Barwienie owadów do testów behawioralnych: zachowanie godowe znieczulonych Drosophila

Podsumowanie

Ten protokół opisuje prosty, ekonomiczny sposób indywidualnej identyfikacji Drosophila lub innych owadów. Dane demonstracyjne badające sukces godowy trzech gatunków Drosophila pokazują, że metoda ta jest porównywalna lub lepsza niż zastosowanie znieczulenia CO₂ .

Streszczenie

Eksperymenty godowe z użyciem Drosophila znacznie przyczyniły się do zrozumienia doboru płciowego i zachowania. Eksperymenty często wymagają prostych, łatwych i tanich metod rozróżniania osób w badaniu. Standardową techniką w tym celu jest znieczulenie CO₂ , a następnie etykietowanie lub obcinanie skrzydeł każdej muchy. Jest to jednak inwazyjne i wykazano, że wpływa na zachowanie. Inne techniki wykorzystywały ubarwienie do identyfikacji much. W artykule przedstawiono prostą i nieinwazyjną metodę znakowania Drosophila, która pozwala na ich indywidualną identyfikację w ramach eksperymentów, przy użyciu barwników spożywczych. Ta metoda jest stosowana w próbach, w których dwa samce rywalizują o kojarzenie się z samicą. Barwienie pozwoliło na szybką i łatwą identyfikację. Istniała jednak pewna różnica w sile wybarwienia u trzech badanych gatunków. Przedstawiono dane pokazujące, że barwnik ma mniejszy wpływ na zachowania godowe niż CO₂ u Drosophila melanogaster. Wykazano, że wpływ znieczulenia CO₂ zależy od gatunku Drosophila, przy czym D. pseudoobscura i D. subobscura nie wykazują wpływu, podczas gdy samce D. melanogaster miały mniejszy sukces godowy. Przedstawiona metoda barwienia ma zastosowanie w szerokim zakresie projektów eksperymentalnych.

Wprowadzenie

W ciągu ostatnich kilku dekad wzrosło zainteresowanie tym, jak dobór płciowy i rywalizacja między samcami wpływają na ewolucję^1,2. Eksperymenty nad zachowaniami godowymi odegrały ważną rolę w rozwoju i testowaniu teorii doboru płciowego^3,4. W szczególności badania z wykorzystaniem gatunków z rodzaju Drosophila w znacznym stopniu przyczyniły się do zrozumienia doboru płciowego i zachowań. Ważne jest jednak zbadanie, czy powszechnie stosowane techniki mogą sztucznie zniekształcać wyniki standardowych eksperymentów kryjowych^5,6.

Znieczulenie jest często używane do obsługi i identyfikacji w eksperymentach⁷. Na przykład muchy są powszechnie zbierane przed kryciem lub sortowane według genotypów lub eksperymentalnych zabiegów z użyciem znieczulenia dwutlenkiem węgla (CO₂ ). W eksperymentach, w których konieczne jest rozróżnienie dwóch lub więcej osobników, powszechną praktyką jest znieczulanie muszek i odcinanie części skrzydła w celu zidentyfikowania każdej osoby lub grupy leczonej^5,8. Ważne jest jednak, aby zrozumieć, w jaki sposób leczenie CO₂ wpłynie na zachowanie. Wpływ znieczulenia CO₂ badano u Drosophilamelanogaster, w którym samce narażone na CO₂ potrzebowały znacznie więcej czasu na kopulację i ogólnie miały niższy sukces krytkowy niż samce nieznieczulone lub samce znieczulone przy użyciu ekspozycji na zimno⁵. Efekt ten zaobserwowano zarówno po zastosowaniu znieczulenia w dniu eksperymentu, jak i po tym, jak muchom dano jeden dzień na wyzdrowienie. Jednak badanie to było ograniczone tylko do badań, w których jednemu mężczyźnie przedstawiono każdą samicę⁵. Bardziej realistycznym scenariuszem jest spotkanie samicy z wieloma samcami^9,10, co pozwala na rywalizację między samcami, co może pozwolić na wykrycie bardziej subtelnych strat męskiej sprawności z powodu znieczulenia. Stwierdzono również, że stosowanie znieczulenia CO₂ zmniejsza płodność i długowieczność dorosłych D. melanogaster, gdy są one narażone wkrótce po eklozji, co jest powszechne w przypadku zbierania dziewiczych much¹¹.

