Deprywacja tlenowo-glukozowa i reoksygenacja jako model uszkodzenia niedokrwienno-reperfuzyjnego in vitro do badania dysfunkcji bariery krew-mózg

Podsumowanie

Uraz niedokrwienno-reperfuzyjny (IR) wiąże się z wysokim wskaźnikiem zachorowalności i śmiertelności. Celem opisanego tutaj modelu deprywacji i reoksygenacji tlenu i glukozy (OGD-R) in vitro jest ocena wpływu uszkodzenia reperfuzyjnego niedokrwiennego na różne komórki, szczególnie w komórkach śródbłonka bariery krew-mózg (BBB).

Streszczenie

Uraz niedokrwienno-reperfuzyjny (IR) jest znany z tego, że znacząco przyczynia się do zachorowalności i śmiertelności związanej z udarami niedokrwiennymi. Incydenty niedokrwienne naczyń mózgowych stanowią 80% wszystkich udarów. Częstą przyczyną uszkodzenia w podczerwieni jest szybki napływ płynów po ostrym/przewlekłym okluzji krwi, składników odżywczych, tlenu do tkanki, powodując powstawanie wolnych rodników.

Udar niedokrwienny powoduje dysfunkcję bariery krew-mózg (BBB) i naczyniopochodny obrzęk mózgu. Strukturalnie ścisłe połączenia (TJ) między komórkami śródbłonka odgrywają ważną rolę w utrzymaniu integralności bariery krew-mózg (BBB). Uraz IR jest wczesnym urazem wtórnym prowadzącym do niespecyficznej odpowiedzi zapalnej. Stres oksydacyjny i metaboliczny następujący po zapaleniu powoduje wtórne uszkodzenie mózgu, w tym przepuszczalność BBB i zakłócenie integralności połączenia ścisłego (TJ).

Nasz protokół przedstawia przykład in vitro deprywacji i reoksygenacji tlenu i glukozy (OGD-R) na integralność komórek śródbłonka mózgu szczura TJ i tworzenie włókien stresowych. Obecnie do badania skutków uszkodzenia spowodowanego podczerwienią wykorzystuje się kilka eksperymentalnych modeli in vivo; Mają jednak kilka ograniczeń, takich jak wyzwania techniczne związane z wykonywaniem operacji, wpływy molekularne zależne od genów i trudności w badaniu zależności mechanistycznych. Jednak modele in vitro mogą pomóc w przezwyciężeniu wielu z tych ograniczeń. Przedstawiony protokół może być wykorzystany do badania różnych mechanizmów molekularnych i zależności mechanistycznych w celu zapewnienia potencjalnych strategii terapeutycznych. Jednak wyniki badań in vitro mogą różnić się od standardowych badań in vivo i należy je interpretować z ostrożnością.

Wprowadzenie

Uraz niedokrwienno-reperfuzyjny (IR) jest częstą przyczyną różnych wyniszczających powikłań i zgonów związanych z udarem, zawałem mięśnia sercowego, urazem, chorobą naczyń obwodowych i urazowym uszkodzeniem mózgu^1,2. Uszkodzenie IR w naczyniach mózgowych jest wczesnym wtórnym uszkodzeniem prowadzącym do stanu zapalnego i obrzęku³. Jednym z poważnych powikłań, do których dochodzi w wyniku stresu oksydacyjnego i metabolicznego po zapaleniu, jest utrata równowagi homeostatycznej prowadząca do powstawania wolnych rodników, zmian w barierze krew-mózg (BBB), ścisłych połączeniach (TJ) i przepuszczalności mikronaczyniowej^4,5.

Obecnie, modele in vivo używane do badania wpływu uszkodzenia IR na BBB obejmują niedrożność tętnicy środkowej mózgu (MCAO), mikroembolizm oraz zwierzęta transgeniczne lub nokautujące. Jednak każdy z nich ma swoje wady i ograniczenia, jak omówiono w Hossmann⁶. Model MCAO służy do badania skutków stresu redoks, zmian w komunikacji połączeniowej BBB oraz interakcji między mózgiem a komórkami odpornościowymi. Wiążą się one jednak z różnymi wyzwaniami technicznymi, takimi jak konieczność precyzyjnych procedur mikrochirurgicznych i związane z tym trudności. Mikrozatorowość natychmiast rozbija barierę krew-mózg, podczas gdy wykorzystanie zwierząt transgenicznych lub nokautujących do badania niedokrwienia mózgu może wiązać się z wyzwaniami, takimi jak zależne od genów wpływy molekularne na powstawanie zawału, zmiany w anatomii naczyniowej i zmienna masa ciała⁶. W związku z tym modele niedokrwienia in vitro cieszą się w ostatnim czasie rosnącym zainteresowaniem, głównie ze względu na ich przydatność w wykonywaniu badań mechanistycznych leków. Wyniki badań in vitro mogą jednak nie odzwierciedlać w pełni badań in vivo i należy je interpretować z ostrożnością⁶.

