Artykuł metodologiczny

Biofunkcjonalizowane nanocząstki błękitu pruskiego do zastosowań w multimodalnym obrazowaniu molekularnym

9.9K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/52621

⸱

28 kwietnia 2015

 ,  ,  ,  , 
1The Sheikh Zayed Institute for Pediatric Surgical Innovation, Children's National Medical Center, 2Fischell Department of Bioengineering, University of Maryland, 3Department of Radiology, George Washington University, 4Department of Pediatrics, George Washington University

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół opisuje syntezę biofunkcjonalizowanych pruskich niebieskich nanocząstek i ich zastosowanie jako multimodalnych, molekularnych środków obrazowania. Nanocząstki mają konstrukcję rdzeń-powłoka, w której jony gadolinu lub manganu w rdzeniu nanocząstki generują kontrast MRI. Otoczka biofunkcjonalna zawiera fluorofory do obrazowania fluorescencyjnego i ligandy celujące do celowania molekularnego.

Streszczenie

Multimodalne, obrazowanie molekularne pozwala na wizualizację procesów biologicznych w rozdzielczościach komórkowych, subkomórkowych i molekularnych przy użyciu wielu, uzupełniających się technik obrazowania. Te środki do obrazowania ułatwiają ocenę szlaków i mechanizmów in vivo w czasie rzeczywistym, co zwiększa skuteczność zarówno diagnostyczną, jak i terapeutyczną. W artykule przedstawiono protokół syntezy biofunkcjonalizowanych nanocząstek błękitu pruskiego (PB NPs) - nowej klasy środków do zastosowania w multimodalnych, molekularnych aplikacjach obrazowania. Metody obrazowania zawarte w nanocząstkach, obrazowanie fluorescencyjne i obrazowanie metodą rezonansu magnetycznego (MRI), mają cechy komplementarne. Nanocząsteczki PB mają konstrukcję rdzeń-powłoka, w której jony gadolinu i manganu włączone w przestrzenie śródmiąższowe sieci PB generują kontrast MRI, zarówno w sekwencjach zależnych T1, jak i T2. Nanocząsteczki PB są powlekane fluorescencyjną awidyną za pomocą elektrostatycznej samoorganizacji, która umożliwia obrazowanie fluorescencyjne. Nanocząstki pokryte awidyną są modyfikowane biotynylowanymi ligandami, które nadają nanocząstkom zdolność celowania molekularnego. Mierzona jest stabilność i toksyczność nanocząstek, a także ich relaksacyjność w MRI. Multimodalne, molekularne możliwości obrazowania tych biofunkcjonalizowanych nanocząsteczek PB są następnie demonstrowane poprzez wykorzystanie ich do obrazowania fluorescencyjnego i molekularnego rezonansu magnetycznego in vitro.

Wprowadzenie

Obrazowanie molekularne to nieinwazyjna i ukierunkowana wizualizacja procesów biologicznych na poziomie komórkowym, subkomórkowym i molekularnym1. Obrazowanie molekularne pozwala próbce pozostać w jej naturalnym mikrośrodowisku, podczas gdy jej endogenne szlaki i mechanizmy są oceniane w czasie rzeczywistym. Zazwyczaj obrazowanie molekularne polega na podaniu egzogennego środka obrazującego w postaci małej cząsteczki, makrocząsteczki lub nanocząstki w celu wizualizacji, ukierunkowania i śledzenia odpowiednich badanych procesów fizjologicznych2. Różne metody obrazowania, które zostały zbadane w obrazowaniu molekularnym, obejmują MRI, CT, PET, SPECT, ultradźwięki, fotoakustykę, spektroskopię Ramana, bioluminescencję, fluorescencję i mikroskopię przyżyciową3. Obrazowanie multimodalne to połączenie dwóch lub więcej modalności obrazowania, w którym połączenie zwiększa zdolność do wizualizacji i charakteryzowania różnych procesów i zdarzeń biologicznych4. Obrazowanie multimodalne wykorzystuje mocne strony poszczególnych technik obrazowania, kompensując jednocześnie ich indywidualne ograniczenia3.

Ten artykuł przedstawia protokół syntezy biofunkcjonalizowanych pruskich niebieskich nanocząstek (PB NPs) - nowej klasy multimodalnych, molekularnych środków obrazowania. Nanocząsteczki PB są wykorzystywane do obrazowania fluorescencyjnego i molekularnego rezonansu magnetycznego. PB jest pigmentem składającym się z naprzemiennych atomów żelaza (II) i żelaza (III) w sześciennej sieci skoncentrowanej na powierzchni (ryc. 1). Sieć PB składa się z liniowych ligandów cyjanku w wiązaniu FeII-CN-Fe III, które zawiera kationy w celu zrównoważenia ładunków w swojej trójwymiarowej sieci5. Zdolność PB do włączania kationów do swojej sieci jest wykorzystywana przez oddzielne ładowanie jonów gadolinu i manganu do NP PB w celu kontrastu MRI.

Uzasadnieniem dla projektu nanocząsteczek dla kontrastu MRI są korzyści, jakie ten projekt oferuje w stosunku do obecnych środków kontrastowych MRI. Zdecydowana większość zatwierdzonych przez amerykańską FDA środków kontrastowych MRI to chelaty gadolinu, które mają charakter paramagnetyczny i zapewniają dodatni kontrast dzięki mechanizmowi relaksacji sieci spinowej6,7,8. W porównaniu z pojedynczym chelatem gadolinu, który sam w sobie zapewnia niską intensywność sygnału, włączenie wielu jonów gadolinu do sieci PB nanocząstek zapewnia zwiększoną intensywność sygnału (dodatni kontrast)3,9. Co więcej, obecność wielu jonów gadolinu w sieci PB zwiększa ogólną gęstość spinu i wielkość paramagnetyzmu nanocząstek, co zaburza lokalne pole magnetyczne w ich pobliżu, generując w ten sposób ujemny kontrast przez mechanizm relaksacji spinowo-spinowej. W ten sposób nanocząstki zawierające gadolin działają zarówno jako środki kontrastowe T1 (dodatni), jak i T2 (ujemne)10,11.