Alternatywą dla znieczulenia CO₂ jest znakowanie much poprzez karmienie ich jedzeniem zabarwionym barwnikiem^4,6,10,12,13. Barwnik ten dostaje się do jelit muchy i jest widoczny przez brzuch, co pozwala odróżnić kolorowe muchy od much bezbarwnych lub od much oznaczonych innym kolorem. Metody różnią się pod względem sposobu ich zastosowania: dodawanie bezpośrednio do żywności¹², za pomocą barwionej dodatkowej pasty drożdżowej⁶ lub poprzez wystawienie na działanie nowego barwionego substratu spożywczego¹³. Wydaje się, że te techniki znakowania nie mają wpływu na wydajność krycia^4,6. Jednak w artykule bezpośrednio badającym wpływ tego samego barwnika spożywczego na dorosłe osobniki D. melanogaster stwierdzono silne skrócenie długości życia¹⁴. Wcześniejsze prace koncentrowały się prawie wyłącznie na D. melanogaster, zarówno w odniesieniu do skutków znieczulenia CO₂ ^5,11, jak i metod barwienia żywności¹⁴. Obecnie niewiele jest informacji na temat tego, jak znieczulenie CO₂ lub stosowanie barwienia jelit wpływa na zachowania godowe innych Drosophila.

Poniższe badanie ocenia wpływ znieczulenia CO₂ na zachowania godowe trzech gatunków Drosophila (D. melanogaster, D. pseudoobscura i D. subobscura). Wpływ zbierania much na CO₂ badano zarówno w próbach krycia pojedynczego, jak i dwóch samców. Stwierdzono również, że wpływ CO₂ różni się u D. melanogaster⁵i dlatego przetestowano różne okresy latencji między ekspozycją na CO₂ a kryciem. Alternatywna metoda znakowania do znieczulenia i obcinania skrzydeł: oceniane jest również użycie barwników spożywczych do barwienia much.

Protokół

1. Przygotowanie pokarmu dla much z barwnikiem spożywczym

1. Weź standardową fiolkę z lekiem Drosophila z około 20 ml pokarmu na dnie (ryc. 1). Skorzystaj z poniższego przepisu na mieszanie żywności przy użyciu 1 l wrzącej wody: 10 g agaru, 85 g dekstrozy, 60 g mąki kukurydzianej, 40 g drożdży i mieszaj przez 5 minut gotowania na wolnym ogniu. Dodać 25 ml 10% nipagenu, gdy mieszanina ostygnie do temperatury 75 °C.
2. Po ostygnięciu i zestaleniu się pokarmu dodać dwie krople (około 0,5 - 1 ml) niebieskiego barwnika spożywczego na wierzch karmy i rozprowadzić na całej powierzchni fiolki (Rysunek 1). Jeśli wolisz, użyj barwnika w innym kolorze.
3. Pozostaw żywność na dwa dni w lodówce, aby barwnik został wchłonięty przez wierzchnią warstwę żywności; pozwoli to uniknąć nadmiernej wilgoci uszkadzającej muchy w okresie dojrzewania. Dodaj mały kawałek bibuły, jeśli nadmierna wilgoć nadal stanowi problem, aby usunąć dodatkową wilgoć, a następnie ją usuń.
4. Przenieś muchy na pokarm pojedynczo lub w grupach.
   Uwaga: Muchy ulegną zabarwieniu jelit w ciągu 1 dnia od umieszczenia na pokarmie. Alternatywnie, w pełni dojrzałe muchy na farbowanym pokarmie przed eksperymentem (nie zaobserwowano zwiększonej śmiertelności w okresie dojrzewania w wyniku ekspozycji na barwnik spożywczy).
5. Sprawdź, czy farbowane muchy można łatwo odróżnić od much niefarbowanych. Jeśli nie można ich odróżnić, powtórz kroki 1.1 - 1.4, używając albo wyższego stężenia barwnika, albo innego barwnika.

