Synchronizacja Caulobacter crescentus w celu zbadania cyklu komórkowego bakterii

Podsumowanie

Synchronizacja komórek bakteryjnych jest niezbędna do badań nad cyklem komórkowym i rozwojem bakterii. Caulobacter crescentus można synchronizować poprzez wirowanie gęstości, co pozwala na szybkie i skuteczne narzędzie do badań cyklu komórkowego bakterii. Tutaj przedstawiamy szczegółowy protokół synchronizacji komórek Caulobacter.

Streszczenie

Cykl komórkowy jest ważny dla wzrostu, replikacji genomu i rozwoju we wszystkich komórkach. W przypadku bakterii badania cyklu komórkowego koncentrowały się głównie na niezsynchronizowanych komórkach, co utrudnia uporządkowanie zdarzeń czasowych wymaganych do postępu cyklu komórkowego, replikacji i podziału genomu. Caulobacter crescentus stanowi doskonały system modelowy dla bakteryjnego cyklu komórkowego, dzięki któremu komórki mogą być szybko synchronizowane w stanie G0 przez wirowanie gęstości. Eksperymenty z synchronizacją cyklu komórkowego wykorzystano do ustalenia zdarzeń molekularnych rządzących replikacją i segregacją chromosomów, do mapowania genetycznej sieci regulacyjnej kontrolującej postęp cyklu komórkowego oraz do zidentyfikowania ustanowienia biegunowych kompleksów sygnalizacyjnych wymaganych do asymetrycznego podziału komórki. Tutaj przedstawiamy szczegółowy protokół szybkiej synchronizacji komórek Caulobacter NA1000. Synchronizację można przeprowadzić w formacie na dużą skalę do profilowania ekspresji genów i testów western blot, a także w formacie na małą skalę do testów mikroskopowych lub FACS. Szybka synchronizacja i wysoka wydajność komórek Caulobacter sprawiają, że organizm ten jest potężnym systemem modelowym do badań cyklu komórkowego bakterii.

Wprowadzenie

Bakteryjny cykl komórkowy kontroluje zarówno replikację genomu, jak i podział komórek potomnych. Co ważne, ponieważ oporność na antybiotyki stanowi coraz większe zagrożenie dla zdrowia publicznego, cykl komórkowy bakterii stanowi niewykorzystany cel dla rozwoju antybiotyków.

U bakterii Caulobacter crescentus każdy cykl komórkowy prowadzi do asymetrycznego podziału, w wyniku którego powstają dwie komórki potomne o różnych losach (Rysunek 1A) ^1,2. Jedna komórka potomna dziedziczy wić i jest ruchliwa, podczas gdy druga córka dziedziczy łodygę i jest siedząca. Zintegrowany obwód genetyczny kontroluje progresję cyklu komórkowego i los komórki poprzez regulację transkrypcji, sygnalizację fosfo i regulację proteolizy ³. Ponadto replikacja chromosomów i jednoczesna segregacja dają komórki potomne, które zawierają dokładnie jedną kopię chromosomu ⁴. Co ważne, te dwa typy komórek można szybko rozdzielić przez wirowanie gęstości cząstek krzemionki koloidalnej w synchronizowalnym szczepie NA1000 ^5-7, co pozwala na izolację komórek roju od reszty populacji z wysoką wydajnością (Figura 1B). Izolowane komórki roju przechodzą następnie synchronicznie przez asymetryczny podział komórek. Tutaj szczegółowo opisujemy protokół używany do synchronizacji szczepu Caulobacter NA1000. Udostępniamy protokoły i typowe wskazówki dotyczące rozwiązywania problemów zarówno dla synchronizacji na dużą, jak i małą skalę. Ta eksperymentalna procedura dostarcza potężnego narzędzia do badania czasoprzestrzennej kontroli cyklu komórkowego Caulobacter i losu komórki.