W podgrupie pacjentów z zaburzeniami czynności nerek, podawanie środków kontrastowych na bazie gadolinu zostało powiązane z rozwojem nerkopochodnego zwłóknienia układowego8,12, 13. Obserwacja ta skłoniła do badań nad zastosowaniem alternatywnych jonów paramagnetycznych jako środków kontrastowych w rezonansie magnetycznym. W związku z tym wszechstronna konstrukcja nanocząstek jest przystosowana do włączania jonów manganu do sieci PB. Podobnie jak chelaty gadolinu, chelaty manganu są również paramagnetyczne i są zwykle używane do zapewnienia dodatniej intensywności sygnału w MRI7,14. Podobnie jak w przypadku NP PB zawierających gadolin, NP PB zawierające mangan działają również jako środki kontrastowe T1 (dodatni) i T2 (ujemny).

Aby włączyć możliwości obrazowania fluorescencyjnego, "rdzenie" nanocząsteczek są pokryte "biofunkcjonalną" powłoką składającą się z znakowanej fluorescencyjnie glikoproteiny awidyny (Rysunek 1). Awidyna nie tylko umożliwia obrazowanie fluorescencyjne, ale służy również jako platforma dokująca dla biotynylowanych ligandów, które celują w określone komórki i tkanki. Wiązanie awidyna–biotyna jest jednym z najsilniejszych znanych, niekowalencyjnych wiązań charakteryzujących się niezwykle silnym powinowactwem wiązania pomiędzy awidyną a biotyną15. Przyłączenie biotynylowanych ligandów do nanocząsteczek PB pokrytych awidyną nadaje nanocząsteczkom PB możliwości celowania molekularnego.

Motywacją do kontynuowania obrazowania fluorescencyjnego i MR za pomocą NP PB jest to, że te metody obrazowania posiadają cechy komplementarne. Obrazowanie fluorescencyjne jest jedną z najczęściej stosowanych technik optycznego obrazowania molekularnego i pozwala na jednoczesną wizualizację wielu obiektów przy wysokiej czułości1,16,17. Obrazowanie fluorescencyjne jest bezpieczną, nieinwazyjną metodą, ale wiąże się z niską głębokością penetracji i rozdzielczościami przestrzennymi1,3,16. Z drugiej strony, rezonans magnetyczny generuje wysoką rozdzielczość czasową i przestrzenną nieinwazyjnie i bez konieczności stosowania promieniowania jonizującego1,3,16. Jednak MRI cierpi na niską czułość. Dlatego obrazowanie fluorescencyjne i MRI zostały wybrane jako techniki obrazowania molekularnego ze względu na ich uzupełniające się cechy penetracji głębokości, czułości i rozdzielczości przestrzennej.

Ten artykuł przedstawia protokół syntezy i biofunkcjonalizacji NP PB, NP zawierających gadolin (GdPB) i NP PB zawierających mangan (MnPB)10,11. Opisano następujące metody: 1) pomiar wielkości, ładunku i stabilności czasowej nanocząstek, 2) ocena cytotoksyczności nanocząstek, 3) pomiar relaksacji MRI oraz 4) wykorzystanie nanocząstek do obrazowania fluorescencyjnego i molekularnego MR populacji docelowych komórek in vitro. Wyniki te wskazują na potencjał nanocząsteczek do stosowania jako multimodalne środki do obrazowania molekularnego in vivo.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Synteza NP PB, GdPB oraz MnPB

Syntezę nanocząsteczek (PB NPs, GdPB lub MnPB) przeprowadza się zgodnie ze schematem syntezy jednopamadkowej (one-pot), wykonując poniższe kroki:

  1. Przygotować roztwór „A” zawierający 5 ml 5 mM heksacyjanożelazianu(II) potasu w wodzie dejonizowanej (DI). W zależności od rodzaju syntetyzowanych nanocząstek — PB NPs, GdPB lub MnPB, przygotować roztwór „B” w następujący sposób:
    1. Dla PB NPs: przygotować 10 ml roztworu zawierającego 2,5 mM chlorku żelaza(III) w wodzie DI.
    2. Dla GdPB NPs: przygotować 10 ml roztworu zawierającego po 2,5 mM azotanu gadolinu(III) i chlorku żelaza(III) w wodzie DI.
    3. Dla MnPB NPs: przygotować 10 ml roztworu zawierającego po 2,5 mM chlorku manganu(II) i chlorku żelaza(III) w wodzie DI.
  2. Przenieść roztwór „B” do kolby okrągłodennej i mieszać zawartość kolby w temperaturze pokojowej (RT) przy 1 000 rpm. Do kolby okrągłodennej z roztworem „B” dodawać kroplami roztwór „A”. Prędkość przepływu podczas dodawania roztworu „A” do „B” kontrolować za pomocą pompy perystaltycznej ustawionej na dozowanie około 10 ml/hr.
  3. Kontynuować mieszanie przy 1 000 rpm w RT przez kolejne 30 min po zakończeniu dodawania roztworu „A” do „B”. Zatrzymać mieszanie i zebrać mieszaninę.
  4. Przenieść alikwoty mieszaniny do probówek do mikrocentryfugi, aby wypłukać nanocząstki z nieprzereagowanych składników. Do każdej alikwoty dodać 5 M NaCl (0,2 ml NaCl/ml mieszaniny reakcyjnej), aby wspomóc zbieranie cząstek poprzez wirowanie.
  5. Wirować każdą alikwotę nanocząstek przez co najmniej 10 min przy 20 000 × g. Po wirowaniu ostrożnie usunąć nadsącz.
  6. Każdy osad nanocząstek resuspender w 1 ml wody DI poprzez sonikację z użyciem mikrokońcówki (impuls sonikacji włączony/wyłączony = 1/1 sec, amplituda = 50%, czas trwania = 5 sec, moc sonikatora = 125 W), aby rozbić osad.
  7. Powtórzyć kroki 1.4-1.6 co najmniej 3×, aby upewnić się, że nanocząstki są wolne od składników początkowej reakcji oraz produktów ubocznych reakcji. Po ostatnim wirowaniu resuspender cząstki w 1 ml wody DI.

