Szczur, ze względu na swoje rozmiary, dostępność i raczej łagodne zachowanie, był wykorzystywany jako model badawczy przez wiele lat. Celem tego protokołu jest wykorzystanie szczura jako niedokrwiennego modelu gojenia się ran skóry, aby zapewnić cenny wgląd w patofizjologię ran przewlekłych.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Demonstracja modelu rany na skórze z niedokrwieniem skóry u szczura
* These authors contributed equally
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Skłonność do przewlekłych ran u ludzi wzrasta wraz z wiekiem, stanami chorobowymi takimi jak cukrzyca i upośledzone funkcje układu krążenia, oraz nieznośnym ciśnieniem spowodowanym bezruchem. Opracowano modele zwierzęce, które próbują naśladować te warunki w celu pogłębienia naszego zrozumienia złożoności ran przewlekłych. Opisany tutaj model to model płata niedokrwiennego skóry szczura, który pozwala na długotrwałe zmniejszenie przepływu krwi, co skutkuje ranami, które stają się niedokrwienne i przypominają fenotyp rany przewlekłej (zmniejszone unaczynienie, zwiększony stan zapalny i opóźnione zamknięcie rany). Składa się z dwunożnego płata grzbietowego z 2 ranami niedokrwiennymi umieszczonymi centralnie i 2 ranami niedokrwiennymi bocznymi do płata jako kontrolnymi. Nowatorskim dodatkiem do tego niedokrwiennego modelu płata skóry jest umieszczenie pod płatem silikonowego arkusza, który działa jako bariera i szyna, aby zapobiec rewaskularyzacji i zmniejszyć skurcz w miarę gojenia się ran. Pomimo debaty na temat wykorzystania szczurów do badań nad gojeniem się ran ze względu na ich dość wyraźne różnice anatomiczne i fizjologiczne w porównaniu z ludźmi (tj. obecność mięśnia panniculus carnosus, krótka żywotność, zwiększona liczba mieszków włosowych i ich zdolność do gojenia zakażonych ran), modyfikacje zastosowane w tym modelu sprawiają, że jest on cenną alternatywą dla wcześniej opracowanych modeli płatów skóry niedokrwiennej.
Wprowadzenie
Skuteczne opracowywanie leków i innych metod leczenia ran wymaga odpowiednich modeli in vivo, pomimo znanych problemów z przekładaniem wyników z modeli zwierzęcych na terapie ludzkie1. Poniżej znajduje się opis szczegółowego protokołu stosowania szczurzego modelu gojenia się ran niedokrwiennych skóry w celu zbadania mechanizmów, które pogłębiają zrozumienie patologicznego gojenia się ran. Gatunek szczurów, często wykorzystywany ze względu na jego szeroką dostępność, rozmiar i łagodny charakter, jest wykorzystywany do badań nad gojeniem się ran, ponieważ jest wystarczająco duży, aby zapewnić odpowiedni obszar skóry do zranień po nacięciach i wycięciach, obrazowania i pobierania tkanek2. Należy jednak wziąć pod uwagę, że skóra szczura i człowieka różni się anatomicznie, przy czym szczury są określane jako zwierzęta o luźnej skórze. Ta wyraźna cecha pozwala na skurcz rany, a nie nabłonek, aby znacząco przyczynić się do zamknięcia ran skóry szczura2. Dodatkowo, obecność podskórnego mięśnia panniculus carnosus u szczurów, przyczynia się do gojenia zarówno przez skurcz, jak i tworzenie kolagenu3,4. Te bardzo ważne różnice anatomiczne zostały wzięte pod uwagę przy opracowywaniu modelu rany niedokrwiennej skóry u szczurów i wdrożono specyficzne modyfikacje w celu zmniejszenia skurczu rany i zmniejszenia wpływu mięśnia pachrzęstnego5.