Przeciwaktywny wpływ niskich stężeń tlenu na monowarstwy komórek śródbłonka i przepuszczalność mikronaczyń krwionośnych został zbadany przez Ogawa⁷. Komórki mikronaczyniowe śródbłonka mózgu szczura (RBMEC) wykorzystano do opracowania BBB in vitro. Technika deprywacji i reoksygenacji tlenowo-glukozowej (OGD-R) przedstawiona w tym protokole została zaadaptowana z badań Zulueta i wsp. oraz Zhu i wsp. ^8,9. Wystawiliśmy komórki śródbłonka mózgu na działanie OGD-R, umieszczając je w komorze hipoksji/anoksji zawierającej 0% O₂, 5% CO₂ i 95% N₂. Komórki zostały później ocenione pod kątem zmian w integralności TJ i tworzeniu włókien stresowych przy użyciu odpowiednio lokalizacji immunofluorescencyjnej i znakowania falloidyny rodaminy. Barwienie immunofluorescencyjne dla zonula occludens-1 (ZO-1) przeprowadza się w celu określenia integralności TJ, ponieważ ZO-1 jest ważnym białkiem TJ związanym z błoną rusztowania. Znakowanie falloidyny rodaminy określa nitkowatą aktynę (f-aktynę) w cytoszkielecie komórki i jest wyraźnym wskazaniem tworzenia włókien stresowych aktyny w komórkach śródbłonka.

Celem tej metody jest dostarczenie wglądu w rozwój OGD-R jako modelu IR in vitro do badania integralności komórek śródbłonka BBB TJ i tworzenia włókien stresowych f-aktyny. Wyniki dostarczą informacji na temat losów białka TJ, ZO-1 i powstawania włókien stresowych po OGD-R. Zrozumienie tych zależności będzie okazją do określenia podstawowych mechanizmów molekularnych, które są wyzwalane po leczeniu OGD-R i opracowania potencjalnych strategii terapeutycznych w celu wzmocnienia zaburzenia bariery krew-mózg po leczeniu OGD-R.

Protokół

1. Wysiewanie komórek śródbłonka

1. Pozyskaj pierwotne kultury RBMEC od dorosłych szczurów Sprague Dawley (lub uzyskaj je komercyjnie).
2. Hoduj RBMEC na 100 cm pokrytych fibronektyną (50 μg/ml) szalkach Petriego, używając pożywki do wzrostu komórek śródbłonka mózgu szczura. Zmieniaj podłoże co dwa dni, aż do osiągnięcia zbiegu.
3. Po osiągnięciu 80-90% zbiegu delikatnie umyj komórki w 5 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS), mieszając. Komórki są następnie odłączane, wystawiając je na działanie 1 ml ciepłego 0,25% roztworu kwasu trypsyno-etylenodiaminotetraoctowego (EDTA), w równowadze do 37 °C.
4. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C przez 2-5 minut, aż komórki zostaną oderwane i rozproszone.
   UWAGA: Dotknij naczynia hodowlanego, aby odłączyć komórki. Zobacz komórki pod mikroskopem, aby potwierdzić całkowite oderwanie komórek od powierzchni naczynia.
5. Dodać 5 ml kompletnej pożywki na szalkę Petriego w celu zneutralizowania trypsyny. Odpipetować pożywkę zawierającą oderwane komórki i zebrać ją do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml. .
6. Odwirować pożywkę zawierającą komórki śródbłonka przy sile 220 x g przez 5 minut.
7. Odessać supernatant i zakonserwować komórki zawierające osad. Zawieś osad w 3-5 ml świeżej pożywki do wzrostu komórek śródbłonka mózgu szczura, delikatnie mieszając ją w górę iw dół za pomocą pipety Komórki zostaną następnie policzone za pomocą automatycznego licznika komórek lub hemocytometru.
8. Przenieś zawiesinę komórek do fibronektyny (50 μg / ml) wstępnie powlekanego 8-dołkowego sterylnego systemu szkiełek komorowych, 0,7 cm² / dołek o gęstości wysiewu w zakresie 10 000-15 000 komórek na dołek. Hodować komórki w temperaturze 37 °C, aż do osiągnięcia konfluencji
   UWAGA: W celu wykonania western blot lub innych eksperymentów komórki można hodować w 10-centymetrowych szalkach do hodowli komórkowych lub specjalnych szalkach, zgodnie z wymaganiami eksperymentu.

2. Model deprywacji tlenu i glukozy – reoksygenacja in vitro

UWAGA: Poniższy protokół został zaadaptowany z Zulueta et al. 1997; Zhu H i wsp. 2012^8,9.

