Artykuł metodologiczny

Model spoczynku in vitro wrażliwego na estrogeny raka piersi w szpiku kostnym: narzędzie do badań mechanizmów molekularnych i generowania hipotez

7.9K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/52672

⸱

30 czerwca 2015

 ,  ,  , 
1Department of Medicine and New Jersey Medical School Cancer Center, Rutgers New Jersey Medical School

W tym artykule

Podsumowanie

Opracowaliśmy model in vitro uśpienia w szpiku kostnym dla wrażliwych na estrogeny komórek raka piersi. Celem tego protokołu jest zademonstrowanie wykorzystania modelu do badania biologii molekularnej i komórkowej stanu spoczynku oraz do generowania hipotez do późniejszych testów in vivo.

Streszczenie

Badanie uśpienia raka piersi w szpiku kostnym jest wyjątkowo trudnym przedsięwzięciem ze względu na złożoność interakcji uśpionych komórek z ich mikrośrodowiskiem, ich rzadkość i przytłaczającą nadwyżkę komórek krwiotwórczych. W tym celu opracowaliśmy in vitro klonogenny model 2D uśpienia wrażliwych na estrogeny komórek raka piersi w szpiku kostnym. Model składa się z kilku kluczowych elementów niezbędnych do stanu spoczynku. Obejmują one 1) wykorzystanie wrażliwych na estrogeny komórek raka piersi, które prawdopodobnie pozostaną uśpione przez dłuższy czas, 2) inkubację komórek o gęstości klonogennej, gdzie interakcja strukturalna każdej komórki odbywa się głównie z podłożem, 3) fibronektyna, kluczowy element strukturalny szpiku i 4) FGF-2, czynnik wzrostu obficie syntetyzowany przez komórki zrębu szpiku kostnego i silnie zdeponowany w macierzy zewnątrzkomórkowej. Komórki inkubowane z FGF-2 tworzą uśpione klony po 6 dniach, które składają się z 12 lub mniej komórek, które mają wyraźny płaski wygląd, są znacznie większe i bardziej rozproszone niż rosnące komórki i mają duży stosunek cytoplazmy do jądra. Natomiast komórki inkubowane bez FGF-2 tworzą przede wszystkim rosnące kolonie składające się z >30 stosunkowo małych komórek. Zaburzenia układu z przeciwciałami, inhibitorami, peptydami lub kwasami nukleinowymi w 3 dniu po inkubacji mogą znacząco wpływać na różne aspekty fenotypowe i molekularne uśpionych komórek po 6 dniach i mogą być wykorzystane do oceny roli zlokalizowanych błonowo lub wewnątrzkomórkowych cząsteczek, czynników lub szlaków sygnałowych w stanie uśpienia lub przeżyciu uśpionych komórek. Uznając charakter testu in vitro, może on funkcjonować jako bardzo przydatne narzędzie do zbierania istotnych informacji na temat mechanizmów molekularnych niezbędnych do powstania i przetrwania uśpionych komórek. Dane te można wykorzystać do wygenerowania hipotez do przetestowania w modelach in vivo.

Wprowadzenie

Komórki raka piersi dają przerzuty do szpiku kostnego przed wykryciem choroby1, gdy tylko w małych guzach pojawią się naczynia krwionośne2,3. Proces przerzutowy jest szybki, ale nieefektywny. Komórki szybko dostają się do nowych naczyń krwionośnych, w milionachdziennie4, ale niewiele z nich przeżywa podróż do odległychnarządów5. Niemniej jednak niektóre mikroprzerzuty przeżywają w kości i można je znaleźć jako pojedyncze komórki lub małe grudki komórek w aspiratach szpiku kostnego od nowo zdiagnozowanych pacjentów1. Komórki te są odporne na chemioterapię uzupełniającą, która jest podawana właśnie w celu ich wyeliminowania6. Oporność ta jest w znacznym stopniu zapewniona przez sygnalizację przeżycia zainicjowaną przez interakcje z mikrośrodowiskiem szpiku kostnego7,8. Mikroprzerzuty można znaleźć u około jednej trzeciej kobiet ze zlokalizowanym rakiem piersi i stanowią niezależny wskaźnik przeżycia, gdy są analizowane za pomocą analizy jednoczynnikowej9. Niektóre mikroprzerzuty są inicjowane wzrostem, ale wzorce nawrotów zależą od typu komórki. Pacjentki z potrójnie ujemnym rakiem piersi mają tendencję do nawrotów między 1 a 4 latami, co sugeruje słabą kontrolę nad stanem uśpienia. Inne typy komórek, w tym komórki ER/PR+, mogą pozostawać w stanie uśpienia przez okres do 20 lat, ze stałym, ciągłym wskaźnikiem nawrotów10. Podczas gdy różnice w sygnaturach ekspresji genów uśpienia między liniami komórek piersi ER+ i ER- a guzami odzwierciedlają różne potencjały uśpienia11, interakcje ze zrębem szpiku kostnego prawdopodobnie stanowią znaczący wkład w uśpienie.

