Znormalizowana metoda analizy sinusoidalnych komórek śródbłonka wątroby i ich fenestracji za pomocą skaningowej mikroskopii elektronowej

Podsumowanie

Fenestrowana komórka śródbłonka wątroby sinusoidalnej jest biologicznie ważnym systemem filtrów, na który duży wpływ mają różne choroby, toksyny i stany fizjologiczne. Zmiany te mają znaczący wpływ na pracę wątroby. Opisano metody standaryzacji pomiaru wielkości i liczby okien w tych komórkach.

Streszczenie

Komórki śródbłonka sinusoidalnego wątroby są bramą do wątroby, ich transkomórkowe fenestracje pozwalają na niezakłócony transfer małych i rozpuszczonych substancji z krwi do miąższu wątroby w celu metabolizmu i przetwarzania. Fenestracje są strukturami dynamicznymi - zarówno ich rozmiar, jak i liczba mogą być zmieniane w odpowiedzi na różne stany fizjologiczne, leki i choroby, co czyni je ważnym celem modulacji. Zrozumienie, w jaki sposób na morfologię LSEC wpływają różne stany chorobowe, toksyczne i fizjologiczne oraz jak te zmiany wpływają na czynność wątroby, wymaga dokładnego pomiaru wielkości i liczby okien. W tym artykule opisujemy techniki utrwalania i przetwarzania skaningowej mikroskopii elektronowej stosowane w naszym laboratorium w celu zapewnienia powtarzalnego przygotowania próbki i dokładnej interpretacji. Metody obejmują utrwalanie perfuzji, wtórne utrwalanie i odwadnianie, przygotowanie do skaningowego mikroskopu elektronowego i analizę. Na koniec przedstawiamy metodę krok po kroku do standaryzowanej analizy obrazu, która przyniesie korzyści wszystkim badaczom w tej dziedzinie.

Wprowadzenie

Sinusoidalne komórki śródbłonka wątroby (LSEC) są wysoce zróżnicowanymi komórkami śródbłonka, które wyściełają ścianę sinusoidy wątrobowej. LSEC są perforowane okienkami, które są nieprzepomierzone, transkomórkowe pory o średnicy 50-250 nm. Do 20% powierzchni LSEC jest pokryta fenestracjami, które zwykle występują w grupach od dziesiątek do setek zwanych płytkami sitowymi^1-3 (ryc. 1). Fenestracje umożliwiają przenoszenie osocza i nanosubstratów między krwią a hepatocytami, tworząc wysoce wydajny system ultrafiltracji. Stolarki są dynamicznymi strukturami - zarówno ich wielkość, jak i liczba mogą ulegać zmianie w odpowiedzi na różne stany fizjologiczne, leki i choroby. Na przykład okienka są większe u osób na czczo niż w stanie nakarmionym⁴; 2-di-jodoamfetamina zwiększa liczbę okien; ^5,6 i zmniejszenie wielkości i liczby okien na komórkę występuje w starzeniu się i wielu stanach chorobowych^7-13. Dokładny pomiar wielkości i liczby okien jest ważny dla zrozumienia, w jaki sposób na morfologię LSEC wpływają różne stany chorobowe, toksyczne i fizjologiczne; ich wpływ na czynność wątroby; oraz do opracowywania interwencji terapeutycznych modulujących fenestrację¹.

Badanie okien jest trudne. Średnica okien leży poniżej rozdzielczości konwencjonalnej mikroskopii świetlnej, więc wcześniej możliwa była tylko obserwacja za pomocą mikroskopii elektronowej zarówno w nienaruszonej tkance wątroby, jak i hodowanych LSEC. Skaningowy mikroskop elektronowy (SEM) jest najczęściej używany do badania wielkości, częstotliwości i porowatości okien (procent błony LSEC, która jest perforowana przez fenestracje), ponieważ SEM pozwala na obserwację dużych obszarów powierzchni śródbłonka i pomiar tysięcy, jeśli nie dziesiątek tysięcy okien. Pomimo jego użyteczności, wyniki badań opartych na SEM dla parametrów LSEC, takich jak wielkość, liczba, częstotliwość i porowatość okien, różnią się znacznie w literaturze (tabela 1).

