Biofunkcjonalizowane nanocząstki błękitu pruskiego do zastosowań w multimodalnym obrazowaniu molekularnym

Podsumowanie

Ten protokół opisuje syntezę biofunkcjonalizowanych pruskich niebieskich nanocząstek i ich zastosowanie jako multimodalnych, molekularnych środków obrazowania. Nanocząstki mają konstrukcję rdzeń-powłoka, w której jony gadolinu lub manganu w rdzeniu nanocząstki generują kontrast MRI. Otoczka biofunkcjonalna zawiera fluorofory do obrazowania fluorescencyjnego i ligandy celujące do celowania molekularnego.

Streszczenie

Multimodalne, obrazowanie molekularne pozwala na wizualizację procesów biologicznych w rozdzielczościach komórkowych, subkomórkowych i molekularnych przy użyciu wielu, uzupełniających się technik obrazowania. Te środki do obrazowania ułatwiają ocenę szlaków i mechanizmów in vivo w czasie rzeczywistym, co zwiększa skuteczność zarówno diagnostyczną, jak i terapeutyczną. W artykule przedstawiono protokół syntezy biofunkcjonalizowanych nanocząstek błękitu pruskiego (PB NPs) - nowej klasy środków do zastosowania w multimodalnych, molekularnych aplikacjach obrazowania. Metody obrazowania zawarte w nanocząstkach, obrazowanie fluorescencyjne i obrazowanie metodą rezonansu magnetycznego (MRI), mają cechy komplementarne. Nanocząsteczki PB mają konstrukcję rdzeń-powłoka, w której jony gadolinu i manganu włączone w przestrzenie śródmiąższowe sieci PB generują kontrast MRI, zarówno w sekwencjach zależnych T₁, jak i T₂. Nanocząsteczki PB są powlekane fluorescencyjną awidyną za pomocą elektrostatycznej samoorganizacji, która umożliwia obrazowanie fluorescencyjne. Nanocząstki pokryte awidyną są modyfikowane biotynylowanymi ligandami, które nadają nanocząstkom zdolność celowania molekularnego. Mierzona jest stabilność i toksyczność nanocząstek, a także ich relaksacyjność w MRI. Multimodalne, molekularne możliwości obrazowania tych biofunkcjonalizowanych nanocząsteczek PB są następnie demonstrowane poprzez wykorzystanie ich do obrazowania fluorescencyjnego i molekularnego rezonansu magnetycznego in vitro.

Wprowadzenie

Obrazowanie molekularne to nieinwazyjna i ukierunkowana wizualizacja procesów biologicznych na poziomie komórkowym, subkomórkowym i molekularnym¹. Obrazowanie molekularne pozwala próbce pozostać w jej naturalnym mikrośrodowisku, podczas gdy jej endogenne szlaki i mechanizmy są oceniane w czasie rzeczywistym. Zazwyczaj obrazowanie molekularne polega na podaniu egzogennego środka obrazującego w postaci małej cząsteczki, makrocząsteczki lub nanocząstki w celu wizualizacji, ukierunkowania i śledzenia odpowiednich badanych procesów fizjologicznych². Różne metody obrazowania, które zostały zbadane w obrazowaniu molekularnym, obejmują MRI, CT, PET, SPECT, ultradźwięki, fotoakustykę, spektroskopię Ramana, bioluminescencję, fluorescencję i mikroskopię przyżyciową³. Obrazowanie multimodalne to połączenie dwóch lub więcej modalności obrazowania, w którym połączenie zwiększa zdolność do wizualizacji i charakteryzowania różnych procesów i zdarzeń biologicznych⁴. Obrazowanie multimodalne wykorzystuje mocne strony poszczególnych technik obrazowania, kompensując jednocześnie ich indywidualne ograniczenia³.

Ten artykuł przedstawia protokół syntezy biofunkcjonalizowanych pruskich niebieskich nanocząstek (PB NPs) - nowej klasy multimodalnych, molekularnych środków obrazowania. Nanocząsteczki PB są wykorzystywane do obrazowania fluorescencyjnego i molekularnego rezonansu magnetycznego. PB jest pigmentem składającym się z naprzemiennych atomów żelaza (II) i żelaza (III) w sześciennej sieci skoncentrowanej na powierzchni (ryc. 1). Sieć PB składa się z liniowych ligandów cyjanku w wiązaniu Fe^{II-CN-Fe III}, które zawiera kationy w celu zrównoważenia ładunków w swojej trójwymiarowej sieci⁵. Zdolność PB do włączania kationów do swojej sieci jest wykorzystywana przez oddzielne ładowanie jonów gadolinu i manganu do NP PB w celu kontrastu MRI.