Badanie spoczynku in vivo jest wyjątkowo trudne, ponieważ mikroprzerzuty są rzadkie i są liczniejsze niż komórki krwiotwórcze ponad 10-krotnie. W związku z tym należy wygenerować odpowiednie modele, które dostarczą danych in vitro, które mogą zasugerować mechanizmy i wygenerować możliwe do przetestowania hipotezy in vivo. Szereg modeli spoczynku, w tym modele matematyczne12,13, modele in vitro 7,8,14,15, modele ksenoprzeszczepów in vivo16, kombinacje modeli in vitro i ksenoprzeszczepów17,18 oraz modele spontanicznych guzów i przerzutów19, dostarczyło pewnych informacji na temat uśpienia komórek nowotworowych20. Każdy z tych modeli ma swoje własne ograniczenia i są same w sobie przydatne przede wszystkim do generowania hipotez dotyczących sygnalizacji molekularnej i interakcji, które rządzą spoczynkiem, które mają być testowane w bardziej istotnych biologicznie modelach.

Mając na celu zdefiniowanie molekularnych mechanizmów uśpienia, interakcji z mikrośrodowiskiem, które powodują zatrzymanie cyklu, redyferencjację i oporność terapeutyczną oraz mechanizmów, które skutkują nawrotami w komórkach ER+, opracowaliśmy model in vitro, który dostarcza wybranych istotnych elementów mikrośrodowiska zrębu7. Model ten, choć stosunkowo skąpy w swoich komponentach, jest wystarczająco solidny, aby umożliwić badaczom wyprowadzenie specyficznych mechanizmów molekularnych, które wpływają na istotne funkcje uśpienia. Eksperymenty te generują hipotezy, które można bezpośrednio przetestować in vivo. Model opiera się na kilku kluczowych elementach, które, jak wykazaliśmy, są istotne w stanie spoczynku. Obejmują one wykorzystanie komórek raka piersi zależnych od estrogenów, hodowlę komórek o gęstości klonogennej, gdzie ich interakcja zachodzi przede wszystkim z podłożem i rozpuszczalnymi składnikami pożywki, podłoże fibronektyny oraz obecność podstawowego czynnika wzrostu fibroblastów (FGF-2) w pożywce.

Scharakteryzowaliśmy mechanizmy rządzące systemem in vitro, w tym indukcję zatrzymania cyklu komórkowego przez FGF-221, pośredniczoną przez TGFβ22, sygnalizację przeżycia przez kinazę PI37,8 i ERK8 oraz różnicowanie morfogenne do fenotypu nabłonkowego, które zależało od inaktywacji RhoA, regulacji w górę integryny α5β1 i ligacji fibronektyny zrębu dla przeżycia7,15 (Rysunek 1). Wpływ FGF-2 na komórki MCF-7 w cyklu komórkowym in vitro rozpoczyna się przy stężeniach co najmniej jeden log poniżej 10 ng/ml21,23. Uzasadnienie opierało się na czasowej kontroli ekspresji FGF-2 rządzącej morfogenezą przewodu sutkowego, cykliczną ekspansją i recesją w wielu układach ssaków24-27. Wykazaliśmy, że FGF-2 indukuje różnicowanie, w tym morfogenezę przewodową w hodowli3D 28, oraz że ekspresja FGF-2 jest na ogół tracona przy złośliwej transformacji ludzkich nowotworów29. Ekspresja FGR1 pozostała nienaruszona w badanych rakach piersi29, a komórki MCF-7 nadal wykazują ekspresję wszystkich 4 receptorów FGF30. W kontekście spoczynku FGF-2 jest eksportowany i silnie odkładany na zrębie szpiku kostnego31,32, gdzie pełni funkcję w zachowaniu hematopoetycznych komórek macierzystych33. Wykazaliśmy, że FGF-2 indukuje stan uśpienia w komórkach raka piersi ER+ hodowanych na podłożach fibronektyny, również obfitujących w szpiku, gdzie indukuje różnicowanie morfogenne7. W modelu komórki raka piersi są zahamowane we wzroście, dezaktywują Rho A przez RhoGap GRAF, różnicują się do fenotypu nabłonkowego i ponownie wyrażają integryny α5β1 utracone ze złośliwą progresją. Wiążą fibronektynę poprzez integrynę α5β1 i aktywują sygnalizację przeżycia, która czyni je odpornymi na terapię cytotoksyczną7,8,15 (ryc. 1). Wcześniej wykazano, że hamowanie GTPaz klasy Rho indukuje uśpiony fenotyp34.

