Otrzymywanie wysoce oczyszczonych kardiomiocytów z ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych przy użyciu różnicowania modulowanego małymi cząsteczkami i późniejszego głodu glukozy

Podsumowanie

Tutaj opisujemy solidny protokół do pozyskiwania ludzkich kardiomiocytów, który łączy modulowane małymi cząsteczkami różnicowanie serca i oczyszczanie kardiomiocytów za pośrednictwem deprywacji glukozy, umożliwiając produkcję oczyszczonych kardiomiocytów dla celów modelowania chorób sercowo-naczyniowych i badań przesiewowych leków.

Streszczenie

Ludzkie indukowane pluripotencjalne kardiomiocyty pochodzące z komórek macierzystych (hiPSC-CMs) stały się ważnym źródłem komórek, aby rozwiązać problem braku podstawowych kardiomiocytów dostępnych do badań podstawowych i zastosowań translacyjnych. Aby zróżnicować hiPSC w kardiomiocyty, opracowano różne protokoły, w tym różnicowanie na podstawie ciała zarodka (EB) i indukcję czynnika wzrostu. Jednak protokoły te są nieefektywne i bardzo zmienne pod względem zdolności do generowania oczyszczonych kardiomiocytów. Niedawno wykazano, że protokół oparty na małych cząsteczkach wykorzystujący modulację sygnalizacji Wnt / β-kateniny promuje różnicowanie serca z wysoką wydajnością. Dzięki temu protokołowi ponad 50%-60% zróżnicowanych komórek było konsekwentnie obserwowanych kardiomiocytów sercowo-troponinowo-dodatnich. Aby jeszcze bardziej zwiększyć czystość kardiomiocytów, zróżnicowane komórki poddano głodowi glukozy w celu specyficznego wyeliminowania niekardiomiocytów w oparciu o różnice metaboliczne między kardiomiocytami a niekardiomiocytami. Stosując tę strategię selekcji, konsekwentnie uzyskiwaliśmy ponad 30% wzrost stosunku kardiomiocytów do niekardiomiocytów w populacji zróżnicowanych komórek. Te wysoce oczyszczone kardiomiocyty powinny zwiększyć wiarygodność wyników badań modelowania in vitro chorób in vitro opartych na iPSC i testach przesiewowych leków.

Wprowadzenie

Pierwotne ludzkie kardiomiocyty są trudne do uzyskania ze względu na konieczność inwazyjnych biopsji serca, trudności w dysocjacji na pojedyncze komórki oraz z powodu słabej długoterminowej przeżywalności komórek w hodowli. Biorąc pod uwagę brak pierwotnych ludzkich kardiomiocytów, specyficzna dla pacjenta technologia ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych pochodzących z kardiomiocytów (hiPSC-CM) została uznana za potężne alternatywne źródło kardiomiocytów do badań podstawowych, a także zastosowań klinicznych i translacyjnych, takich jak modelowanie chorób i odkrywanie leków¹. Wczesne próby różnicowania pluripotencjalnych komórek macierzystych w kardiomiocyty wykorzystywały protokoły różnicowania przy użyciu ciał embrionalnych (EB), ale ta metoda jest nieskuteczna w wytwarzaniu kardiomiocytów, ponieważ często mniej niż 25% komórek w EB pokonuje kardiomiocyty^2,3. Dla porównania, monowarstwowy protokół różnicowania wykorzystujący cytokiny aktywinę A i BMP4 wykazał wyższą skuteczność niż EB, ale protokół ten jest nadal stosunkowo nieefektywny, wymaga drogich czynników wzrostu i działa tylko w ograniczonej liczbie ludzkich linii pluripotencjalnych komórek macierzystych⁴. Niedawno opracowano wysoce skuteczny, oparty na monowarstwie hiPSC protokół różnicowania kardiomiocytów poprzez modulację sygnalizacji Wnt/β-kateniny⁵. Te hiPSC-CM wyrażają sercową troponinę T i alfa aktyninę, dwa białka sarkomeryczne, które są standardowymi markerami kardiomiocytów⁶. Opisany tutaj protokół jest adaptacją tej opartej na małych cząsteczkach, bezkomórkowej, jednowarstwowej metody różnicowania^5,7. Jesteśmy w stanie uzyskać bijące kardiomiocyty z hiPSC po 7-10 dniach (ryc. 1). Jednak po różnicowaniu kardiomiocytów, w wyniku którego 50% bije komórki, barwienie immunologiczne konsekwentnie pokazuje istnienie populacji niekardiomiocytów, które są ujemne dla markerów specyficznych dla kardiomiocytów, takich jak specyficzna dla serca troponina T i alfa-aktynina. Aby jeszcze bardziej oczyścić kardiomiocyty i wyeliminować niekardiomiocyty, heterogeniczne zróżnicowane populacje komórek poddano głodowi glukozy, traktując je pożywką hodowlaną o wyjątkowo niskim poziomie glukozy przez wiele dni (ryc. 2). Leczenie to selektywnie eliminuje niekardiomiocyty ze względu na zdolność kardiomiocytów, ale nie niekardiomiocytów, do metabolizowania mleczanu jako podstawowego źródła energii w celu przetrwania w środowisku o niskim poziomie glukozy⁸. Po tym etapie oczyszczania obserwuje się 40% wzrost stosunku kardiomiocytów do niekardiomiocytów (ryc. 3, ryc. 4), a komórki te można wykorzystać do dalszej analizy ekspresji genów, modelowania choroby i testów przesiewowych leków.