W przypadku owrzodzeń stopy cukrzycowej, owrzodzeń żylnych nóg i odleżyn, gojenie jest opóźnione, a rany te są uważane za przewlekłe. Rany charakteryzują się nadmiernym stanem zapalnym, który uniemożliwia przejście rany do kolejnych faz gojenia się rany6. Jednym z głównych czynników rozwoju rany przewlekłej jest miejscowe niedokrwienie tkanek (zmniejszony przepływ krwi)5 przyczyniające się do niemożności usunięcia stanu zapalnego. W czasie, w którym model ten był opracowywany i walidowany (w latach 2003-2004), nie było wystandaryzowanych modeli zwierzęcych, które mogłyby dostarczyć wystarczającą ilość tkanki do przetestowania indukcji angiogenezy w łożysku rany, kluczowego etapu podczas normalnego gojenia się rany i motywacji do opracowaniatego modelu. To powiedziawszy, przedstawiony tutaj model jest modyfikacją modelu rany niedokrwiennej pierwotnie opisanego przez Schwartza i wsp.7, a następnie wykorzystany w zmodyfikowanej formie przez Chen i wsp.8
W zmodyfikowanym modelu rany niedokrwiennej wprowadzono zmiany mające na celu obejście wyżej wymienionych cech anatomicznych szczura, które prowadzą do gojenia przez skurcz, a nie przez nabłonek: (1) Dwie rany wycinające o pełnej grubości są tworzone w obrębie dwunożnego płata skóry grzbietowej, a mięsień panniculus carnosus jest usuwany z łożyska rany poprzez preparację tuż nad powięzią mięśniową. (2) Sam płat ma węższe wymiary, co zapewnia, że dopływ krwi jest losowy, a rany znajdujące się w środku płata są niedokrwienne. (3) Pod klapką wkłada się silikonowy arkusz, który zapobiega readherencji i reperfuzji płata z tkanki znajdującej się pod spodem. Skurcz rany jest ograniczony (nie wyeliminowany) poprzez zakotwiczenie lub przyszycie płata do arkusza silikonowego5.
Model był ostatnio używany w badaniach, począwszy od hiperbarycznego wpływu tlenu na gojenie się ran niedokrwiennych9,10, a skończywszy na gojeniu się ran niedokrwiennych u młodych i starszychszczurów11, i okazał się wiarygodnym modelem przedłużonego niedokrwienia tkanek. Wymiary dwunożnej klapy zostały również dostosowane do różnych szczepów szczurów, w tym szczurów Sprague Dawley (11 cm długości i 2 cm szerokości) i F344 (10,5 cm długości i 3,0-3,5 cm szerokości) oraz innych gatunków, w tym świń12 i myszy13,14 . Ten film wykorzystuje wsobny szczep szczurów F344 w demonstracji niedokrwiennego modelu rany skóry.
Zatwierdzenie wszystkich procedur na zwierzętach przedstawionych poniżej zostało uzyskanych od Komitetu ds. Opieki nad Zwierzętami Uniwersytetu Południowej Florydy (IACUC) i spełnia wszystkie wymagania Ustawy o Dobrostanie Zwierząt oraz Przewodnika do Opieki i Użytkowania Zwierząt Laboratoryjnych.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
UWAGA: Zatwierdzenie wszystkich procedur na zwierzętach przedstawionych poniżej zostało uzyskanych od Komitetu ds. Opieki nad Zwierzętami Uniwersytetu Południowej Florydy (IACUC) i przestrzega wszystkich wymagań Ustawy o Dobrostanie Zwierząt oraz Przewodnika do Opieki i Użytkowania Zwierząt Laboratoryjnych.
1. Przygotowanie arkuszy silikonowych i narzędzi chirurgicznych
- Wstępnie przycięte paski (10,5 cm x 3,0 cm) o niewzmocnionej grubości 0,01, folia silikonowa klasy medycznej i sterylizacja w autoklawie.
- Wyczyść i wysterylizuj odpowiednie narzędzia chirurgiczne (nożyczki, kleszcze i zasłony lub ręczniki, aby stworzyć sterylne pole podczas operacji).
2. Zwierzęta doświadczalne
- Używaj dorosłych samców lub samic szczurów o wadze od 250 do 350 g uzyskanych od hodowcy komercyjnego. Jeśli wykorzystywane są szczury w podeszłym wieku, powinny one ważyć ≥350 g, aby zapewnić lepsze przeżycie po operacji. Przed rozpoczęciem jakichkolwiek doświadczeń należy zaaklimatyzować wszystkie zwierzęta przez co najmniej 7 dni w standardowych warunkach 12-godzinnego cyklu jasno-ciemnego, z jedzeniem i wodą ad libitum.