Tutaj przedstawimy konkretne procedury, które pozwolą badaczom na stworzenie modelu i zbadanie specyficznych molekularnych i komórkowych mechanizmów rządzących uśpieniem komórek raka piersi ER+. W eksperymentach przedstawionych tutaj, aby zilustrować zastosowanie modelu, celowaliśmy w szlak PI3K (Figura 1B) za pomocą inhibitora Akt i inhibitora PI3K, a wszystkich członków rodziny Rho (Figura 1B) za pomocą inhibitora pan-Rho i inhibitora kinazy Rho (ROCK).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Test klonogenny

  1. Przygotuj zawiesiny pojedynczej komórki estrogenozależnych linii komórkowych raka piersi MCF-7 i komórek T47D, wykonując czynności opisane poniżej
    1. Odessać pożywkę hodowlaną (DMEM/10% inaktywowana termicznie płodowa surowica cielęca/glutamina i wstrzykiwacz/paciorkowiec) z 10-centymetrowego naczynia do hodowli tkankowej, które nie więcej niż w 50% zlewa się z komórkami MCF-7 lub T-47D. Spłucz PBS. Inkubować z trypsyną 0,25%/2,21 mM EDTA rozpuszczoną w DMEM o wysokiej zawartości glukozy w temperaturze 37 °C przez 1-4 min.
    2. Sprawdzaj komórki w odstępach 1-minutowych pod mikroskopem z kontrastem fazowym, aby upewnić się, że rozkład pojedynczych komórek. Ponownie zawiesić komórki za pomocą pipety o pojemności 2 ml, kilkakrotnie pipetując w górę i w dół, aby przerwać kontakt komórka-komórka i uzyskać prawie niezmienny, pojedynczy status.
    3. Kontynuuj inkubację komórek w trypsynie w temperaturze 37 °C przez okres do 4 minut, jeśli zauważysz skupiska komórek już po 2 minutach inkubacji. Nie używaj tych komórek do badań klonogennych, jeśli pozostają one przylegające do siebie po 4 minutach trypsynizacji, ponieważ zostanie wprowadzony błąd w wydajności liczby kolonii.
      UWAGA: Jeśli komórki są zbite, liczba utworzonych kolonii będzie odzwierciedlać iloczyn mniejszej liczby komórek niż liczba inkubowanych. Jeśli komórki są nadmiernie trypsynizowane, ich potencjał klonogenny może być zmniejszony.
    4. Przygotować zawiesinę pojedynczej komórki o stężeniu 1 500 komórek/ml pożywki hodowlanej na płytki 24-dołkowe lub mniej (+ 500 komórek/ml, w zależności od typu komórki lub liczby pasaży), przez seryjne rozcieńczenia w jednej probówce głównej zawierającej całą objętość potrzebną dla wszystkich zmiennych w doświadczeniu.
      UWAGA: Celem jest końcowa gęstość komórek 800 komórek/cm2 (zakres około 500 do 1,100 komórek/cm2). Celem jest uzyskanie około 100 + 50 kolonii, co pozwala na stosunkowo łatwe liczenie, zapobiega stłoczeniu i pozwala na uzyskanie wystarczającej liczby kolonii, aby spowodować znaczące różnice statystyczne, gdy kolonie są zwiększane lub zmniejszane przez perturbacje eksperymentalne.
  2. Inkubuj komórki w gęstości klonogenicznej, wykonując czynności opisane poniżej
    1. Inkubować komórki w studzienkach poczwórnych na 24-dołkowych płytkach pokrytych fibronektyną o gęstości klonogennej 1500 komórek/basenik z głównej probówki zawiesinowej jednokomórkowej o zawartości 1500 komórek/ml. Rozetrzeć pożywkę zawierającą komórki za pomocą pipety o pojemności 5 ml, pobierając 3 ml i dozując 1 ml pożywki do każdej z 2 studzienek.
      UWAGA: Płytki pokryte fibronektyną należy kupować wstępnie powlekane od komercyjnego dostawcy. Powlekanie płytek poza kontrolowanym jakościowo, zautomatyzowanym procesem powoduje powstanie nierównej powierzchni, która nie nadaje się do tego testu.
    2. Wymieszać zawiesinę, pipetując w górę i w dół za pomocą pipety o pojemności 5 ml, pobrać 3 ml zawiesiny komórek i napełnić 2 studzienki po 1 ml każdy. Napełniaj tylko 2 studzienki jednocześnie z jednej pipety. Wróć pozostałą objętość pipety do zawiesiny komórek w probówce głównej, ponownie zawiesić komórki, pipetując w górę i w dół, a następnie pobrać kolejne 3 ml, aby napełnić kolejne 2 studzienki po 1 ml każdy.
      UWAGA: Konieczne jest ciągłe mieszanie rurki głównej, ponieważ komórki będą się stale osadzać. Pobranie wystarczającej objętości do napełnienia tylko 2 studzienek jest konieczne, aby dodać podobne numery komórek do każdego dołka, ponieważ komórki również osadzają się w pipecie.