2. Dwie próby krycia samców przy użyciu barwników spożywczych

1. W celu uzyskania potomstwa należy ustawić wiele fiolek zawierających pary samic i samców much (odpowiednie są również małe grupy samców i samic, należy jednak uważać, aby uniknąć stłoczenia larw). Pozwól samicom złożyć jaja i przenieś muchy do nowych fiolek co 5-7 dni. Przechowywać fiolki w temperaturze odpowiedniej dla danego gatunku (22 °C dla D. pseudoobscura i D. subobscura oraz 25 °C dla D. melanogaster).
2. Przed zebraniem eksperymentalnych muszek należy usunąć wszystkie muchy z fiolek do pobierania o określonej porze przed zebraniem samców i samic, aby upewnić się, że będą dziewicami (D. melanogaster – 6 godzin w 25 °C, D. pseudoobscura – 18 godzin w 22 °C i D. subobscura – 24 godziny w 22 °C).
   Uwaga: Jeśli muchy nie są dziewicze, wpłynie to na ich zachowanie w próbach godowych¹⁵.
   1. Przechowywać i dojrzewać samca pojedynczo w standardowych plastikowych fiolkach o wymiarach 75 x 20 mm (zawierających ~ 20 ml karmy). Pozwala to uniknąć negatywnego wpływu na zachowania godowe i sprawność samców obserwowanych u niektórych gatunków, gdy samce są trzymane w grupach¹⁶.
   2. Poddaj połowę samców pożądanemu leczeniu (w tym przypadku znieczulenie_CO2). Użyj maty CO₂ lub kranu, aby wystawić muchy na wymagany czas. Przechowuj połowę samców w każdym zabiegu na kolorowym pokarmie, aż dojdzie do krycia. To sprawi, że będą one wizualnie odróżnialne podczas prób godowych.
   3. Do przenoszenia much użyj aspiratora¹⁷. Oznaczyć każdą fiolkę, aby zidentyfikować zarówno leczenie, jak i stan koloru samca. Tutaj należy zastosować cztery zabiegi (znieczulenie, bezbarwne = G-NC, znieczulenie, kolorowe = G-C, bez znieczulenia, bezbarwne, NG-NC i bez znieczulenia, kolorowe, NG-C).
3. Przenieś nowo pojawiające się samice do fiolek ze świeżą żywnością, aby dojrzały jako grupy po 10 osób.
4. Pozwól muchom dojrzeć do wieku godowego (D. melanogaster – 3 dni, D. pseudoobscura – 5 dni, D. subobscura – 7 dni¹⁸. Muchy należy przechowywać w temperaturze odpowiedniej dla badanego gatunku (np. 22 °C dla D. pseudoobscura i D. subobscura oraz 25 °C dla D. melanogaster).
5. Przenieść samice do pojedynczych fiolek (zawierających ~ 20 ml pokarmu) na 1 dzień przed próbą krycia w celu aklimatyzacji do fiolki kryjącej. Oznaczyć te fiolki tak, aby można było je rozróżnić. Należy uważać, aby zaślepić eksperyment za pomocą neutralnego oznakowania (np. 1 - 150), aby nie było możliwe odgadnięcie tożsamości much w żadnej fiolce.
   Uwaga: Osoba, która umieści muchy w każdej fiolce, będzie musiała znać tożsamość much umieszczonych w każdej fiolce, ponieważ zauważy, które leczenie było barwione. Jednak obserwator, który obserwuje krycie, nie powinien znać ich tożsamości. Aby to zrobić, potrzebnych będzie co najmniej dwóch eksperymentatorów, jeden do przygotowania i jeden do obserwacji.
6. Próby godowe należy rozpocząć między godziną 10 a 12 rano lub w czasie, który zbiega się z zapaleniem się światła w cyklu światło/ciemność, na który narażone są muchy ("świt" dla much). Dodać dwa samce much do każdej fiolki godowej (zawierającej pojedynczą samicę muchy) za pomocą aspiratora. Upewnij się, że dwa samce pochodzą z różnych metod leczenia (znieczulenie lub kontrola) i że jeden z nich ma barwienie jelit, aby umożliwić odróżnienie ich od siebie, i zwróć uwagę, który samiec jest zabarwiony.
7. Jeśli dojdzie do kopulacji, zapisz status samca, który łączy się w pary (ubarwiony lub nieubarwiony). Jeśli próby trwają 2 godziny, załóżmy, że samica nie będzie się kojarzyć.
   Uwaga: 2 godziny są odpowiednie dla tych gatunków, ale inne Drosophila mogą potrzebować więcej lub mniej czasu.

