Rusztowania z nanowłókien elektroprzędzonych z gradacją w organizacji włókien

Podsumowanie

Tutaj prezentujemy protokół wytwarzania elektroprzędzonych rusztowań z nanowłókien o stopniowanej organizacji włókien i badamy ich zastosowania w regulacji morfologii/orientacji komórek. Gradienty w odniesieniu do właściwości fizycznych i chemicznych rusztowań z nanowłókien oferują szeroką gamę zastosowań w dziedzinie biomedycyny.

Streszczenie

Celem tego protokołu jest przedstawienie prostej metody generowania rusztowań z nanowłókien z gradacją w organizacji włókien i przetestowanie ich możliwych zastosowań w kontrolowaniu morfologii/orientacji komórek. Organizacja nanowłókien jest kontrolowana za pomocą nowego aparatu produkcyjnego, który umożliwia stopniowe zmniejszanie organizacji włókien w rusztowaniu. Zmiana ułożenia włókien uzyskuje się poprzez skrócenie czasu osadzania losowych włókien elektroprzędzonych na jednoosiowo wyrównanej macie światłowodowej. Dzięki pokryciu kolektora ruchomą barierą/maską, wzdłuż tej samej osi co osadzanie włókien, struktura organizacyjna jest łatwo kontrolowana. Dla celów inżynierii tkankowej komórki macierzyste pochodzące z tkanki tłuszczowej mogą być wysiewane do tych rusztowań. Komórki macierzyste ulegają zmianom morfologicznym w wyniku ich umiejscowienia w zróżnicowanej strukturze organizacyjnej i mogą potencjalnie różnicować się w różne typy komórek w zależności od ich lokalizacji. Dodatkowo stopniowana organizacja włókien poprawia biomimikrę rusztowań z nanowłókien, dzięki czemu bardziej przypominają one naturalne orientacje nanowłókien kolagenowych w miejscu przyczepu ścięgna do kości w porównaniu z tradycyjnymi rusztowaniami. Dzięki nanokapsułkowaniu, stopniowane włókna dają również możliwość konstruowania gradientów chemicznych w rusztowaniach włóknistych, a tym samym jeszcze bardziej wzmacniają swoje potencjalne zastosowania w szybkich badaniach przesiewowych interakcji komórka-materiały i regeneracji tkanek międzyfazowych. Technika ta umożliwia produkcję rusztowań o ciągłym gradiencie, ale może również potencjalnie wytwarzać włókna w dyskretnych krokach, kontrolując ruch ruchomej bariery/maski w dyskretny sposób.

Wprowadzenie

Nanowłókna są popularnym narzędziem w inżynierii tkankowej ze względu na ich zdolność do naśladowania macierzy zewnątrzkomórkowej w jej strukturze i względnym rozmiarze¹. Jednak niektóre natywne interfejsy tkankowe, takie jak miejsce przyczepu ścięgna do kości, zawierają włókna kolagenowe, które wykazują zmienną strukturę organizacyjną, która zwiększa się w stosunku do ścięgna i zmniejsza się w miejscu kości^2-5. Tak więc, aby zapewnić skuteczną regenerację tkanek, konieczne jest wyprodukowanie rusztowania, które mogłoby skutecznie naśladować ten gradient strukturalny

.

Poprzednio prowadzono badania nad stopniowymi zmianami w składzie włókien, a konkretnie w zawartości minerałów⁶. Jednak odtworzenie składnika strukturalnego tkanek łącznych pozostaje w dużej mierze niezbadane. We wcześniejszym badaniu zbadano gradienty morfologiczne, badając wpływ powierzchniowej gęstości cząstek krzemionki na proliferację osteoblastów kalwarialnych szczurów i stwierdzono odwrotną zależność między gęstością cząstek krzemionki a proliferacją komórek⁷. Ale zmiany morfologiczne, które pośredniczyły w proliferacji komórek w poprzednich pracach, były głównie związane z chropowatością powierzchni, która nie była w stanie naśladować zmian organizacyjnych włókien^7,8. W jednym z ostatnich badań podjęto próbę wytworzenia rusztowania, które naśladowałoby unikalną orientację włókien kolagenowych przy użyciu nowatorskiego kolektora do^{elektroprzędzenia.} Chociaż w tym badaniu udało się wytworzyć rusztowanie z zarówno wyrównanymi, jak i losowymi włóknami, nie udało się naśladować stopniowych zmian wykazywanych w tkankach natywnych. Ponadto, przy wytwarzaniu oddzielnych komponentów, przy natychmiastowej zmianie orientacji z wyrównanej na losową, właściwości biomechaniczne tego rusztowania znacznie się zmniejszyły. Żadne wcześniejsze prace nie były w stanie wyprodukować odpowiednich rusztowań z nanowłókien z ciągłymi gradacjami orientacji włókien od wyrównanych i losowych. Nasze ostatnie badanie wykazało udane odtworzenie rusztowań z nanowłókien z gradacją organizacji włókien, które mogą potencjalnie naśladować natywną organizację kolagenu przy przyczepie ścięgna do kości¹⁰. Praca ta ma na celu przedstawienie protokołów stosowanych do produkcji rusztowań z nanowłókien o strukturze bardzo zbliżonej do organizacji włókien na granicy natywnej tkanki ścięgno-kostnej.