Okienka i płyty sitowe są delikatnymi strukturami, które kurczą się, pękają, rozszerzają lub łączą podczas przygotowywania próbek, dlatego konieczne jest staranne przetwarzanie, aby zachować ich integralność. Podwyższone ciśnienie perfuzji¹⁴; nieprawidłowa osmolarność utrwalacza i¹⁵; niewystarczające utrwalenie lub czas utrwalenia; i szybkość odwadniania i suszenia po utrwaleniu to obszary przetwarzania SEM, które mogą wytwarzać artefakty zakłócające zachowanie ultrastruktury (ryc. 2). Utrata okien ("defenestracja") i kurczenie się okien może wystąpić w wyniku słabego mocowania, co skutkuje zmniejszeniem średnicy okien i porowatości komórek. Metody poprawy konserwacji próbek do analizy SEM zostały opisane wcześniej ^15-17 i zostaną omówione tutaj wraz z dodatkowymi wskazówkami, jak poprawić konserwację próbek. Głównym celem konserwacji próbki jest usunięcie krwi z sinusoid, tak aby można było uwidocznić powierzchnię LSEC i uniknąć uszkodzenia LSEC przez wysokie ciśnienie lub opóźnione utrwalenie. Cała perfuzja utrwalacza w wątrobie przez żyłę wrotną jest preferowaną metodą zespolenia wątroby. Jak opisano szczegółowo w innym miejscu,^16,18 perfuzja musi być przeprowadzana pod niskim ciśnieniem (np. 10 cm H₂0), aby uniknąć artefaktów perfuzji związanych z ciśnieniem i uszkodzenia LSEC, zwykle objawiającego się dużymi przerwami w błonie komórkowej. Jednak rozsądną fiksację można często uzyskać za pomocą perfuzji igłowej biopsji wątroby od ludzi i zwierząt, jak opisano szczegółowo w innym miejscu¹⁹. Technika ta polega na bezpośrednim wstrzykiwaniu utrwalacza do tkanki, aż krew zostanie wypłukana z próbki, a tkanka stanie się twarda i utrwalona. Utrwalenie próbek do mikroskopii elektronowej musi być wykonane tak szybko, jak to możliwe po ustaniu przepływu krwi, aby zapobiec zmianom ultrastrukturalnym zachodzącym w wyniku niezwykle szybkich procesów autolitycznych w wątrobie.

Prezentujemy również metodę analizy obrazu, która minimalizuje włączenie artefaktów i standaryzuje pomiar okien. Różnice w doborze sinusoid do mikrofotografii, analizie obrazu artefaktów oraz pomiarze powierzchni komórek pod kątem porowatości i częstotliwości fenestracji doprowadziły do poważnych rozbieżności w opublikowanych wynikach. Ustandaryzowane podejście do oceny i pomiaru okien oraz minimalne wymagania dotyczące prezentacji danych nie zostały jasno omówione w literaturze^4,10,20-31.

Protokół

UWAGA: Wszystkie procedury związane z wykorzystaniem zwierząt są przeprowadzane zgodnie z lokalnymi przepisami. Nasza praca jest zatwierdzona przez Komitet ds. Dobrostanu Zwierząt Lokalnego Okręgu Zdrowia w Sydney. Dozwolone procedury są opisane w dokumentacji licencyjnej projektu i są zgodne z wytycznymi, które zapewniają dobrostan zwierzęcia przez cały czas. Należy zapewnić przestrzeganie przepisów dotyczących doświadczeń na zwierzętach obowiązujących w kraju, w którym praca jest wykonywana.