3. Próby krycia pojedynczych samców

1. W przypadku badań z udziałem pojedynczych mężczyzn należy powtórzyć Protokół 2 z dwiema zmianami:
   1. W kroku 2.3 nie trzymaj samców na kolorowych pokarmach.
   2. W kroku 2.7 dodać tylko jednego samca do każdej fiolki.
2. W kroku 2.8 zapisz czas dodania muchy do fiolki, czas rozpoczęcia krycia i czas zakończenia krycia. Na podstawie tych wartości oblicz powodzenie krycia, opóźnienie i czas trwania.

4. Analiza danych

1. Użyj odpowiedniego pakietu statystyk do analizy. Jeśli dane są normalne i obejmują tylko dwa zabiegi, należy użyć testów t lub równoważnego uogólnionego modelu liniowego (GLM). W przypadku dwóch eksperymentów męskich użyj testów dwumianowych lub dwumianowego GLM, które są dostępne w dowolnym pakiecie podstawowych statystyk.
   Uwaga: W przypadku danych przykładowych wszystkie analizy zostały przeprowadzone w wersji R 3.0.3¹⁹.
2. Sprawdź dane dotyczące opóźnienia krycia i czasu trwania krycia pod kątem normalności, wykreślając histogramy częstotliwości opóźnienia i czasu trwania dla każdego leczenia²⁰ i używając testu normalności, takiego jak Shapiro-Wilk. Jeśli nie jest to normalne, przekształć go lub użyj nieparametrycznych równoważnych statystyk²⁰.
   Uwaga: Dla przykładu dane z eksperymentów z pojedynczym samcem transformacja logarytmiczna spełniała wymagania normalności i równych wariancji.
3. Jeśli dane można znormalizować, użyj testów t, aby zbadać różnice między opóźnieniem i czasem trwania krycia w próbach krycia z pojedynczym samcem przy użyciu dwóch zabiegów²¹. Jeśli stosuje się wiele zabiegów, wypróbuj analizę wariancji (ANOVA)²⁰. Jeśli danych nie można znormalizować, spróbuj przeprowadzić równoważne testy nieparametryczne²¹.
4. Użyj testów dwumianowych, aby sprawdzić wpływ barwnika spożywczego lub znieczulenia CO₂ na sukces kryty rywalizujących samców²⁰. Jeśli stosuje się wiele zabiegów, tak jak ma to miejsce w przypadku przykładowych danych, należy użyć OML ze strukturą błędu dwumianowego²¹.
5. W przypadku dwóch prób męskich w przykładowych danych należy użyć OML ze strukturami błędów dwumianowych. W jednym z GLM zbadano kolor jako zmienną odpowiedzi (kolorowy = 0 i niekolorowy = 1) z gatunkami, statusem gazu i traktowaniem gazu jako zmiennymi objaśniającymi. W jednym z GLM badano CO₂ jako zmienną reakcyjną (zagazowany = 0 i niezagazowany = 1) z dopasowanym gatunkiem, kolorem i traktowaniem gazem. W każdym przypadku należy utworzyć model maksymalny i przeprowadzić uproszczenie modelu w oparciu o AIC²⁰.

Wyniki

Dwie próby krycia samców - Wpływ znieczulenia CO₂ na zachowania godowe

Najlepszy znaleziony model wyjaśniający zmienność efektu znieczulenia CO₂ zawierał gatunki jako czynnik (z D. pseudoobscura i D. subobscura połączonymi, ponieważ nie wykazały żadnych różnic między sobą). U D. pseudoobscura i D. subobscura nie stwierdzono istotnego wpływu znieczulenia CO₂ na powodzenie krycia w dwóch badaniach męskich (Z_1,589 = 0,087, P = 0,931). W przypadku D. melanogaster samce narażone na znieczulenie CO₂ miały znacznie niższy sukces godowy (Z1,589 = 2,467, P = 0,014). Stwierdzono również istotną interakcję między gatunkami a leczeniem (χ²_1,589 = 6,83, P = 0,009), przy czym większy efekt zaobserwowano, gdy D. melanogaster był wystawiony na działanie gazu podczas pobierania lub 1 dzień przed próbami (Tabela 1). Jednak samce D. melanogaster narażone na CO₂ dwa dni przed próbą eksperymentalną nie wykazały wpływu CO₂ .

