Labirynt Double-H: solidny test behawioralny do uczenia się i pamięci u gryzoni

Summary

Celem tego protokołu jest zbadanie poznania przestrzennego u gryzoni. Wodny labirynt z podwójnym H to nowatorski test, który jest szczególnie przydatny do wyjaśnienia różnych elementów uczenia się, konsolidacji i pamięci, a także wzajemnego oddziaływania systemów pamięci.

Abstract

Badania nad poznaniem przestrzennym u gryzoni zazwyczaj wykorzystują zadania labiryntowe, których atrybuty różnią się w zależności od labiryntu. Zadania te różnią się elastycznością behawioralną i wymaganym czasem trwania pamięci, liczbą celów i ścieżek, a także ogólną złożonością zadania. Cechą mylącą w wielu z tych zadań jest brak kontroli nad strategią stosowaną przez gryzonie, aby osiągnąć cel, np. strategiami allocentrycznymi (deklaratywnymi) lub egocentrycznymi (proceduralnymi). Labirynt z podwójnym H to nowatorskie zadanie pamięciowe polegające na ucieczce z wody, które rozwiązuje ten problem, umożliwiając eksperymentatorowi kierowanie rodzajem strategii wyuczonej podczas okresu treningowego. Labirynt z podwójnym H jest przezroczystym urządzeniem, które składa się z centralnego korytarza z trzema ramionami wystającymi po obu stronach, wraz z platformą ewakuacyjną zanurzoną na końcu jednego z tych ramion.

Szczury mogą być szkolone za pomocą strategii allocentrycznej, zmieniając pozycję początkową w labiryncie w nieprzewidywalny sposób (patrz protokół 1; §4.7), co wymaga od nich nauczenia się lokalizacji platformy na podstawie dostępnych wskazówek alotycznych. Alternatywnie, egocentryczna strategia uczenia się (protokół 2; § 4.8) może być zastosowana poprzez uwalnianie szczurów z tej samej pozycji podczas każdej próby, dopóki nie nauczą się wzorca proceduralnego wymaganego do osiągnięcia celu. Udowodniono, że to zadanie pozwala na tworzenie stabilnych śladów pamięciowych.

Pamięć może być badana po okresie treningu w mylącej próbie sondy, w której pozycja wyjściowa dla szczurów zmienia się. Podążając za egocentrycznym paradygmatem uczenia się, szczury zazwyczaj uciekają się do strategii opartej na allocentryczności, ale tylko wtedy, gdy ich początkowy pogląd na wskazówki poza labiryntem znacznie różni się od ich pierwotnej pozycji. To zadanie idealnie nadaje się do zbadania wpływu leków/zaburzeń na wydajność pamięci allocentrycznej/egocentrycznej, a także interakcji między tymi dwoma systemami pamięci.

Introduction

U zwierząt nauka odbywa się głównie za pośrednictwem systemów pamięci opartych na hipokampie i prążkowiu^1,2, które odgrywają centralne role odpowiednio w odniesieniu do pamięci miejsca i proceduralnej. Relacje między tymi dwoma systemami są złożone i wiadomo, że oddziałują one na siebie w sposób kooperatywny lub konkurencyjny^1,3. Ponadto badania wykazały, że wpływ każdego z tych systemów pamięci na zachowanie zwierząt może wzrosnąć w wyniku braku lub uszkodzenia drugiego układu^4-7. Oba te systemy są połączone z korą przedczołową za pośrednictwem wzgórza.

Liczne zaburzenia neurologiczne i choroby neurodegeneracyjne mogą wpływać na poznanie przestrzenne u ludzi, które opiera się na wzajemnym oddziaływaniu między systemami pamięci proceduralnej i deklaratywnej. Przykłady obejmują chorobę Parkinsona (PD), chorobę Huntingtona (HD)^8-10, chorobę Alzheimera (AD)^11-14, a także stwardnienie zanikowe boczne (ALS)¹⁵. Modele zwierzęce, które są istotne dla tych zaburzeń, mogą być indukowane za pomocą różnych terapii farmakologicznych, które blokują niektóre receptory¹⁶, a także za pomocą ukierunkowanych zmian chorobowych. Kiedy takie zwierzęta są wykorzystywane do zadań związanych z pamięcią przestrzenną, można uzyskać cenny wgląd w mechanizmy leżące u podstaw tych zaburzeń, a także w różne opcje leczenia.

