Artykuł metodologiczny

Niedrogi, skalowalny test behawioralny do pomiaru wrażliwości i szybkiej tolerancji sedacji etanolem u Drosophila

10K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/52676

⸱

15 kwietnia 2015

 ,  ,  ,  , 
1Department of Human and Molecular Genetics, Virginia Commonwealth University, 2VCU Alcohol Research Center, Virginia Commonwealth University

W tym artykule

Podsumowanie

Proste testy do pomiaru wrażliwości etanolu i szybkiej tolerancji u Drosophila ułatwiają wykorzystanie tego organizmu modelowego do badania tych ważnych zachowań związanych z etanolem. W tym miejscu opisano stosunkowo prosty, skalowalny test do pomiaru wrażliwości etanolu i szybkiej tolerancji u much.

Streszczenie

Zaburzenia związane z używaniem alkoholu (AUD) to poważne wyzwanie zdrowotne. Pomimo dużego dziedzicznego komponentu AUD, niewiele genów zostało jednoznacznie zaangażowanych w ich etiologię. Muszka owocowa, Drosophila melanogaster, jest potężnym modelem do badania molekularno-genetycznych mechanizmów leżących u podstaw zachowań związanych z alkoholem i dlatego jest bardzo obiecująca dla identyfikacji i zrozumienia funkcji genów wpływających na AUD. Zastosowanie modelu Drosophila w tego typu badaniach zależy od dostępności testów, które wiarygodnie mierzą reakcje behawioralne na etanol. W niniejszym raporcie opisano test odpowiedni do oceny wrażliwości etanolu i szybkiej tolerancji u much. Na czułość etanolu mierzoną w tym teście ma wpływ objętość i stężenie użytego etanolu, różne wcześniej zgłoszone manipulacje genetyczne, a także czas, przez jaki muszki są trzymane bez pożywienia bezpośrednio przed badaniem. W przeciwieństwie do tego, na wrażliwość etanolu mierzoną w tym teście nie ma wpływu wigor obchodzenia się z muchami, płeć much i suplementacja pożywki wzrostowej antybiotykami lub żywymi drożdżami. Opisano trzy różne metody ilościowego określania wrażliwości etanolu, z których wszystkie prowadzą do zasadniczo nierozróżnialnych wyników wrażliwości na etanol. Skalowalny charakter tego testu, w połączeniu z jego ogólną prostotą konfiguracji i stosunkowo niskimi kosztami, sprawiają, że nadaje się on do analizy genetycznej na małą i dużą skalę wrażliwości etanolu i szybkiej tolerancji u Drosophila.

Wprowadzenie

Zaburzenie związane z używaniem alkoholu (AUD) jest ogromnym problemem zdrowotnym na całym świecie (omówione w 1). Chociaż mechanizmy napędzające rozwój AUD są złożone, zaburzenia te mają główny komponent genetyczny (np. 2). Duża odziedziczalność AUD i konserwatywne reakcje behawioralne na etanol u wielu gatunków (omówione w 3,4) wzbudziły duże zainteresowanie wykorzystaniem organizmów modelowych genetycznie do zbadania udziału określonych genów w zachowaniach związanych z etanolem w celu lepszego zrozumienia molekularnych podstaw AUD. Muszka owocowa, Drosophila melanogaster, stała się wiodącym organizmem modelowym do badania molekularno-genetycznych mechanizmów zachowań związanych z etanolem (przegląd w 3,4). Badania na muchach podkreśliły rolę kilku szlaków sygnałowych w behawioralnych reakcjach na etanol (przegląd w 5). Co ciekawe, niektóre geny i szlaki, które wpływają na reakcje behawioralne na etanol u much, są również związane z zachowaniami związanymi z etanolem u gryzoni i / lub ludzkim AUD (np. 6-14). Zachowanie mechanizmów kierujących zachowaniami związanymi z etanolem u różnych gatunków, w połączeniu z zestawem narzędzi genetycznych dostępnych w systemie modelowym Drosophila, podkreśla użyteczność modelu muszki owocowej w badaniu genetyki reakcji behawioralnych na etanol.

