Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Elektroretinogram Analiza odpowiedzi wzrokowej u larw danio pręgowanego

15.5K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/52662

⸱

16 marca 2015

 ,  , 
1Department of Cell Biology and Physiology, University of North Carolina at Chapel Hill, 2Department of Ophthalmology, Duke University

W tym artykule

Podsumowanie

Prezentujemy metodę analizy elektroretinograficznej (ERG) larw danio pręgowanego z wykorzystaniem technik mikromanipulacji i elektroretinografii. Jest to prosta i nieskomplikowana metoda oznaczania funkcji wzrokowych larw danio pręgowanego in vivo.

Streszczenie

Elektroretinogram (ERG) to nieinwazyjna elektrofizjologiczna metoda określania funkcji siatkówki. Dzięki umieszczeniu elektrody na powierzchni rogówki, aktywność elektryczna generowana w odpowiedzi na światło może być mierzona i wykorzystywana do oceny aktywności komórek siatkówki in vivo. Niniejszy manuskrypt opisuje zastosowanie ERG do pomiaru funkcji wzrokowych u danio pręgowanego. Danio pręgowany od dawna jest wykorzystywany jako model rozwoju kręgowców ze względu na łatwość supresji genów przez oligonukleotydy morfolino i manipulację farmakologiczną. Przy 5-10 dpf w siatkówce larwy funkcjonują tylko czopki. Dlatego danio pręgowany, w przeciwieństwie do innych zwierząt, jest potężnym systemem modelowym do badania funkcji wzrokowych stożków in vivo. Protokół ten wykorzystuje standardowe protokoły znieczulenia, mikromanipulacji i stereomikroskopii, które są powszechne w laboratoriach prowadzących badania nad danio pręgowanym. Przedstawione metody wykorzystują standardowy sprzęt elektrofizjologiczny i kamerę przy słabym oświetleniu, aby pokierować umieszczeniem mikroelektrody rejestrującej na rogówce larwy. Na koniec pokazujemy, w jaki sposób dostępny na rynku stymulator/rejestrator ERG, pierwotnie zaprojektowany do użytku z myszami, można łatwo dostosować do stosowania u danio pręgowanego. ERG larw danio pręgowanego stanowi doskonałą metodę oznaczania funkcji wzrokowych stożka u zwierząt, które zostały zmodyfikowane przez wstrzyknięcie morfoligonukleotydów, a także nowsze techniki inżynierii genomu, takie jak nukleazy palca cynkowego (ZFN), nukleazy efektorowe podobne do aktywatora transkrypcji (TALEN) i zgrupowane regularnie rozmieszczone krótkie powtórzenia palindromiczne (CRISPR) / Cas9, z których wszystkie znacznie zwiększyły wydajność i skuteczność celowania w geny u danio pręgowanego. Ponadto wykorzystujemy zdolność środków farmakologicznych do penetracji larw danio pręgowanego, aby ocenić składniki molekularne, które przyczyniają się do fotoreakcji. Protokół ten określa konfigurację, która może być modyfikowana i wykorzystywana przez badaczy mających różne cele eksperymentalne.

Wprowadzenie

Elektroretinogram (ERG) to nieinwazyjna metoda elektrofizjologiczna, która była szeroko stosowana w klinice do określania funkcji siatkówki u ludzi. Aktywność elektryczną w odpowiedzi na bodziec świetlny mierzy się poprzez umieszczenie elektrod rejestrujących na zewnętrznej powierzchni rogówki. Charakterystyka paradygmatu bodźca i przebiegu odpowiedzi definiują neurony siatkówki przyczyniające się do odpowiedzi. Metoda ta została dostosowana do stosowania z wieloma modelami zwierzęcymi, w tym myszami i danio pręgowanymi. Typowa odpowiedź ERG kręgowców składa się z czterech głównych elementów: załamka a, która jest ujemnym potencjałem rogówki pochodzącym z aktywności komórek fotoreceptorów; załamek b, potencjał rogówkowo-dodatni pochodzący z komórek dwubiegunowych ON; załamek d, potencjał rogówkowo-dodatni interpretowany jako aktywność komórek dwubiegunowych OFF; oraz załamek c, który występuje kilka sekund po załamku b i odzwierciedla aktywność gleju Müllera i nabłonka barwnikowego siatkówki1-4. Dodatkowymi źródłami do zrozumienia historii i zasad analizy ERG u ludzi i zwierząt modelowych są podręcznik online Webvision z University of Utah oraz teksty takie jak Principles and Practice of Clinical Electrophysiology of Vision 4,5.

