Method Article

Biofunkcjonalizowane nanocząstki błękitu pruskiego do zastosowań w multimodalnym obrazowaniu molekularnym

DOI:

10.3791/52621

⸱

April 28th, 2015

 ,  ,  ,  , 
1The Sheikh Zayed Institute for Pediatric Surgical Innovation, Children's National Medical Center, 2Fischell Department of Bioengineering, University of Maryland, 3Department of Radiology, George Washington University, 4Department of Pediatrics, George Washington University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół opisuje syntezę biofunkcjonalizowanych pruskich niebieskich nanocząstek i ich zastosowanie jako multimodalnych, molekularnych środków obrazowania. Nanocząstki mają konstrukcję rdzeń-powłoka, w której jony gadolinu lub manganu w rdzeniu nanocząstki generują kontrast MRI. Otoczka biofunkcjonalna zawiera fluorofory do obrazowania fluorescencyjnego i ligandy celujące do celowania molekularnego.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Multimodalne, obrazowanie molekularne pozwala na wizualizację procesów biologicznych w rozdzielczościach komórkowych, subkomórkowych i molekularnych przy użyciu wielu, uzupełniających się technik obrazowania. Te środki do obrazowania ułatwiają ocenę szlaków i mechanizmów in vivo w czasie rzeczywistym, co zwiększa skuteczność zarówno diagnostyczną, jak i terapeutyczną. W artykule przedstawiono protokół syntezy biofunkcjonalizowanych nanocząstek błękitu pruskiego (PB NPs) - nowej klasy środków do zastosowania w multimodalnych, molekularnych aplikacjach obrazowania. Metody obrazowania zawarte w nanocząstkach, obrazowanie fluorescencyjne i obrazowanie metodą rezonansu magnetycznego (MRI), mają cechy komplementarne. Nanocząsteczki PB mają konstrukcję rdzeń-powłoka, w której jony gadolinu i manganu włączone w przestrzenie śródmiąższowe sieci PB generują kontrast MRI, zarówno w sekwencjach zależnych T1, jak i T2. Nanocząsteczki PB są powlekane fluorescencyjną awidyną za pomocą elektrostatycznej samoorganizacji, która umożliwia obrazowanie fluorescencyjne. Nanocząstki pokryte awidyną są modyfikowane biotynylowanymi ligandami, które nadają nanocząstkom zdolność celowania molekularnego. Mierzona jest stabilność i toksyczność nanocząstek, a także ich relaksacyjność w MRI. Multimodalne, molekularne możliwości obrazowania tych biofunkcjonalizowanych nanocząsteczek PB są następnie demonstrowane poprzez wykorzystanie ich do obrazowania fluorescencyjnego i molekularnego rezonansu magnetycznego in vitro.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Obrazowanie molekularne to nieinwazyjna i ukierunkowana wizualizacja procesów biologicznych na poziomie komórkowym, subkomórkowym i molekularnym1. Obrazowanie molekularne pozwala próbce pozostać w jej naturalnym mikrośrodowisku, podczas gdy jej endogenne szlaki i mechanizmy są oceniane w czasie rzeczywistym. Zazwyczaj obrazowanie molekularne polega na podaniu egzogennego środka obrazującego w postaci małej cząsteczki, makrocząsteczki lub nanocząstki w celu wizualizacji, ukierunkowania i śledzenia odpowiednich badanych procesów fizjologicznych2. Różne metody obrazowania, które zostały zbadane w obrazowaniu molekularnym, obejmują MRI, CT, PET, SPEC....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Synteza PB NP, GDPB i MnPB

Synteza nanocząstek (PB NPs, GdPB lub MnPB) jest osiągana przy użyciu jednoetapowego schematu syntezy, wykonując kroki opisane poniżej:

  1. Przygotować roztwór "A" zawierający 5 ml 5 mM heksacyjanożelazianu (II) potasu w wodzie dejonizowanej (DI). W zależności od rodzaju syntetyzowanej nanocząstki — PB NPs, GdPB lub MnPB, należy przygotować roztwór "B" w następujący sposób:
    1. Dla PB NPs: przygotować 10 ml roztworu zawierającego 2,5 mM chlorku żelaza (III) w wodzie demineralizowanej.
    2. Dla NP GdPB: przygotować 10 ml roztworu zawierającego po 2,5 mM azotanu gadolinu (II....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Korzystając ze schematu syntezy jednogarnkowej, nanocząstki PB NPs (średnia średnica 78,8 nm, wskaźnik polidyspersyjności (PDI) = 0,230; obliczony przez instrument do dynamicznego rozpraszania światła), GdPB (średnia średnica 164,2 nm, PDI = 0,102) lub MnPB (średnia średnica 122,4 nm, PDI = 0,124), które są monodyspersyjne (mierzone przez DLS) mogą być konsekwentnie syntetyzowane (Rysunek 2A). Zmierzone potencjały zeta zsyntetyzowanych nanocząstek są mniejsze niż -30 mV (rysunek 2B), co .......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W artykule przedstawiono metody syntezy nowej klasy multimodalnych środków do obrazowania molekularnego opartych na biofunkcjonalizowanych nanocząstkach błękitu pruskiego. Metodami obrazowania molekularnego zawartymi w nanocząstkach są obrazowanie fluorescencyjne i molekularny rezonans magnetyczny, ze względu na ich uzupełniające się cechy. Biofunkcjonalizowane nanocząstki błękitu pruskiego mają konstrukcję typu rdzeń-powłoka. Kluczowymi etapami syntezy tych nanocząstek są: 1) synteza jednoetapowa, w wyniku której powsta.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez Sheikh Zayed Institute for Pediatric Surgical Innovation (RAC Awards #30000174 i 30001489).