    3. Pracuj szybko, aby rozprowadzić duże objętości komórek, ponieważ pozostawienie komórek w zawiesinie w temperaturze pokojowej i stężeniu CO2 moduluje ich potencjał klonogenny (niepublikowane obserwacje).
    4. Zoptymalizuj rozmieszczenie przestrzenne komórek podczas pipetowania ich do studzienek w celu przeprowadzenia testów na kolonie. W tym celu należy powoli pipetować zawiesinę zawierającą końcowe stężenie komórek do środka studzienki. Nie poddawaj płytki dalszemu ruchowi, zanim komórki osiądą. Nie obracaj płytki, ponieważ mieszanie kołowe skutecznie odwiruje komórki do obwodu studni, tworząc wysokie zagęszczenie komórek i niezliczone zbiegające się kolonie po 6 dniach.
      UWAGA: Nie mieszać, chyba że jest to konieczne, ponieważ jest to mniej pożądane niż brak mieszania po wprowadzeniu objętości z komórkami w zawiesinie. Jeśli konieczne jest wymieszanie komórek, należy to zrobić, przesuwając płytkę do przodu i do tyłu w prostopadłych kierunkach, gdy spoczywa na płaskiej powierzchni.
    5. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C 5% CO2 bez zmiany pożywki przez 6 dni. Mała liczba komórek w studzience po 6 dniach nie wpłynie znacząco na skład składników odżywczych lub cytokin ani na pH oryginalnej pożywki.
    6. Zaprojektuj przebieg testu w następujący sposób: Inkubuj komórki na podłożach pokrytych fibronektyną w dniu 1. Zastąp istniejącą pożywkę 1 ml świeżej pożywki lub świeżą pożywką zawierającą FGF-2 10 ng/ml w dniu 0. Wybarwić komórki w dniu 6, jak poniżej w 1.4). Przeprowadzić wszelkie perturbacje eksperymentalne w dniu 3, jak poniżej w ppkt 1.3).
  3. Ustawianie eksperymentalnych zaburzeń molekularnych cząsteczek sygnalizacyjnych lub adhezyjnych
    1. W dniu 3 dodać 100 μl roztworu zawierającego 10 razy więcej niż końcowe zamierzone stężenie czynnika zakłócającego do 1 ml pożywki w studzienkach. Nie mieszać. Kontynuować inkubację komórek w temperaturze 37 °C, 5% CO2 przez dodatkowe 3 dni.
      UWAGA: Czynniki zakłócające mogą obejmować różne inhibitory i środki blokujące cząsteczki adhezyjne, receptory lub inne białka powierzchniowe, inhibitory wewnątrzkomórkowych szlaków sygnałowych, cząsteczki, czynniki, kofaktory lub białka strukturalne, które mogą odgrywać rolę we wspieraniu stanu uśpienia.
    2. Plam kolonie w dniu 6 w następujący sposób.
  4. Kolonie plam
    1. Wybarwić komórki po 6 dniach w hodowli świeżo przygotowanym 0,1% fioletem krystalicznym w 2% roztworze etanolu/10 mM boranu sodu (pH 9,0). Odessać pożywkę i dodawać po jednym ml roztworu fioletu krystalicznego do każdej studzienki przez 20 minut.
    2. Umyj talerze, zanurzając je otworami studzienki skierowanymi w dół pod ostrym kątem do wiadra z lodem przepełnionego stale płynącą wodą z kranu w zlewie. Po zanurzeniu pod wodą przechyl płytę pod kątem poziomym, dobrze otwierając się w dół, a następnie przechyl z powrotem do ostrego kąta podczas wyjmowania jednym delikatnym, płynnym ruchem.
    3. Powtórz zanurzenie 2 lub 3 razy, aż woda na dnie studni przestanie być niebieska. Energiczne płukanie może usunąć komórki lub kolonie, które są mniej przylegające z powodu interwencji eksperymentalnej, co znacznie zwiększa błąd w liczeniu i danych.
    4. Wysusz talerze przez noc, kładąc je do góry nogami na ręcznikach na blacie obok odpowiednich oznaczonych pokrowców.
  5. Policz kolonie
    1. Policz liczbę rosnących i uśpionych kolonii w każdym dołku po 6 dniach inkubacji, barwienia i suszenia. Policz kolonie optymalnie przy 40-krotnym powiększeniu w mikroskopie z kontrastem z odwróconymi fazami. Policz kolonie >30 komórek jako rosnące i kolonie składające się z 12 lub mniej komórek, o wyglądzie morfologicznym bardzo dużych rozmiarów w porównaniu z rosnącymi komórkami, dużą rozszerzoną cytoplazmę z dużymi stosunkami cytoplazmy do jądra, pokazane na rysunku 17,15.
      UWAGA: Klastry 13-29 komórek zwykle nie są liczone, ponieważ nie są zbyt częste w prostych testach uśpienia. Można je policzyć, jeśli perturbacje zmieniają potencjał wzrostu komórek rosnących lub uśpionych. Wyniki te będą następnie musiały zostać skorelowane ze znaczeniem biologicznym.