Daniorerio (danio pręgowany) od dawna jest preferowany jako model rozwoju kręgowców, ze względu na jego szybkie dojrzewanie i przezroczystość, co pozwala na nieinwazyjną analizę morfologiczną układów narządów, testy behawioralne oraz zarówno do przodu, jak i do tyłu genetyczne badania przesiewowe (dla przeglądu, zobacz Fadool i Dowling6). Larwy danio pręgowanego są bardzo podatne na manipulacje genetyczne i farmakologiczne, co w połączeniu z ich wysoką płodnością czyni je doskonałym modelem zwierzęcym do wysokoprzepustowych analiz biologicznych. Wyższy stosunek czopków do pręcików u larw danio pręgowanego – około 1:1 w porównaniu z myszami (~3% czopków) – sprawia, że są one szczególnie przydatne do badania funkcji czopków7-9.

W siatkówce kręgowców czopki rozwijają się przed pręcikami10. Co ciekawe, szyszki danio pręgowanego działają już po 4 dpf, co pozwala na selektywną analizę elektrofizjologiczną czopków na tym etapie 6,11,12. Natomiast odpowiedzi ERG w pręcikach pojawiają się między 11 a 21 dpf13. Dlatego larwy danio pręgowanego w stężeniu 4-7 dpf służą funkcjonalnie jako siatkówka w całości stożkowa. Jednak natywna odpowiedź fotobowa ERG larw 4-7 dpf jest zdominowana przez załamek b. Stosowanie środków farmakologicznych, takich jak kwas L-(+)-2-amino-4-fosfono-masłowy (L-AP4), agonista receptora metabotropowego glutaminianu (mGluR6) ulegającego ekspresji przez komórki dwubiegunowe ON, skutecznie blokuje wytwarzanie załamka b i ujawnia izolowany potencjał receptora masy czopka ("fala a")14-17.

Tutaj opisujemy prostą i niezawodną metodę analizy ERG przy użyciu dostępnego na rynku sprzętu ERG przeznaczonego do użytku z myszami, które zostały przystosowane do stosowania z larwami danio pręgowanego. System ten może być stosowany na larwach danio pręgowanego o różnym pochodzeniu genetycznym, a także na tych leczonych środkami farmakologicznymi, aby pomóc naukowcom w identyfikacji szlaków sygnałowych, które przyczyniają się do wrażliwości wzrokowej i adaptacji światła16. Procedury eksperymentalne przedstawione w tym protokole poprowadzą badaczy w korzystaniu z analizy ERG w celu udzielenia odpowiedzi na różne pytania biologiczne dotyczące widzenia i zademonstrują konstrukcję elastycznej konfiguracji ERG.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Utrzymanie zwierząt i protokoły eksperymentalne zostały zatwierdzone przez Instytucjonalne Komitety ds. Opieki nad Zwierzętami i Użytkowania Uniwersytetu Karoliny Północnej w Chapel Hill i spełniają wszystkie wymagania Biura Dobrostanu Zwierząt Laboratoryjnych NIH oraz Stowarzyszenia Oceny i Akredytacji Międzynarodowej Opieki nad Zwierzętami Laboratoryjnymi.
UWAGA: Aby uzyskać larwy do analizy ERG, wykorzystano opublikowane protokoły standardowej hodowli i utrzymania danio pręgowanego18. Larwy są pozyskiwane w wyniku naturalnej hodowli i trzymane w 14-godzinnym cyklu światła / 10-godzinnym cyklu ciemności. Protokół ten został zoptymalizowany dla larw w 5-7 dniu po zapłodnieniu (dpf), ale idealnie mógłby być wykonywany na starszych rybach z niewielkimi modyfikacjami procedury. W tym przypadku użyj szczepu TL larw danio pręgowanego typu dzikiego w temperaturze 5 dpf.