1. Protokół przygotowania utrwalacza EM

1. Na 100 ml utrwalacza przygotować paraformaldehyd, dodając 2 g proszku paraformaldehydu do 25 ml wody destylowanej w kolbie stożkowej, podgrzać do 65 °C, ciągle mieszając mieszadłem magnetycznym.
   UWAGA: Aldehyd glutarowy, paraformaldehyd i bufor kakodylanu sodu są substancjami niebezpiecznymi i zawsze należy się z nimi obchodzić w oparach.
2. Podgrzewać w temperaturze 65 ºC przez 2 minuty, a następnie pozostawić do ostygnięcia. W razie potrzeby dodawać kroplami roztwór wodorotlenku sodu, mieszając do całkowitego uzyskania klarownego roztworu.
   UWAGA: wodorotlenek sodu jest niebezpieczny, należy obchodzić się z nim ostrożnie.
3. Dodać 10 ml bulionowego aldehydu glutarowego klasy EM, 50 ml 0,2 M buforu kakodylanu sodu i 2 g sacharozy i wymieszać mieszadłem magnetycznym. Dodać 2 ml 1,0 M CaCl₂.
4. Doprowadzić do pH 7,4 przed przygotowaniem roztworu do objętości 100 ml wodą destylowaną. Końcowy utrwalacz zawiera 2,5 % aldehydu glutarowego, 2 % paraformaldehydu, 2 mmol CaCl₂, 2 % sacharozy w 0,1 M buforze kakodylowym. Upewnij się, że całkowita osmolalność wynosi 440 mOsmol/L. Zużyć w ciągu 24 godzin od przygotowania.

2. Fiksacja perfuzyjna wątroby

1. Ciepły bufor perfuzyjny i utrwalacz do 35 - 37 ºC. Właściwa temperatura buforu do wykrwawiania i utrwalacza pomaga zapewnić integralność tkanek.
2. Znieczulić zwierzę pojedynczym wstrzyknięciem dootrzewnowym 50 mg/kg ketaminy i 5 mg/kg ksylazyny.
3. Gdy zwierzę znajduje się w głębokim znieczuleniu, ocenianym na podstawie wycofania kończyn tylnych i uszczypnięcia ogona, wykonuje się nacięcie w kształcie litery Y nożyczkami w brzuchu zwierzęcia, aby odsłonić wątrobę i żyłę wrotną.
   UWAGA: Upewnij się, że sprzęt jest czysty, aby uniknąć zanieczyszczenia próbek mikroorganizmami i ogólnymi zanieczyszczeniami, które będą łatwo widoczne na SEM.
4. Zawiąż dwa bardzo luźne szwy wokół żyły wrotnej, jeden proksymalnie do wątroby, drugi bardziej dystalnie do wątroby.
5. Kankaniuj żyłę wrotną za pomocą kaniuli dożylnej o odpowiedniej wielkości (18 G dla szczurów, 22 G dla myszy). Zaciśnij szwy, aby zabezpieczyć kaniulę.
6. Rozpocząć perfuzję roztworem soli fizjologicznej buforowanej fosforanem, ogrzanej do temperatury 37 °C i pod ciśnieniem 10 cm_H200. Do wykrwawienia wątroby zwykle potrzeba od 5 do 20 ml PBS.
   UWAGA: Nie pozwól, aby pęcherzyki powietrza dostały się do wątroby przez rurki podłączone do kaniuli, ponieważ indukują one artefakty wtórne do embolizacji i ciśnienia; Uszkodzenie hepatocytów, sinusoid i okien LSEC następuje, jeśli ciśnienie perfuzji jest zbyt wysokie.
7. Przeciąć żyłę główną jamy brzusznej i piersiowej, aby umożliwić swobodne wydostanie się buforu z wątroby. Zapobiega to uszkodzeniom LSEC spowodowanym wysokim ciśnieniem wstecznym.
8. Gdy wątroba jest wolna od krwi, zastąp PBS utrwalaczem EM i wykonuj perfuzję przez około 5 minut, aż wątroba stwardnieje i będzie bardzo blada.
9. Przerwij perfuzję i pokrój utrwaloną wątrobę na 1 - 2 mm³ bloki za pomocą ostrego skalpela.
10. Tkanka po utrwaleniu w utrwalaczu EM przez 24 - 72 godziny w temperaturze 4 ºC.
    UWAGA: Ogólnie rzecz biorąc, niedostateczna fiksacja powoduje więcej artefaktów niż nadmierna fiksacja.
11. Zmienić utrwalacz po okresie po utrwaleniu na 0,1 M bufor kakodylanu sodu do przechowywania w temperaturze 4 ºC.
    UWAGA: Próbki przechowywane w ten sposób będą przechowywane przez znaczny okres czasu (do 12 miesięcy), jednak w celu uzyskania najlepszych wyników zaleca się terminowe wtórne utrwalenie i badanie.