Uzasadnieniem dla projektu nanocząsteczek dla kontrastu MRI są korzyści, jakie ten projekt oferuje w stosunku do obecnych środków kontrastowych MRI. Zdecydowana większość zatwierdzonych przez amerykańską FDA środków kontrastowych MRI to chelaty gadolinu, które mają charakter paramagnetyczny i zapewniają dodatni kontrast dzięki mechanizmowi relaksacji sieci spinowej^6,7,8. W porównaniu z pojedynczym chelatem gadolinu, który sam w sobie zapewnia niską intensywność sygnału, włączenie wielu jonów gadolinu do sieci PB nanocząstek zapewnia zwiększoną intensywność sygnału (dodatni kontrast)^3,9. Co więcej, obecność wielu jonów gadolinu w sieci PB zwiększa ogólną gęstość spinu i wielkość paramagnetyzmu nanocząstek, co zaburza lokalne pole magnetyczne w ich pobliżu, generując w ten sposób ujemny kontrast przez mechanizm relaksacji spinowo-spinowej. W ten sposób nanocząstki zawierające gadolin działają zarówno jako środki kontrastowe T₁ (dodatni), jak i T₂ (ujemne)^10,11.

W podgrupie pacjentów z zaburzeniami czynności nerek, podawanie środków kontrastowych na bazie gadolinu zostało powiązane z rozwojem nerkopochodnego zwłóknienia układowego^{8,12, 13}. Obserwacja ta skłoniła do badań nad zastosowaniem alternatywnych jonów paramagnetycznych jako środków kontrastowych w rezonansie magnetycznym. W związku z tym wszechstronna konstrukcja nanocząstek jest przystosowana do włączania jonów manganu do sieci PB. Podobnie jak chelaty gadolinu, chelaty manganu są również paramagnetyczne i są zwykle używane do zapewnienia dodatniej intensywności sygnału w MRI^7,14. Podobnie jak w przypadku NP PB zawierających gadolin, NP PB zawierające mangan działają również jako środki kontrastowe T₁ (dodatni) i T₂ (ujemny).

Aby włączyć możliwości obrazowania fluorescencyjnego, "rdzenie" nanocząsteczek są pokryte "biofunkcjonalną" powłoką składającą się z znakowanej fluorescencyjnie glikoproteiny awidyny (Rysunek 1). Awidyna nie tylko umożliwia obrazowanie fluorescencyjne, ale służy również jako platforma dokująca dla biotynylowanych ligandów, które celują w określone komórki i tkanki. Wiązanie awidyna–biotyna jest jednym z najsilniejszych znanych, niekowalencyjnych wiązań charakteryzujących się niezwykle silnym powinowactwem wiązania pomiędzy awidyną a biotyną¹⁵. Przyłączenie biotynylowanych ligandów do nanocząsteczek PB pokrytych awidyną nadaje nanocząsteczkom PB możliwości celowania molekularnego.

Motywacją do kontynuowania obrazowania fluorescencyjnego i MR za pomocą NP PB jest to, że te metody obrazowania posiadają cechy komplementarne. Obrazowanie fluorescencyjne jest jedną z najczęściej stosowanych technik optycznego obrazowania molekularnego i pozwala na jednoczesną wizualizację wielu obiektów przy wysokiej czułości^1,16,17. Obrazowanie fluorescencyjne jest bezpieczną, nieinwazyjną metodą, ale wiąże się z niską głębokością penetracji i rozdzielczościami przestrzennymi^1,3,16. Z drugiej strony, rezonans magnetyczny generuje wysoką rozdzielczość czasową i przestrzenną nieinwazyjnie i bez konieczności stosowania promieniowania jonizującego^1,3,16. Jednak MRI cierpi na niską czułość. Dlatego obrazowanie fluorescencyjne i MRI zostały wybrane jako techniki obrazowania molekularnego ze względu na ich uzupełniające się cechy penetracji głębokości, czułości i rozdzielczości przestrzennej.

Ten artykuł przedstawia protokół syntezy i biofunkcjonalizacji NP PB, NP zawierających gadolin (GdPB) i NP PB zawierających mangan (MnPB)^10,11. Opisano następujące metody: 1) pomiar wielkości, ładunku i stabilności czasowej nanocząstek, 2) ocena cytotoksyczności nanocząstek, 3) pomiar relaksacji MRI oraz 4) wykorzystanie nanocząstek do obrazowania fluorescencyjnego i molekularnego MR populacji docelowych komórek in vitro. Wyniki te wskazują na potencjał nanocząsteczek do stosowania jako multimodalne środki do obrazowania molekularnego in vivo.