Gradientowe struktury nanowłókien mają potencjalnie daleko idące zastosowania w różnych dziedzinach. Skupiliśmy się na zastosowaniach w inżynierii tkankowej miejsca przyczepu ścięgna do kości, łącząc nasze rusztowania z komórkami macierzystymi pochodzącymi z tkanki tłuszczowej (ADSC), które są już wykorzystywane do regeneracji tkanek na różnych podłożach^11-14. Ponadto ADSC są z natury bardzo podobne do komórek macierzystych szpiku kostnego pod względem wielomocy, a ich zasoby są obfite, można je pobrać za pomocą prostej procedury liposukcji^15,16. Umieszczanie tych komórek na stopniowanych rusztowaniach z nanowłókien dodatkowo zwiększa ich zastosowania w inżynierii tkankowej, umożliwiając kontrolowaną dystrybucję komórek, które mogą potencjalnie różnicować się w różne tkanki. Oprócz wysiewu komórek macierzystych, nanowłókna mogą być otoczone cząsteczkami sygnałowymi w celu regulacji odpowiedzi komórkowej. Sprzężenie nanoenkapsulacji z gradientem organizacyjnym tych rusztowań pozwala na badanie zachowania komórek lub możliwych projektów i powłok implantów. Enkapsulacja funkcjonalnych cząsteczek, takich jak białko morfogenetyczne kości 2 (BMP2), które, jak wykazano, indukuje różnicowanie osteoblastów^15,16, może jeszcze bardziej wzmocnić zastosowania tych rusztowań w inżynierii tkankowej¹⁰.

Protokół

1. Przygotowanie roztworu

1. Przygotować roztwór poli(ε-kaprolaktonu) (PCL) (M_w = 80 000 g/mol) o przybliżonym stężeniu 100 mg/ml. Rozpuścić PCL w mieszaninie dichlorometanu (DCM) i N, N-dimetyloformamidu (DMF) w stosunku 4:1 (v/v) o stężeniu 10% (w/v).
2. Umieść roztwór w szklanej probówce o pojemności 20 ml do wymieszania. Umieść szklaną rurkę w myjce ultradźwiękowej na 30 minut lub do momentu, gdy roztwór stanie się przezroczysty.

2. Przygotowanie aparatury

1. Dodać przygotowany roztwór PCL do strzykawki o pojemności 5 ml z dołączoną igłą w rozmiarze 21.
2. Ustawić pompę strzykawkową w pionowej pozycji do elektrowirowania, zgodnie z rysunkiem 1.
3. Użyj kolektora szczelinowego ze stali nierdzewnej z otwartą przestrzenią 2 cm x 5 cm na wyrównane podłoże światłowodowe. Umieść kolektor w odległości 12 cm od końcówki igły.
4. Podłącz prąd stały (DC) High Voltage zasilacz do igły i uziemić kolektor. Upewnij się, że kolektor jest indywidualnie uziemiony i nie ma kontaktu z innym sprzętem laboratoryjnym.

3. Elektroprzędzenie

1. Ustawić pompkę strzykawkową na 1,50 ml/godz., aż kropelki tworzące się na końcu igły zostaną natychmiast zastąpione po usunięciu. Następnie ustaw natężenie przepływu na 0,50 ml/h.
2. Przekręć napęd napięcia na 12 kV.
3. Elektrowiruj, aż jednoosiowo wyrównane włókna całkowicie zakryją szczelinę w kolektorze.
4. Nałóż klej na krawędzie małej szklanej płytki i przenieś włókna z kolektora szczelinowego na szklaną płytkę. Umieść szklaną płytkę na kawałku folii aluminiowej, która ma ten sam rozmiar co szklana płyta i jest uziemiona.
5. Umieścić drugi pojemnik na strzykawkę zgodnie z rysunkiem 3.
6. Przymocuj plastikową maskę do drugiej pompy strzykawkowej i umieść ją 2 mm nad kolektorem.
7. Dodaj kumarynę 6 w stężeniu 1% (w/w) do roztworu PCL - jeśli pożądana jest nanokapsułkowanie - i mieszaj, aż roztwór stanie się przezroczysty.
8. Roztwór PCL lub PCL/kumaryny 6 należy umieścić w igle o pojemności 5 ml za pomocą igły o rozmiarze 21. Ustaw pompę pionową na 0,50 ml/godz., a poziomą, aby ciągnąć z prędkością 9 ml/godz. lub z przybliżoną prędkością 1 mm/min.
9. Elektrowiruj, aż maska prawie całkowicie odsunie się od kolektora, ale obszar krawędzi nadal znajduje się pod maską.