Dwie próby krycia samców - Wpływ barwienia jelit na zachowania godowe

Uproszczenie modelu nie wykazało znaczącego wpływu barwnika spożywczego dla żadnego z trzech gatunków (P > 0,1). Gdy w analizie uwzględniono stan leczenia lub gazu, również nie były one istotne (P > 0,1). Proporcje udanych kryć much kolorowych w różnych zabiegach przedstawiono w >tabeli 2. Różnicę w ubarwieniu między muchami trzymanymi na kolorowym i bezbarwionym pokarmie można zobaczyć na rysunku 1. Intensywność barwienia pokarmu jelitowego była większa u D. pseudoobscura i D. subobscura niż u D. melanogaster.

Pojedyncze próby krycia - Wpływ stosowania znieczulenia CO₂ na zachowanie godowe

Nie było różnicy w czasie krycia dla żadnego z trzech gatunków, gdy do zbierania niedawno wynurzonych dorosłych osobników użyto znieczulenia CO₂. Stwierdzono wpływ na czas krycia u D. subobscura, gdy był wystawiony na działanie CO₂ dwa dni przed próbami krycia (ryc. 2 i 3; Tabela 2).

Rysunek 1. Fotografia przedstawiająca fiolki z kolorowym i niebarwionym pokarmem dla much (A) oraz siłę zabarwienia jelit u samca D. subobscura (B).

Rysunek 2. Średnie i 95% przedziały ufności dla opóźnienia kopulacji dla trzech gatunków badanych w badaniach z pojedynczymi samcami, gdy samce były znieczulane (jasne paski) lub nieznieczulone (ciemne paski), gdy zostały zebrane jako dziewice przed osiągnięciem dojrzałości płciowej.

Rysunek 3. Średnie i 95% przedziały ufności dla czasu trwania kopulacji dla trzech gatunków badanych w badaniach z pojedynczymi samcami, gdy samce były znieczulane (jasne paski) lub nieznieczulone (ciemne paski), gdy zostały zebrane jako dziewice przed osiągnięciem dojrzałości płciowej.

TGL Rozdział pkt. TGL TGL Rozdział Rozdział Rozdział TGL TGL Rozdział jednka TGL

leczenie	gatunek	Liczba prób	Nie. muchy ubarwione, które się kryją	Wartość p	Nie, muchy zagazowane, które się kryją	Wartość p
Zbiórka na CO2	D. mel	73 Rozdział 73	36	1	27 Rozdział 27	0,0344
	D. pse	79	Rozdział 41	0,8221	Rozdział 44	0,3682
	D. sub	71 Rozdział 71	Rozdział 40	0,3425	33 Rozdział 33	0,6353
Narażony na działanie CO2 18 godzin wcześniej	D. mel	57	28	1	Rozdział 19	0,0163
	D. pse	65	Rozdział 32	1	Rozdział 31	0,8043
	D. sub	68	38 Rozdział 38	Numer katalogowy: 0,3961	35	0,9036
Narażony na działanie CO2 2 dni.	D. mel	56 Rozdział 56	Rozdział 19	0,0222	Rozdział 32	0,3497
	D. pse	70	Rozdział 32	0,5504	33 Rozdział 33	0,7202
	D. sub	56 Rozdział 56	29	0,8939	26	0,6889

Tabela 1. Wyniki dwóch eksperymentów z wyborem samców na wszystkich gatunkach i badanych zabiegach.

TGL pkt. TGL pkt. jezdnego pkt. pkt. pkt. TGL punktu

gatunek	cecha	d.f.	Wartość t	Wartość p
D. melanogaster	Opóźnienie	Rozdział 58	1,379	0,174
	czas trwania	Rozdział 58	1,243	0,221
D. pseudoobscura	Opóźnienie	Rozdział 109	0,419	0,676
	czas trwania	Rozdział 109	0,436	0,664
D. subobscura	Opóźnienie	Rozdział 83	0,098	0,922
	czas trwania	Rozdział 83	1,767	0,081

Tabela 2. Wyniki eksperymentów z pojedynczym kryciem badających wpływ pobierania na znieczulenie CO₂ na opóźnienie i czas trwania krycia. Badania przeprowadzono na trzech gatunkach Drosophila (D. melanogaster, D. pseudoobscura i D. subobscura).