2. Inkubacja klonogenna do badań immunofluorescencyjnych

  1. Dostosuj liczbę komórek do około 7,500-8,000 komórek / studzienkę w płytkach 6-dołkowych, aby odpowiadała liczbie komórek / powierzchni analogicznie do eksperymentów z 24 dołkami.
  2. Umieść okrągłą, sterylną, pokrytą fibronektyną szkiełko nakrywkowe w każdej podstawie studzienki z 6 dołków do badań obrazowych przed dodaniem komórek. Pipetować komórki w objętościach 3 ml do każdej studzienki po 2 dołki na raz w podanych stężeniach, jak opisano dla eksperymentów klonogennych powyżej w ppkt 1.2).
  3. Inkubować komórki przez 6 dni, jak powyżej w ppkt 1.2.4 i 1.2.5. Dodać czynniki zakłócające w dniu 3 przy 10-krotnych stężeniach w objętościach 300 μl, zgodnie z opisem w procedurach oznaczania kolonii w ppkt 1.3).
  4. Wybarwić komórki w dniu 6 przeciwciałami przeciwko cząsteczkom adhezyjnym komórek, takim jak integryny α4, α5, α6, β1, β3, na przykład cząsteczkami ogniskowego kompleksu adhezyjnego FAK, paxillin i winkulina, na przykład białkami zaangażowanymi w ruchliwość, takimi jak α-tubulina, na przykład członkowie szlaku sygnałowego, tacy jak phospho-Akt, phospho-ERK, phospho-p38, phospho-JNK, lub jakiekolwiek inne białko, które jest przedmiotem badań pod kątem jego roli w stanie spoczynku, przy użyciu standardowych technik bezpośredniego lub pośredniego barwienia immunofluorescencyjnego.
    1. Usuń szkiełka za pomocą kleszczy dzień 6. Utrwalić w acetonie/metanolu w stosunku 1:1 w temperaturze -20 °C przez 20 minut i wysuszyć na powietrzu. W razie potrzeby można zastosować alternatywny utrwalacz, taki jak paraformaldehyd. Udrażniać komórki 0,1% Triton X-100, 0,1% cytrynianem sodu przez 2 minuty w celu wykrycia antygenów wewnątrzkomórkowych. Umyj komórki PBS.
    2. W przypadku pośredniego barwienia immunofluorescencyjnego należy blokować szkiełka przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej z 5% BSA lub z 10% surowicą przedimmunologiczną z gatunku, w którym wytworzono przeciwciało drugorzędowe.
    3. Inkubować przez noc w temperaturze 4 °C z pierwszorzędowymi przeciwciałami przeciwko cząsteczkom adhezji komórek, cząsteczkami kompleksu ogniskowego, elementami szlaku sygnałowego lub jakimkolwiek innym białkiem, które jest przedmiotem badań pod kątem jego roli w spoczynku, rozcieńczonym do określonych rozcieńczeń zalecanych przez producenta w PBS 0,1% TRITON X-100.
    4. Umyj 3 razy PBS. Inkubować szkiełka nakrywkowe z przeciwciałami sprzężonymi z fluoroforem w temperaturze pokojowej przez 2 godziny. Na przykład Alexa Fluor 488 Donkey anty-Mouse IgG Antibody może być używany do wykrywania mysich pierwotnych przeciwciał monoklonalnych. Zamontuj szkiełka nakrywkowe komórką do dołu na szkiełkach za pomocą środka zapobiegającego blaknięciu z Dapi. Uszczelnij obwody lakierem do paznokci.
    5. Do celów immunofluorescencji bezpośredniej przeprowadzić blokowanie BSA jak powyżej w ppkt 2.4.2), inkubować z przeciwciałem pierwszorzędowym sprzężonym z fluoroforem przez noc w temperaturze 4 °C. Przemyć 3 razy PBS. Inkubuj szkiełka ze środkiem zapobiegającym blaknięciu i Dapi i uszczelnij lakierem do paznokci.
    6. Przykryj tacki na slajdy folią aluminiową i przechowuj w temperaturze 4 °C do obrazowania i fotografowania w dowolnym momencie do kilku tygodni później. Przeglądaj i fotografuj komórki za pomocą dowolnych systemów obrazowania pod mikroskopem fluorescencyjnym wyposażonych w kamerę o powiększeniu 1,000x.
    7. W przypadku barwienia aktyną fibrylarną należy zablokować szkiełka w 1% albuminie surowicy bydlęcej (BSA) przez 30 minut i inkubować w BODIPY FL-Phallacidin (zielona) lub falloidynie rodaminy (czerwona) w temperaturze pokojowej przez 20 minut. Dodać środek zapobiegający blaknięciu i uszczelnić jak powyżej.

