie ustalonym z każdego tętna. Kliknij analizę bazową, aby uzyskać dane.
- W przypadku danych ESPVR i PRSW wybierz pierwsze ~15 śladów ciśnienia/objętości, kliknij analizę okluzji w oprogramowaniu, aby wygenerować nachylenia ESPVR (nachylenie ciśnienia wytwarzanego przez LV przy objętości końcoworozkurczowej) i PRSW (regresja liniowa pracy udarowej z objętością końcoworozkurczową).
- Zwróć uwagę na kształt pętli. Upewnij się, że pętla jest zamknięta bez kątowych punktów lub skrętów. Jest to oznaka nieprawidłowego umieszczenia cewnika lub nadmiernego hałasu. Okresowo sprawdzaj pętle podczas eksperymentu, aby upewnić się, że generowane są prawidłowe dane dotyczące ciśnienia i objętości.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Prawidłowe wprowadzenie cewnika do lewej komory jest istotnym krokiem w celu uzyskania odpowiednich wartości ciśnienia i objętości. Na Rysunku 1, z wykorzystaniem programu LabChart Pro 7, przedstawiono zmianę kształtu i wartości fali ciśnienia w momencie przemieszczania się cewnika z tętnicy do komory.
Po prawidłowym wprowadzeniu cewnika do lewej komory, uzyskane wartości ciśnienia (P) i objętości (V) zostaną wykorzystane do wygenerowania pętli PV (przedstawionych na R...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Kluczowym krokiem dla tej techniki w celu uzyskania wiarygodnej miary kurczliwości jest prawidłowe umieszczenie cewnika w LV. Jeśli cewnik nie zostanie umieszczony prawidłowo, gdy LV kurczy się, ścianki mogą stykać się z cewnikiem, co skutkuje bardzo wysokimi, a nie fizjologicznymi wartościami ciśnienia powodującymi nieregularne kształty pętli PV. W razie potrzeby cewnik można obrócić, aby uzyskać prawidłowe umieszczenie. Kolejnym kluczowym krokiem w tej technice jest upewnienie się, że mysz otrzymała odpowiednie znieczu...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Nie ma sprzecznych interesów finansowych.
Podziękowania
To badanie było wspierane przez granty NIH HL091986 (JPD) i HL094692 (MTZ).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Xlyzine 100 mg/ml | Ana Sed | 4821 | |
| Katamin 50 mg/ml | Ketalar | 310006 | |
| Heparyna | APP Pharmaceuticals | 6003922 | |
| 4-0 nić jedwabna | Specjalizacje chirurgiczne | SP102 | |
| 6-0 nić jedwabna | Specjalizacje chirurgiczne | MBKF270 | |
| Kleszcze | Narzędzia do nauki | 11251-10 | |
| Kleszcze krzywe | Narzędzia do nauki precyzyjnej | 11274-20 | |
| Nożyczki | Fine Science Tools | 14090-09 | |
| Zacisk naczyniowy | Fine Science Tools | 18555-03 | |
| Mikroskop | Świat instrumenty precyzyjne | PZM-3 | |
| Cewnik ciśnieniowy | Instrumenty Millar | SPR-839 | |
| System ciśnienia i objętości | Instrumenty Millar | MPVS-300 | |
| PowerLab4/35 | Instrumenty AD | N12128 | |
| LabchartPro 7 | Przyrządy | ||
| Regulator temperatury | CWE | TC-1000 | |
| Stymulator | Trawa | SD-5 | |
| Sterylna rękawica | Micro-Touch | 1305018821 | |
| Balsam do depilacji | |||
| Betadine | Weterynaryjne | NDC 6761815401 | |
| Alcohol | Decon Laboratories | 2801 | |
| Kauteryzacja Bovie | Bovie | AA29 | |
| 1 ml Strzykawka (26 Igła G) | BD | 8017299 |
Bibliografia
- Janssen, P. M. Myocardial contraction-relaxation coupling. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 299, H1741-H1749 (2010).
- Roman, M. J., Devereux, R. B. Comparison of noninvasive measures of contractility in dilated cardiomyopathy. Echocardiography. 8, 139-150 (1991).
- Hamlin, R. L., del Rio, C. dP/dt(max)--a measure of 'baroinometry. J Pharmacol Toxicol Methods. 66, 63-65 (2012).
- Feneley, M. P., et al. Comparison of preload recruitable stroke work, end-systolic pressure-volume and dP/dtmax-end-diastolic volume relations as indexes of left ventricular contractile performance in patients undergoing routine cardiac catheterization. J Am Coll Cardiol. 19, 1522-1530 (1992).
- Kass, D. A., et al. Comparative influence of load versus inotropic states on indexes of ventricular contractility: experimental and theoretical analysis based on pressure-volume relationships. Circulation. 76, 1422-1436 (1987).
- Nemoto, S., DeFreitas, G., Mann, D. L., Carabello, B. A. Effects of changes in left ventricular contractility on indexes of contractility in mice. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 283, H2504-H2510 (2002).
- Ziolo, M. T., Kohr, M. J., Wang, H. Nitric oxide signaling and the regulation of myocardial function. J Mol Cell Cardiol. 45, 625-632 (2008).
- Barouch, L. A., et al. Nitric oxide regulates the heart by spatial confinement of nitric oxide synthase isoforms. Nature. 416, 337-339 (2002).
- Wang, H., et al. Neuronal nitric oxide synthase signaling within cardiac myocytes targets phospholamban. Am J Physiol Cell Physiol. 294, C1566-C1575 (2008).
- Georgakopoulos, D., et al. In vivo murine left ventricular pressure-volume relations by miniaturized conductance micromanometry. Am J Physiol. 274, H1416-H1422 (1998).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