3. Perfuzja igły

UWAGA: Fiksacja igłą to wariant fiksacji perfuzyjnej, który polega na wstrzyknięciu utrwalacza bezpośrednio do tkanki wątroby poddanej biopsji. Celem jest, aby utrwalacz został przepłukany przez naczynia krwionośne w celu ich wykrwawienia i wystawienia całego bloku tkankowego na działanie utrwalacza. Należy zachować ostrożność, aby utrzymać niskie ciśnienie wstrzykiwania, aby uniknąć odleżyn^18,19.

1. Usuń mały kawałek wątroby od zwierzęcia lub osoby badanej i spłucz solą fizjologiczną, aby usunąć krew i zanieczyszczenia.
2. Narysuj zwykłą sól fizjologiczną do strzykawki wyposażonej w igłę o cienkiej grubości (zwykle strzykawkę insulinową).
3. Sól fizjologiczną należy wstrzykiwać bardzo powoli do wątroby, aż krew zostanie wypłukana z tkanki. Może być konieczne wykonanie kilku wstrzyknięć.
4. Pobrać utrwalacz EM do innej strzykawki wyposażonej w igłę o cienkiej grubości (zwykle strzykawkę insulinową).
5. Utrwalacz należy wstrzykiwać bardzo powoli do wątroby, aż stanie się twarda i brązowa. Może być konieczne wykonanie kilku wstrzyknięć.
6. Pokrój utrwaloną wątrobę na 1 - 2 mm³ bloki za pomocą ostrego skalpela. Inkubować w utrwalaczu EM przez 24 - 72 godziny w temperaturze 4 °C. Przemyć 3 razy w 0,1 M buforze kakodylanu sodu przed rozpoczęciem wtórnego utrwalania.

4. Przygotowanie do skaningowej mikroskopii elektronowej

1. Przemyć próbkę 3 razy w 0,1 M buforze kakodylanu sodu. Aby utrwalić lipidy, należy umieścić próbkę w 2% tetratlenku osmu w 0,1 M buforze kakodylanu sodu przez 2 godziny
   UWAGA: Całkowite mycie jest bardzo ważne, ponieważ aldehyd glutarowy i tetratlenek osmu reagują krzyżowo i generują artefakty na SEM.
2. Przepłukać próbki w rosnących stężeniach etanolu, aby rozpocząć odwadnianie. Najpierw płukać w 50 % etanolu przez 5 minut; następnie 3 razy przez 5 minut z 70% etanolem; spłukać 3 razy przez 5 minut 90% etanolem; płukać 2 razy przez 5 minut w 100 % etanolu; i na koniec płukać 2 razy przez 10 minut w 100% etanolu (sito molekularne).
3. Usunąć cały etanol z próbek i zastąpić go heksametylodylazanem (HMDS) w dymioracji i pozostawić na 10 minut. Usunąć HMDS z próbek tkanek i pozostawić do odparowania.
   UWAGA: HMDS jest wysoce higroskopijny, gdy jest zimny, dlatego przed użyciem do ostatniego etapu odwadniania należy pozostawić do osiągnięcia temperatury regulowanej.
4. Opcjonalnie należy natychmiast zamontować próbki lub umieścić je w eksykatorze do momentu, aż będą gotowe do zamontowania w SEM.

5. Montaż

UWAGA: Prawidłowe zamontowanie próbki zmaksymalizuje liczbę wyraźnie zaznaczonych sinusoid dostępnych do analizy w ramach SEM.

1. Oznacz podstawę metalowych króćców SEM i nałóż dwustronną przewodzącą taśmę węglową na górną część króćców.
2. Wizualizuj próbki za pomocą mikroskopu preparacyjnego, aby zidentyfikować powierzchnię z najlepszymi sinusoidami dla późniejszego SEM. Umieść tę powierzchnię w górę na powierzchni taśmy węglowej króćca.
3. Mocno przyklej próbki do kikuta, próbki są teraz gotowe do napylania.

6. Powłoka

UWAGA: Pokrycie próbki cienką warstwą przewodzącego metalu (złota lub platyny) w powlekarce napylającej uziemia próbkę i chroni ją przed uszkodzeniem przez wiązkę elektronów. Jeśli powłoka jest zbyt gruba, interesujące struktury mogą być zasłonięte.