1. Produkcja mikropipet

  1. Wyciągnij kilka mikropipet za pomocą kapilar z polerowanego ogniowo szkła borokrzemianowego o wymiarach 1,5 x 0,86 mm (średnica zewnętrzna przez średnicę wewnętrzną) z filamentem (temperatura topnienia, 821 °C) i ściągacza do mikropipet P-97 Flaming/Brown wyposażonego w żarnik grzewczy w pudełku. Należy użyć programu do tworzenia mikropipet opisanego w Tabeli 1.
  2. Sprawdź każdą mikropipetę pod mikroskopem za pomocą odpowiedniej linijki z siatką, aby upewnić się, że końcówki mają średnicę 10-15 μm i gładki otwór końcówki (tj. bez postrzępionych krawędzi).
  3. Mikropipety należy przechowywać ostrożnie, aby zapobiec uszkodzeniu końcówki i narażeniu na kurz. Opcje przechowywania obejmują szalki Petriego z taśmą laboratoryjną, pudełka wyłożone pianką lub dostępne w handlu pojemniki do przechowywania mikropipet.
    UWAGA: Inne ściągacze do mikropipet i szklane kapilary mogą być używane, o ile uzyskana jest prawidłowa średnica mikropipety i wysokiej jakości końcówka.
szt. szt. szt. szt. szt. szt. szt. szt. Rozdział szt.
ciśnienieupałciągnąćprędkośćGodzina
500560-Rozdział 30200
500450-Rozdział 30200
50041055Rozdział 40200

Tabela 1: Program do produkcji mikropipet za pomocą flamingowego/brązowego ściągacza do mikropipet P-97 wyposażonego w żarnik grzewczy w pudełku. Mikropipety są wykonane z polerowanych ogniowo kapilar ze szkła borokrzemianowego o wymiarach 1,5 x 1,0mm2 (średnica zewnętrzna na średnicę wewnętrzna) z żarnikiem (temperatura topnienia, 821 °C).

2. Przygotowanie bufora

  1. Użyć przefiltrowanego, natlenionego buforu Ringera19 złotej rybki w kapilarze mikroelektrody i nasycić gąbkę z alkoholu poliwinylowego (PVA), na której umieszcza się larwy do eksperymentów. Alternatywnie użyj pożywki dla zarodków E3 lub Hank's Balanced Salt Solution.
  2. Przygotować 10x roztwór Ringera dla złotej rybki zgodnie z opisem w Tabeli 2. Dostosuj do pH 7,8 i wysterylizuj za pomocą filtra 0,22 μm i przechowuj 10-krotny bulion w temperaturze 4 °C.
  3. Stwórz roztwór roboczy w dniu eksperymentu, rozcieńczając 10x roztwór Ringera do 1x dejonizowaną, destylowaną wodą. Filtruj za pomocą systemu filtrów 0,22 μm. Natleniać przez bulgotanie 95% gazem O2/5% CO2 przez 10 minut. Następnie szczelnie zakryj, aby upewnić się, że roztwór pozostaje natleniony.
Zawartość NaCl1,25 mln
Kcl26 mM
CaCl225 mM
MgCl210 mM
glukoza100 mM
HEPESY100 mM

Tabela 2: Przygotowanie 10x roztworu Ringera dla złotej rybki.

3. Platforma elektroretinogramu

  1. Wykonuj eksperymenty ERG na stole antywibracyjnym wewnątrz klatki Faradaya, aby poprawić stosunek sygnału do szumu. Przymocuj niestandardową stalową platformę do stołu antywibracyjnego za pomocą nakrętek sześciokątnych. Umieść ruchomą plastikową platformę z lepkosprężystym dnem amortyzującym uretan polimer na stole pod źródłem światła.
  2. Ustaw kamerę za pomocą namagnesowanej podstawy, skierowanej w dół na ruchomą plastikową platformę. Umieść mikromanipulator (który będzie trzymał mikroelektrodę rejestrującą) z drugim namagnesowanym stojakiem po prawej stronie ruchomej plastikowej platformy. Upewnij się, że kamera i mikromanipulator nie będą zakłócane przez ruch innych urządzeń i aby nie blokowały oświetlenia ze źródła światła.
  3. Podłącz kamerę do monitora wideo i ustaw ją tak, aby view oko larwy, aby ustawić elektrodę we właściwej pozycji.
  4. Upewnij się, że konfiguracja jest prawidłowo uziemiona drutem miedzianym. Aby sprawdzić szum, umieść elektrodę odniesienia i końcówkę mikroelektrody rejestrującej na szalce Petriego o średnicy 35 mm wypełnionej roztworem Ringera. Sprawdź poziomy zakłóceń elektrycznych w konfiguracji za pomocą oscyloskopu lub wbudowanej funkcji aparatu ERG. Poziom hałasu nie powinien przekraczać ±10 μV od linii podstawowej.