Protokół

1. Synteza PB NP, GDPB i MnPB

Synteza nanocząstek (PB NPs, GdPB lub MnPB) jest osiągana przy użyciu jednoetapowego schematu syntezy, wykonując kroki opisane poniżej:

1. Przygotować roztwór "A" zawierający 5 ml 5 mM heksacyjanożelazianu (II) potasu w wodzie dejonizowanej (DI). W zależności od rodzaju syntetyzowanej nanocząstki — PB NPs, GdPB lub MnPB, należy przygotować roztwór "B" w następujący sposób:
   1. Dla PB NPs: przygotować 10 ml roztworu zawierającego 2,5 mM chlorku żelaza (III) w wodzie demineralizowanej.
   2. Dla NP GdPB: przygotować 10 ml roztworu zawierającego po 2,5 mM azotanu gadolinu (III) i chlorku żelaza (III) w wodzie demineralizowanej
   3. Dla nanocząsteczek MnPB: przygotować 10 ml roztworu zawierającego po 2,5 mM chlorku manganu (II) i chlorku żelaza (III) w wodzie demineralizowanej.
2. Dodać roztwór "B" do kolby okrągłodennej i wymieszać zawartość kolby w temperaturze pokojowej (RT) i 1 000 obr./min. Dodawać kroplami roztwór "A" do kolby okrągłodennej zawierającej roztwór "B". Kontrolować natężenie przepływu przy dodawaniu roztworu "A" do "B" za pomocą pompy perystaltycznej ustawionej na dozowanie około 10 ml/h.
3. Kontynuować mieszanie z prędkością 1 000 obr./min w temperaturze pokojowej przez dodatkowe 30 minut po zakończeniu dodawania roztworu "A" do "B". Przestań mieszać i zbierz mieszaninę.
4. Przenieść podwielokrotności mieszaniny do probówek mikrowirówek w celu wypłukania nanocząstek z nieprzereagowanych składników. Dodać 5 M NaCl (0,2 ml NaCl/ml mieszaniny reakcyjnej) do każdej podwielokrotności, aby pomóc w zbieraniu cząstek przez odwirowanie.
5. Odwirować każdą porcję nanocząstek przez co najmniej 10 minut w temperaturze 20 000 × g. Po odwirowaniu ostrożnie usunąć supernatant.
6. Ponownie zawiesić każdą osadkę nanocząstek w 1 ml wody DI za pomocą sonikacji za pomocą mikrokońcówki (włączanie/wyłączanie impulsu sonikacji = 1/1 sekundy, amplituda = 50%, czas trwania = 5 sekund, moc znamionowa sonikatora = 125 W), aby rozbić osad.
7. Powtórzyć kroki 1.4-1.6 co najmniej 3×, aby upewnić się, że nanocząstki są wolne od składników początkowej reakcji i produktów ubocznych reakcji. Po końcowym odwirowaniu ponownie zawiesić cząstki w 1 ml wody demineralizowanej.

2. Biofunkcjonalizacja NP PB, GdPB i MnPB

Biofunkcjonalizacja nanocząstek polega na pokryciu "rdzeni" nanocząstek awidyną i dodaniu biotynylowanych ligandów, jak opisano poniżej:

1. Powlekanie nanocząstek fluorescencyjnym Avidin
   Powlekanie nanocząstek fluorescencyjną awidyną uzyskuje się za pomocą elektrostatycznej samoorganizacji, w której dodatnio naładowana awidyna (pI ~ 10,5) jest powlekana ujemnie naładowanymi nanocząstkami^{w następujący sposób}:
   1. Przygotować zawiesiny PB NPs, GdPB lub MnPB w 1 ml wody DI. Przefiltruj awidynę znakowaną przez Alexa Fluor 488 (A488; rozpuszczoną w wodzie demineralizowanej) przez nylonowy filtr mikrowirówkowy 0,2 μm przy 14 000 × g przez 10 min. Dodać ≤0,2 mg nanocząstek awidyny/mg. Dodaj każdą przefiltrowaną podwielokrotność A488 oddzielnie do podwielokrotności PB NPs, GdPB lub MnPB.
   2. Kontaktować nanocząstki z A488 przez 2-4 godziny, delikatnie wstrząsając lub obracając w temperaturze 4 °C. Chronić próbki przed światłem za pomocą folii aluminiowej.
      UWAGA: Ten krok daje NP PB pokryte A488 (PB-A488), GdPB (GdPB-A488) i MnPB (MnPB-A488).
2. Przyłączenie przeciwciał biotynylowanych
   Przyłączenie biotynylowanych przeciwciał celujących do nanocząstek pokrytych awidyną uzyskuje się za pomocą oddziaływań awidyna-biotyna w następujący sposób:
   1. Przygotować zawiesiny nanocząstek pokrytych awidyną — PB-A488, GdPB-A488 i MnPB-A488 w 1 ml wody demineralizowanej. Przefiltrować biotynylowane przeciwciało (dostarczone przez producenta) przez nylonowy filtr wirówkowy 0,2 μm o sile 14 000 × g przez 10 min.
      UWAGA: W niniejszym badaniu wykorzystuje się biotynylowany anty-neuronalno-glejowy antygen 2 (ANG2), który celuje w nadekspresję NG2 w komórkach i tkankach ośrodkowego układu nerwowego oraz biotynylowaną anty-ludzką eotaksynę-3 (Eot3), która celuje w receptory z nadekspresją na eozynofilach lub eozynofilowych liniach komórkowych.
   2. Dodać każdą przefiltrowaną podwielokrotność biotynylowanego przeciwciała oddzielnie do podwielokrotności nanocząstek pokrytych awidyną. Dodać ≤0,05 mg biotynylowanego przeciwciała/mg nanocząstek pokrytych awidyną. Nanocząstki pokryte awidyną należy kontaktować z biotynylowanymi przeciwciałami (ANG2 lub Eot3) przez 2-4 godziny, delikatnie wstrząsając lub obracając w temperaturze 4 °C. Próbki należy chronić przed światłem za pomocą folii aluminiowej.
      UWAGA: Na tym etapie otrzymujemy nanocząstki pokryte przeciwciałem (np. GdPB-A488-Eot3 i MnPB-A488-ANG2).