Dyskusja

Dane te pokazują, że wpływ znieczulenia CO₂ jest niespójny między gatunkami, przy czym dwa z trzech gatunków wykazują niewielki wpływ. Nasze wyniki sugerują, że znakowanie barwnikiem spożywczym miało mniejszy wpływ na sukces krytkowy samców niż znieczulenie CO₂ w przypadku D. melanogaster. Eksperymenty te pokazują, że barwniki spożywcze mogą być łatwo i tanio używane do oznaczania much do testów godowych z udziałem wielu samców.

Spośród trzech badanych modelowych gatunków Drosophila tylko D. melanogaster wykazał wpływ znieczulenia CO₂ na wydajność krycia w sytuacji konkurencyjnej. W przeciwieństwie do tego, żaden z gatunków nie wykazał wpływu zbierania na gaz w pojedynczych próbach godowych pod względem opóźnienia krycia, w przeciwieństwie do poprzednich wyników dla D. melanogaster⁵. Efektem konkurencji może być zatem uwypuklenie bardziej subtelnych efektów sprawności fizycznej znieczulenia CO₂ , które są wykrywalne tylko w sytuacjach, w których występuje rywalizacja między mężczyznami. Narażenie na kontakt przy wczesnym zbiorze i na jeden dzień przed badaniem ma negatywny wpływ na zdolność samców D. melanogaster do krycia. Ekspozycja na dwa dni przed badaniem nie wykazała jednak żadnego efektu. Zarówno D. pseudoobscura, jak i D. subobscura nie wykazały żadnego wpływu ekspozycji na gaz w żadnym z badań. Jednym z wyjaśnień jest to, że D. melanogaster był podatny na wczesne narażenie na CO₂ , ponieważ musi być zbierany wcześniej w życiu (0 - 6 godzin) niż inne gatunki, aby zapewnić dziewicze samce. Stąd samce D. melanogaster w tym wieku mogą być bardziej wrażliwe, ponieważ naskórek muchy nadal twardnieje, w porównaniu z innymi gatunkami, które miały więcej czasu na stwardnienie naskórka. Ogólnie rzecz biorąc, potwierdza to tezę, że efekty znieczulenia CO₂ są specyficzne dla gatunku i badacze powinni odpowiednio przetestować efekt u swoich gatunków docelowych. Obecnie większość prac nad wpływem znieczulenia CO₂ przeprowadzono na Drosophila melanogaster^5,11,22 i dlatego może nie być odpowiednie do zastosowania do innych pokrewnych gatunków.

Alternatywną nieinwazyjną metodą różnicowania much jest barwnik spożywczy. Wyniki sugerują, że zabieg ten nie miał wpływu na wszystkie badane gatunki. Jednakże, chociaż jego użycie było udane w dostarczaniu taniego i łatwo widocznego markera do rozróżniania osobników, należy zauważyć, że barwnik był łatwiejszy do odróżnienia u D. pseudoobscura i D. subobscura niż u D. melanogaster. Poprzedni autorzy używali kilku kolorów (czerwonego, zielonego i niebieskiego)^4,6. Stwierdziliśmy, że niebieskie zabarwienie jest najłatwiejsze do odróżnienia u wszystkich gatunków, w szczególności D. pseudoobscura i D. subobscura. Użycie kilku kolorów potencjalnie pozwoliłoby na bardziej złożone eksperymenty z wieloma indywidualnie oznaczonymi muchami. Jednak wstępne testy różnych barwników są niezbędne, ponieważ niektóre barwniki spożywcze nie barwią much, prawdopodobnie są trawione po spożyciu. Inne barwniki mogą mieć działanie toksyczne i zmniejszać przeżywalność much i należy ich unikać¹⁴). Alternatywne metody barwienia żywności przy użyciu droższych barwników zostały również wykorzystane do zbadania integralności jelit pod kątem D. melanogaster²³. Mogą one stanowić alternatywną, choć droższą, metodę barwienia²³.