Protokół

UWAGA: Informacje o dostawcach wszystkich odczynników używanych w tym protokole zostały wymienione w Tabeli 1 i Liście Materiałów. Wszystkie roztwory i sprzęt mający kontakt z komórkami muszą być sterylne i należy stosować odpowiednie techniki aseptyki. Wszystkie inkubacje kultur należy przeprowadzić w nawilżonym inkubatorze o temperaturze 37 °C, 5% CO_{2 ,} chyba że określono inaczej. W tym protokole wszystkie różnicowania przeprowadza się na płytkach 6-dołkowych, w których wysiewane są hiPSC. Po różnicowaniu i oczyszczeniu komórki mogą zostać zdysocjowane i ponownie posiane do dalszego użytku.

1. Przygotowanie podłoża

1. Dla pożywki E8 przygotować roztwór podstawowy dla każdego składnika pożywki (_NaHCO3, 2-fosforan kwasu L-askorbinowego, selenin sodu, transferyna, insulina, FGF2, TGFB1) i przechowywać roztwory w temperaturze -20 °C. Dodać odpowiednią ilość roztworów podstawowych do butelki DMEM/F12 i przefiltrować w celu sterylizacji. Stężenie roztworu i układ reakcji dla składników podstawowych i pożywki E8 można znaleźć w Tabeli 1.
2. W przypadku roztworu macierzy zewnątrzkomórkowej należy rozmrozić macierz błony podstawnej (zwykle dostarczaną w dawce 10 mg/ml) w temperaturze 4 °C O/N. Matrigel jest powszechnie stosowany do hodowli pluripotencjalnych komórek macierzystych, ponieważ ludzkie pluripotencjalne komórki macierzyste mogą dobrze przylegać do tego materiału przy użyciu integryny alfa-6-beta-1⁹. Po rozmrożeniu przygotować 2,25 mg (250 μl) podwielokrotności na lodzie za pomocą lodowatych końcówek i probówek do pipet i przechowywać podwielokrotności w temperaturze -80 °C.
   1. W przypadku wstępnego powlekania płytek ECMS należy rozmrozić i podsycić roztwór macierzy zewnątrzkomórkowej (ECMS) na lodzie. Wymieszaj ECMS i lodowato zimne podłoże DMEM/F12 w stosunku 1:200 na lodzie. Przechowywać w chłodnym miejscu, aby zapobiec przedwczesnemu zestaleniu ECMS.
3. W przypadku pożywki RPMI/B27 bez pożywki insulinowej dodać 10 ml witaminy B27 bez insuliny do 500 ml pożywki RPMI.
4. W przypadku pożywki RPMI/B27 (z insuliną) dodać 10 ml suplementu B27 (z insuliną) i 5 ml antybiotyku Pen-strep do 500 ml pożywki RPMI.
5. W przypadku pożywki o niskim poziomie glukozy dodaj 10 ml suplementu B27 i 5 ml antybiotyku Pen-strep do 500 ml bezglukozowego podłoża RPMI.
6. W przypadku pożywki do zamrażania/kriokonserwacji należy zmieszać płodową surowicę bydlęcą razem z dimetylosulfotlenkiem (DMSO) w stosunku 9:1. Podłoże zamrażające można przechowywać do 1 miesiąca w temperaturze 4 °C.
   UWAGA: Wszystkie media należy przefiltrować i przechowywać w temperaturze 4 °C i zużyć w ciągu 2 tygodni, chyba że określono inaczej. Wszystkie objętości odczynników/roztworów użyte poniżej są przeznaczone dla pojedynczego dołka w płytce 6-dołkowej, chyba że określono inaczej.