3. Inkubacja klonogenna do badań molekularnych

  1. Western Blot (Zachodnie Bloty)
    1. Inkubować komórki raka piersi ER+ MCF-7 lub T47D przy gęstości klonogennej 20 000 komórek/płytkę 60 mm i 50 000 komórek/płytkę 100 mm na płytkach pokrytych fibronektyną w temperaturze 37 °C w 5% CO2 .
    2. Inkubuj komórki o nieco większej gęstości 75 000 komórek/płytkę 100 mm do badań molekularnych wymagających ilości mg dla białka z lizatów. Użyj do dziesięciu płytek na punkt doświadczalny, aby zebrać wystarczającą ilość białka do badań molekularnych z użyciem Western blot lub do izolacji RNA dla północnych plam.
    3. Ładowanie żelem na podstawie liczby komórek jest niezbędnym uzupełnieniem do porównywania ekspresji białek w bardzo różnych rozmiarach rosnących i uśpionych komórkach. Zbierz komórki przez trypsynizację i policz podwielokrotność w hemocytometrze w 0,2% błękitu trypanowego w celu przygotowania lizatów dla Western blot zamiast zeskrobywania komórek jednym ostrzem krawędziowym.
    4. Odwirować komórki przy 10 000 x g przez 2 minuty, usunąć pożywkę przez aspirację, dodać 200 μl buforu do lizy, sonikować komórki w buforze do lizy i określić stężenie białka.
    5. Oblicz ilość białka na komórkę, dzieląc wydajność białka przez liczbę komórek, które wygenerowały tę ilość. Załadować lizat do każdej studzienki oddzielnych żeli poliakrylamidowych, które reprezentują zarówno a) równoważne ilości białka, jak i b) ilości białka reprezentujące równoważną liczbę komórek. Do każdej studzienki należy załadować co najmniej 25 μg białka.
      UWAGA: Pozwoli to na porównanie między rosnącymi i uśpionymi komórkami, które znacznie różnią się wielkością i zawartością białka (ryc. 1).
  2. Cytometria przepływowa
    1. Zebrać komórki z płytek o średnicy 100 mm metodą trypsynizacji, jak w ppkt 3.1 i przeanalizować za pomocą standardowych protokołów sortowania komórek aktywowanych fluorescencją (FACS) przy użyciu pierwotnego lub wtórnego barwienia immunofluorescencyjnego dla antygenów wewnątrzkomórkowych lub zewnątrzkomórkowych, jak opisano w 2.4.
      UWAGA: Oderwanie komórek od płytek do hodowli tkankowej przez trypsynizację nie wpływa na stężenie białek błonowych określone przez znakowanie przeciwciałami.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Przeprowadzono doświadczenia w celu powtórzenia testu. Przebieg czasowy eksperymentu przedstawiono na Rysunku 2A. Komórki inkubuje się w gęstości klonogennej w dniu -1, w dniu 0 dodaje się FGF-2 w świeżej pożywce, a następnie hoduje komórki do dnia 6, kiedy zostają one zabarwione, a kolonie przeliczone. Wszelkie perturbacje systemu wprowadza się w dniu 3 w objętościach 100 μl przy 10-krotnym stężeniu końcowym. Rysunek 2B obrazuje typowy wygląd kolonii rosnących i uśpionych. Kolonie rosną...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Nasz model składa się z kilku kluczowych elementów spoczynku w szpiku kostnym. Składa się z komórek wrażliwych na estrogeny, które prawdopodobnie pozostają uśpione w szpiku przez dłuższy czas10, składa się z fibronektyny, kluczowego elementu strukturalnego szpiku, FGF-2, czynnika wzrostu obficie syntetyzowanego przez zrąb szpiku kostnego i silnie zdeponowanego w macierzy zewnątrzkomórkowej szpiku kostnego31,32 oraz inkubacja komórek o gęstości klonogennej, gdzie ich interakcje zachodzą przede wszyst...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Wspierane przez Departament Obrony przyznaje granty DAMD17-01-C-0343 i DAMD17-03-1-0524, Komisję Badań nad Rakiem Stanu New Jersey 02-1140-CCR-E0 oraz Ruth Estrin Goldberg Memorial for Cancer Research (RW)