Czułość 15,16 i tolerancja (sprawdzona w 17) na etanol u ludzi jest związana z rozwojem AUD. Obie te reakcje behawioralne na etanol można modelować u much za pomocą różnych testów laboratoryjnych (omówionych w 3,4). Wszystkie testy much znane autorom opierają się albo na zależnej od czasu sedacji/braku koordynacji wywołanej etanolem, albo na zależnym od czasu powrocie do zdrowia po sedacji etanolem.

W poprzednim artykule naszej grupy na temat genetyki wrażliwości na etanol i szybkiej tolerancji u Drosophila, użyto testu behawioralnego opartego na uspokojeniu much wywołanym parami etanolu 18. Testy w tym teście rozpoczęto od przeniesienia żywych dorosłych much bez znieczulenia do pustych fiolek z żywnością, uwięzienia much w fiolkach za pomocą zatyczki z octanu celulozy, dodania etanolu do górnej (tj. strony nieprzewodzącej) korka z octanu celulozy i uszczelnienia fiolki zawierającej muchy, zatyczkę z octanu celulozy i etanol silikonowym korkiem (patrz schemat na rysunku S3, odniesienie 18). Wiele fiolek reprezentujących różne grupy much oceniano równolegle, co zwiększyło przepustowość tego testu. Fiolki otrzymały anonimowy kod, a eksperymentatorzy zostali zaślepieni na grupę leczoną, aby zapobiec niezamierzonym błędom w ocenie sedacji. W standardowym eksperymencie muchy w fiolkach były delikatnie stukane w odstępach 6-minutowych, a po 30 sekundach odzyskiwania liczba uspokojonych much w każdej fiolce została policzona i przeliczona na procent aktywnych much. Muchy absorbowały opary etanolu z korka octanu celulozy w sposób zależny od czasu, powodując postępujący wzrost wewnętrznego etanolu18 i sedacji (por. odniesienie 18 i rysunki 1A i 1B w tym raporcie). Sedacja w tym teście została operacyjnie zdefiniowana jako muchy (i) stojące bez chodzenia lub (ii) leżące na plecach z trzepotaniem skrzydłami lub bez. W tym miejscu szczegółowo opisano ten test sedacji etanolem, przedstawiono dalszą optymalizację operacyjną związaną z jego stosowaniem, a test jest stosowany w celu uwzględnienia wpływu opcji suplementacji diety na wrażliwość na sedację muchową.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Dzień przed testem

  1. Zbieraj muchy do fiolek ze świeżą żywnością w grupach po 11 osób (jedna płeć) pod krótkim (1-5 min) CO2.
  2. Pozwól muszkom odzyskać O/N w fiolkach z żywnością w kontrolowanej przestrzeni (zwykle 25 °C, 60% wilgotności względnej, 12-godzinny cykl światła/ciemności).
  3. Przygotować roztwor(-y) etanolu, rozcieńczając czysty (100%) etanol w oczyszczonej (≥18 MΩ) wodzie do końcowego stężenia(-ń) odpowiedniego dla planowanego doświadczenia. Poczekaj, aż roztwór (roztwory) powróci do RT O/N.
    Uwaga: Rozcieńczanie etanolu jest egzotermiczne.