3. Rozmiar, potencjał zeta i stabilność czasowa nanocząstek

Rozkład rozmiaru, ładunek i stabilność nanocząstek są mierzone za pomocą metod dynamicznego rozpraszania światła (DLS), jak opisano poniżej:

1. Wymiarowanie nanocząstek
   Wymiarowanie nanocząstek uzyskuje się za pomocą dynamicznego rozpraszania światła w następujący sposób:
   1. Dodać 10 μl próbki nanocząstek (1 mg/ml) do 990 μl wody demineralizowanej w jednorazowej plastikowej kuwecie.
      UWAGA: Jest to wartość reprezentatywna dla dobrego sygnału DLS.
   2. Zakręć kuwetę i wiruj, aby dobrze wymieszać. Umieść kuwetę w systemie służącym do analizy wielkości cząstek w celu zmierzenia wielkości nanocząstek. Przeprowadzić analizę wielkości cząstek pod kątem pomiaru 173°.
2. Potencjał Zeta nanocząstek
   Potencjał Zeta nanocząstek mierzy się za pomocą analizy fazowej rozpraszania światła w następujący sposób:
   1. Dodać 100 μl próbki nanocząstek (1 mg/ml) do 900 μl wody demineralizowanej w jednorazowej plastikowej komorze kapilarnej. Wartość ta jest reprezentatywna dla dobrego pomiaru potencjału zeta.
   2. Umieścić komórkę kapilarną w systemie służącym do analizy potencjału zeta w celu zmierzenia potencjału zeta nanocząstek przy użyciu domyślnych parametrów w temperaturze 25 °C.
3. Stabilność czasowa nanocząstek
   Stabilność czasową nanocząstek mierzy się za pomocą dynamicznego rozpraszania światła w następujący sposób:
   1. Ocenić stabilność nanocząstek, mierząc rozmiary nanocząstek w wodzie demineralizowanej, a także w zmodyfikowanym pożywce Eagle's Medium (DMEM) firmy Dulbecco, jak opisano w sekcji 3.1.
   2. Powtarzaj pomiary wielkości w wodzie DI i DMEM raz dziennie przez okres 5 dni.

4. Cytotoksyczność nanocząstek

Cytotoksyczność nanocząsteczek jest mierzona za pomocą testu proliferacji komórek XTT w następujący sposób:

1. Wysiewaj 10 000-15 000 komórek / dołek każdego badanego typu komórek (Neuro2a, BSG D10, EoL-1 i OE21) na 96-dołkowej płytce. Upewnij się, że całkowita objętość wysianych komórek nie przekracza 0,2 ml / studzienkę. Wysiane komórki inkubować przez noc w temperaturze 37 °C i 5% CO₂ .
2. Kontakt nanocząstek z komórkami:
   1. Inkubować komórki z różnymi stężeniami nanocząstek (0,01 – 0,5 mg/ml). Patrz Tabela 1 jako reprezentatywna tabela opisująca ilości nanocząstek (w 50 μl) dodanych do komórek po usunięciu 50 μl pożywki/basenika.
      1. Aby uwzględnić jakąkolwiek zakłócającą absorbancję nanocząstek w badaniu, należy dodać ślepą próbę składającą się z odpowiedniego stężenia nanocząstek (0-0,5 mg/ml; równoważnie z ilościami dodanymi do komórek) do pożywki bez komórek.
   2. Inkubować komórki z nanocząstkami przez noc w temperaturze 37 °C i 5% CO₂ . Odessać pożywkę z każdej studzienki i przepłukać buforem barwiącym składającym się z 5% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) w roztworze buforowanym fosforanem (PBS). Dodać 100 μl pożywki bez czerwieni fenolowej i inkubować w temperaturze 37 °C i 5% CO₂ przez 16-18 godzin.
3. Przygotuj roztwór roboczy do testu proliferacji komórek XTT, mieszając składniki zestawu (odczynnik XTT i aktywator XTT) zgodnie ze specyfikacją producenta. Odessać pożywkę ze studzienek i dodać 100 μl RPMI (RPMI bez czerwieni fenolowej + 10% FBS + 1× Pen-Strep) lub pożywki odpowiedniej dla badanego typu komórek. Dodać 50 μl roztworu roboczego XTT do każdej studzienki i inkubować w temperaturze 37 °C i 5% CO₂ przez 2-2,5 godziny.
4. Zmierzyć absorbancję przy długości fali 490 nm przy długości fali odniesienia 630 nm w celu skorygowania odcisków palców lub smug. Obliczyć skorygowaną absorbancję dla każdej studzienki (A_{490-A 630}) i uśrednić odczyty dla kontrprób.
5. Odejmij odczyty ślepej próby od każdej wartości studzienki, aby obliczyć końcowe skorygowane wartości absorbancji. Obliczyć procent przeżywalności dla każdej próbki, normalizując końcową skorygowaną absorbancję do absorbancji komórek niepoddanych działaniu nanocząstek. Wykreślić procent przeżycia w funkcji stężenia nanocząstek.