1. Umieść klocki w komorze próżniowej automatycznej powlekarki do drobnego napylania, ustaw tryb obrotu i automatycznego napylania na 45 sekund. Użyj powłoki platynowej dla drobniejszych detali, jednak odpowiednie jest również złoto.
2. Nałożyć cienką warstwę farby węglowej na zewnętrzne powierzchnie zamontowanych próbek wątroby, uważając, aby nie pokryć powierzchni sinusoidalnych.
3. Po pokryciu próbek platyną i wyschnięciu farby węglowej są one gotowe do obserwacji na SEM. Próbki można przechowywać w eksykatorze.

7. Korzystanie ze skaningowego mikroskopu elektronowego

1. Umieść próbki w skaningowym mikroskopie elektronowym i zwróć mikroskop do próżni.
2. Wykorzystanie standardowych procedur operacyjnych mikroskopu do wizualizacji próbek poprzez rozpoczęcie od małego powiększenia, stopniowo zwiększając powiększenie.
3. Upewnij się, że mikroskop jest odpowiednio dostosowany do odległości roboczej, wielkości plamki i astygmatyzmu.
4. Sprawdź integralność fiksacji. Jeśli LSEC jest w większości wolny od szczelin i zawiera otwory o średnicy 30 - 250 nm, oznacza to, że przygotowanie próbki zakończyło się sukcesem.
5. Jeśli sinusoidy są pełne szczelin lub pozbawione okienek, oznacza to, że przygotowanie próbki nie powiodło się lub występuje znaczna patologia. W takim przypadku należy pokroić próbkę bardzo drobną żyletką, a powierzchnie cięcia ponownie pokryć i przeanalizować pod kątem pomyślnie utrwalonych sinusoid.
6. Przy powiększeniu około 15 000-20 000 × wybierz płaskie powierzchnie LSEC, które są wolne od zanieczyszczeń z dobrym mocowaniem i gdzie okienka są wyraźnie widoczne (zwykle zawierające co najmniej 10 okien).
7. Zapisz obrazy co najmniej 10 sinusoid na wątrobę, z różnych obszarów bloków, używając co najmniej dwóch bloków na wątrobę. Pobranie próbek 10 mikrofotografii w powiększeniu 15 000 - 20 000 × na zwierzę jest na ogół wystarczające, aby kwantyfikacja fenestracji była reprezentatywna dla całej wątroby.

8. Analiza

UWAGA: Oprogramowanie ImageJ, które można pobrać bezpłatnie z NIH, jest wykorzystywane do ilościowego określania średnicy i częstotliwości okien (www.imagej.nih.gov/ij).

1. Otwórz obraz J i ustaw skalę za pomocą paska skali osadzonego w obrazie (zrzut ekranu 1).
2. Korzystając z narzędzia wielokąta w ImageJ, obrysuj cały płaski obszar LSEC, w tym obszary z fenestracją i defenestracją. Nie śledź tylko płytek sitowych, ponieważ spowoduje to fałszywe nadmuchanie porowatości. Wyklucz wszelkie duże kawałki zanieczyszczeń, które znajdują się na powierzchni komórki, a które mogą zasłaniać okna.
3. Aby zmierzyć średnicę okienka, prześledź linię przez najdłuższą średnicę każdego okienka, wybierając narzędzie linii, i naciśnij "m", aby zmierzyć linię, i "d" (narysuj), aby trwale narysować linię na obrazie. Linia ta jest definiowana jako średnica okienka. Długość linii będzie teraz dostępna w polu wyników ImageJ (zrzut ekranu 2).
4. Zmierz wszystkie przerwy, które są większymi otworami w cytoplazmie LSEC powyżej 250 nm, a także fenestracje. Luki są często artefaktami odzwierciedlającymi słabą perfuzję lub fiksację, jednak luki mogą również wystąpić w wyniku choroby i toksyczności. Dane dotyczące luk zostaną wyłączone z obliczeń parametrów okien w dalszej części analizy.
5. Obszar przerw, które nie są okrągłe, należy obliczyć, śledząc wokół przerw i obliczając ich pole na obrazie ImageJ.
6. Wklej dane z pola wyników w ImageJ do arkusza kalkulacyjnego EXCEL w celu dalszej analizy.