2. Dzień próby

  1. Dla każdej fiolki z muchami, która ma być poddana badaniu, należy przygotować (i) czystą, pustą fiolkę z pokarmem, tj. fiolkę do badań, (ii) nową zatyczkę z octanu celulozy, (iii) korek silikonowy i (iv) 1 ml roztworu etanolu (patrz Tabela 3).
  2. Przygotuj pomieszczenie testowe, dostosowując temperaturę do 20-25 °C i wilgotność względną do 55-65%.
  3. Poproś innego pracownika, aby przypisał unikalny kod do każdej grupy fiolek i zapisał go na później. Umieść zakodowane fiolki z muchami w pomieszczeniu testowym, aby zaaklimatyzować się przez kilka minut.
  4. Oznaczyć puste fiolki testowe, aby pasowały do kodów na fiolkach muchowych z 2.3.
  5. Skonstruuj dziennik testowania w wersji papierowej, wprowadzając kody w kolumnach (jedna kolumna/fiolka) w arkuszu kalkulacyjnym podobnym do tabeli 1.
  6. Korzystając z dziennika testów jako przewodnika, ułóż zakodowane fiolki z jedzeniem z muchami i pustymi fiolkami testowymi w pasujące tablice w pomieszczeniu testowym.
    Uwaga: Rozsądna maksymalna liczba fiolek do badania to 24 (tj. 6 zestawów po 4 fiolki każdy).
  7. Przenieść muchy z fiolek z żywnością do dopasowanych/oznakowanych pustych fiolek testowych i natychmiast włożyć zatyczki z octanu celulozy do fiolek testowych, aż zatyczki z octanu celulozy znajdą się 2 cm poniżej górnej części fiolki.
  8. Następnie należy traktować każdy rząd czterech fiolek jako zestaw w odstępach 1-minutowych.
  9. W celu oceny czasu 0 chwyć każdą fiolkę z osobna kciukiem i palcem wskazującym, delikatnie postukaj trzy razy w stół, aby strącić muchy na dno fiolki, odczekaj 30 sekund, a następnie policz liczbę much, które są nieruchome/martwe. Zapisać liczbę nieruchomych/martwych much dla każdej fiolki w czasie 0 min w papierowym dzienniku testów.
  10. Rozpocznij odliczanie timera w sposób ciągły w czasie 0 i natychmiast rozpocznij dodawanie 1 ml etanolu do zatyczek z octanu celulozy w fiolkach dla pierwszego rzędu/zestawu 4 fiolek. Dodać 1 ml etanolu do zatyczek z octanu celulozy w fiolkach w odstępach 5 sekund w kolejności, w jakiej będą badane. Dodaj etanol do korków octanu celulozy ruchem okrężnym, tak aby etanol był równomiernie wchłaniany przez korki octanu celulozy. Po dodaniu etanolu do wszystkich 4 fiolek testowych w zestawie, włóż silikonową zatyczkę do każdej fiolki, aby ją uszczelnić.
  11. Na 1, 2, 3, 4 i 5 minut dodać 1 ml etanolu odpowiednio do drugiego, trzeciego, czwartego, piątego i szóstego zestawu 4 fiolek. Kontynuować wkładanie silikonowych korków po dodaniu etanolu do każdego zestawu 4 fiolek.
  12. W czasie 6 minut przetestuj pierwszy zestaw 4 fiolek, chwytając każdą fiolkę kciukiem i palcem wskazującym, delikatnie stukając trzy razy w stół, aby strącić muchy na dno fiolki, odczekaj 30 sekund, a następnie policz i zapisz całkowitą liczbę much, które są uspokojone. Score leci jako uspokojony, jeśli (i) stoi na dnie fiolki, ale nie chodzi, lub (ii) leży na plecach z trzepotaniem skrzydłami lub bez.