2. Wstępne powlekanie płytek 6-dołkowych za pomocą ECMS

1. Wykonać ECMS, mieszając matrycę membrany podstawnej (np. Matrigel) z lodowatymi pożywkami DMEM/F12 w stosunku 1:200, a następnie nanieść 2 ml świeżo przygotowanego ECMS do każdego dołka na płytkę 6-dołkową. Każda studzienka w płytce 6-dołkowej otrzyma około 90 mg ECMS.
2. Inkubować płytki pokryte ECMS przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C. Bezpośrednio przed posiewem komórek należy odessać roztwór DMEM/F12 z każdej studzienki. Płytki będą wtedy gotowe do przyjęcia komórek.

3. Rozmrażanie zamrożonych hiPSC

UWAGA: Uważnie przestrzegaj tej procedury, ponieważ może ona prowadzić do optymalnego hodowania i dalszego różnicowania hiPSC-CM w hiPSC-CM po cyklu zamrażania/rozmrażania.

1. Rozmrozić jedną fiolkę hiPSC na każdą studzienkę płytki 6-dołkowej. Przygotować stożkową probówkę o pojemności 15 ml z 9 ml zimnego podłoża E8 z inhibitorem ROCK (10 μM) dla każdej fiolki. Inhibitor ROCK poprawia przeżywalność hiPSC po kriokonserwacji¹⁰. Przechowywać fiolki w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C w celu rozmrożenia komórek do momentu pozostawienia kryształków lodu o średnicy około 5 mm.
2. Spryskać zewnętrzną stronę fiolek 70% etanolem. Przetrzeć fiolki bibułką przed przeniesieniem ich do sterylnego kaptura laminarnego.
3. Przenieś komórki do przygotowanej stożkowej probówki. Przepłukać fiolkę jednorazowo 500 μl pożywki E8 i przenieść pożywkę zawierającą rozmrożone komórki do tej samej stożkowej probówki. Wirować w temperaturze pokojowej przez 4 minuty przy 200 x g.
4. Odessać supernatant po odwirowaniu i delikatnie zawiesić osad komórkowy z 2 ml pożywki E8 z inhibitorem ROCK (10 μM). Przenieść zawieszone komórki do jednego dołka na 6-dołkowej płytce wstępnie pokrytej ECMS.
5. Zastąp pożywkę pożywką E8 bez inhibitora ROCK po 24 godzinach hodowli. Do tego czasu komórki powinny były przylegać.

