Izolacja komórek mononuklearnych z ośrodkowego układu nerwowego szczurów z EAE

Podsumowanie

W tym filmie demonstrujemy, jak izolować komórki mononuklearne z ośrodkowego układu nerwowego szczurów z eksperymentalnym autoimmunologicznym zapaleniem mózgu i rdzenia kręgowego.

Streszczenie

Niezależnie od tego, czy bada się chorobę autoimmunologiczną skierowaną przeciwko ośrodkowemu układowi nerwowemu (OUN), taką jak eksperymentalne autoimmunologiczne zapalenie mózgu i rdzenia (EAE, 1), czy odpowiedź immunologiczną na infekcję OUN, taką jak poliomyelitis, neuroborelioza z Lyme lub neurosyfilis, często konieczne jest wyizolowanie naciekających OUN komórek odpornościowych.

W tym protokole wideo demonstrujemy, jak izolować komórki mononuklearne (MNCs) z ośrodkowego układu nerwowego (OUN) szczura z EAE. Pierwszy krok tej procedury wymaga perfuzji serca gryzonia roztworem soli fizjologicznej, aby upewnić się, że w naczyniach krwionośnych ukrwiających OUN nie pozostała krew. Jakiekolwiek zanieczyszczenie krwią sztucznie zwiększy liczbę pozornych MNCs infiltrujących OUN i może zmienić pozorny skład nacieku odpornościowego. Następnie pokazujemy, jak usunąć mózg i rdzeń kręgowy szczura w celu ich późniejszego rozdrobnienia w celu przygotowania zawiesiny pojedynczych komórek. Zawiesina ta jest rozdzielana na dwuwarstwowym gradiencie Percoll w celu izolacji MNCs. Po przemyciu komórki te są gotowe do przeprowadzenia dowolnej wymaganej procedury.

Komórki mononuklearne wyizolowane za pomocą tej procedury są żywotne i mogą być wykorzystane do elektrofizjologii, cytometrii przepływowej (FACS) lub biochemii. Jeśli technika ta jest przeprowadzana w warunkach sterylnych (przy użyciu sterylnych narzędzi w komorze do hodowli tkanek), komórki można również hodować w medium do hodowli tkanek. Daną populację komórek można dodatkowo oczyścić, stosując procedury separacji magnetycznej lub FACS.

Protokół

1. Głęboko znieczul szczury. Spryskaj 70% etanolem i przeprowadź perfuzję serca PBS przez 10 min w celu usunięcia komórek z naczyń krwionośnych (przetnij prawy przedsionek i wykonaj perfuzję przez lewą komorę).
2. Wyjmij mózg oraz rdzeń kręgowy i umieść je w probówce 50 ml zawierającej schłodzony PBS. Rozdrobnij mózg i rdzeń kręgowy w sitku komórkowym 70 mm umieszczonym w szalce Petriego 10 cm zawierającej 10 ml schłodzonego PBS. Przeciskaj każdy fragment organu przez sitko komórkowe, używając tłoka sterylnej strzykawki 1 ml. Zbierz zawiesinę pojedynczych komórek do probówki 50 ml na lodzie. Przepłucz sitko komórkowe PBS i dodaj płuczynkę do probówki, aż roztwór będzie klarowny.
3. Wiruj przez 8-10 min przy 390 g.
4. Resuspenduj komórki w 20 ml PBS + 30% Percoll i nałóż warstwą na 10 ml PBS + 70% Percoll.
5. Wiruj przy 390 g przez 20 min w temperaturze pokojowej.
6. Usuń warstwę tłuszczu z góry probówki. Zbierz komórki z interfejsu i przemyj je dwukrotnie PBS. Wykonaj pomiar liczby komórek.

Dyskusja

Niniejsza procedura, podobnie jak wszystkie procedury z udziałem żywych zwierząt, musi zostać zatwierdzona przez komisję ds. etyki i opieki nad zwierzętami w Twojej instytucji. Zalecamy, aby podczas przeprowadzania pierwszych perfuzji serca obecny był lekarz weterynarii lub technik weterynaryjny, aby zapewnić zwierzęciu odpowiedni poziom znieczulenia przed i w trakcie procedury oraz uniknąć niepotrzebnego bólu lub stresu zwierząt.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
PBS, 1x, sterylny	Odczynnik	GIBCO, by Life Technologies	14190-250
Sito do komórek, 70 um	Narzędzie	Fisher Scientific	08-771-2
Percoll	Odczynnik	Sigma-Aldrich	P1644