Protokół

1. Synchronizacja na dużą skalę - optymalna dla Western Blot, mikromacierzy/sekwencjonowania RNA i innych intensywnych testów materiałowych

1. Z bulionu zamrażarskiego lub talerza wyhoduj 5 ml kultury O/N szczepu NA1000, wstrząsając w temperaturze 28 °C w pożywce PYE.
2. Zaszczepić 0,5 ml komórek z etapu 1 w 25 ml M2G (tabele 1-2) i wstrząsać w temperaturze 28 °C, aż kultura osiągnie OD₆₀₀ między 0,5 a 0,6.
3. Zaszczepić komórki w 1 l M2G i wstrząsnąć w temperaturze 28 °C.
4. Gdy OD₆₀₀ osiągnie 0,5 do 0,6, potwierdź obecność komórek roju za pomocą mikroskopii fazowej zamontowanej w cieczy. Umieścić 1 μl komórek na szkiełku podstawowym, przykryć szkiełkiem nakrywkowym i zobrazować za pomocą mikroskopii fazowej. Potwierdź obecność komórek roju, wizualizując szybko pływające komórki w populacji.
5. Wirować komórki przez 15 minut w temperaturze 7 k x g w temperaturze 4 °C w wirniku JA-10.
6. Odrzucić sklarowany osad i dodać 180 ml zimnego M2 (tabele 1-2) i delikatnie zawiesić wszystkie komórki za pomocą pipety serologicznej. Wyrzuć luźno granulowane komórki; Są to komórki przedpodziałowe i szypułkowe.
7. Dodać 60 ml zimnego roztworu krzemionki koloidalnej (należy dobrze wymieszać zawiesinę krzemionki koloidalnej przed dodaniem do komórek) i dobrze wymieszać zawiesinę komórkową.
8. Wlać zawiesinę komórek do ośmiu probówek o pojemności 30 ml i wirować przez 30 minut w temperaturze 6,4 k x g w temperaturze 4 °C w rotorze JA-20.
   UWAGA: Powinny być widoczne dwa wyraźne pasma; pasmo roju jest dolnym pasmem, podczas gdy komórki szypułkowe/przedpodziałowe znajdują się w górnym paśmie (ryc. 1B).
9. Ostrożnie odessać górną opaskę i usunąć płyn do ~1 cm powyżej opaski roju (dolna wstęga).
10. (Krytyczne) Za pomocą pipety Pasteura ostrożnie usuń opaskę roju i umieść ją w czystej probówce. Aby zmyć krzemionkę koloidalną, uzupełnij probówkę zimnym M2 i wiruj przez 10 minut w temperaturze 6,4 k x g w 4 °C w wirniku JA-20.
11. Ostrożnie odrzucić supernatant i ponownie zawiesić komórki w 20 ml zimnego M2 i wirować przez 10 minut w temperaturze 6,4 k x g w temperaturze 4 °C w wirniku JA-20.
12. Ponownie zawiesić wszystkie granulki w 30 ml zimnego M2 i zmierzyć OD₆₀₀ za pomocą spektrofotometru i ślepej próby za pomocą zimnego podłoża M2. Zaoszczędź 1 μl na obrazowanie fazowe, aby sprawdzić, czy nie ma komórek roju; 90-95% komórek powinno być rojami.
13. Wirować komórki przez 5 minut w temperaturze 6,4 k x g w temperaturze 4 °C w wirniku JA-20. Ponownie zawieś ogniwa w podłożu M2G o temperaturze 28 °C, tak aby A₆₀₀ miało temperaturę ~0,3-0,4 i zacznij wstrząsać w temperaturze 28 °C.
    UWAGA: Typowe plony wynoszą od 30 do 60 ml hodowli komórek roju z 1 litra niezsynchronizowanych komórek.
14. Zacznij zbierać punkty czasowe (podział kultury typu dzikiego zajmie około 135-140 minut) ^8,9. W każdym punkcie czasowym zmierz średnicę zewnętrzną₆₀₀. Sprawdź, czy średnica zewnętrzna₆₀₀ po podzieleniu jest około 2 razy większa od początkowej średnicy zewnętrznej₆₀₀.
15. W przypadku testów western blot lub ekspresji genów należy usunąć 1 ml podwielokrotności kultury w żądanych punktach czasowych, odwirować z maksymalną prędkością w wirówce stołowej przez 30 sekund, szybko zdekantować lub zassać pożywkę i błyskawicznie zamrozić osad komórkowy w ciekłym azocie. Przechowywać komórki w temperaturze -80 °C do czasu dalszej analizy.