Podziękowania

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Ogniwa MCF-7Ogniwa ATCCHTB-22
T47D ATCCHTB-123
BD BioCoat Fibronectin 24 Well Clear Płaska płytka wielodołkowa z płaskim dnem z powłoką TCCorning354411
BD BioCoat Fibronectin 60 mm Naczynia hodowlaneCorning354403
BD BioCoat Fibronectin 100 mm Naczynia hodowlaneCorning354451
BD BioCoat 22x22mm #1 Szklane szkiełko nakrywkowe z równomiernym nałożeniem ludzkiej fibronektynyCorning354088
6-dołkowa płytka do hodowli tkanekCellTreat229106
Dulbecco Modified Eagle Medium High Glucose 10X w proszkuCorning Life Sciences50-013-PB
Inaktywowana termicznie, płodowa surowica bydlęcaŹródło surowicy InternationalFB02-500HI
0,25% trypsyny/2,21 mM EDTACorning25-053-CI
Roztwór penicyliny-streptomycyny, 100XCorning30-002-CI
L-glutamina, 100x, płynnyCorning25-005-CI
Rekombinowany ludzki FGF  podstawoweR& D Systems234-FSE-025
Inhibitor Akt (1L6-hydroksymetylo-chiro-inozytol-2-(R)-2-O-metylo-3-O-oktadecylo-sn-glicerowęglan)CalBiochem124005
LY294002 CalBiochem19-142Cheniczny inhibitor PI3K
transferaza C3 CytoszkieletCTO3hamuje RhoA, RhoB i RhoC, ale nie powiązane GTPazy, takie jak Cdc42 lub
Rac1 Y-27632 dichlorowodorek Santa Cruz Biotechnology129830-28-2
BODIPY FL-fallacydyna (zielona) Sondy molekularneB607Fluorochrom do barwienia aktyną fibrylarną
BODIPY FL-Rhodamina falloidyna (czerwona) Sondy molekularneR415Fluorochrom do barwienia aktyną fibrylarną
Alexa Fluor 488 Przeciwciało anty-mysie IgG osła, odczynnik ReadyPropes Sondy molekularneR37114
ProLong Gold Antifade Mountant z DAPI Sondy molekularneP-36931