Istnieje wiele różnych rodzajów zadań związanych z pamięcią przestrzenną u gryzoni, które łącznie mają na celu ocenę konkretnych aspektów uczenia się i pamięci, a także efektów potencjalnych metod leczenia różnych zaburzeń^17,18. Zadania te można rozróżnić ze względu na liczbę celów i ścieżek, stopień elastyczności behawioralnej w rozwiązywaniu zadania, czas trwania pamięci lub opóźnienie, a także wybór strategii zastosowanej w rozwiązaniu zadania. Dobre wyniki można uzyskać na podstawie zewnętrznych wskazówek lub punktów orientacyjnych, które są wykorzystywane do orientacji zwierzęcia w kierunku celu (strategia allocentryczna lub miejscowa). Alternatywnie, gryzoń może opracować strategię, która opiera się na kierunku ciała i wskazówkach dotyczących kierunku, w którym należy się poruszać (strategia egocentryczna lub proceduralna), np. jeśli szczur wie, że celem jest jeden skręt w lewo, po którym następuje jeden skręt w prawo, to nie ma potrzeby stosowania strategii allocentrycznej lub miejscowej. Zadania labiryntowe często różnią się w zależności od stopnia elastyczności oferowanej gryzoniu w ich rozwiązywaniu. Na przykład w labiryncie wodnym Morrisa, suchej wersji tego ostatniego (np. ¹⁹) lub labiryncie Barnesa (np. ²⁰), istnieje potencjalnie nieskończona liczba tras, którymi szczur może podążać, aby dotrzeć do celu. Na przykład w labiryncie wodnym Morrisa lokalizacji celu można się nauczyć na podstawie zewnętrznych punktów orientacyjnych lub wskazówek (strategia allocentryczna) lub po prostu pływając w kółko w kierunku środka, aż zostanie znaleziona platforma (strategia egocentryczna)²¹. Niektóre zadania mają wiele celów i wysoki stopień elastyczności, takie jak zadanie w polu stożkowym²² lub labirynt kołowy Oltona²³. Na drugim końcu skali znajdują się zadania, które oferują ograniczoną elastyczność w osiąganiu celu, np. labirynt z kamienia lub naprzemienna wersja labiryntu T. Zadania te zapewniają tylko jeden prawidłowy sposób osiągnięcia celu i ułatwiają pojawienie się rutyn poznawczych, które są zasadniczo regulowane przez system pamięci proceduralnej opartej na prążkowiu.

Labirynt z podwójnym H to nowatorskie urządzenie do testowania pamięci przestrzennej, które zostało zaprojektowane, aby umożliwić eksperymentatorowi kierowanie rodzajem strategii, której uczą się gryzonie podczas rozwiązywania zadania²⁴. Składający się z trzech równoległych ramion przeciętych prostopadłą centralną alejką, labirynt z podwójnym H jest zadaniem ucieczki z wody, w którym gryzonie uczą się docierać do platformy ewakuacyjnej, która jest zanurzona w jednym z miejsc labiryntu. Podczas treningu można opracować strategię proceduralną, utrzymując te same lokalizacje startu i celu przez cały czas. Alternatywnie, strategię allocentryczną można opracować, zmieniając lokalizację początkową w losowej kolejności, wymagając w ten sposób od szczura nauczenia się lokalizacji ukrytej platformy na podstawie wskazówek środowiskowych, tak jak ma to miejsce w labiryncie wodnym. W ten sposób pokonuje się przeszkodę obecną w wielu różnych zadaniach labiryntowych, w których eksperymentator ma niewielką kontrolę nad rodzajem strategii stosowanej przez gryzonie. Jest to ważne, jeśli weźmie się pod uwagę, że działanie niektórych kandydatów na leki poprawiające funkcje poznawcze zależy od systemu pamięci miejsca opartego na hipokampie, a zatem pojawienie się rutyn lub procedur poznawczych może zakłócić interpretację obserwacji behawioralnych, gdy zwierzęta, na przykład, przełączają się z pamięci allocentrycznej na proceduralną w trakcie treningu. Podobnie, pożądana może być ocena wpływu leków i terapii na pamięć proceduralną, bez wpływu allocentrycznej pamięci opartej na miejscu. Wreszcie, urządzenie to może być wykorzystane do badania kooperacyjnych lub konkurencyjnych interakcji między tymi systemami pamięci oraz warunków, w których gryzonie mogą przełączać się z jednego systemu na drugi.