Metoda barwienia jest tak szybka, jak przycinanie skrzydeł CO₂ , ponieważ muchy mogą być przechowywane na farbowanej żywności ze zbioru. Pobieranie pokarmu było szybkie (~ 3 godziny), więc przechowywanie O/N na kolorowym pokarmie byłoby również wystarczające do znakowania much, jak to było stosowane w innych badaniach⁶. Jednak czas trwania koloryzacji jest stosunkowo krótki (~ 4 - 5 godzin) w porównaniu z przycinaniem skrzydeł (na stałe) lub fluorescencyjnym znakowaniem pyłem (10 - 12 dni)²⁴. Ponieważ gatunki Drosophila różnią się wyglądem, różne barwniki będą mniej lub bardziej skuteczne dla różnych gatunków, a ponieważ niektóre szczepy (np. mutanty knock-out) mogą być podatne na zmiany w diecie, każde użycie barwnika wymaga wstępnego testu jego skuteczności, zwłaszcza jeśli długotrwałe narażenie na barwniki może być toksyczne¹⁴. W przeciwieństwie do badania Kalaw i wsp.¹⁴, nie stwierdziliśmy znaczącej śmiertelności po przechowywaniu przez wiele dni na kolorowych pokarmach dla D. melanogaster (3 dni), D. pseudoobscura (5 dni) lub D. subobscura (7 dni), prawdopodobnie ze względu na różnicę w użytym barwniku.

Kluczowym krokiem dla pomyślnego zastosowania techniki barwienia jest krok 1.5, sprawdzający, czy wybrany barwnik dobrze współpracuje z użytym gatunkiem i szczepem. Alternatywna technika polega na nałożeniu kolorowego pyłu na zewnętrzną stronę muchy przed użyciem w eksperymentach terenowych²⁴. Metoda ta została wykorzystana do śledzenia osobników w terenie ze względu na czas znakowania i łatwość masowego znakowania much²⁴. Chociaż nie przetestowaliśmy wyraźnie tej metody w próbach godowych, ważne byłoby zbadanie wszelkich wpływów, jakie pył może mieć na zmysły ważne w kojarzeniu, szczególnie u Drosophila^{25, 26}. Jednak u gatunków, u których barwienie jelit nie jest możliwe, metody te mogą być odpowiednie.

Podsumowując, stwierdziliśmy, że u dwóch z trzech badanych gatunków (D. pseudoobscura i D. subobscura) nie stwierdzono wpływu ani znieczulenia CO₂ , ani barwnika spożywczego na zdolność samców do krycia. W przypadku D. melanogaster wykryto negatywny wpływ znieczulenia_CO2 , ale barwienie żywności nie wpłynęło na sukces godowy tego gatunku. Ogólnie rzecz biorąc, metoda barwnikowa zapewnia prostą i tanią nieinwazyjną metodę identyfikacji poszczególnych Drosophila , która jest równoważna lub lepsza niż metody wymagające znieczulenia_CO2 . Jest prawdopodobne, że ta metoda będzie działać w przypadku wielu gatunków.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Rurka plastikowa	Fisher Scientific	TWT-200-061G	Inne rurki mogą być odpowiednie, jednak muszą zmieścić się w końcówce do pipety o pojemności 1 ml.
Drobna siatka	Odpowiednia jest każda pasmanteryjna		siatka kurtynowa
ml	VWR	83007-376	Odpowiednie będą różne marki końcówek do pipet
Fiolki plastikowe	Sarstedt	58.49	Można również użyć większych fiolek lub butelek.
Kulki bawełniane	Lewis Medical Solutions	28170	Rozmiar bawełny będzie się różnić w zależności od wielkości użytych fiolek
Niebieski barwnik spożywczy	Thesugarcraftcompany-Inne		kolory barwników i marki mogą mieć różne wyniki.
CO2 Zbiornik	BOC	BOC 40VK
Markery Sharpie	Steadtler	Lumocolor 313 S	Można stosować różne kolory, ale Lumocolor S daje doskonałe połączenie trwałości i delikatności
Stoper	Salter	SL3920	Każdy stoper z dobrym wyświetlaczem cyfrowym byłby w porządku