4. Przygotowanie gąbki

  1. Wytnij mały prostokąt z suchej gąbki PVA, który będzie dobrze pasował do szalki Petriego o średnicy 35 mm. Grubość gąbki nie powinna być większa niż głębokość naczynia. Do cięcia używaj noża uniwersalnego z czystą żyletką.
  2. Wykonaj dodatkowe nacięcie w gąbce, aby pomieścić elektrodę odniesienia (albo płytkie nacięcie wzdłużne na dnie gąbki, albo motylek przecięty pionowo przez jeden z mniejszych końców).
  3. Użyj chemicznie odpornego markera, aby zaznaczyć małą kropkę na gąbce (w miejscu, w którym zostanie umieszczona larwa), którą można wykorzystać do ustawienia kamery.
  4. Namocz gąbkę PVA w roztworze Ringera, aż się nasiąknie. Usuń i szybko osusz ręcznik papierowy 2-3 razy. Umieść gąbkę na czystej szalce Petriego o średnicy 35 mm.
  5. Umieść szalkę Petriego zawierającą gąbkę na plastikowej platformie w taki sposób, aby znak mógł być uwidoczniony przez kamerę.

5. Przygotowanie elektrody

UWAGA: Konfiguracja danio pręgowanego składa się z elektrody referencyjnej stykającej się z nasączoną roztworem gąbką PVA Ringera oraz elektrody rejestrującej stykającej się z rogówką. Elektroda referencyjna składa się z osadu Ag/AgCl. Elektroda rejestrująca jest ciągnioną szklaną mikropipetą wypełnioną roztworem Ringera i trzymaną przez uchwyt mikroelektrody zawierający drut Ag.

  1. Chlorkować elektrody, mocząc je w 6-9% podchlorynie sodu (wybielacz) przez 5 minut (drut mikroelektrody rejestrującej) lub 15 minut (elektroda odniesienia). Suszyć na powietrzu na Kimwipe przez 5 minut.
    1. W zależności od stylu cięcia wykonanego w kroku 4.2, umieść osad Ag/AgCl elektrody odniesienia w gąbce (w przypadku pionowego cięcia motylkowego) lub pod (w przypadku płytkiego cięcia wzdłuż na dole) gąbce. Podłącz przewód elektrody odniesienia do systemu nagrywania.
    2. Alternatywnie, jeśli konfiguracja ERG ma ograniczenia przestrzenne lub występują szczególnie silne artefakty fotowoltaiczne z elektrody Ag/AgCl, podłącz elektrodę referencyjną do gąbki za pomocą mostka soli agarowej, aby przesunąć elektrodę poza ścieżkę światła.
  2. Podłącz ~40 cm rurki o odpowiedniej wielkości do strzykawki o pojemności 5 ml bez Luer lock. Napełnić strzykawkę roztworem Ringera. Uchwyty mikroelektrod posiadające porty ciśnieniowe są zazwyczaj dostarczane z adapterami do rurek o średnicach wewnętrznych 1/16", 3/32", 1/8" lub 5/32".
  3. Napełnij strzykawkę o pojemności 1 ml roztworem Ringera i za pomocą Micro-fil ostrożnie napełnij uchwyt mikroelektrody. Zapobiegaj tworzeniu się pęcherzyków.
  4. Podłączyć strzykawkę o pojemności 5 ml do portu ciśnieniowego uchwytu mikroelektrody za pomocą rurki i użyć jej, aby upewnić się, że uchwyt mikroelektrody jest wypełniony roztworem Ringera. Używając Micro-fil i strzykawki o pojemności 1 ml wypełnionej roztworem Ringera, napełnij szklankę mikropipety od końcówki i upewnij się, że nie ma pęcherzyków powietrza.
  5. Przymocuj szklaną mikropipetę do uchwytu mikroelektrody, uważając, aby drut elektrody był prosty. Po zabezpieczeniu użyj strzykawki o pojemności 5 ml, aby ostrożnie przecisnąć roztwór Ringera przez mikroelektrodę, aż niewielka ilość roztworu będzie widoczna na końcówce. Sporadyczne wywieranie nacisku na strzykawkę (gdy nie jest stosowany do rogówki) zapobiegnie tworzeniu się pęcherzyków powietrza, a także okluzji spowodowanej gromadzeniem się kurzu lub soli w końcówce mikropipety.
    1. Jeśli roztwór wypływa w postaci strumienia, wymień szklaną mikropipetę, ponieważ otwór końcówki jest zbyt duży lub jest uszkodzony.
  6. Ostrożnie umieść mikroelektrodę rejestrującą w mikromanipulatorze i podłącz przewód do systemu nagrywającego.