Protocol

1. Uwagi ogólne

Ten protokół został zatwierdzony przez Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami i Użytkowania Szpitala Uniwersyteckiego we Fryburgu (to samo dotyczy Strasburga). Ostrość wzroku jest niezbędna do osiągania wyników w testach uczenia się przestrzennego. Gryzonie z upośledzonym układem wzrokowym nie są więc odpowiednie. Ponadto oświetlenie musi być wystarczające, aby szczury mogły zobaczyć różne wskazówki znajdujące się na otaczających ścianach. Przydatne jest użycie wskazówek o podstawowym kształcie (kwadrat, koło, trójkąt), ale dobrze skontrastowanych (np. namalowane na czarno wskazówki na białym tle). Podobnie, poważne deficyty motoryczne są kryteriami wykluczającymi, ponieważ do tego testu wymagane jest pływanie i może dojść do utonięcia. Wreszcie, nadmiernie niespokojne gryzonie mogą wykazywać silnie stronnicze zachowania związane z wyszukiwaniem, co wpływa na wydajność.

2. Konfiguracja aparatury

1. Zbuduj labirynt z podwójnym H, składający się z centralnej alejki o długości 160 cm, która jest przecięta na obu końcach i pośrodku trzema równoległymi ramionami o długości 160 cm (patrz rysunek 1). Upewnij się, że centralna alejka i jej prostopadłe ramiona mają szerokość 20 cm i są otoczone przezroczystymi ścianami z pleksiglasu o wysokości 35 cm. Grubość pleksi wynosi 6 mm dla wszystkich części.
2. Zabezpiecz ściany na miejscu za pomocą kleju i i zaimpregnuj labirynt za pomocą silikonowych połączeń pod wszystkimi kątami wewnętrznymi. Połączenia te można łatwo wymienić, jeśli stracą swoją wodoodporność. Umieść odpływ na końcu jednego z narożnych ramion (lub na środku labiryntu) w celu opróżnienia.
3. Umieść labirynt na stole o wysokości 80 cm, z odpowiednią ilością miejsca wokół niego, a) spacerując po labiryncie i b) umieszczając dobrze skontrastowane wskazówki. Oznacz każde ramię w labiryncie według jego położenia, tj. północny zachód (NW), północ (N), północny wschód (NE), południowy zachód (SW), południe (S) i południowy wschód (SE).
4. Umieść kamerę zamontowaną na suficie nad labiryntem w celu analizy zachowania zwierząt po teście, przy użyciu metod ręcznych lub automatycznych (śledzenie wideo) (patrz §5).

3. Uwagi ogólne

1. Przed użyciem napełnij labirynt wodą do przybliżonej wysokości 18 cm (200 L). Jest ona wystarczająco wysoka, aby szczury nie dotykały dna labiryntu stopami, ale wystarczająco płytka, aby uniemożliwić ucieczkę.
2. Po treningu wstępnym należy uczynić wodę nieprzezroczystą, mieszając 250 g odtłuszczonego mleka w proszku. Zmieniaj wodę codziennie, aby zapobiec jełczeniu wody z mlekiem. Utrzymuj temperaturę wody w zakresie od 21 do 23 °C, aby zachęcić szczury do szukania platformy ewakuacyjnej.
   UWAGA: Gdy szczury zapoznają się z pozycją platformy podczas treningu wstępnego, jej pozycja jest przenoszona na inne ramię podczas treningu.
3. Przed użyciem zanurz platformę o wysokości 17 cm i średnicy 10 cm na końcu jednego z ramion narożnych (NE, NW, SE lub SW). Upewnij się, że wysokość, która ma być zanurzona, znajduje się 1 cm poniżej powierzchni wody. Trenuj szczury, aby osiągnęły platformę docelową za pomocą allocentrycznej lub egocentrycznej strategii uczenia się, która zależy od rodzaju zastosowanego paradygmatu (patrz §4).

4. Podstawowe protokoły treningowe

UWAGA: Szczury zazwyczaj otrzymują wstępny dzień treningu, który pozwala im zapoznać się z labiryntem.