Bibliografia

  1. Braun, S., et al. Cytokeratin-positive cells in the bone marrow and survival of patients with stage I, II, or III breast cancer. N Engl J Med. 342 (8), 525-533 (2000).
  2. Benoy, I. H., et al. Relative microvessel area of the primary tumour, and not lymph node status, predicts the presence of bone marrow micrometastases detected by reverse transcriptase polymerase chain reaction in patients with clinically non-metastatic breast cancer. Breast Cancer Res. 7 (2), R210-R219 (1186).
  3. Wapnir, I. L., Barnard, N., Wartenberg, D., Greco, R. S. The inverse relationship between microvessel counts and tumor volume in breast cancer. Breast J. 7 (3), 184-188 (2001).
  4. Wyckoff, J. B., et al. A critical step in metastasis: in vivo analysis of intravasation at the primary tumor. Cancer Res. 60 (9), 2504-2511 (2000).
  5. Phadke, P. A., et al. Kinetics of metastatic breast cancer cell trafficking in bone. Clin Cancer Res. 12 (5), 1431-1440 (2006).
  6. Braun, S., et al. Lack of an effect of adjuvant chemotherapy on the elimination of single dormant tumor cells in bone marrow of high risk breast cancer patients. J Clin Onc. 18 (1), 80-86 (2000).
  7. Korah, R., Boots, M., Wieder, R. Integrin α5β1 promotes survival of growth-arrested breast cancer cells: an in vitro paradigm for breast cancer dormancy in bone marrow. Cancer Res. 64 (13), 4514-4522 (2004).
  8. Najmi, S., Korah, R., Chandra, R., Abdellatif, M., Wieder, R. Flavopiridol blocks integrin-mediated survival in dormant breast cancer cells. Clin Cancer Res. 11 (5), 2038-2046 (2005).
  9. Braun, S., et al. A pooled analysis of bone marrow micrometastasis in breast cancer. N England J Med. 353 (8), 793-802 (2005).
  10. Dent, R., et al. Triple-negative breast cancer: clinical features and patterns of recurrence. Clin Cancer Res. 13 (15 Part 1), 4429-4434 (2007).
  11. Kim, R. S., et al. Dormancy signatures and metastasis in estrogen receptor positive and negative breast cancer. PLoS One. 7 (4), e35569(2012).
  12. Hanin, L. Seeing the invisible: how mathematical models uncover tumor dormancy, reconstruct the natural history of cancer, and assess the effects of treatment. Adv in Exp Med & Biol. 734, 261-282 (2013).
  13. Wilkie, K. P. A review of mathematical models of cancer-immune interactions in the context of tumor dormancy. Adv in Exp Med & Biol. 734, 201-234 (2013).
  14. Barkan, D., Green, J. E. An in vitro system to study tumor dormancy and the switch to metastatic growth. J Vis Exp. (54), e2914(2011).
  15. Barrios, J., Wieder, R. Dual FGF-2 and intergrin α5β1 signaling mediate GRAF-induced RhoA inactivation in a model of breast cancer dormancy. Cancer Microenvironment. 2 (1), 33-47 (2009).
  16. Ganapathy, V., et al. Luminal breast cancer metastasis is dependent on estrogen signaling. Clin & Exp Metastasis. 29 (5), 493-509 (2012).
  17. Barkan, D., et al. Inhibition of metastatic outgrowth from single dormant tumor cells by targeting the cytoskeleton. Cancer Res. 68 (15), 6241-6250 (2008).
  18. Ghajar, C. M., et al. The perivascular niche regulates breast tumour dormancy. Nat Cell Biology. 15 (7), 807-817 (2013).
  19. Marshall, J. C., et al. Effect of inhibition of the lysophosphatidic acid receptor 1 on metastasis and metastatic dormancy in breast cancer. J Nat Cancer Inst. 104 (17), 1306-1319 (2012).
  20. Almog, N. Genes and regulatory pathways involved in persistence of dormant micro-tumors. Adv in Exp Med & Biol. 734, 3-17 (2013).
  21. Wang, H., et al. Basic FGF causes growth arrest in MCF-7 human breast cancer cells while inducing both mitogenic and inhibitory G1 events. Cancer Res. 57 (9), 1750-1757 (1997).
  22. Fenig, E., et al. Role of transforming growth factor beta in the growth inhibition of human breast cancer cells by basic fibroblast growth factor. Breast Cancer Res Treat. 70 (1), 27-37 (2001).
  23. Fenig, E., et al. Basic fibroblast growth factor confers growth inhibition and Mitogen-activated Protein Kinase activation in human breast cancer cells. Clinical Cancer Research. 3 (1), 135-142 (1997).
  24. Coleman-Krnacik, S., Rosen, J. M. Differential temporal and spatial gene expression of fibroblast growth factor family members during mouse mammary gland development. Molecular Endocrinology. 8 (2), 218-229 (1994).
  25. Plath, A., et al. Expression and localization of members of the fibroblast growth factor family in the bovine mammary gland. J Dairy Science. 81 (10), 2604-2613 (1998).
  26. Lavandero, S., Chappuzeau, A., Sapag-Hagar, M., Oka, T. In vivo and in vitro evidence of basic fibroblast growth factor action in mouse mammary gland development. FEBS letters. 439 (3), 351-356 (1998).
  27. Sinowatz, F., Schams, D., Plath, A., Kolle, S. Expression and localization of growth factors during mammary gland development. Adv in Exp Med & Biol. 480, 19-27 (2000).
  28. Korah, R., Sysounthone, V., Scheff, E., Wieder, R. Intracellular FGF-2 promotes differentiation in T47-D breast cancer cells. Biochem Biophys Res Comm. 277 (1), 255-260 (2000).
  29. Korah, R., Das, K., Lindy, M. E., Hameed, M., Wieder, R. Co-ordinate loss of FGF-2 and laminin 5 expression during neoplastic progression of mammary duct epithelium. Human Pathology. 38 (1), 154-160 (2007).
  30. Wieder, R., et al. Overexpression of basic fibroblast growth factor in MCF-7 human breast cancer cells: lack of correlation between inhibition of cell growth and MAP kinase activation. J. Cellular Physiology. 177, 411-425 (1998).
  31. Brunner, G., Gabrilove, J., Rifkin, D. B., Wilson, E. L. Phospholipase C release of basic fibroblast growth factor from human bone marrow cultures as a biologically active complex with a phosphatidylinositol-anchored heparan sulfate proteoglycan. J Cell Biol. 114 (6), 1275-1283 (1991).
  32. Wilson, E. L., Rifkin, D. B., Kelly, F., Hannocks, M. J., Gabrilove, J. L. Basic fibroblast growth factor stimulates myelopoiesis in long-term human bone marrow cultures. Blood. 77 (5), 954-960 (1991).
  33. Gupta, P., McCarthy, J. B., Verfaillie, C. M. Stromal fibroblast heparan sulfate is required for cytokine-mediated ex vivo maintenance of human long-term culture-initiating cells. Blood. 87 (8), 3229-3236 (1996).
  34. Chatterjee, M., van Golen, K. L. Farnesyl transferase inhibitor treatment of breast cancer cells leads to altered RhoA and RhoC GTPase activity and induces a dormant phenotype. Int J Cancer. 129 (1), 61-69 (2011).
  35. Korah, R., Sysounthone, V., Golowa, Y., Wieder, R. Basic fibroblast growth factor confers a more differentiated phenotype in MDA-MB-231 human breast cancer cells. Cancer Res. 60 (3), 733-740 (2000).
  36. Dontu, G., et al. In vitro propagation and transcriptional profiling of human mammary stem/progenitor cells. Genes & Dev. 17 (10), 1253-1270 (2003).
  37. Tivari, S., Lu, H., Dasgupta, T., Wieder, R. Reactivation of dormant estrogen-dependent breast cancer micrometastases by bone marrow stromal injury in an in vitro model of dormancy. Proceedings of the 105th Annual Meeting of the American Association for Cancer Research. , AACR. San Diego, CA. Philadelphia (PA). (2014).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

U pienie szpiku kostnegop ytki pokryte fibronektyntraktowanie FGF 2hodowla o g sto ci klonogennejtest tworzenia koloniitraktowanie inhibitorem PI3Kbarwienie fioletem krystalicznymkwantyfikacja u pionych kolonii

Powiązane artykuły