1. Użyj systemu hodowli komórek hipoksji, aby zbadać wpływ OGD-R na RBMEC w (patrz rycina 1). Skonfiguruj i skalibruj system hodowli komórek hipoksji przed rozpoczęciem eksperymentu, zgodnie z instrukcjami producenta.
2. Wyjąć szkiełka z komorą zlewającą się (krok 1.8) z inkubatora w temperaturze 37 °C. Zastąp całe podłoże w szkiełku komory odtlenionym, niezawierającym glukozy, zmodyfikowanym podłożem Eagle's Medium (DMEM) firmy Dulbecco i umieść w komorze do hipoksji z 95%, N₂ i 5% CO₂ przez 2 godziny w temperaturze 37 °C, aby przedstawić stan OGD.
3. Przenieść komórki z powrotem do inkubatora z 95%_O2, 5% CO₂ w temperaturze 37 °C i zaopatrzyć w świeżą pożywkę z komórek śródbłonka mózgu szczura i inkubować przez kolejną 1 godzinę w temperaturze 37 °C.
   UWAGA: Ten krok reprezentuje sytuację ponownego natleniania.
4. Szkiełka z komory należy stosować do lokalizacji immunofluorescencji i znakowania falloidyny rodaminy (patrz punkt 3).

3. Immunofluorescencyjna lokalizacja znakowania ZO-1 i f-aktyny za pomocą faroidyny rodaminy

1. Szkiełka komory zawierające monowarstwy RBMEC należy wystawić na działanie 100 μl opti-MEM/zredukowanej pożywki surowicy/studzienki przez 1 godzinę. Przemyć szkiełka komory 3 razy w 100 μl soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS, pH 7,0-7,2).
2. Utrwalić komórki za pomocą 100 μl 4% paraformaldehydu w PBS (pH 7,0-7,2) przez 15 minut i umyć szkiełka komory jeszcze 3 razy w PBS (pH 7,0-7,2).
3. Przepuszczalność komórek za pomocą 100 μl 0,5% Triton X-100 w PBS (pH 7,0-7,2) przez kolejne 15 minut. Blok ze 100 μl 2% albuminy surowicy bydlęcej (BSA) w PBS przez godzinę. Po tym kroku albo wybarwić/oznaczyć komórki dla ZO-1, albo f-aktyny.
   1. W celu barwienia immunofluorescencyjnego inkubować komórki z pierwszorzędowym przeciwciałem anty-króliczym przeciwko ZO-1 w stosunku 1:150, przygotowanym w 2% BSA-PBS dla O/N w temperaturze 4 °C. Umyć komórki 3 razy w PBS (pH 7,0-7,2). Inkubować ze 100 μl drugorzędowego przeciwciała przeciw królikowi znakowanemu izotiocyjanianem fluoresceiny (FITC) przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
   2. W przypadku znakowania faroidyny rodaminy, po zablokowaniu, należy wystawić komórki na działanie 100 μl falloidyny rodaminy w rozcieńczeniu 1:50, przygotowanej w 2% BSA-PBS, przez 20 min.
   3. Umyj komórki z barwienia immunofluorescencyjnego i znakowania falloidyną rodaminy w PBS (pH 7,0-7,2). Zamontuj komory za pomocą mediów montażowych zawierających odczynnik zapobiegający blaknięciu z DAPI.
4. Wizualizuj komórki za pomocą soczewki zanurzeniowej 60 X, a komórki są skanowane w jednej płaszczyźnie optycznej pod mikroskopem konfokalnym.

Wyniki

Komórki hodowane na szkiełkach komorowych Nunc II powlekanych uprzednio fibronektyną poddano OGD-R poprzez umieszczenie ich w komorze Biospherix ProOx model 110. Po poddaniu komórek OGD-R przetworzono je w celu wybarwienia białka połączeń ZO-1 z wykorzystaniem techniki immunofluorescence, jak pokazano na Rysunku 2, oraz oceny organizacji cytoszkieletu wskazującej na tworzenie się włókien stresowych F-aktyny przy użyciu barwienia rodaminą falloidynową, jak pokazano na Rysunku 3. Komórki k...

Dyskusja

OGD-R jako model in vitro uszkodzenia niedokrwienno-reperfuzyjnego został dobrze przyjęty do badania neuronów^10,11. Istnieją również badania wykazujące wpływ OGD na komórki śródbłonka mózgu oraz zmiany w przepuszczalności i integralności TJ⁹. Jednak nasze badanie pokazuje wpływ OGD, a także reoksygenacji, która jest bliższą reprezentacją niedokrwiennego uszkodzenia reperfuzyjnego w warunkach in vivo , które występują po udarze niedokrwiennym.

Wiadomo, że...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Proox model 110	Biospherix	Model 110
DMEM, bez glukozy	Gibco, Life technologies	11966-025
Rhodamine Phalloidin	Life technologies	R415
ZO-1 Rabbit Polyclonal	Antibody Life technologies	617300
Nunc Lab Tek II-CC 8  dobrze sterylne, szkło  Slajdy	Termo scientific	177402
Przeciwciało wtórne przeciwko królikowi oznaczone FITC	Santa cruz	sc-2090
DPBS 1X	Thermo scientific	SH 30028.03	Można użyć dowolnego innego dostępnego PBS