6. Analiza elektroretinogramu

UWAGA: Ze względu na dominację czopków w siatkówce larwalnej, wysokiej jakości wyniki ERG można uzyskać, gdy przygotowania do rejestracji są wykonywane przy niskich poziomach pośredniego światła białego (<1 luks) lub przy krótkich okresach (<1 min) światła roboczego o większej intensywności (≤250 luksów). Przed nagraniem wymagany jest jeszcze krótki okres adaptacji do ciemności (patrz krok 6.7). Jednak eksperymenty można przeprowadzać w słabym świetle czerwonym lub podczerwonym za pomocą kamery czułej na podczerwień. Wszystkie eksperymenty przeprowadzono w wysterylizowanej filtrem (0,22 μm) wodzie systemowej z UNC Zebrafish AquaCulture Facility, ale można użyć alternatywnych pożywek dla zarodków.

  1. Wytnij kwadraty ręcznika papierowego o wymiarach około 1 cm2.
  2. W przypadku pomiaru potencjału izolowanego receptora masy czopka, inkubować 3-5 larw w wodzie systemowej z 500 μM (±)-2-amino-4-fosfonomasłowym kwasem (APB) przez 5 min.
    UWAGA: Chociaż APB jest racemiczną mieszaniną aktywnych (L) i nieaktywnych (R) form AP4, jest tak samo skuteczny jak L-AP4 i jest tańszy.
  3. Znieczulić 3-5 larw w wodzie systemowej z 0,02% (w/v) Trikainą, aż przestanie reagować, około 1-2 min.
  4. Użyj pipety Pasteura i pompki do pipet, aby ostrożnie przenieść pojedyncze larwy na kwadraty ręcznika papierowego pod stereoskopem preparacyjnym przy minimalnym oświetleniu (≤250 luksów przez <1 min). Sprawdź pozycję każdej larwy i wybierz kandydata, który jest grzbietową stroną do góry z niezasłoniętym okiem.
    1. W przypadku dłuższych nagrań (>30 min) utrzymuj larwę wilgotną, glazurując ciało aż do głowy, ale nie włącznie, 3% metylocelulozy za pomocą cienkiej szczotki z wielbłądziej sierści.
  5. Za pomocą kleszczy przenieś kwadrat ręcznika papierowego z larwą na wilgotną gąbkę PVA.
    1. W przypadku dłuższych nagrań (>30 min) należy nanieść ciągły strumień nasyconego wodą 100% gazuO2 na larwę, przepuszczając gaz przez kamień napowietrzający w bocznej kolbie zawierającej wodę destylowaną. Umieścić rurkę wychodzącą z bocznego ramienia kolby, która transportuje nawilżony tlen, w pobliżu głowy larwy.
      UWAGA: Krok 6.4.1 i krok 6.5.1 przedłużą życie ryb16.
  6. Przy minimalnym oświetleniu za pomocą mikromanipulatora i kamery umieść końcówkę mikroelektrody w punkcie środkowym między nosowym a ogonowym końcem oka i delikatnie dociśnij grzbietową granicę rogówki.
    UWAGA: Niewłaściwe przemieszczenie końcówki elektrody w odległych obszarach rogówki może spowodować przebiegi ERG o odwróconej polaryzacji.
  7. Pozwól larwom przystosować się do ciemności przez 5-10 minut.
  8. Rejestrować testowe reakcje błysku na światło dostarczane przez źródło światła LED lub stymulator optyczny przy użyciu dostępnego sprzętu do stymulacji i nagrywania. Dostosuj parametry protokołu, takie jak intensywność błysku, długość błysku, kolor błysku, intensywność i kolor tła oraz ustawienia filtra, aby dopasować je do eksperymentu.
  9. Po zakończeniu eksperymentu należy poddać larwy eutanazji zgodnie z wytycznymi AVMA/IACUC.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Zazwyczaj ERG rejestruje się u larw zebrafish w 5 dpf, ponieważ liczne badania opublikowały zapisy ERG na tym etapie rozwoju9,16,20. Odpowiedzi larwalne mierzono w warunkach adaptacji do ciemności, bez oświetlenia tła, stosując 20 msec bodziec białego światła LED. Wykorzystano dostępny komercyjnie system ERG składający się ze stymulatora światła Ganzfelda oraz kontrolera/rejestratora komputerowego. Stymulator wykorzystuje ściśle kontrolowany, zastrzeżony system modulacji szerokości impulsu (PWM) do ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