4. Przekazywanie hiPSC

1. Zazwyczaj przejście hiPSC następuje po osiągnięciu 75%-80% konfluencji w płytce 6-dołkowej. Odessać pożywkę hodowlaną. Szybko umyj studzienki 1 ml sterylnego RT PBS. Zasysać PBS.
   1. Dodać 500 μl 0,5 mM EDTA lub 1x roztwór do odrywania komórek (np. Accutase) i inkubować przez 1-7 minut w temperaturze pokojowej. Odpowiedni czas inkubacji EDTA różni się w zależności od linii hiPSC. Spodziewaj się widocznego zwijania się lub pogrubienia kolonii wokół krawędzi, ponieważ będzie to oznaczać, że EDTA lub roztwór do odrywania komórek jest gotowy do usunięcia.
2. Odessać EDTA lub roztwór do odłączania komórek. Dodać 1 ml pożywki E8 uzupełnionej 10 μM inhibitorem ROCK. Przemieszcz kolonie hiPSC w studzience poprzez wielokrotne pipetowanie w górę iw dół oraz rozpylanie kolonii za pomocą pipety P1000. Po zakończeniu kolonie należy rozbić na 5-10 kępek komórek.
3. Przenieść kolonie zawieszone w 1 ml pożywki E8 z inhibitorem ROCK do stożkowej probówki o pojemności 15 ml.
4. Rozbij duże grudki komórek na małe grudki w pożywce E8. Dodać odpowiednią objętość pożywki E8 z inhibitorem do zawiesiny komórkowej w celu rozcieńczenia komórek. Objętość pożywki, którą należy dodać do rozcieńczenia, zależy od gęstości komórek i liczby studzienek, które mają zostać wysiane. Idealnie, pojedyncza, 80% zlewająca się studzienka hiPSC powinna być rozcieńczona w stosunku 1:12.
   1. Dodać 11 ml pożywki E8 z inhibitorem ROCK do istniejącego 1 ml roztworu komórkowego w wyżej wymienionej stożkowej probówce o pojemności 15 ml w celu uzyskania rozcieńczenia 1:12.
5. Dalej rozcieraj komórki zbijają się w małe fragmenty komórek (najlepiej około 50-200 komórek w każdym fragmencie). Unikaj nadmiernego rozcierania, ponieważ zmniejsza to przeżycie komórek.
6. Odessać ECMS z wstępnie pokrytych płytek i dodać 2 ml zawieszonych komórek do każdej studzienki. Idealne jest około 100 000 komórek na dołek płytki 6-dołkowej. Staraj się równomiernie rozmieścić komórki wokół studzienki, aby uniknąć grupowania komórek w środku studzienki.
7. Po 24 godzinach hodowli należy zastąpić pożywkę pożywką E8 bez inhibitora ROCK. Zmieniaj pożywkę hodowlaną co 24 godziny, aż komórki staną się zlewające się w 80%. Następnie komórki są gotowe do ponownego przejścia. Zwykle potrzeba 3-6 dni między przejściami, aby osiągnąć 80% zbieżności.

5. Zamrażanie hiPSC

UWAGA: Uważnie przestrzegaj tej procedury, ponieważ może ona prowadzić do optymalnego hodowania i dalszego różnicowania hiPSC-CM w hiPSC-CM po cyklu zamrażania/rozmrażania.