1. W celu treningu wstępnego uwolnij szczura z końca jednego ze środkowych ramion (np. ramienia S) i umieść platformę bramkową na końcu jednego z ramion narożnych (np. NE), a następnie daj szczurom 4 kolejne 60-sekundowe próby, w których dotrą do platformy docelowej.
2. Po dotarciu na platformę ewakuacyjną pozwól szczurowi poczekać tam przez 15 sekund, aby mógł odpocząć i obserwować otoczenie. Niezależnie od pozycji startowej, zawsze blokuj przeciwległe ramię przezroczystymi drzwiczkami gilotyny, które uniemożliwiają wejście.
   UWAGA: Podczas treningu należy pozostawić wodę przezroczystą i wyregulować wysokość platformy tak, aby wystawała 1 cm ponad powierzchnię wody, dzięki czemu była widoczna dla szczura.
3. Wykonuj codzienną sesję treningową składającą się z maksymalnie 4 następujących po sobie prób, oddzielonych co najmniej 10-sekundową przerwą (alternatywą jest trening dyskretny, tj. z kilkuminutowymi przerwami między próbami).
4. Do treningu należy przesunąć platformę z pozycji przedtreningowej na wybrane ramię (np. NW) i zanurzyć ją na końcu 1 cm poniżej powierzchni wody. Teraz spraw, aby woda stała się nieprzezroczysta przez dodanie mocy mleka i wykonaj następujące ćwiczenie (sekcja 4).
5. W przypadku szczurów, które nie dotrą do platformy docelowej w ciągu 60 sekund, przywróć je do pozycji wyjściowej i delikatnie poprowadź je na platformę przez eksperymentatora.
6. Zmierz kilka zmiennych podczas sesji treningowych i sondowych, takich jak przepłynięty dystans, opóźnienie do ramienia / platformy celu, czas spędzony w każdym ramieniu, a także liczba początkowych/powtarzających się błędów (patrz rysunek 2). Należy pamiętać, że na opóźnienia mogą mieć wpływ trudności motoryczne. Jeśli tak się stanie, odległość i błędy wydają się być bardziej wiarygodnymi zmiennymi dotyczącymi wydajności poznawczej.
7. Szkolenie w zakresie strategii allocentrycznej:
   1. Dzień 1 - Trening wstępny:
      1. Na tym etapie nie dodawaj mleka w proszku. Umieść platformę ewakuacyjną wystającą 1 cm ponad powierzchnię wody w ustalonym miejscu. Trenuj szczury w 4 kolejnych próbach, aby dotrzeć na platformę.
   2. Dzień 2 - 5 – Szkolenie:
      1. Dodaj 250 g odtłuszczonego mleka w proszku do wody, aby stała się nieprzezroczysta. Przenieś platformę na inne ramię (np. z NE do NW) i dolej wody tak, aby platforma znajdowała się 1 cm poniżej powierzchni wody. Uwalniaj szczury z ramienia N lub S w nieprzewidywalnych sekwencjach dla każdej sesji, tak aby oba ramiona były używane dwukrotnie jako początek próby w jednej sesji (4 próby / dzień, np. SNNS, NSNS; patrz Rysunek 3).
   3. Dzień 6 – Sesja sondy:
      1. Usuń platformę dla próby sondy. Wypuść szczury z innego ramienia niż to, które jest używane podczas treningu (np. SW) i pozwól im pływać przez 60 sekund. Na rysunku 4 przedstawiono reprezentatywne ścieżki pływackie. Analiza czasu spędzonego w ramieniu docelowym (dawna lokalizacja platformy) daje wskazówkę co do tego, czy szczury stosują strategię przestrzenną, inny rodzaj strategii, sekwencyjną kombinację różnych strategii (patrz poniżej), czy też zdezorganizowany wzorzec wyszukiwania.
8. Trening strategii egocentrycznej:
   1. Dzień 1 – Przedtreningówka:
      1. Jest to taki sam krok, jak pierwszy krok w treningu strategii allocentrycznej (krok 4.1). Na tym etapie nie dodawaj mleka w proszku. Umieść platformę ewakuacyjną wystającą 1 cm ponad powierzchnię wody w ustalonym miejscu. Trenuj szczury w 4 kolejnych próbach, aby dotrzeć na platformę.
   2. Dzień 2 - 5 – Szkolenie:
      1. Dodaj 250 g odtłuszczonego mleka w proszku do wody, aby stała się nieprzezroczysta. Przenieś platformę na inne ramię i dolej wody tak, aby platforma znajdowała się 1 cm poniżej powierzchni wody. Uwolnić szczury z tego samego ramienia startowego (S lub N; patrz rysunek 5) dla każdej próby (4 próby/dzień).
   3. Dzień 6 – Sesja sondy:
      1. Usuń platformę dla próby sondy. Szczury są wypuszczane z ramienia innego niż to, w którym zostały wypuszczone podczas treningu. Pozwól szczurom pływać przez 60 sekund. Zablokuj przeciwległe ramię przezroczystymi drzwiami gilotyny.
         UWAGA: Zmodyfikuj powyższe strategie treningowe zgodnie z wymaganiami konkretnego eksperymentu, np. Testowanie efektów leków itp.
9. Osusz szczura chłonnymi ręcznikami po każdej sesji w wodzie.