W tym protokole szczegółowo opisano prostą procedurę rejestracji ERG larw danio pręgowanego. Procedura ta pozwala na szybkie i kompleksowe oznaczenie funkcji wzrokowych. W trakcie procedury należy pamiętać o kilku krytycznych krokach. Larwy danio pręgowanego powinny być zdrowe przed eksperymentem, aby zapobiec śmierci podczas potencjalnego leczenia farmakologicznego i zapewnić przedłużone źródło utrzymania podczas zapisów ERG. Ponadto ważne jest, aby larwy wykorzystywane w eksperymentach były ściśle dopasowane do wieku. ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Nie stwierdzono konfliktu interesów.

Podziękowania

Dziękujemy członkom UNC Zebrafish Aquaculture za utrzymanie danio pręgowanego. Chcielibyśmy również podziękować firmie Diagnosys, LLC za pomoc w konfiguracji aparatury ERG. Dodatkowe podziękowania kierujemy do dr Portii McCoy i laboratorium dr Bena Philpota za pomoc w metodach elektrofizjologicznych. Pragniemy również podziękować Lizzy Griffiths za ilustrację przedstawiającą larwę danio pręgowanego. Praca ta była wspierana przez National Institutes of Health Award F32 EY022279 (dla J.D.C) i R21 EY019758 (dla E.R.W).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Klatka Faradaya80/20 Incna zamówienieSpecjalnie zaprojektowany aluminiowy "Przemysłowy zestaw montażowy" do ramy klatki
Gąbka PVAAmazonB000ZOWG1CZapewnia miękką, wilgotną platformę do umieszczania larw danio pręgowanego
150 ml Sterylne systemy filtracyjneCorning431154Rozwiązania filtrujące zapobiegające blokowaniu mikropipet przez małe przeguby
Espion E2Diagnosys, Sp. z o.okontaktModułowy system elektrofizjologiczny zdolny do generowania bodźców wizualnych dla dowolnego stymulatora oraz cyfrowego zapisu i analizy odpowiedzi za pomocą zastrzeżonego oprogramowania, więcej informacji na stronie http://www.diagnosysllc.com
ColordomeDiagnosys, LLCkontaktStymulator światła z diodami LED RGB i ksenonowymi źródłami światła dla Ganzfeld ERG, więcej informacji na stronie http://www.diagnosysllc.com
MikromanipulatorDrummond3-000-024-RTrzymanie i pozycjonowanie mikroelektrody rejestrującej
Magnetyczny stojak pierścieniowyDrummond3-000-025-MBTrzymanie i pozycjonowanie kamery i elektrody refrencyjnej
Przedłużacze ołowiuGrass TechnologiesF-LXZapasowe żeńskie na męskie 1,5 mm do podłączenia elektrod
Męski Pin na żeński SAFELEAD AdapterGrass TechnologiesDF-215/10Podłączanie pinów 2 mm do kołków 1,5 wezgłowia