2. Biofunkcjonalizacja PB NPs, GdPB i MnPB

Biofunkcjonalizacja nanocząstek polega na powleczeniu „rdzeni” nanocząstek awidyną i dodaniu ligandów biotynilowanych, zgodnie z poniższym opisem:

  1. Powlekanie nanocząsteczek fluorescencyjną awidyną
    Powlekanie nanocząsteczek fluorescencyjną awidyną odbywa się poprzez elektrostatyczny samoorganizowany montaż, w którym dodatnio naładowana awidyna (pI ~10.5) jest osadzana na ujemnie naładowanych nanocząsteczkach w następujący sposób18:
    1. Przygotować zawiesiny PB NPs, GdPB lub MnPB w 1 ml wody DI. Przefiltrować awidynę znakowaną Alexa Fluor 488 (A488; rozpuszczoną w wodzie DI) przez nylonowy filtr do mikrocentryfugi 0,2 µm przy 14 000 × g przez 10 min. Dodać ≤0,2 mg awidyny/mg nanocząsteczek. Dodać każdą przefiltrowaną porcję A488 oddzielnie do porcji PB NPs, GdPB lub MnPB.
    2. Inkubować nanocząsteczki z A488 przez 2-4 h przy łagodnym wstrząsaniu lub rotacji w 4 °C. Chronić próbki przed światłem za pomocą folii aluminiowej.
      UWAGA: Ten etap pozwala otrzymać PB NPs powleczone A488 (PB-A488), GdPB (GdPB-A488) oraz MnPB (MnPB-A488).
  2. Przyłączanie biotynylowanych przeciwciał
    Przyłączanie biotynylowanych przeciwciał celujących do nanocząsteczek powleczonych awidyną odbywa się z wykorzystaniem oddziaływań awidyna-biotyna w następujący sposób:
    1. Przygotować zawiesiny nanocząsteczek powleczonych awidyną — PB-A488, GdPB-A488 oraz MnPB-A488 w 1 ml wody DI. Przefiltrować biotynylowane przeciwciało (dostarczone przez producenta) przez nylonowy filtr do mikrocentryfugi 0,2 µm przy 14 000 × g przez 10 min.
      UWAGA: W niniejszym badaniu wykorzystano biotynylowane przeciwciało przeciwko antygenowi neuronalno-glejowemu 2 (ANG2), które celuje w NG2 nadmiernie eksprymowany w komórkach i tkankach ośrodkowego układu nerwowego, oraz biotynylowane przeciwciało przeciwko ludzkiej eotaksynie-3 (Eot3), które celuje w receptory nadmiernie eksprymowane na eozynofilach lub liniach komórkowych eozynofilnych.
    2. Dodać każdą przefiltrowaną porcję biotynylowanego przeciwciała oddzielnie do porcji nanocząsteczek powleczonych awidyną. Dodać ≤0,05 mg biotynylowanego przeciwciała/mg nanocząsteczek powleczonych awidyną. Inkubować nanocząsteczki powleczone awidyną z biotynylowanymi przeciwciałami (ANG2 lub Eot3) przez 2-4 h przy łagodnym wstrząsaniu lub rotacji w 4 °C. Chronić próbki przed światłem za pomocą folii aluminiowej.
      UWAGA: Ten etap pozwala otrzymać nanocząsteczki powleczone przeciwciałami (np. GdPB-A488-Eot3 i MnPB-A488-ANG2).

3. Rozmiar, potencjał zeta i stabilność czasowa nanocząsteczek

Rozkład wielkości, ładunek i stabilność nanocząsteczek są pomierzane z wykorzystaniem metod dynamicznego rozpraszania światła (DLS) zgodnie z poniższym opisem:

  1. Wyznaczanie wielkości nanocząsteczek
    Wielkość nanocząsteczek wyznacza się za pomocą dynamicznego rozpraszania światła w następujący sposób:
    1. Do jednorazowej plastikowej kuwety dodać 10 µl próbki nanocząsteczek (1 mg/ml) do 990 µl wody DI.
      UWAGA: Jest to wartość reprezentatywna dla uzyskania dobrego sygnału DLS.
    2. Zakryć kuwetę i wymieszać za pomocą wortexa. Umieścić kuwetę w systemie do analizy wielkości cząstek, aby zmierzyć wielkość nanocząsteczek. Analizę wielkości cząstek przeprowadzić pod kątem pomiaru 173°.
  2. Potencjał zeta nanocząsteczek
    Potencjał zeta nanocząsteczek mierzy się za pomocą analizy rozpraszania światła z analizą fazową w następujący sposób:
    1. Do jednorazowej plastikowej celi kapilarnej dodać 100 µl próbki nanocząsteczek (1 mg/ml) do 900 µl wody DI. Wartość ta jest reprezentatywna dla prawidłowego pomiaru potencjału zeta.
    2. Umieścić celę kapilarną w systemie do analizy potencjału zeta, aby zmierzyć potencjał zeta nanocząsteczek przy użyciu parametrów domyślnych w temperaturze 25 °C.
  3. Stabilność czasowa nanocząsteczek
    Stabilność czasową nanocząsteczek mierzy się za pomocą dynamicznego rozpraszania światła w następujący sposób:
    1. Ocenić stabilność nanocząsteczek poprzez pomiar ich wielkości w wodzie DI, a także w modyfikowanej pożywce Eagle'a (DMEM), zgodnie z opisem w sekcji 3.1.
    2. Powtórzyć pomiary wielkości w wodzie DI i DMEM raz dziennie przez okres 5 dni.

4. Cytotoksyczność nanocząstek

Cytotoksyczność nanocząsteczek jest mierzona za pomocą testu proliferacji komórek XTT w następujący sposób:

  1. Wysiać od 10 000 do 15 000 komórek/dołka każdego z badanych typów komórek (Neuro2a, BSG D10, EoL-1 oraz OE21) na płytce 96-dołkowej. Należy upewnić się, że całkowita objętość wysianych komórek nie przekracza 0,2 ml/dołek. Inkubować wysiane komórki przez noc w temperaturze 37 °C i 5% CO2.
  2. Kontakt nanocząstek z komórkami:
    1. Inkubować komórki z nanocząstkami o różnych stężeniach (0,01–0,5 mg/ml). W odniesieniu do Tabeli 1, która stanowi reprezentatywne zestawienie opisujące ilości nanocząstek (w 50 µl) dodawanych do komórek po usunięciu 50 µl medium/dołek.
      1. Aby uwzględnić ewentualną interferencję absorbancji nanocząstek w teście, dodać próbę ślepą składającą się z odpowiedniego stężenia nanocząstek (0–0,5 mg/ml; w ilościach równoważnych tym dodanym do komórek) do medium bez komórek.
    2. Inkubować komórki z nanocząstkami przez noc w temperaturze 37 °C i 5% CO2. Odessać medium z każdego dołka i wypłukać buforem barwiącym składającym się z 5% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) w roztworze fosforanowym (PBS). Dodać 100 µl medium bez czerwieni fenolowej i inkubować w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez 16–18 h.
  3. Przygotować roztwór roboczy do testu proliferacji komórek XTT, mieszając komponenty zestawu (odczynnik XTT i aktywator XTT) zgodnie ze specyfikacją producenta. Odessać medium z dołków i dodać 100 µl RPMI (RPMI bez czerwieni fenolowej + 10% FBS + 1× Pen-Strep) lub odpowiedniego medium dla badanego typu komórek. Dodać 50 µl roztworu roboczego XTT do każdego dołka i inkubować w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez 2–2,5 h.
  4. Zmierzyć absorbancję przy 490 nm, z długością fali referencyjną 630 nm w celu korekcji odcisków palców lub smug. Obliczyć skorygowaną absorbancję dla każdego dołka (A490-A630) i wyciągnąć średnią z odczytów dla powtórzeń.
  5. Odjąć odczyty z próbek ślepych od wartości każdego dołka, aby obliczyć końcowe skorygowane wartości absorbancji. Obliczyć procent przeżywalności dla każdej próbki, normalizując końcową skorygowaną absorbancję do absorbancji komórek nieleczonych, bez nanocząstek. Wykreślić procent przeżywalności jako funkcję stężenia nanocząstek.

5. Relaksywności MRI nanocząstek PB, GdPB i MnPB

Relaksywność MRI mierzy się przy użyciu sekwencji T1- i T2-zależnych, przygotowując „fantom” MRI z wykorzystaniem płytki 96-dołkowej zawierającej nanocząstki, zgodnie z opisem poniżej:

  1. Przygotowanie fantoma
    1. Przygotować płytkę 96-dołkową, w której każdy dołek zawiera 100 µl nanocząsteczek (PB NPs, GdPB lub MnPB) o odpowiednim stężeniu. Rozpoczynając od stężenia 0,4 mM dla każdego rodzaju nanocząsteczek, wykonać rozcieńczenia szeregowe 2× przy użyciu wody DI, aż do osiągnięcia stężenia 2,4 × 10-5 M (wymaga to 14 rozcieńczeń i 15 dołków).
    2. Do każdego dołka dodać 100 µl stopionego 1% roztworu agarozy w wodzie DI i dokładnie wymieszać. Pozostawić żel do zestalenia w temperaturze 4 °C przez 12 h.
      UWAGA: W ten sposób otrzymuje się fantom zawierający rozcieńczenia szeregowe nanocząsteczek w zestalonej agarozie.
    3. Umieścić fantom w poziomym klinicznym magnesie 3 T pod litym blokiem 2% agaru (150 cm3). Zabezpieczyć fantom i blok agaru w centrum 8-kanałowej cewki HD do obrazowania mózgu. Zmierzyć czasy relaksacji, stosując coronalne przekroje o grubości 0,5 mm na wysokości środkowej płytki 96-dołkowej11.
  2. Sekwencje T1- i T2-zależne
    W celu pozyskania sekwencji w magnesie klinicznym należy zastosować następujące reprezentatywne ustawienia.
    UWAGA: Wartości te są zoptymalizowane dla nanocząsteczek użytych w niniejszym badaniu:
    1. Pozyskać obrazy MR T1-zależne (T1W), stosując następującą sekwencję FLAIR (fluid attenuated inversion recovery): pociąg ech (ET) = 8, czas repetycji (TR) = 2300 msec, czas echa (TE) = 24,4 msec, rozmiar macierzy = 512 x 224, pole widzenia (FOV) = 16 x 16 cm2.
    2. Pozyskać obrazy MR T2-zależne (T2W), stosując następującą sekwencję szybkich ech spinowych z szybką relaksacją (FRFSE): ET = 21; TR = 3500 msec; TE = 104 msec; rozmiar macierzy = 512 x 224; FOV = 16 x 16 cm2.
    3. Pozyskać obrazy MR T1W i T2W przy 127 MHz (3 T) dla następujących czasów inwersji: 50, 177, 432, 942, 1961 i 4000 msec.
  3. Pomiar relaksywności MRI
    1. Po pozyskaniu obrazów T1W i T2W przy użyciu sekwencji opisanych w sekcji 5.2, zmierzyć intensywność sygnału dla każdego dołka za pomocą programu ImageJ, wyznaczając obszar zainteresowania (ROI) poprzez zaznaczenie każdego ROI za pomocą przycisku owalnego wycinania na głównym pasku narzędzi, a następnie wybranie Analyze > Measure.
      UWAGA: W oknie pop-up powinna wyświetlić się średnia intensywność sygnału każdego ROI w kolumnie oznaczonej jako „Mean”.
    2. Dla każdego ROI nanieść zmierzoną intensywność sygnału w funkcji odpowiadającego mu czasu inwersji. W razie potrzeby odwrócić punkty (odczyty), które generują początkową „bańkę” lub wartości odstające na początku wykresu (niższe czasy inwersji).
      UWAGA: Odczyty te pojawiają się przy niskich czasach inwersji, ponieważ MRI mierzy amplitudę lub wartość bezwzględną obrazów, a nie ich rzeczywistą (ujemną) wartość, co musi zostać uwzględnione/skorygowane19.
    3. Przygotować dopasowanie wykładnicze dla każdego wykresu intensywności sygnału dla ROI (SI) w funkcji czasów inwersji (TI), zgodnie z opisem w sekcji 5.2. Nanieść TI na oś x, a SI na oś y; ɑ i Δ są stałymi wyznaczonymi metodą regresji, a T1 lub T2 jest zmienną do obliczenia:
      Wzór na zanik wykładniczy dla intensywności sygnału SI(t) w badaniu spektroskopii absorpcji przejściowej.
      gdzie t = T1, T2.
    4. Obliczyć T1 lub T2 przy użyciu powyższego równania i nanieść odwrotność obliczonych wartości (1/T1 i 1/T2) w funkcji stężeń nanocząsteczek użytych w każdym ROI.
    5. Obliczyć nachylenie wykresu liniowego, co pozwoli wyznaczyć relaksywności r1 i r2.
      UWAGA: Kolejna sekcja protokołu opisuje zastosowanie nanocząsteczek do znakowania fluorescencyjnego i generowania kontrastu MRI w komórkach docelowych.

6. Fluorescencyjne znakowanie komórek docelowych z użyciem nanocząsteczek — mikroskopia konfokalna

UWAGA: Nanocząstki (PB NPs, GdPB oraz MnPB) mogą być wykorzystane do fluorescencyjnego znakowania populacji komórek docelowych (monitorowanych za pomocą mikroskopii konfokalnej) w następujący sposób:

  1. Synteza fluorescencyjnych nanocząsteczek
    1. Zsyntetyzować GdPB-A488, GdPB-A488-Eot3, MnPB-A488, MnPB-A488-ANG2 do znakowania fluorescencyjnego populacji komórek docelowych, postępując zgodnie z krokami szczegółowo opisanymi w sekcjach 1 i 2.
  2. Przygotowanie komórek do celowania fluorescencyjnego
    1. Pokryć szkiełka nakrywkowe nr 1,5, zanurzając je w roztworze 0,002% hydrobromku poli(L-lizyny) na 90 min. Wyjąć szkiełka nakrywkowe z roztworu i pozostawić do wyschnięcia na 24 hr.
    2. Wysiać komórki (np. EoL-1, BSG D10, SUDIPG1) na pokryte szkiełka nakrywkowe umieszczone w płytce 6-dołkowej i inkubować w 37 °C i 5% CO2 przez co najmniej 16 hr. Przepłukać komórki roztworem 1× PBS i (opcjonalnie) utrwalić 10% formaldehydem w neutralnym roztworze buforowym przez 15 min. Barwić komórki 5 µM czerwonopomarańczowym barwnikiem przenikającym do komórek w PBS w 37 °C przez 30 min. Następnie przepłukać komórki PBS.
  3. >Znakowanie fluorescencyjne komórek docelowych
    1. Dodać do komórek 1% albuminy surowicy bydlęcej (BSA; w wodzie DI), aby zminimalizować niespecyficzne wiązanie na komórkach, i inkubować w 37 °C przez 1 hr.
    2. Inkubować komórki z nanocząsteczkami w 1% BSA przez 1 hr. Dla EoL-1: inkubować z 0,2 mg/ml GdPB-A488 lub GdPB-A488-Eot3; dla BSG D10 i SUDIPG1: inkubować z 0,2 mg/ml MnPB-A488 lub MnPB-A488-ANG2. Przepłukać komórki PBS 3×, aby usunąć niezwiązane nanocząsteczki.
    3. Ostrożnie odwrócić szkiełko nakrywkowe (zawierające komórki i nanocząsteczki) na szkiełku przedmiotowym, upewniając się, że nie powstały pęcherzyki powietrza. Uszczelnić krawędź między szkiełkiem nakrywkowym a szkiełkiem przedmiotowym, ostrożnie nakładając bezbarwny lakier do paznokci. Wykonać obrazowanie komórek przy użyciu konfokalnego skaningowego mikroskopu laserowego.