5. Relaksacyjność MRI NPs, GdPB i MnPB

Relaksacyjność MRI mierzy się za pomocą sekwencji T₁- i T_2-ważonych, przygotowując "fantom" MRI przy użyciu 96-dołkowej płytki zawierającej nanocząstki, jak opisano poniżej:

1. Przygotowanie fantomowe
   1. Przygotować 96-dołkową płytkę, z której każda zawiera 100 μl nanocząstek (PB NPs, GdPB lub MnPB) w odpowiednim stężeniu. Zaczynając od stężenia 0,4 mM dla każdego rodzaju nanocząstki, seryjnie rozcieńczaj nanocząstki 2× używając wody DI, aż do osiągnięcia stężenia 2,4 × ^10-5 M (wymaga to 14 rozcieńczeń i 15 studzienek).
   2. Dodaj 100 μl stopionego 1% roztworu agarozy w wodzie DI do każdej studzienki i dobrze wymieszaj. Pozostawić żel do zestalenia się w temperaturze 4 °C przez 12 godz.
      UWAGA: W ten sposób powstaje fantom zawierający seryjne rozcieńczenia nanocząstek w zestalonej agarozie.
   3. Umieść fantom w poziomym magnesie klinicznym 3 T pod solidnym blokiem 2% agaru (150 cm³). Zabezpiecz fantom i blok agaru w środku 8-kanałowej cewki mózgowej HD. Zmierz czasy relaksacji za pomocą plastrów koronalnych o grubości 0,5 mm w połowie wysokości 96-dołkowej płytki¹¹.
2. T_{Sekwencje 1}- i T_2-ważone
   Użyj następujących reprezentatywnych ustawień do pozyskiwania sekwencji w magnesie klinicznym.
   UWAGA: Wartości te są zoptymalizowane dla nanocząstek użytych w niniejszym badaniu:
   1. Uzyskaj obrazy MR T_1-zależne (T1W) przy użyciu następującej sekwencji odzyskiwania inwersji z tłumieniem płynu (FLAIR): Ciąg echa (ET) = 8, Czas powtarzania (TR) = 2,300 ms, Czas echa (TE) = 24,4 ms, Rozmiar matrycy = 512 x 224, Pole widzenia (FOV) = 16 x 16 cm².
   2. Pozyskaj obrazy MR T_2-zależne (T2W) przy użyciu następującej sekwencji szybkiego echa spinowego (FRFSE): ET = 21; TR = 3 500 ms; TE = 104 ms; Rozmiar matrycy = 512 x 224; Pole widzenia = 16 x 16 cm².
   3. Uzyskuj obrazy T1W i T2W MR na częstotliwości 127 MHz (3 T) w następujących czasach inwersji: 50, 177, 432, 942, 1 961 i 4 000 ms.
3. Pomiar relaksacji MRI
   1. Po uzyskaniu obrazów T1W i T2W przy użyciu sekwencji opisanych w sekcji 5.2, zmierz intensywność sygnału dla każdej studni za pomocą ImageJ, odtąd oznaczonego jako obszar zainteresowania (ROI), wybierając każdy ROI za pomocą owalnego przycisku przycinania znajdującego się na głównym pasku narzędzi, a następnie wybierając Analizuj > Mierz.
      UWAGA: Wyskakujące okienko powinno wyświetlać średnią intensywność sygnału każdego zwrotu z inwestycji w kolumnie oznaczonej "Średnia".
   2. Dla każdego zwrotu z inwestycji wykreśl zmierzoną intensywność sygnału w stosunku do określonego czasu odwrócenia. W razie potrzeby odwróć punkty (odczyty), które generują początkową "bańkę" lub wartości odstające na początku wykresu (dolne czasy odwrócenia).
      UWAGA: Odczyty te są generowane przy niskich czasach inwersji, ponieważ MRI mierzy wielkość lub wartość bezwzględną obrazów, a nie ich rzeczywistą (ujemną) wartość, którą należy uwzględnić/skorygować dla¹⁹.
   3. Przygotuj dopasowanie wykładnicze dla każdego wykresu intensywności sygnału dla ROI (SI) w funkcji czasów inwersji (T_I), jak opisano w sekcji 5.2. Wykres T_I na osi x, SI na osi y; ɑ i Δ są stałymi wyznaczonymi przez regresję, a T₁ lub T₂ to zmienna do rozwiązania:
      
      gdzie t = T₁, T₂.
   4. Rozwiąż dla T₁ lub T₂ za pomocą powyższego równania i wykreśl odwrotność obliczonych wartości (1/T₁ i 1/T₂) w stosunku do stężeń nanocząstek użytych w każdym ROI.
   5. Oblicz nachylenie wykresu liniowego, które daje relaksyjność r₁ i r₂,
      UWAGA: Poniższa sekcja protokołu opisuje zastosowanie nanocząstek do znakowania fluorescencyjnego i generowania kontrastu MRI w docelowych komórkach.