5. Analiza

1. Wykonuj pomiary opóźnień, błędów początkowych i powtarzalnych, pierwszych wyborów i typu odpowiedzi ręcznie, rejestrując te zmienne z filmów zarejestrowanych z kamery napowietrznej.
2. Alternatywnie, jeśli to możliwe, skorzystaj z dostępnego na rynku oprogramowania do śledzenia wideo i skonfigurowanego do automatycznego rejestrowania tych zmiennych.
3. Analiza statystyczna:
   UWAGA: Konkretne wdrożenie analizy statystycznej zależy od badania, które się odbywa.
   1. Wykonaj jedno-, dwu- lub trójstronne analizy ANOVA dotyczące początkowych/powtarzających się błędów, opóźnienia do ramienia/platformy docelowej i czasu spędzonego w ramieniu docelowym; z czynnikami, które obejmują dzień testu i grupę (grupy) leczenia.
   2. W razie potrzeby postępuj zgodnie z tymi analizami ANOVA, korzystając z testów wielokrotnych porównań Newmana-Keulsa post-hoc. Aby porównać wydajność, użyj wartości referencyjnej (np. czas spędzony w ramieniu docelowym podczas próby sondy w porównaniu z poziomem szansy) i wykonaj test t.
   3. W razie potrzeby należy użyć statystyk nieparametrycznych dodatkowo (np. χ², patrz poniżej) lub zamiast nich, gdy warunki dla statystyk parametrycznych nie są spełnione.

Results

Egocentryczna strategia uczenia się

Przeprowadzono badanie, aby ustalić, czy wybrana strategia pamięci u szczurów zmienia się w zależności od zmian ich perspektywy zewnętrznych sygnałów środowiskowych, zgodnie z paradygmatem egocentrycznego uczenia się²⁵. Szczury były trenowane przez 4 dni (4 próby / dzień), aby osiągnąć ramię docelowe zlokalizowane w NE, a następnie były testowane piątego dnia za pomocą wprowadzającej w błąd próby z sondą, w której ramię startowe było albo przesunięte...

Discussion

Uwagi na temat projektu i analizy badania

Od momentu powstania, labirynt z podwójnym H był wykorzystywany w wielu eksperymentach behawioralnych na szczurach, które łącznie zostały zaprojektowane do badania egocentrycznych i / lub allocentrycznych reakcji u szczurów w normalnych^24,25 i zmienionych^26-29 stanach mózgu. Te ostatnie badania obejmują głęboką stymulację mózgu prążkowia (DBS)²⁶, zwierzęce modele zaburzeń neurologicznych^27,28, a także obustronne...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Szczury lub myszy	River
Ręczniki do suszenia	Szpital		1 / zwierzę
Woda			~ 200 L / dzień
Odtłuszczone mleko w proszku	Sklep		250 g / 200 L
wody Wąż ogrodowy	Sklep
Suszarka do ręczników	Sklep		z narzędziami
Kamera Kinect	Kinect
Komputer PC	any
[header]
Double H Maze, (pleksi) (Custom-Built)
Zewnętrzne ściany boczne, 1600 × 350 &; 6 mm			2
Wewnętrzne ściany boczne, 706 × 350 &; 6 mm			8
Panele korytarza środkowego, 500 &razy; 350 &; 6 mm			4
Kończyny ramion, 188 & razy; 350 & razy; 6 mm			6
Drzwi gilotynowe, 187 & razy; 350 & razy; 6 mm			3
Osłony kończyn, 200 & razy; 250 mm			6
Poprzeczki 200 & razy; 40 mm			6
[nagłówek]
Platforma labiryntu Double-H (do balastowania) (Custom-Built)
Metalowa platforma, średnica 100 mm i czasy; 150 mm			2
Pokrywa platformy, średnica 100 mm i czasy; 6 mm			2