Rama ekranu okiennego (metalowa) i wielowypustLowes lub Home DepotróżneDo mocowania siatki miedzianej do ramy klatki Faradaya
Filtry Steriflip 50 mlMilliporeSCGP00525Rozwiązania filtrujące zapobiegające blokowaniu mikropipet przez małe przeguby
Adapter BNCMonoprice4127Podłączanie kamery do BNC
BNCMonoprice626Podłączanie kamery do adaptera wideo
Obiektyw kameryNavitar1582232Wizualizacja położenia mikroelektrody rejestrującej na rogówce larwy
Łącznik kameryNavitar1501149Wizualizacja położenia mikroelektrody rejestrującej na rogówce larwy
Luna BNC na VGA + HDMI KonwerterSewellSW-29297-PROPrzejściówka BNC na VGA pozwalająca na projekcję obrazu z kamery na monitorze komputera
APBSigmaA1910Agonista mGluR6, blokuje falę b pozwalającą na analizę potencjału izolowanego receptora masy stożka
Szkło borokrzemianoweSutterBF-150-86-10Szkło borokrzemianowe polerowane ogniowo (temperatura pomiaru = 821° C) o wymiarach filamentu 1,5mm x 0,86 mm (średnica zewnętrzna na średnicę wewnętrzna) 
P97 Flaming/Brown pullerSutterP97Do wyciągania szklanych mikropipet
Arkusz sorbotanuThorlabsSB12ASyntetyczny lepkosprężysty polimer uretanowy, umieszczony pod pasywnymi mocowaniami izolacyjnymi i platformą ERG w celu amortyzacji wstrząsów i zapobiegania ślizganiu się, może być przycięty na wymiar
Płytka do krojenia chlebaThorlabsB2436FPłyta izolująca drgania do stymulatora ERG i próbki
danio pręgowanegoPasywne mocowania izolacyjneThorlabsPWA074Zapewnia izolację drgań na płytce stykowej
Siatka miedzianaTWP022X022C0150W36TDo linii Faraday Cage
Pompa pipetowaVWR53502-233Używana z pipetami Pasteura do ostrożnego przenoszenia larw danio pręgowanego
Pipety PasteuraVWR14672-608Używana z pompą do pipet do ostrożnego przenoszenia larw danio pręgowanego
KameraWatecWAT-902BWizualizacja położenia mikroelektrody rejestrującej na rogówce larwy
Tricaine (MS-222)Western ChemicalTricaine-SZnieczulenie klasy farmaceutycznej,
Micro-filWPIMF28G-5Napełnianie uchwytu mikroelektrody i szkła mikroelektrody
Uchwyt mikroelektrodyWPIMEH2SW15Trzyma szklaną mikroelektrodę, łączy się ze sprzętem ERG
Elektroda referencyjnaWPIDRIREF-5SHOstrożnie oderwij ostatni centymetr obudowy, aby odprowadzić elektrolit i odsłonić spiekaną elektrodę peletową Ag / AgCl
Elektroda referencyjna (alternatywa)WPIEP1Alternatywa dla DRIREF-5SH. Elektroda Ag/AgCl, którą należy okablować/do przewodu połączeniowego
o niskim poziomie szumów do uchwytu mikroelektrodyWPI13620Podłączanie uchwytu mikroelektrody do nagrywania do adaptera/wezgłowia
.