6. Fluorescencyjne znakowanie docelowych komórek za pomocą nanocząstek — mikroskopia konfokalna

UWAGA: Nanocząstki (PB NPs, GdPB i MnPB) mogą być używane do fluorescencyjnego znakowania populacji docelowych komórek (monitorowanych za pomocą mikroskopii konfokalnej) w następujący sposób:

1. Synteza nanocząstek fluorescencyjnych
   1. Zsyntetyzować GdPB-A488, GdPB-A488-EOT3, MnPB-A488, MnPB-A488-ANG2 w celu znakowania fluorescencyjnego populacji komórek docelowych, wykonując czynności opisane w sekcjach 1 i 2.
2. Przygotowanie komórek do celowania fluorescencyjnego
   1. Pokryj mikro okulary nakrywkowe nr 1,5, zanurzając je w roztworze 0,002% bromowodorku poli(L-lizyny) na 90 min. Wyjmij okulary nakrywkowe z roztworu i pozostaw do wyschnięcia na 24 godziny.
   2. Wysiewa komórki (np. EoL-1, BSG, D10, SUDIPG1) na powlekanych szkiełkach nakrywkowych umieszczonych na płytce 6-dołkowej i inkubuje w temperaturze 37 °C i 5% CO₂ przez co najmniej 16 godzin. Przepłukać komórki roztworem 1× PBS i (opcjonalnie) utrwalić 10% formaldehydem w obojętnym roztworze buforowym przez 15 min. Wybarwić komórki 5 μM czerwono-pomarańczowym barwnikiem przepuszczalnym dla komórek w PBS w temperaturze 37 °C przez 30 min. Następnie przepłucz komórki PBS.
3. >Znakowanie fluorescencyjne docelowych komórek
   1. Dodać 1% albuminy surowicy bydlęcej (BSA; w wodzie demineralizowanej) do komórek, aby zminimalizować niespecyficzne wiązanie na komórkach, i inkubować w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę.
   2. Inkubować komórki z nanocząstkami w 1% BSA przez 1 godzinę. W przypadku EoL-1: inkubować z 0,2 mg/ml GdPB-A488 lub GdPB-A488-Eot3; W przypadku BSG D10 i SUDIPG1: inkubować z 0,2 mg/ml MnPB-A488 lub MnPB-A488-ANG2. Przepłucz komórki PBS 3× aby usunąć niezwiązane nanocząstki.
   3. Ostrożnie odwróć szkło nakrywkowe (zawierające komórki i nanocząstki) na szkiełku mikroskopowym, upewniając się, że nie ma uwięzionych pęcherzyków powietrza. Uszczelnij krawędź między szkłem nakrywkowym a szkiełkiem mikroskopowym, ostrożnie nakładając przezroczysty lakier do paznokci. Zobrazuj komórki za pomocą konfokalnego laserowego mikroskopu skaningowego.

7. Znakowanie fluorescencyjne docelowych komórek za pomocą nanocząstek — cytometria przepływowa

Nanocząstki (PB NPs, GdPB i MnPB) mogą być używane do fluorescencyjnego znakowania populacji docelowych komórek (monitorowanych za pomocą cytometrii przepływowej) w następujący sposób:

1. Przygotować zawiesiny komórek, które są celem PBS. W przypadku badań z czystymi kulturami zawiesiny składają się z pojedynczego typu komórek (np. BSG D10); ponownie zawiesić osad komórkowy komórek BSG D10 w PBS w stężeniu 100 000 komórek/ml (łącznie 10 ml). W przypadku badań z kulturami mieszanymi zawiesiny składają się z co najmniej dwóch typów komórek (np. EoL-1 i OE21); podobnie jak w przypadku BSG D10, ponownie zawiesić granulki komórkowe EoL-1 i OE21 w PBS w ilości 100 000 komórek/ml każda (łącznie 10 ml).
   1. Przygotuj różne proporcje EoL-1:OE21: 1:0 (2 ml EoL-1), 3:1 (1,5 ml EoL-1, 0,5 ml OE21), 1:1 (po 1 ml EoL-1 i OE21), 1:3 (0,5 ml EoL-1, 1,5 ml OE21), 0:1 (2 ml OE21).
2. Zablokuj komórki (czyste i mieszane zawiesiny), na które namierzane są nanocząstki, za pomocą 2 ml 5% BSA, aby zminimalizować niespecyficzne wiązanie.
3. Dodać 1 ml (1 mg/ml) nanocząstek do komórek i inkubować przez 1 godzinę. W przypadku BSG D10 inkubować komórki z MnPB-A488, MnPB-A488-AbC (przeciwciało kontrolne) lub MnPB-A488-ANG2). W przypadku mieszanin EoL-1 i OE21 inkubować mieszaniny z ustaloną ilością GdPB-A488-Eot3.
4. Wypłukać komórki z niezwiązanych nanocząstek, obracając próbki o masie 1 000 × g przez 5 minut co najmniej 3× w celu usunięcia niezwiązanych cząstek. Ponownie zawiesić komórki w 1 ml PBS i utrwalić 10% formaldehydem w PBS. Barwienie komórek przez inkubację z 10 μg/ml 7-aminoaktynomycycyny D w PBS na lodzie przez 30 min. Przepłukać PBS, a następnie przeanalizować 10 000 bramkowanych komórek z każdej próbki za pomocą cytometru przepływowego.

