W tym filmie demonstrujemy, jak izolować komórki mononuklearne z ośrodkowego układu nerwowego szczurów z eksperymentalnym autoimmunologicznym zapaleniem mózgu i rdzenia kręgowego.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Izolacja komórek mononuklearnych z ośrodkowego układu nerwowego szczurów z EAE
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Niezależnie od tego, czy bada się chorobę autoimmunologiczną skierowaną przeciwko ośrodkowemu układowi nerwowemu (OUN), taką jak eksperymentalne autoimmunologiczne zapalenie mózgu i rdzenia (EAE, 1), czy odpowiedź immunologiczną na infekcję OUN, taką jak poliomyelitis, neuroborelioza z Lyme lub neurosyfilis, często konieczne jest wyizolowanie naciekających OUN komórek odpornościowych.
W tym protokole wideo demonstrujemy, jak izolować komórki mononuklearne (MNCs) z ośrodkowego układu nerwowego (OUN) szczura z EAE. Pierwszy krok tej procedury wymaga perfuzji serca gryzonia roztworem soli fizjologicznej, aby upewnić się, że w naczyniach krwionośnych ukrwiających OUN nie pozostała krew. Jakiekolwiek zanieczyszczenie krwią sztucznie zwiększy liczbę pozornych MNCs infiltrujących OUN i może zmienić pozorny skład nacieku odpornościowego. Następnie pokazujemy, jak usunąć mózg i rdzeń kręgowy szczura w celu ich późniejszego rozdrobnienia w celu przygotowania zawiesiny pojedynczych komórek. Zawiesina ta jest rozdzielana na dwuwarstwowym gradiencie Percoll w celu izolacji MNCs. Po przemyciu komórki te są gotowe do przeprowadzenia dowolnej wymaganej procedury.
Komórki mononuklearne wyizolowane za pomocą tej procedury są żywotne i mogą być wykorzystane do elektrofizjologii, cytometrii przepływowej (FACS) lub biochemii. Jeśli technika ta jest przeprowadzana w warunkach sterylnych (przy użyciu sterylnych narzędzi w komorze do hodowli tkanek), komórki można również hodować w medium do hodowli tkanek. Daną populację komórek można dodatkowo oczyścić, stosując procedury separacji magnetycznej lub FACS.
Protokół
- Głęboko znieczul szczury. Spryskaj 70% etanolem i przeprowadź perfuzję serca PBS przez 10 min w celu usunięcia komórek z naczyń krwionośnych (przetnij prawy przedsionek i wykonaj perfuzję przez lewą komorę).
- Wyjmij mózg oraz rdzeń kręgowy i umieść je w probówce 50 ml zawierającej schłodzony PBS. Rozdrobnij mózg i rdzeń kręgowy w sitku komórkowym 70 mm umieszczonym w szalce Petriego 10 cm zawierającej 10 ml schłodzonego PBS. Przeciskaj każdy fragment organu przez sitko komórkowe, używając tłoka sterylnej strzykawki 1 ml. Zbierz zawiesinę pojedynczych komórek do probówki 50 ml na lodzie. Przepłucz sitko komórkowe PBS i dodaj płuczynkę do probówki, aż roztwór będzie klarowny.
- Wiruj przez 8-10 min przy 390 g.
- Resuspenduj komórki w 20 ml PBS + 30% Percoll i nałóż warstwą na 10 ml PBS + 70% Percoll.
- Wiruj przy 390 g przez 20 min w temperaturze pokojowej.
- Usuń warstwę tłuszczu z góry probówki. Zbierz komórki z interfejsu i przemyj je dwukrotnie PBS. Wykonaj pomiar liczby komórek.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Niniejsza procedura, podobnie jak wszystkie procedury z udziałem żywych zwierząt, musi zostać zatwierdzona przez komisję ds. etyki i opieki nad zwierzętami w Twojej instytucji. Zalecamy, aby podczas przeprowadzania pierwszych perfuzji serca obecny był lekarz weterynarii lub technik weterynaryjny, aby zapewnić zwierzęciu odpowiedni poziom znieczulenia przed i w trakcie procedury oraz uniknąć niepotrzebnego bólu lub stresu zwierząt.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze | |
|---|---|---|---|---|
| PBS, 1x, sterylny | Odczynnik | GIBCO, by Life Technologies | 14190-250 | |
| Sito do komórek, 70 um | Narzędzie | Fisher Scientific | 08-771-2 | |
| Percoll | Odczynnik | Sigma-Aldrich | P1644 |
Bibliografia
- Beeton, C., Chandy, K. G. Induction and clinical scoring of chronic-relapsing experimental autoimmune encephalomyelitis. Journal of Visualized Experiments. 5, Forthcoming.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