3. Znieczulenie, Analgezja przedoperacyjna i przygotowanie operacyjne
- Wywołać znieczulenie ogólne za pomocą izofluranu w stężeniu 3%-4% przez komorę indukcyjną i utrzymać (za pomocą stożka nosowego) na poziomie 1%-2% zO2 podczas przygotowania skóry i operacji. Monitoruj głębokość znieczulenia, obserwując szybkość i głębokość oddychania, międzypalcowe szczypanie lub odruch mrugania powieki.
UWAGA: W tym czasie na oczy można nałożyć maść weterynaryjną, aby zapobiec wysuszeniu, gdy zwierzę jest pod narkozą. - W miejscu oddalonym od sterylnego obszaru operacyjnego umieść szczura w pozycji leżącej i ogol grzbiet maszynką do strzyżenia od podstawy szyi w dół około 11 cm. Szablon z markerem permanentnym, kontur płata o wymiarach 3,0 cm x 10,5 cm (patrz ryc. 1A).
- Przenieś szczura do czystego, wyznaczonego obszaru operacyjnego wyposażonego w zatwierdzoną poduszkę grzewczą i sterylne zasłony chirurgiczne lub ręczniki. Wstrzyknąć 5 mg/kg ketoprofenu podskórnie przed pierwszymi nacięciami chirurgicznymi w celu złagodzenia bólu. W razie potrzeby można podawać podskórnie dodatkowe płyny (sól fizjologiczna) (do 5 cm³).
- Przygotuj skórę dalej, przecierając najpierw 70% alkohol izopropylowy, a następnie 0,2% chlorheksydynę, a następnie nałóż sterylne zasłony, aby stworzyć sterylne pole. Można również użyć 10% jodu powidonu (betadyny).
UWAGA: Antybiotyk (ampicylina w dawce 15 mg/kg) może być podawany podskórnie, ale jeśli stosowane są dobre techniki aseptyki, nie jest to wymagane.
4. Tworzenie ran wycinających i płata dwunożnego
- Za pomocą sterylnego, jednorazowego narzędzia do dziurkacza do biopsji o średnicy 6 mm utwórz dwie okrągłe rany "niedokrwienne" w środku wyznaczonego obszaru płata (ryc. 1B). Głębokość rany powinna sięgać (nie przez) leżącą poniżej powięź mięśnia panniculus carnosus (wstawka ryc. 1B).
- Za pomocą kleszczy podnieś skórę w środku konturu rany utworzonego przez biopsję stempla, a następnie użyj nożyczek tęczówki (z zakrzywionymi końcówkami), aby wyciąć okrągły kawałek tkanki (w tym mięsień panniculus carnosus). Rezultatem będzie rana o pełnej grubości z powięzią jako podstawą rany.
UWAGA: Wyciętą tkankę (zatyczki ran) można zamrozić w ciekłym azocie lub utrwalić w 10% buforowanym formalinie O/N w celu późniejszego przetworzenia jako kontrolna, normalna skóra. - Utwórz dwunożny płat, wykonując nacięcia sterylnym skalpelem po każdej stronie ran niedokrwiennych wzdłuż wcześniej narysowanych linii (ryc. 1C), które mają 10,5 cm długości i 3,0 cm od siebie. Głębokość nacięć powinna sięgać mięśni przykolcowych. Za pomocą nożyczek do tęczówki oddziel powięź panniculus carnosus od mięśni przykolcowych, uważając, aby powięź pozostała nienaruszona jako "podstawa" stempli 6 mm (ryc. 1D).
- Weź 1 sterylny, wstępnie przycięty arkusz silikonowy i umieść go między powięzią panniculus carnosus a mięśniami przykolcowymi (ryc. 1E), upewniając się, że prześcieradło nie wygina się ani nie składa. Za pomocą czarnych, niewchłanialnych szwów (rozmiar 4.0) zamknij oba nacięcia, zakotwiczając arkusz silikonu do skóry za pomocą co najmniej 8 przerwanych szwów z każdej strony, wzdłuż długości płata (ryc. 1F i 1G).
- Za pomocą sterylnego, jednorazowego narzędzia do dziurkowania do biopsji utwórz dwie "nieniedokrwienne" rany kontroli wewnętrznej (aż do przedniej powięzi mięśnia panniculus carnosus) 1 cm w bok od ran niedokrwiennych po obu stronach płata (ryc. 1G).