8. Generowanie kontrastu MRI na wybranych komórkach za pomocą nanocząsteczek

Nanocząstki (PB NPs, GdPB i MnPB) mogą być użyte do wygenerowania kontrastu MRI (zarówno w sekwencjach T₁, jak i T_2-zależnych) w populacji docelowych komórek w następujący sposób:

1. Przygotowanie fantomowe
   1. Hoduj komórki (np. BSG D10) w kolbach T75 aż do ~80% konfluencji. Używaj odpowiedniego podłoża i warunków wzrostu. W przypadku BSG D10 hoduj komórki w DMEM + 10% FBS + 1× Pen-Strep w temperaturze 37 °C i 5% CO₂ .
   2. Wypłucz komórki z pożywki za pomocą 5 ml PBS i zablokuj komórki 5 ml 1% BSA w PBS na 1 godzinę, aby zminimalizować niespecyficzne wiązanie. Dodaj 5 ml (0,5 mg/ml) nanocząsteczek do komórek. W przypadku BSG D10 inkubować komórki z MnPB-A488, MnPB-A488-AbC (przeciwciało kontrolne) i MnPB-A488-ANG2 przez 1 godzinę.
   3. Przepłukać komórki 3× 5 ml PBS w celu usunięcia niezwiązanych nanocząstek. Trypsynizować komórki, inkubując je z 2 ml 0,25% roztworu trypsyny EDTA 1× przez 5 minut w temperaturze 37 °C i 5% CO₂ w celu odłączenia ich od kolby w celu przygotowania fantomu. Dodać 8 ml DMEM, aby wygasić trypsynizację komórek.
   4. Zebrać komórki, odwirowując je w stężeniu 1 000 × g przez 5 minut; odessać supernatant. Ponownie zawiesić komórki w 1 ml PBS i dodać 1 ml 10% formaldehydu do PBS, aby utrwalić komórki. Dodać 100 μl każdej próbki do oddzielnego dołka na 96-dołkowej płytce.
   5. Dodaj 100 μl stopionego 1% roztworu agarozy w wodzie demineralizowanej do każdej studzienki i dobrze wymieszaj, pipetując w górę iw dół. Pozostawić żel do zestalenia się w temperaturze 4 °C przez 12 godz.
      UWAGA: W ten sposób powstaje fantom zawierający komórki z przyłączonymi nanocząstkami w zestalonej agarozie.
   6. Umieść fantom w poziomym magnesie klinicznym 3 T obok solidnego bloku 2% agaru (150 cm³). Zabezpiecz fantom i blok agaru w środku 8-kanałowej cewki mózgowej HD. Zmierz czasy relaksacji za pomocą plastrów koronalnych o grubości 0,5 mm w połowie wysokości 96-dołkowej płytki¹¹.
2. T_{Sekwencje 1}- i T_2-ważone
   Użyj następujących ustawień, aby uzyskać sekwencje w klinicznym magnesie MRI:
   1. Uzyskaj obrazy T1W MR przy użyciu następującej sekwencji echa spinowego: Ciąg echa (ET) = 1, Czas powtarzania (TR) = 650 ms, Czas echa (TE) = 11 ms, Rozmiar matrycy = 320 x 256, Pole widzenia (FOV) = 10 x 10 cm².
   2. Pozyskaj obrazy T2W MR przy użyciu następującej sekwencji FRFSE: ET = 28; TR = 3 000 ms; TE = 101 ms; Rozmiar matrycy = 384 x 288; Pole widzenia = 10 x 10 cm².
3. Przetwarzanie po przejęciu
   1. Aby ułatwić czytanie, przekonwertuj oryginalne obrazy w skali szarości na obraz w skali kolorów za pomocą ImageJ: Wybierz opcję Image > Type (Typ obrazu) > 8-bitowy, aby przekonwertować obraz na skalę szarości.
   2. Obliczyć znormalizowaną intensywność dla każdej próbki po odjęciu wkładu sygnału od roztworu agarozy.