  13. Z każdą fiolką w zestawie należy obchodzić się w odstępach 5 sekund, postępując zgodnie ze schematem w Tabeli 2.
  14. Czasem po 7, 8, 9, 10 i 11 minutach należy przetestować odpowiednio drugi, trzeci, czwarty, piąty i szósty zestaw fiolek, tak jak to ma miejsce w przypadku pierwszego zestawu.
  15. Po upływie 12 minut ponownie zbadać pierwszy zestaw 4 fiolek, jak opisano w ppkt 2.12 i kontynuować badanie drugiego, trzeciego, czwartego, piątego i szóstego zestawu fiolek odpowiednio po 13, 14, 15, 16 i 17 minutach.
  16. Kontynuować badanie much zgodnie z opisem w ppkt 2.12, aż wszystkie muchy zostaną uspokojone.
  17. Wprowadzić całkowitą liczbę much w każdej fiolce w dzienniku testów w wersji papierowej. Cenzuruje nieruchome/martwe muchy w czasie 0 od całkowitej liczby much.
  18. Oblicz procent aktywnych much w każdym punkcie czasowym oceny i wykreśl dane jako % aktywnych much (oś y) w funkcji czasu (oś x). Określ ilościowo sedację etanolem przez interpolację wartości czasu sedacji 50 (ST50, czas do 50% sedacji) z dopasowań krzywej wielomianowej lub esigmoidalnej trzeciego rzędu lub obliczania pola pod krzywą.
  19. Skompilować dane z odkodowanych fiolek i przeprowadzić analizy statystyczne (np. jednoczynnikowy test ANOVA z wielokrotnym testem porównawczym Bonferroni) zgodnie z potrzebami projektu eksperymentalnego.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Surowymi danymi z tego testu sedacji etanolem są liczby much poddanych sedacji w funkcji czasu ekspozycji na opary etanolu. Dane surowe są przeliczane na procent aktywnych much w funkcji czasu (dane podstawowe, Rycina 1A, B, D-F). Wrażliwość na sedację etanolem na podstawie danych podstawowych można określić ilościowo jako czas sedacji 50 (ST50), czyli czas wymagany do sedacji 50% much, lub jako pole pod krzywą (AUC), poprzez interpolację z dopasowanych ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Proste testy, które w powtarzalny sposób określają ilościowo znaczące fenotypy, mają ogromną wartość dla analizy zachowania. Opisana tutaj praca dotyczy kilku praktycznych aspektów testu do pomiaru czułości sedacji etanolem i szybkiej tolerancji u Drosophila. Chociaż nie jest to przedmiotem tej pracy, analizy behawioralne są ułatwione dzięki utrzymaniu stałego środowiska i tła genetycznego dla badanych w badaniu. Ponadto zazwyczaj należy dokonywać porównań między grupami much hodowanych i badanych obok siebie. W...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Te badania były wspierane przez granty z National Institutes of Health, National Institute for Alcoholism and Alcohol Abuse dla M.G. (P20AA017828, R01AA020634, P50 AA022537). Autorzy dziękują Jill Bettinger za pomocne dyskusje i Jacqueline DeLoyht za pomoc techniczną.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
fiolki na żywnośćVWR89092-772wąskie
FlugsGenesee/flystuff.com49-102wąski
korek silikonowyFisher Scientific09-704-1l#4
etanolPharmaco-Aaper111000200200 proof