- Umieść linijkę pod ranami i zrób zdjęcia cyfrowe w celu pomiaru rany (patrz Rysunek 3A). W tym czasie przepływ krwi (perfuzja) może być monitorowany za pomocą laserowego Dopplera lub innych manipulacji (miejscowe umieszczanie leków).
- Nałóż zatwierdzony płynny klej zarówno czaszkowy, jak i ogonowy na rany oraz przezroczysty opatrunek foliowy, aby utrzymać wilgotność i czystość (sterylność) miejsca rany. Na ogonowym końcu klapy można założyć dodatkowy opatrunek, aby zapobiec usunięciu przez zwierzę większości szwów ogonowych.
5. Zabiegi pooperacyjne
- Umieszczaj zwierzęta w klatkach (trzymanych pojedynczo) wyposażonych w płytkie karmniki, tak aby miejsce operacji nie ocierało się o karmnik. Zwierzęta nie powinny być pozostawiane bez opieki ani zwracane do towarzystwa innych zwierząt, dopóki nie odzyskają wystarczającej świadomości, aby utrzymać pozycję leżącą mostka i wykazywać celowe ruchy. Maty grzewcze należy umieścić pod połową klatki na okres do 2 dni podczas rekonwalescencji.
- Aby poradzić sobie z bólem pooperacyjnym, podawaj zwierzętom ketoprofen (5 mg/kg) podskórnie następnego ranka i 1 raz dziennie przez maksymalnie 48 godzin po operacji. Zwierzęta powinny być również codziennie monitorowane pod kątem przedłużających się objawów bólu, utraty masy ciała lub zakażeń miejsca operowanego.
6. Późniejsze pomiary ran i zmiany opatrunku
- Mierz rany niedokrwienne i nieniedokrwienne często w znieczuleniu ogólnym, używając izofluranu w stężeniu 3%-4% przez komorę indukcyjną i utrzymywane (przez stożek nosowy) na poziomie 1%-2% za pomocąO2, jak w kroku 3.1.
- Delikatnie zdejmij opatrunek, aby nie ściągnąć kleju ze skóry. W tym czasie wykonywane są dodatkowe zdjęcia cyfrowe w celu pomiaru ran, ponownego zastosowania leczenia miejscowego, laserowego obrazowania dopplerowskiego (LDI) lub innych manipulacji wykonywanych w zależności od potrzeb badacza.
- Nałożyć klej i czysty opatrunek i pozwolić zwierzęciu dojść do siebie, jak w kroku 5.1.
7. Zbieranie ran i eutanazja
- Zebrać rany niedokrwienne i nieniedokrwienne (w dniach, które badacz uzna za stosowne), podczas gdy zwierzę jest w znieczuleniu ogólnym, stosując izofluran w stężeniu 3%-4% przez komorę indukcyjną i utrzymywane (przez stożek nosowy) na poziomie 1%-2% zO2, jak w kroku 3.1.
- Za pomocą skalpela wykonaj kwadratowe wycięcie wokół rany, aby objąć zdrową tkankę wokół rany. Umieścić wycięcie w probówce z nakrętką zatrzaskową o pojemności 1,5 ml i zamrozić w ciekłym azocie (przechowywać w temperaturze -80 °C) do przyszłej analizy molekularnej lub inkubować w 10% buforowanej formalinie O/N w temperaturze pokojowej w celu przetwarzania histologicznego.
UWAGA: Wycięcia ran można również przeciąć na pół, aby uzyskać więcej próbek do analizy. - Po usunięciu tkanki rany zwierzę należy poddać eutanazji przy użyciu zatwierdzonej metody wdychania CO2 .