Bibliografia

  1. Dowling, J. E. The retina: an approachable part of the brain. , Harvard University Press. Cambridge, MA. (1987).
  2. Makhankov, Y. V., Rinner, O., Neuhauss, S. C. An inexpensive device for non-invasive electroretinography in small aquatic vertebrates. J Neurosci. Methods. 135, 205-210 (2004).
  3. Wu, J., Peachey, N. S., Marmorstein, A. D. Light-evoked responses of the mouse retinal pigment epithelium. J Neurophysiol. 91, 1134-1142 (2004).
  4. Heckenlively, J. R., Arden, G. B. Principles and Practice of Clinical Electrophysiology of Vision. , 2nd edn, The MIT Press. Cambridge, MA. (2006).
  5. Perlman, I. Webvision: The Organization of the Retina and Visual System. Kolb, H., Nelson, R., Fernandez, E., Jones, B. , (1995).
  6. Fadool, J. M., Dowling, J. E. Zebrafish: a model system for the study of eye genetics. ProgRetin. Eye Res. 27, 89-110 (2008).
  7. Doerre, G., Malicki, J. Genetic analysis of photoreceptor cell development in the zebrafish retina. Mech. Dev. 110, 125-138 (2002).
  8. Brockerhoff, S. E., et al. Light stimulates a transducin-independent increase of cytoplasmic Ca2+ and suppression of current in cones from the zebrafish mutant nof. J Neurosci. 23, 470-480 (2003).
  9. Rinner, O., Makhankov, Y. V., Biehlmaier, O., Neuhauss, S. C. Knockdown of cone-specific kinase GRK7 in larval zebrafish leads to impaired cone response recovery and delayed dark adaptation. Neuron. 47, 231-242 (2005).
  10. Harada, T., Harada, C., Parada, L. F. Molecular regulation of visual system development: more than meets the eye. Genes Dev. 21, 367-378 (2007).
  11. Branchek, T. The development of photoreceptors in the zebrafish, brachydaniorerio. II. Function. J Comp Neurol. 224, 116-122 (1984).
  12. Schmitt, E. A., Dowling, J. E. Early retinal development in the zebrafish, Daniorerio: light and electron microscopic analyses. J Comp Neurol. 404, 515-536 (1999).
  13. Bilotta, J., Saszik, S., Sutherland, S. E. Rod contributions to the electroretinogram of the dark-adapted developing zebrafish. Dev Dyn. 222, 564-570 (2001).
  14. Wong, K. Y., Adolph, A. R., Dowling, J. E. Retinal bipolar cell input mechanisms in giant danio. I. Electroretinographic analysis. J Neurophysiol. 93, 84-93 (2005).
  15. Nelson, R. F., Singla, N. A spectral model for signal elements isolated from zebrafish photopicelectroretinogram. Vis Neurosci. 26, 349-363 (2009).
  16. Korenbrot, J. I., Mehta, M., Tserentsoodol, N., Postlethwait, J. H., Rebrik, T. I. EML1 (CNG-modulin) controls light sensitivity in darkness and under continuous illumination in zebrafish retinal cone photoreceptors. J Neurosci. 33, 17763-17776 (2013).
  17. Gurevich, L., Slaughter, M. M. Comparison of the waveforms of the ON bipolar neuron and the b-wave of the electroretinogram. Vision Res. 33, 2431-2435 (1993).
  18. Westerfield, M. The Zebrafish Book: A guide for the laboratory use of zebrafish (Daniorerio). , 5th edn, University of Oregon Press. Portland, OR. (2007).
  19. Kim, D. Y., Jung, C. S. Gap junction contributions to the goldfish electroretinogram at the photopic illumination level. Korean J PhysiolPharmacol. 16, 219-224 (2012).
  20. Brockerhoff, S. E., Dowling, J. E., Hurley, J. B. Zebrafish retinal mutants. Vision Res. 38, 1335-1339 (1998).
  21. Naka, K. I., Rushton, W. A. S-potentials from colour units in the retina of fish (Cyprinidae). J Physiol. 185, 536-555 (1966).
  22. Naka, K. I., Rushton, W. A. S-potentials from luminosity units in the retina of fish (Cyprinidae). J Physiol. 185, 587-599 (1966).
  23. Shao, X. M., Feldman, J. L. Micro-agar salt bridge in patch-clamp electrode holder stabilizes electrode potentials. J Neurosci. Methods. 159, 108-115 (2007).
  24. Brockerhoff, S. E., et al. A behavioral screen for isolating zebrafish mutants with visual system defects. ProcNatlAcadSci. U S A. 92, 10545-10549 (1995).
  25. Fleisch, V. C., Jametti, T., Neuhauss, S. C. Electroretinogram (ERG) Measurements in Larval Zebrafish. CSH protocols. , (2008).
  26. Seeliger, M. W., Rilk, A., Neuhauss, S. C. Ganzfeld ERG in zebrafish larvae. Doc Ophthalmol. 104, 57-68 (2002).
  27. Kainz, P. M., Adolph, A. R., Wong, K. Y., Dowling, J. E. Lazy eyes zebrafish mutation affects Müller glial cells, compromising photoreceptor function and causing partial blindness. J Comp Neurol. 463, 265-280 (2003).
  28. Lewis, A., et al. Celsr3 is required for normal development of GABA circuits in the inner retina. PLoS. genetics. 7, e1002239(2011).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Funkcja wzrokowa czopk wumiejscowienie mikroelektrodyanaliza ERGocena funkcji siatk wkiprotok znieczuleniakonfiguracja stereomikroskopustymulacja wiat emczu o fotoreceptor w
Elektroretinogram Analiza odpowiedzi wzrokowej u larw danio pręgowanego
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.