1. Oznacz probówki kriogeniczne nazwą linii komórkowej, typem komórki, numerem przejścia i datą zamrożenia. Jako ogólną wskazówkę należy użyć jednej fiolki na każdą studzienkę płytki 6-dołkowej. Przygotować stożkową probówkę o pojemności 15 ml wypełnioną 9 ml pożywki E8 z inhibitorem ROCK (10 μM). Przygotuj pożywkę do zamrażania z 90% FBS i 10% DMSO i utrzymuj podłoże w temperaturze 4 °C do momentu użycia.
2. Odessać pożywkę hodowlaną, dodać 500 μl 0,5 mM EDTA lub 1x roztwór do odrywania komórek i inkubować przez 2-7 minut w temperaturze pokojowej. Czas ekspozycji na EDTA lub roztwór do odrywania komórek różni się w zależności od linii komórkowej.
3. Odessać EDTA lub roztwór do odrywania komórek. Dodać 1 ml pożywki E8.
4. Przemieszcz kolonie hiPSC w studzience, pipetując w górę iw dół i spryskując kolonie pipetą P1000. Kolonie nie powinny być rozbijane na mniejsze niż 100 kępek komórek. Przenieść zawieszone komórki do przygotowanej stożkowej probówki zawierającej E8. Wirować w temperaturze pokojowej przez 4 minuty przy 200 x g.
5. Odessać supernatant i dodać do osadu 500 μl zimnego podłoża do zamrażania. Zawiesić osad przez pipetowanie jeden do dwóch razy. Przeżywalność komórek poprawia się dzięki utrzymywaniu komórek w dużych kępach.
6. Przenieś zawieszone komórki do oznakowanej probówki kriogenicznej. Szybko przenieść fiolki do pojemnika do zamrażania zawierającego izopropanol, co pozwoli na stopniowe chłodzenie. Przechowywać pojemnik z komórkami w temperaturze -80 °C przez 24 godziny, a następnie przenieść komórki do ciekłego azotu w celu długotrwałego przechowywania.

6. Różnicowanie serca ludzkiego iPSC

UWAGA: Wszystkie media powinny być co najmniej w RT po dodaniu.

1. Po dysocjacji za pomocą EDTA lub roztworu do odrywania komórek 1x, wysiewaj około 100 000 ludzkich iPSC na 6-dołkowych płytkach hodowlanych pokrytych ECMS w celu różnicowania (te same kroki, co procedury pasażowania komórek). Gdy komórki osiągną 85% konfluencji, zmień pożywkę na RPMI/B27 bez pożywki insulinowej z 6 μM CHIR99021 inhibitora GSK3-beta (CHIR) i utrzymuj przez 48 godzin.
2. Po 48 godzinach zastąp pożywkę hodowlaną zawierającą CHIR pożywką RPMI/B27 bez pożywki insulinowej i pozostaw w spokoju na 24 godziny (do 3 dnia).
3. W 3 dniu zmień pożywkę na RPMI/B27 bez insuliny z inhibitorem 5 μM Wnt IWR1 i utrzymuj przez 48 godzin (do 5 dnia).
   UWAGA: Hamowanie Wnt można również próbować przy użyciu innych związków małocząsteczkowych, jak opisano we wcześniejszych badaniach¹¹. IWR1 został wybrany spośród innych małocząsteczkowych inhibitorów Wnt ze względu na zwiększony zakres, w którym wykazano, że jest skuteczny w hamowaniu sygnalizacji Wnt¹¹.
4. W 5 dniu zmień pożywkę z powrotem na RPMI/B27 bez pożywki insulinowej i pozostaw na 48 godzin (do 7 dnia).
5. W dniu 7 należy zastąpić pożywkę pożywką RPMI/B27 (insuliną), a następnie co 3 dni wymieniać pożywkę tą samą pożywką. Spontaniczne bicie kardiomiocytów powinno być najpierw widoczne około 8 do 10 dnia.