7. Fluorescencyjne znakowanie komórek docelowych przy użyciu nanocząsteczek — cytometria przepływowa

Nanocząsteczki (PB NPs, GdPB oraz MnPB) mogą być wykorzystane do znakowania fluorescencyjnego populacji komórek docelowych (monitorowanych za pomocą cytometrii przepływowej) w następujący sposób:

  1. Przygotować zawiesiny docelowych komórek w PBS. W badaniach kultur czystych zawiesiny składają się z jednego typu komórek (np. BSG D10); osad komórek BSG D10 resuspendować w PBS do stężenia 100 000 komórek/ml (łącznie 10 ml). W badaniach kultur mieszanych zawiesiny składają się z co najmniej dwóch typów komórek (np. EoL-1 i OE21); analogicznie jak w przypadku BSG D10, osady komórek EoL-1 i OE21 resuspendować w PBS do stężenia 100 000 komórek/ml dla każdego z typów (łącznie 10 ml).
    1. Przygotować różne proporcje EoL-1:OE21: 1:0 (2 ml EoL-1), 3:1 (1,5 ml EoL-1, 0,5 ml OE21), 1:1 (po 1 ml EoL-1 i OE21), 1:3 (0,5 ml EoL-1, 1,5 ml OE21), 0:1 (2 ml OE21).
  2. Zablokować komórki (zawiesiny czyste i mieszane) będące celem nanocząsteczek za pomocą 2 ml 5% BSA, aby zminimalizować wiązanie nieswoiste.
  3. Dodać do komórek 1 ml (1 mg/ml) nanocząsteczek i inkubować przez 1 hr. W przypadku BSG D10 inkubować komórki z MnPB-A488, MnPB-A488-AbC (przeciwciało kontrolne) lub MnPB-A488-ANG2). W przypadku mieszanin EoL-1 i OE21 inkubować mieszaniny ze stałą ilością GdPB-A488-Eot3.
  4. Wypłukać komórki z niezwiązanych nanocząsteczek, wirując próbki z prędkością 1 000 × g przez 5 min co najmniej 3×, aby usunąć niezwiązane cząstki. Resuspendować komórki w 1 ml PBS i utrwalić za pomocą 10% formaldehydu w PBS. Barwić komórki poprzez inkubację z 10 µg/ml 7-Aminoactinomytcin D w PBS w lodzie przez 30 min. Wypłukać PBS, a następnie przeanalizować 10 000 bramkowanych komórek z każdej próbki przy użyciu cytometru przepływowego.

8. Generowanie kontrastu MRI w komórkach docelowych przy użyciu nanocząsteczek

Nanocząstki (PB NPs, GdPB oraz MnPB) mogą być wykorzystane do generowania kontrastu w MRI (zarówno w sekwencjach T1, jak i T2) w populacji komórek docelowych w następujący sposób:

  1. Przygotowanie fantoma
    1. Hodować komórki (np. BSG D10) w kolbach T75 do osiągnięcia ~80% konfluencji. Należy zastosować odpowiednie medium wzrostowe i warunki. W przypadku BSG D10 hodować komórki w DMEM + 10% FBS + 1× Pen-Strep w temperaturze 37 °C i 5% CO2.
    2. Przepłukać komórki 5 ml PBS, aby usunąć medium, a następnie zablokować komórki za pomocą 5 ml 1% BSA w PBS przez 1 h w celu zminimalizowania nieswoistego wiązania. Dodać do komórek 5 ml (0,5 mg/ml) nanocząsteczek. W przypadku BSG D10 inkubować komórki z MnPB-A488, MnPB-A488-AbC (przeciwciało kontrolne) oraz MnPB-A488-ANG2 przez 1 h.
    3. Przepłukać komórki 3× 5 ml PBS, aby usunąć niezwiązane nanocząsteczki. Przeprowadzić trypsynizację komórek poprzez inkubację z 2 ml 0,25% roztworu Trypsyny EDTA 1× przez 5 min w temperaturze 37 °C i 5% CO2, aby odłączyć je od ścianek kolby na potrzeby przygotowania fantoma. Dodać 8 ml DMEM, aby przerwać proces trypsynizacji komórek.
    4. Zebrać komórki poprzez wirowanie przy 1,000 × g przez 5 min; odessać nadsącz. Resuspenderć komórki w 1 ml PBS i dodać 1 ml 10% formaldehydu w PBS, aby utrwalić komórki. Do oddzielnych dołków płytki 96-dołkowej dodać po 100 µl każdej próbki.
    5. Do każdego dołka dodać 100 µl stopionego 1% roztworu agarozy w wodzie DI i dokładnie wymieszać za pomocą pipetowania w górę i w dół. Pozostawić żel do zastygnięcia w temperaturze 4 °C przez 12 h.
      UWAGA: W ten sposób otrzymuje się fantom zawierający komórki z przyłączonymi nanocząsteczkami w zastygłej agarozie.
    6. Umieścić fantom w poziomym klinicznym magnesie 3 T obok litego bloku 2% agaru (150 cm3). Zabezpieczyć fantom i blok agaru w centrum 8-kanałowej cewki głowowej HD. Zmierzyć czasy relaksacji, stosując przekroje koronalne o grubości 0,5 mm na wysokości połowy płytki 96-dołkowej11.
  2. Sekwencje T1- i T2-zależne
    Do akwizycji sekwencji w klinicznym magnesie MRI należy zastosować następujące ustawienia:
    1. Obrazy MR T1W pozyskać przy użyciu następującej sekwencji echa spinowego: pociąg ech (ET) = 1, czas repetycji (TR) = 650 msec, czas echa (TE) = 11 msec, rozmiar macierzy = 320 x 256, pole widzenia (FOV) = 10 x 10 cm2.
    2. Obrazy MR T2W pozyskać przy użyciu następującej sekwencji FRFSE: ET = 28; TR = 3,000 msec; TE = 101 msec; rozmiar macierzy = 384 x 288; FOV = 10 x 10 cm2.
  3. Przetwarzanie poakwizycyjne
    1. W celu ułatwienia odczytu, przekonwertować oryginalne obrazy w skali szarości na obrazy w skali kolorystycznej za pomocą programu ImageJ: Wybrać Image > Type > 8-Bit, aby przekonwertować obraz na skalę szarości.
    2. Obliczyć znormalizowaną intensywność dla każdej próbki po odjęciu wkładu sygnału z roztworu agarozy.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Wykorzystując schemat syntezy w jednym naczyniu (one-pot), można powtarzalnie syntetyzować monodyspersyjne (mierzone za pomocą DLS) nanocząsteczki PB NPs (średnica średnia 78,8 nm, indeks polidyspersyjności (PDI) = 0,230; obliczone przez instrument do dynamicznego rozpraszania światła), GdPB (średnica średnia 164,2 nm, PDI = 0,102) lub MnPB (średnica średnia 122,4 nm, PDI = 0,124) (Rycyna 2A). Zmierzone potencjały zeta zsyntetyzowanych nanocząsteczek wynoszą mniej niż -30 mV (Rycina 2B),...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

W artykule przedstawiono metody syntezy nowej klasy multimodalnych środków do obrazowania molekularnego opartych na biofunkcjonalizowanych nanocząstkach błękitu pruskiego. Metodami obrazowania molekularnego zawartymi w nanocząstkach są obrazowanie fluorescencyjne i molekularny rezonans magnetyczny, ze względu na ich uzupełniające się cechy. Biofunkcjonalizowane nanocząstki błękitu pruskiego mają konstrukcję typu rdzeń-powłoka. Kluczowymi etapami syntezy tych nanocząstek są: 1) synteza jednoetapowa, w wyniku której powsta...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez Sheikh Zayed Institute for Pediatric Surgical Innovation (RAC Awards #30000174 i 30001489).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Trójwodzian heksacyjanożelazianu (II) potasu (K4Fe(CN)6· 3H2O)Sigma-AldrichP9387
Czterowodny chlorek manganu (II) (MnCl2· 4H2O)Sigma-Aldrich221279
sześciowodny azotan gadolinu (III) (Gd(NO3)3· 6H2O)Sigma-Aldrich211591
Sześciowodny chlorek żelaza (III) (FeCl3· 6H2O)Sigma-Aldrich236489
Chlorek sodu (NaCl)Sigma-AldrichS9888
Anty-NG2 Siarczan chondroityny Proteoglikan Przeciwciało koniugatu biotynyMilliporeAB5320
Biotynylowana anty-ludzka eotaksyna-3Peprotech500-P156GBT
Linia komórkowa Neuro-2aATCCCCL-131
Linia komórkowa BSG D10Magazyn laboratoryjny---
OE21 Linia komórkowaSigma-Aldrich96062201
SUDIPG1 NeurospheresLab stock---
Eol-1 Cell LineSigma-Aldrich94042252
Bromek poli(L-lizyny)Sigma-AldrichP1399
FormaldehydSigma-AldrichF8775
Albumina surowicy bydlęcejSigma-AldrichA2153
Aminoaktynomycyna DSigma-AldrichA9400
Triton X-100Sigma-AldrichX100
CellTrace Kalceina czerwono-pomarańczowa, AMLife TechnologiesC34851
Avidin-Alexa Fluor 488Life TechnologiesA21370
WirówkaEppendorf5424
Pompa perystaltycznaInstechP270
Zetasizer Nano ZSMalvernZEN3600
SonicatorQSonicaQ125
Mieszadło z płytą grzejną/magnetycznąVWR97042-642
Ultra czysta folia aluminiowaVWR89107-732
Vortex MieszalnikVWR58816-121
Stożkowe probówki wirówkowe 1,7 mlVWR87003-295
Probówki wirówkowe stożkowe 15 mlVWR21008-918
Uchwyty probówekVWR82024-342
Kuwety jednorazowe z tworzywa sztucznegoVWR7000-590 (/586)
Zetasizer kapilarnyVWRDTS1070
Filtry odśrodkowe, kolumna wirująca 0,2 mikrometraVWR82031-356
96-dołkowa taca do hodowli komórkowychVWR29442-056
Trypsyna EDTA 0,25% roztwór 1xJR Scientific82702
Klasa hodowli komórkowej PBS (1x)Life Technologies10010023
Zestaw do oznaczania proliferacji komórek XTTTrevigen4891-025-K
Kolba T7589092-700VWR
Zmodyfikowany Eagle's MediumBiowhitaker12-604Q
Płodowa surowica bydlęcaLife Technologies10437-010
Pen-Strep 1xLife Technologies15070063
Fluoview FV1200 Konfokalny laserowy mikroskop skaningowyOlympusFV1200
Szkiełka mikroskopowe komoroweThermo Scientific154534
Okulary Micro Cover Glasses, kwadratowe, nr 1.5VWR48366-227
Szkiełka mikroskopoweVWR16004-368
RPMISigma-AldrichR8758 
AgarozaSigma-AldrichA9539 
FACSCalibur Cytometr przepływowyBD Biosciences
3 T Kliniczny magnes MRIGE Healthcare
100 ml kolba
firmy Dulbecco okrągłodenna