Wyniki

Korzystając ze schematu syntezy jednogarnkowej, nanocząstki PB NPs (średnia średnica 78,8 nm, wskaźnik polidyspersyjności (PDI) = 0,230; obliczony przez instrument do dynamicznego rozpraszania światła), GdPB (średnia średnica 164,2 nm, PDI = 0,102) lub MnPB (średnia średnica 122,4 nm, PDI = 0,124), które są monodyspersyjne (mierzone przez DLS) mogą być konsekwentnie syntetyzowane (Rysunek 2A). Zmierzone potencjały zeta zsyntetyzowanych nanocząstek są mniejsze niż -30 mV (rysunek 2B), co ...

Dyskusja

W artykule przedstawiono metody syntezy nowej klasy multimodalnych środków do obrazowania molekularnego opartych na biofunkcjonalizowanych nanocząstkach błękitu pruskiego. Metodami obrazowania molekularnego zawartymi w nanocząstkach są obrazowanie fluorescencyjne i molekularny rezonans magnetyczny, ze względu na ich uzupełniające się cechy. Biofunkcjonalizowane nanocząstki błękitu pruskiego mają konstrukcję typu rdzeń-powłoka. Kluczowymi etapami syntezy tych nanocząstek są: 1) synteza jednoetapowa, w wyniku której powsta...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Trójwodzian heksacyjanożelazianu (II) potasu (K4Fe(CN)6· 3H2O)	Sigma-Aldrich	P9387
Czterowodny chlorek manganu (II) (MnCl2· 4H2O)	Sigma-Aldrich	221279
sześciowodny azotan gadolinu (III) (Gd(NO3)3· 6H2O)	Sigma-Aldrich	211591
Sześciowodny chlorek żelaza (III) (FeCl3· 6H2O)	Sigma-Aldrich	236489
Chlorek sodu (NaCl)	Sigma-Aldrich	S9888
Anty-NG2 Siarczan chondroityny Proteoglikan Przeciwciało koniugatu biotyny	Millipore	AB5320
Biotynylowana anty-ludzka eotaksyna-3	Peprotech	500-P156GBT
Linia komórkowa Neuro-2a	ATCC	CCL-131
Linia komórkowa BSG D10	Magazyn laboratoryjny	---
OE21 Linia komórkowa	Sigma-Aldrich	96062201
SUDIPG1 Neurospheres	Lab stock	---
Eol-1 Cell Line	Sigma-Aldrich	94042252
Bromek poli(L-lizyny)	Sigma-Aldrich	P1399
Formaldehyd	Sigma-Aldrich	F8775
Albumina surowicy bydlęcej	Sigma-Aldrich	A2153
Aminoaktynomycyna D	Sigma-Aldrich	A9400
Triton X-100	Sigma-Aldrich	X100
CellTrace Kalceina czerwono-pomarańczowa, AM	Life Technologies	C34851
Avidin-Alexa Fluor 488	Life Technologies	A21370
Wirówka	Eppendorf	5424
Pompa perystaltyczna	Instech	P270
Zetasizer Nano ZS	Malvern	ZEN3600
Sonicator	QSonica	Q125
Mieszadło z płytą grzejną/magnetyczną	VWR	97042-642
Ultra czysta folia aluminiowa	VWR	89107-732
Vortex Mieszalnik	VWR	58816-121
Stożkowe probówki wirówkowe 1,7 ml	VWR	87003-295
Probówki wirówkowe stożkowe 15 ml	VWR	21008-918
Uchwyty probówek	VWR	82024-342
Kuwety jednorazowe z tworzywa sztucznego	VWR	7000-590 (/586)
Zetasizer kapilarny	VWR	DTS1070
Filtry odśrodkowe, kolumna wirująca 0,2 mikrometra	VWR	82031-356
96-dołkowa taca do hodowli komórkowych	VWR	29442-056
Trypsyna EDTA 0,25% roztwór 1x	JR Scientific	82702
Klasa hodowli komórkowej PBS (1x)	Life Technologies	10010023
Zestaw do oznaczania proliferacji komórek XTT	Trevigen	4891-025-K
Kolba T75	89092-700	VWR
Zmodyfikowany Eagle's Medium	Biowhitaker	12-604Q
Płodowa surowica bydlęca	Life Technologies	10437-010
Pen-Strep 1x	Life Technologies	15070063
Fluoview FV1200 Konfokalny laserowy mikroskop skaningowy	Olympus	FV1200
Szkiełka mikroskopowe komorowe	Thermo Scientific	154534
Okulary Micro Cover Glasses, kwadratowe, nr 1.5	VWR	48366-227
Szkiełka mikroskopowe	VWR	16004-368
RPMI	Sigma-Aldrich	R8758
Agaroza	Sigma-Aldrich	A9539
FACSCalibur Cytometr przepływowy	BD Biosciences
3 T Kliniczny magnes MRI	GE Healthcare
100 ml kolba