4. Charakterystyka włókien

1. Umieść próbki za pomocą dwustronnej taśmy przewodzącej na metalowym kołku i pokryj platyną przez 40 sekund za pomocą napylarki do napylania w temperaturze 40 mA.
   1. Zbadaj włókna za pomocą skaningowego mikroskopu elektronowego (SEM) zgodnie z naszymi wcześniejszymi badaniami^17,18.
   2. Zbieraj obrazy przy narastającym napięciu 15 kV.
2. Wykonaj szybką analizę transformaty Fouriera (FFT) na oddzielnej próbce włókna, aby zmierzyć wyrównanie włókien. Szczegółowe informacje na temat pomiaru wyrównania włókien przez FFT można odnieść do wcześniejszych badań^19,20.

5. Wysiewanie komórek macierzystych.

1. Wysterylizuj próbki włókien, mocząc je w 70% roztworze etanolu przez 2 godziny. Następnie umyj włókna wodą destylowaną, aby usunąć wszelkie zanieczyszczenia.
2. Otrzymać ludzkie ADSC i komórki hodowlane w kolbie o średnicy 25^cm2 w temperaturze 37 °C w atmosferze 95% powietrza/5%_CO2. Zmieniaj pożywkę do hodowli komórkowych co drugi dzień¹⁰.
3. Trypsynizuj komórki i policz liczbę komórek. W szczególności należy usunąć całą pożywkę hodowlaną z kolby do hodowli komórkowych i dwukrotnie przemyć komórki roztworem soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS). Następnie dodać 1 m^l 0,25% roztworu trypsyny-EDTA (wstępnie podgrzanego w łaźni wodnej do temperatury 37 °C) w celu przykrycia monowarstwy komórek i inkubować kolbę w inkubatorze do hodowli komórkowych przez 2-3 minuty. Dodać 4 ml pożywki hodowlanej i wypłukać wszystkie komórki z powierzchni, pipetując pożywkę na całej powierzchni. Odwirować zawiesinę komórkową i ponownie zdyspergować osad komórkowy w pożywce hodowlanej. Policz komórki za pomocą hemekytometru. Wysiewaj około 1 ×^{10 4} komórek do rusztowania z nanowłókien umieszczonego w naczyniu hodowlanym o średnicy 35 mm i inkubuj przez 3 i 7 dni.
4. Wybarwić komórki za pomocą dioctanu fluoresceiny (5 mg/ml w acetonie) (FDA), a następnie zobrazować próbki za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego. W szczególności dodaj 100 μl roztworu FDA do naczynia hodowlanego i inkubuj przez 30 minut. Umyj komórki trzykrotnie PBS przed obrazowaniem fluorescencyjnym. Analizuj orientację komórek za pomocą dostosowanego programu mat-lab opartego na naszych poprzednich badaniach¹⁰.

Wyniki

Zastosowanie niniejszego protokołu pozwoliło na utworzenie maty z włókien o gradiencie organizacyjnym. Rysunek 3 przedstawia obrazy SEM wykonane w różnych miejscach rusztowania nanowłóknistego. Jakościowo można stwierdzić przejście od włókien wyrównanych jednowymiarowo w punkcie 0 mm (Rysunek 3A) do przypadkowego układu włókien w punkcie 6 mm (Rysunek 3D). Analiza FFT pozwala na ilościowe określenie stopnia wyrównania włókien; szczegóły dotyczące procesów ilościowych opi...

Dyskusja

Najbardziej krytyczną częścią protokołu jest generowanie rusztowania gradientowego. Konieczne jest, aby maska zakrywająca kolektor poruszała się ze stałą prędkością, aby nastąpiła stopniowa zmiana w rusztowaniu światłowodowym. Prawidłowe przygotowanie roztworu PCL jest również ważne dla zapewnienia powodzenia elektroprzędzenia. Zaleca się sprawdzenie morfologii włókien przed elektroprzędzeniem, szczególnie po enkapsulacji kumaryny-6, która może wymagać wyższego napięcia do prawidłowego elektrowirowania.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Polikaprolakton	Sigma-Aldrich	440744
N,N-dimetyloformamid	Fisher Chemical	D-119-1
Dichlorometan	Fisher Chemical	AC61093-1000
Kumaryna 6	Sigma-Aldrich	546283
Komórki macierzyste pochodzące z tkanki tłuszczowej	Technologie inżynierii komórkowej	HMSC. AD-100
Płodowa surowica bydlęca	Technologies	26140-111
Dioctan fluoresceiny	Sigma-Aldrich	F7378
Etanol	Sigma-Aldrich	E7023
Trypsyna-EDTA	Invitrogen	25300-054
&alfa;-Zmodyfikowany Eagle's Medium	Invitrogen	A10490-01
Aceton	Fisher Scientific	s25120a
Sól fizjologiczna buforowana fosforanem	Invitrogen	10010023
Szkiełka szklane	VWR international, LLC	101412-842
Pompa strzykawkowa	Fisher Scientific	14-831-200	Pojedyncza strzykawka
Myjka ultradźwiękowa	Branson	1510
Zasilacz	wysokiego napięcia DCBadania wysokiego napięcia gamma	ES30
Skaningowy mikroskop elektronowy	FEI	Nova 2300
Mikroskop fluorescencyjny	Zeiss	Axio Imager 2

Life