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Protokół modelu gojenia ran niedokrwiennych u szczurów powinien zająć około 20 min na zwierzę przy sprawnej realizacji. Przed nałożeniem opatrunku model powinien wyglądać tak, jak przedstawiono na Rysunku 1G. Ważne jest zweryfikowanie, czy płat dwupieńkowy oraz znajdujące się w nim rany są niedokrwione. Napięcie tlenu w tkance podskórnej (PscO2) na poziomie ran było mierzone podczas walidacji tego modelu5 poprzez umieszczenie elektrody polarygraficznej w tkance podskórnej pomiędzy d...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Gojenie się ran u szczurów było często przedmiotem debaty ze względu na ich zdolność do gojenia zakażonych ran i wysoki wskaźnik zmienności międzyzwierzęcej5. Jednym z pierwotnych celów modelu podczas jego opracowywania było zmniejszenie tej zmienności. Modyfikacje szerokości płata, zmniejszenie liczby ran o określonym umiejscowieniu (wyśrodkowanie na klapie ze stałym położeniem czaszkowo-ogonowym) oraz wprowadzenie arkusza silikonowego osiągnęły ten cel. Gojenie się ran przez skurcz również zostało zmniejszon...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Autorzy chcieliby podziękować za wsparcie finansowe ze strony University of South Florida, Department of Surgery (Mack Wu, MD, PhD).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Sil-Tec folia klasy medycznej | Produkty techniczne Inc. | 500-3 | niewzmocnione, grubość 0,01 cala |
| Nożyczki Mini Iris, 8 cm, zakrzywione, SS | World Precision Instruments | #503671 | |
| Nici nylonowe Ethilon | Ethicon | 1964G | czarne, rozmiar 4.0, PC-3 16 mm igły (3/8 koła) |
| Laserowy obrazownik dopplerowski | Moor Instruments | moorLDI2-IR | Standardowe obrazowanie przepływu krwi: http://us.moor.co.uk/product/moorldi2-laser-doppler-imager/8 |
| ImageJ | NIH | do pobrania za darmo | http://rsb.info.nih.gov/ij/ |
| Mastisol | Henry Schein | Cat # 7289210 | Fisher Scientific NC9774929 |
| Tegaderm | Medical Specialties | 3M1624W | Fisher Scientific NC9922128 |
Bibliografia
- Ansell, D. M., Holden, K. A., Hardman, M. J. Animal models of wound repair: Are they cutting it. Experimental dermatology. 21 (8), 581-585 (2012).
- Dorsett-Martin, W. A. Rat models of skin wound healing: a review. Wound repair and regeneration : official publication of the Wound Healing Society [and] the European Tissue Repair Society. 12 (6), 591-599 (2003).
- Davidson, J. M. Animal models for wound repair. Arch Dermatol Res. 290 (S1-11), (1998).
- Finn, G., Magnus, S. A., Tonny, K. Models for use in wound healing research: A survey focusing on in vitro and in vivo adult soft tissue). Wound Repair and Regeneration. 8, (2000).
- Gould, L. J., Leong, M., Sonstein, J., Wilson, S. Optimization and validation of an ischemic wound model. Wound repair and regeneration : official publication of the Wound Healing Society [and] the European Tissue Repair Society. 13 (6), 576-582 (2004).
- Loots, M. A., et al. Differences in cellular infiltrate and extracellular matrix of chronic diabetic and venous ulcers versus acute wounds. The Journal of investigative dermatology. 111 (5), 850-857 (1998).
- Schwartz, D. A., Lindblad, W. J., Rees, R. R. Altered collagen metabolism and delayed healing in a novel model of ischemic wounds. Wound Repair Regen. 3 (2), 204-212 (1995).
- Chen, C., et al. Molecular and mechanistic validation of delayed healing rat wounds as a model for human chronic wounds. Wound Repair and Regeneration. 7, (1999).
- Zhang, Q., Chang, Q., Cox, R. A., Gong, X., Gould, L. J. Hyperbaric oxygen attenuates apoptosis and decreases inflammation in an ischemic wound model. The Journal of investigative dermatology. 128 (8), 2102-2112 (2008).
- Zhang, Q., Gould, L. J. Hyperbaric oxygen reduces matrix metalloproteinases in ischemic wounds through a redox-dependent mechanism. The Journal of investigative dermatology. 134 (1), 237-246 (2013).
- Moor, A. N., et al. Consequences of age on ischemic wound healing in rats: altered antioxidant activity and delayed wound closure. Age (Dordrecht, Netherlands). 36 (2), 733-748 (2014).
- Roy, S., et al. Characterization of a preclinical model of chronic ischemic wound). Physiological genomics. 37 (3), 211-224 (2009).
- Biswas, S., et al. Hypoxia inducible microRNA 210 attenuates keratinocyte proliferation and impairs closure in a murine model of ischemic wounds. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (15), 6976-6981 (2010).
- Winocour, S., Vorstenbosch, J., Trzeciak, A., Lessard, L., Philip, A. CD109, a novel TGF-beta antagonist, decreases fibrotic responses in a hypoxic wound model. Exp Dermatol. 23 (7), 475-479 (2014).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