9. Obliczenia

1. Średnia średnica okien = średnia wszystkich średnic okien (bez uwzględnienia szczelin, gdzie szczeliny wynoszą ≥ 250 nm).
2. Powierzchnia okien = πr², gdzie r, promień, oblicza się na podstawie średnicy poszczególnych okien (r = d / 2), bez uwzględnienia przerw.
3. Porowatość (%) = (Σ (πr²)/całkowita analizowana powierzchnia - Σ (powierzchnia przerw =)) (μm²)) × 100.
4. Częstotliwość okien = całkowita liczba okien/ (całkowita analizowana powierzchnia-Σ (powierzchnia szczelin) (μm²).

10. Prezentacja danych dotyczących stolarki

UWAGA: Jeśli to możliwe, publikacje zawierające kwantyfikację danych dotyczących fenestracji powinny zawierać następujące informacje

1. Średnica okien wraz z oświadczeniem potwierdzającym, jakie średnice graniczne zostały użyte do zdefiniowania okien (zwykle między 50 a 250 nm), częstotliwość fenestracji (liczba/μm²) i porowatość (%).
2. Do analizy należy dołączyć stwierdzenie potwierdzające, czy w analizie uwzględniono luki, wykres rozkładu częstości średnicy okien oraz liczbę wątrób, bloków, obrazów i okien
.

Wyniki

Wstępna wizualizacja przy małym powiększeniu za pomocą skaningowej mikroskopii elektronowej ujawnia płaską powierzchnię próbki wątroby z odsłoniętym obszarem wystarczająco dużym, aby zaobserwować wiele dużych naczyń wątrobowych i sinusoid (Rysunek 1A). Zapewnienie prawidłowego umieszczenia bloku wątroby na króćcu montażowym jest niezbędne do uzyskania wyraźnych obrazów sinusoid i z tego powodu należy unikać torebki Glissona wątroby (ryc. 1B). Zwiększenie powiększenia pozwala na dokładnie...

Dyskusja

Możliwość dokładnego i powtarzalnego pomiaru stanu śródbłonka sinusoidalnego wątroby jest ważnym krokiem w zrozumieniu biologii tych wysoce wyspecjalizowanych komórek. Nowsze techniki, takie jak mikroskopia oświetlenia strukturalnego³², mikroskopia sił atomowych³³ i d-STORM (bezpośrednia stochastyczna mikroskopia rekonstrukcyjna) ³⁴ dostarczą ważnych informacji dotyczących morfologii tych komórek in vitro , ale SEM pozostaje podstawową metodologią wizualizacji i pomiaru ich struk...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
25% aldehyd glutarowy klasy EM	ProSciTech	C001	Przechowywać zapasy w temperaturze -20 C do czasu, gdy będą potrzebne, unikać ponownego zamrażania
Proszek paraformaldehydu	Sigma Aldrich	158127	Zawsze przygotowuj Paraformaldehyd świeży
Kakodylan sodu	w proszku Sigma Aldrich	C0250	Przygotuj 0,2 M bulionu, pH 7,4, rozpuszczając proszek w dH2O, stosowany głównie w 0,1 M, przygotowując rozcieńczenie 1:2
Chlorek wapnia	Sigma Aldrich	C1016	Przygotuj 1 M CaCl2rozpuszczając proszek w dH2O
Tretroxide osmu	ProSciTech	C011	Przed użyciem umyj ampułki w słabym kwasie, aby uniknąć zanieczyszczenia. Przygotuj 2 % bulionu w szklanej butelce
Etanol - Absolute	Sigma Aldrich	459836	100% etanol musi być wysokiej jakości i przechowywany na sicie molekularnym
Inne gatunki etanolu	Labtech	EL5	Przygotuj stopniowane etanole z dH2O
Hexamethyldisilazane	Sigma	Aldrich 52619	Przed użyciem pozostawić do osiągnięcia temperatury pokojowej
Kaniule	Terumo	TSROX1832C, TSROX2225C, TSROX2419C	18 G jest odpowiednie dla większości szczurów, 22 G jest odpowiednie dla większości myszy, ale dobrze jest mieć kilka 24 G pod ręką w przypadku bardzo małych myszy
Przewodząca taśma węglowa	ProSciTech	IA0201
Farba węglowa	ProSciTech	I003
Ketamina			Musi być uzyskana na podstawie licencji
Ksylazyna			Musi być uzyskany na podstawie licencji
Sito molekularne	Sigma Aldrich	208647	Usuwa wodę ze 100% etanolu