7. Oczyszczanie ludzkich kardiomiocytów poprzez głód glukozy

1. W 10 dniu po różnicowaniu zmień pożywkę w każdym dołku płytki 6-dołkowej na 2 ml pożywki o niskiej zawartości glukozy i utrzymuj komórki w tym podłożu przez 3 dni (do dnia 13).
2. W 13 dniu zwróć komórki do pożywki RPMI/B27 (z insuliną).
3. Opcjonalnie należy ponownie podać kardiomiocyty przed drugą rundą głodu glukozy, aby pomóc rozluźnić niekardiomiocyty z płytki hodowlanej, co pozwala na łatwiejszą dysocjację niekardiomiocytów podczas głodu glukozy.
   1. W dniu 13 odessać pożywkę, przemyć raz PBS i zdysocjować komórki na pojedyncze komórki za pomocą 500 μl enzymu dysocjacji komórek przez 5 minut w temperaturze 37 °C. W szczególności, po 5 minutach leczenia enzymamicznego, użyj pipety 1,000 μl do ręcznej dysocjacji kardiomiocytów od płytki 6-dołkowej poprzez wielokrotne wyciąganie enzymu dysocjacji komórek i rozpylanie go na monowarstwę kardiomiocytów. Do dysocjacji kardiomiocytów na pojedyncze komórki może być wymagane do 30 powtórzeń pipetowania.
   2. Po dysocjacji komórek i osiągnięciu formy jednokomórkowej, zebrać wszystkie komórki do stożkowej probówki o pojemności 15 ml wypełnionej 5 ml pożywki RPMI/B27 z insuliną w celu rozcieńczenia enzymu dysocjacji komórek i odwirować przez 4 minuty przy 200 x g. Odessać i odrzucić supernatant.
   3. Ponownie zawiesić komórki za pomocą 2 ml pożywki RPMI/B27 i umieścić je na nowej płytce 6-dołkowej pokrytej ECMS. Zazwyczaj większa konfluencja kardiomiocytów pomaga w przetrwaniu komórek podczas ponownego powlekania. Staraj się ponownie platerować 2 miliony komórek na nowe 6-dołkowe naczynie, aby zapewnić optymalne przeżycie podczas ponownego powlekania.
4. W dniu 14 zmień pożywkę z powrotem na 2 ml pożywki o niskim poziomie glukozy, aby uzyskać drugi cykl deprywacji glukozy. Hoduj komórki w tym stanie niskiego poziomu glukozy przez kolejne 3 dni. Większość niekardiomiocytów umrze w tym stanie hodowli o niskim poziomie glukozy.
5. W dniu 17 zmień pożywkę na 2 ml pożywki RPMI/B27 z insuliną. Pozostałe komórki będą wysoce oczyszczonymi kardiomiocytami. Te kardiomiocyty mogą być wykorzystywane do analizy ekspresji genów, badań przesiewowych leków, analizy metabolicznej i różnych innych dalszych testów.

Wyniki

Zmiany morfologiczne podczas różnicowania hiPSC.

hiPSC hodowane na płytkach bez komórek karmicielskich rosły w postaci płaskich, dwuwymiarowych kolonii. Po osiągnięciu około 85% konfluencji, hiPSC poddano działaniu 6 µM CHIR w celu indukcji różnicowania (Rysunek 1A). Po 24 h traktowania CHIR zaobserwowano znaczne ilości śmierci komórek, co jest zjawiskiem normalnym i częstym. Po dwóch dniach traktowania CHIR, hiPSC nadal różnicowały się w kierunku mezodermalny...

Dyskusja

Uzyskanie dużej ilości wysoce oczyszczonych kardiomiocytów pochodzących z hiPSC ma kluczowe znaczenie dla podstawowych badań kardiologicznych, a także zastosowań klinicznych i translacyjnych. Protokoły różnicowania serca uległy w ostatnich latach ogromnej poprawie, przechodząc od metod opartych na ciele embrionalnym z wykorzystaniem kardiogennych czynników wzrostu² do metod kanapkowych z matrycą¹² i wreszcie do metod modulowanych małymi cząsteczkami i opartych na monowarstwach⁵. Spośród w...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Matrigel (9-12 mg / ml)	BD Biosciences	354277
RPMI media	Invitrogen	11835055
Wolne od glukozy pożywki RPMI	Invitrogen	11879-020
B27 Minus Insulina	Suplement Invitrogen	A1895601
B27 (z insuliną)	Invitrogen	17504-044
Antybiotyk Pen-strep	Invitrogen	15140122
Płodowa surowica bydlęca	BenchMark	100-106
DMSO	Sigma	D-2650
ROCK inhibitor Y-27632	EMD Millipore	688000
CHIR99021	Thermo Fisher	508306
IWR1	Sigma	I0161
EDTA	Invitrogen	15575-020
Accutase	Millipore	SCR005
Podnośnik komórek	Fisher	08-100-240
Cryovial	Fisher (probówki NUNC)	375418
TrypLE Select Enzyme	Invitrogen	12563-011