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Trójwodzian heksacyjanożelazianu (II) potasu (K4Fe(CN)6· 3H2O)Sigma-AldrichP9387
Czterowodny chlorek manganu (II) (MnCl2· 4H2O)Sigma-Aldrich221279
sześciowodny azotan gadolinu (III) (Gd(NO3)3· 6H2O)Sigma-Aldrich211591
Sześciowodny chlorek żelaza (III) (FeCl3· 6H2O)Sigma-Aldrich236489
Chlorek sodu (NaCl)Sigma-AldrichS9888
Anty-NG2 Siarczan chondroityny Proteoglikan Przeciwciało koniugatu biotynyMilliporeAB5320
Biotynylowana anty-ludzka eotaksyna-3Peprotech500-P156GBT
Linia komórkowa Neuro-2aATCCCCL-131
Linia komórkowa BSG D10Magazyn laboratoryjny---
OE21 Linia komórkowaSigma-Aldrich96062201
SUDIPG1 NeurospheresLab stock---
Eol-1 Cell LineSigma-Aldrich94042252
Bromek poli(L-lizyny)Sigma-AldrichP1399
FormaldehydSigma-AldrichF8775
Albumina surowicy bydlęcejSigma-AldrichA2153
Aminoaktynomycyna DSigma-AldrichA9400
Triton X-100Sigma-AldrichX100
CellTrace Kalceina czerwono-pomarańczowa, AMLife TechnologiesC34851
Avidin-Alexa Fluor 488Life TechnologiesA21370
WirówkaEppendorf5424
Pompa perystaltycznaInstechP270
Zetasizer Nano ZSMalvernZEN3600
SonicatorQSonicaQ125
Mieszadło z płytą grzejną/magnetycznąVWR97042-642
Ultra czysta folia aluminiowaVWR89107-732
Vortex MieszalnikVWR58816-121
Stożkowe probówki wirówkowe 1,7 mlVWR87003-295
Probówki wirówkowe stożkowe 15 mlVWR21008-918
Uchwyty probówekVWR82024-342
Kuwety jednorazowe z tworzywa sztucznegoVWR7000-590 (/586)
Zetasizer kapilarnyVWRDTS1070
Filtry odśrodkowe, kolumna wirująca 0,2 mikrometraVWR82031-356
96-dołkowa taca do hodowli komórkowychVWR29442-056
Trypsyna EDTA 0,25% roztwór 1xJR Scientific82702
Klasa hodowli komórkowej PBS (1x)Life Technologies10010023
Zestaw do oznaczania proliferacji komórek XTTTrevigen4891-025-K
Kolba T7589092-700VWR
Zmodyfikowany Eagle's MediumBiowhitaker12-604Q
Płodowa surowica bydlęcaLife Technologies10437-010
Pen-Strep 1xLife Technologies15070063
Fluoview FV1200 Konfokalny laserowy mikroskop skaningowyOlympusFV1200
Szkiełka mikroskopowe komoroweThermo Scientific154534
Okulary Micro Cover Glasses, kwadratowe, nr 1.5VWR48366-227
Szkiełka mikroskopoweVWR16004-368
RPMISigma-AldrichR8758 
AgarozaSigma-AldrichA9539 
FACSCalibur Cytometr przepływowyBD Biosciences
3 T Kliniczny magnes MRIGE Healthcare
100 ml kolba
firmy Dulbecco okrągłodenna

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Massoud, T. F., Gambhir, S. S. Molecular imaging in living subjects: seeing fundamental biological processes in a new light. Genes Dev. 17, 545-580 (2003).
  2. Mankoff, D. A. A Definition of Molecular Imaging. J Nucl Med. 48 (6), 18N-21N (2007).
  3. James, M. L., ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Prussian Blue NanoparticlesMultimodal Molecular ImagingFluorescence ImagingMagnetic Resonance ImagingBiofunctionalized NanoparticlesGadolinium Manganese IonsFluorescent Avidin CoatingBiotinylated LigandsDynamic Light ScatteringFlow Cytometry Analysis

Related Articles