2. Synchronizacja na małą skalę – optymalna dla mikroskopii

1. Z bulionu zamrażarskiego lub talerza wyhoduj 5 ml kultury O/N wytrząsającej w temperaturze 28 °C w M2G.
2. Rozcieńczyć w 15 ml M2G (tabele 1-2) i rosnąć do połowy log (OD₆₀₀ = 0,5-0,6).
3. Wirować w temperaturze 6,4 k x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C w wirniku JA-20, ponownie zawiesić w 1 ml zimnego M2 (tabele 1-2) i przenieść do probówki do mikrowirówki o pojemności 2 ml.
4. Wirować z prędkością 15 k x g przez 3 minuty w probówce do mikrowirówki, aby osad był granulowany, odessać z supernatantu, umieścić osad na lodzie i ponownie zawiesić w 900 μl zimnego M2.
5. Dodać 900 μl zimnej krzemionki koloidalnej pokrytej PVP i wirować przez 20 minut w temperaturze 15 k x g w temperaturze 4 °C w probówce mikrowirówkowej.
6. (Krytyczne) Odessać lub odpipetować górną grupę komórek szypułkowych/predivisional i zebrać dolną grupę roju do nowej probówki do mikrowirówki.
7. Umyj komórki roju dwa razy w 1 ml zimnego M2, wirując przy 15 k x g przez 3 minuty.
8. Przed ostatnim wirowaniem przenieś komórki do wstępnie schłodzonej szklanej probówki o pojemności 1 ml i zmierz OD₆₀₀ komórek w porównaniu z ślepą próbą M2.
9. Zawiesić końcową osadkę komórkową w temperaturze 28 °C M2G przy średnicy zewnętrznej między 0,3 – 0,4 i wstrząsnąć/zwinąć komórki w temperaturze 28 °C.
   UWAGA: Typowe plony wynoszą od 2 do 4 ml hodowli komórek roju.
10. W przypadku eksperymentów mikroskopowych w żądanych punktach czasowych umieść 1 μl komórek na podkładce agarozowej M2G w celu obrazowania.

Wyniki

Synchronizacja zazwyczaj daje dwa pasma komórek (Rysunek 1B): pasmo roju, które ma większą gęstość, oraz pasmo komórek szypułkowych/prepodziałowych o mniejszej gęstości. Aby zapewnić wydajną synchronizację, typowe kontrole obejmują monitorowanie OD₆₀₀ i pomiar poziomu białka CtrA za pomocą western blot w różnych punktach czasowych cyklu komórkowego. OD₆₀₀ powinien wzrosnąć około 2-krotnie w trakcie cyklu komórkowego (ryc. 2). Western blot dla głównego regulatora cyk...

Dyskusja

Bakteryjny cykl komórkowy jest podstawowym procesem w życiu i jest ważny dla badań nad wzrostem oraz jako cel dla antybiotyków nowej generacji. W tym miejscu szczegółowo opisaliśmy procedury szybkiej synchronizacji dla C. crescentus NA1000, organizmu modelowego do badania cyklu komórkowego bakterii i asymetrycznego podziału komórek. Metoda ta jest modyfikowana do western blot, profilowania ekspresji genów i testów mikroskopii fluorescencyjnej w celu zbadania czasoprzestrzennej regulacji cyklu komórkowego bakter...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Krzemionka koloidalna powlekana PVP (percoll)	Sigma-Aldrich	P4937
Krzemionka koloidalna (Ludox AS-40)	Sigma-Aldrich	420840
JA10 Rotor	Beckman-Coulter	369687
JA20 Rotor	Beckman-Coulter	334831
roztwór chelatu siarczanu żelazawego	Sigma-Aldrich	F0518
Probówki wirówkowe 30 ml	Corning	8445
Na2HPO4	EMD	SX0720-1
KH2PO4	VWR	BDH9268-500G
NH4Cl	Amresco	0621-500g