Bibliografia

  1. Massoud, T. F., Gambhir, S. S. Molecular imaging in living subjects: seeing fundamental biological processes in a new light. Genes Dev. 17, 545-580 (2003).
  2. Mankoff, D. A. A Definition of Molecular Imaging. J Nucl Med. 48 (6), 18N-21N (2007).
  3. James, M. L., Gambhir, S. S. A Molecular Imaging Primer: Modalities, Imaging Agents, and Applications. Phys Rev. 92, 897-965 (2012).
  4. Cao, W., Chen, X. Multimodality Molecular Imaging of Tumor Angiogenesis. J Nucl Med. 49 (2), 113S-129S (2008).
  5. Heinrich, J. L., Berseth, P. A., Long, J. R. Molecular Prussian Blue analogues: synthesis and structure of cubic Cr4Co4(CN)12 and Co8(CN)12 clusters. Chem Commun. 11, 1231-1232 (1998).
  6. Molecular Imaging and Contrast Agent Database (MICAD). , National Center for Biotechnology Information. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK5330 (2004).
  7. Zhu, D., Liu, F., Ma, L., Liu, D., Wang, Z. Nanoparticle-Based Systems for T1-Weighted Magnetic Resonance Imaging Contrast Agents. Int J Mol Sci. 14 (5), 10607-1010 (2013).
  8. Bartolini, M. E., et al. An investigation of the toxicity of gadolinium based MRI contrast agents using neutron activation analysis. Magn. Reson. Imaging. 21 (5), 541-544 (2003).
  9. Adel, B., et al. Histological validation of iron-oxide and gadolinium based MRI contrast agents in experimental atherosclerosis: The do's and don't's. Atherosclerosis. 225 (2), 274-280 (2012).
  10. Dumont, M. F., Yadavilli, S., Sze, R. W., Nazarian, J., Fernandes, R. Manganese-containing Prussian blue nanoparticles for imaging of pediatric brain tumors. Int J Nanomedicine. 9, 2581-2595 (2014).
  11. Dumont, M. F., et al. Biofunctionalized gadolinium-containing prussian blue nanoparticles as multimodal molecular imaging agents. Bioconjug Chem. 25 (1), 129-137 (2014).
  12. Yang, L., et al. Nephrogenic Systemic Fibrosis and Class Labeling of Gadolinium-based Contrast Agents by the Food and Drug Administration. Radiology. 265 (1), 248-253 (2012).
  13. Information on Gadolinium-Based Contrast Agents. , U.S. Food and Drug Administration. Available from: http://www.fda.gov/Drugs/DrugSafety/PostmarketDrugSafetyInformationforPatientsandProviders/ucm142882.htm (2013).
  14. Mendonca-Dias, M. H., Gaggelli, E., Lauterbur, P. C. Paramagnetic contrast agents in nuclear magnetic resonance medical imaging. Sem in Nuc Med. 13 (4), 364-376 (1983).
  15. Izrailev, S., Stepaniants, S., Balsera, M., Oono, Y., Schulten, K. Molecular Dynamics Study of Unbinding of the Avidin-Biotin Complex. Biophys. 72 (4), 1568-1581 (1997).
  16. Chen, Z. Y., et al. Advance of Molecular Imaging Technology and Targeted Imaging Agent in Imaging and Therapy. Biomed Res Int. 2014, 1-12 (2014).
  17. Weissleder, R., Pittet, M. J. Imaging in the era of molecular oncology. Nature. 452 (7187), 580-589 (2008).
  18. Jaiswal, J. K., Mattoussi, H., Mauro, J. M., Simon, S. M. Long-term multiple color imaging of live cells using quantum dot bioconjugates. Nature Biotech. 21 (1), 47-51 (2002).
  19. Mangrum, W., Christianson, K., Duncan, S., Hoang, P., Song, A., Merkle, E. Duke Review of MRI Principles. 304, Mosby. Philadelphia, PA. 304(2012).
  20. Shokouhimehr, M., Soehnlen, E. S., Hao, J., Griswold, M., Flask, C., Fan, X., Basilion, J. P., Basu, S., Huang, S. D. Dual purpose prussian blue nanoparticles for cellular imaging and drug delivery: a new generation of T1-weighted MRI contrast and small molecule delivery agents. J. Mater. Chem. 20, 5251-5259 (2010).
  21. Hoffman, H. A., Chakrabarti, L., Dumont, M. F., Sandler, A. D., Fernandes, R. Prussian blue nanoparticles for laser-induced photothermal therapy of tumors. RSC Adv. 4 (56), 29729-29734 (2014).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Obrazowanie fluorescencyjneobrazowanie rezonansem magnetycznymnanocz stki biofunkcjonalizowanejony gadolinu i manganupow oka z fluorescencyjnej awidynyligandy biotynilowanedynamiczne rozpraszanie wiat aanaliza cytometryczna

Powiązane artykuły