Bibliografia

  1. Rehm, J., et al. Global burden of disease and injury and economic cost attributable to alcohol use and alcohol-use disorders. Lancet. 373, 2223-2233 (2009).
  2. Prescott, C. A., Kendler, K. S. Genetic and environmental contributions to alcohol abuse and dependence in a population-based sample of male twins. The American journal of psychiatry. 156, 34-40 (1999).
  3. Devineni, A. V., Heberlein, U. The evolution of Drosophila melanogaster as a model for alcohol research. Annual review of neuroscience. 36, 121-138 (2013).
  4. Scholz, H., Mustard, J. A. Invertebrate Models of Alcoholism. Current topics in behavioral neurosciences. 13, 433-457 (2011).
  5. Rodan, A. R., Rothenfluh, A. Functional Plasticity and Genetic Variation: Insights into the Neurobiology of Alcoholism. Reilly, M. T., Lovinger, D. M. 91, Elsevier. (2010).
  6. Schumann, G., et al. Genome-wide association and genetic functional studies identify autism susceptibility candidate 2 gene (AUTS2) in the regulation of alcohol consumption. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, 7119-7124 (2011).
  7. Corl, A. B., et al. Happyhour, a Ste20 family kinase, implicates EGFR signaling in ethanol-induced behaviors. Cell. 137, 949-960 (2009).
  8. Moore, M. S., et al. Ethanol intoxication in Drosophila: Genetic and pharmacological evidence for regulation by the cAMP signaling pathway. Cell. 93, 997-1007 (1998).
  9. Scholz, H., Franz, M., Heberlein, U. The hangover gene defines a stress pathway required for ethanol tolerance development. Nature. 436, 845-847 (2005).
  10. Riley, B. P., et al. Alcohol dependence is associated with the ZNF699 gene, a human locus related to Drosophila hangover, in the Irish affected sib pair study of alcohol dependence (IASPSAD) sample. Molecular psychiatry. 11, 1025-1031 (2006).
  11. Morozova, T. V., et al. Alcohol sensitivity in Drosophila: translational potential of systems genetics. Genetics. 183, 733-745 (2009).
  12. Ogueta, M., Cibik, O., Eltrop, R., Schneider, A., Scholz, H. The influence of Adh function on ethanol preference and tolerance in adult Drosophila melanogaster. Chemical senses. 35, 813-822 (2010).
  13. Han, S., et al. Integrating GWASs and human protein interaction networks identifies a gene subnetwork underlying alcohol dependence. American journal of human genetics. 93, 1027-1034 (2013).
  14. Lind, P. A., et al. A genomewide association study of nicotine and alcohol dependence in Australian and Dutch populations. Twin Res Hum Genet. 13, 10-29 (2010).
  15. Schuckit, M. A. Low level of response to alcohol as a predictor of future alcoholism. The American journal of psychiatry. 151, 184-189 (1994).
  16. Schuckit, M. A., Smith, T. L. An 8-year follow-up of 450 sons of alcoholic and control subjects. Archives of general psychiatry. 53, 202-210 (1996).
  17. Tabakoff, B., Cornell, N., Hoffman, P. L. Alcohol tolerance. Ann Emerg Med. 15, 1005-1012 (1986).
  18. Chan, R. F., et al. Contrasting Influences of Drosophila white/mini-white on Ethanol Sensitivity in Two Different Behavioral Assays. Alcohol Clin Exp Res. 38, 1582-1593 (2014).
  19. Eddison, M., et al. arouser reveals a role for synapse number in the regulation of ethanol sensitivity. Neuron. 70, 979-990 (2011).
  20. Wen, T., Parrish, C. A., Xu, D., Wu, Q., Shen, P. Drosophila neuropeptide F and its receptor, NPFR1, define a signaling pathway that acutely modulates alcohol sensitivity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102, 2141-2146 (2005).
  21. Bhandari, P., Kendler, K. S., Bettinger, J. C., Davies, A. G., Grotewiel, M. An assay for evoked locomotor behavior in Drosophila reveals a role for integrins in ethanol sensitivity and rapid ethanol tolerance. Alcohol Clin Exp Res. 33, 1794-1805 (2009).
  22. Bhandari, P., et al. Chloride intracellular channels modulate acute ethanol behaviors in Drosophila, Caenorhabditis elegans and mice. Genes, brain, and behavior. 11, 387-397 (2012).
  23. Gargano, J. W., Martin, I., Bhandari, P., Grotewiel, M. S. Rapid iterative negative geotaxis (RING): a new method for assessing age-related locomotor decline in Drosophila. Experimental gerontology. 40, 386-395 (2005).
  24. Chen, J., Wang, Y., Zhang, Y., Shen, P. Mutations in Bacchus reveal a tyramine-dependent nuclear regulator for acute ethanol sensitivity in Drosophila. Neuropharmacology. 67, 25-31 (2013).
  25. Lasek, A. W., Giorgetti, F., Berger, K. H., Tayor, S., Heberlein, U. Lmo genes regulate behavioral responses to ethanol in Drosophila melanogaster and the mouse. Alcohol Clin Exp Res. 35, 1600-1606 (2011).
  26. Maples, T., Rothenfluh, A. A simple way to measure ethanol sensitivity in flies. J Vis Exp. , e2541(2011).
  27. Rothenfluh, A., et al. Distinct behavioral responses to ethanol are regulated by alternate RhoGAP18B isoforms. Cell. 127, 199-211 (2006).
  28. Nohronha, A. Ch. 23. Neurobiology of Alcohol Dependence. 23, Elsevier. 467-495 (2014).
  29. Jones, M. A., Grotewiel, M. Drosophila as a model for age-related impairment in locomotor and other behaviors. Experimental gerontology. 46, 320-325 (2010).
  30. Martin, I., Grotewiel, M. S. Oxidative damage and age-related functional declines. Mechanisms of ageing and development. 127, 411-413 (2006).
  31. Devineni, A. V., Heberlein, U. Acute ethanol responses in Drosophila are sexually dimorphic. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 21087-21092 (2012).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Test sedacji etanolemDrosophila melanogasterwra liwo na etanolmetoda testowania w prob wkachczas sedacji 50analiza genetycznazaburzenia zwi zane z u ywaniem alkoholukorki z octanu celulozy

Powiązane artykuły