Obrazowanie źródła mózgu w przedklinicznych szczurzych modelach padaczki ogniskowej przy użyciu zapisów EEG o wysokiej rozdzielczości

Wykazano, że międzynapadowe wyładowania padaczkowe (IED) obserwowane w EEG stanowią użyteczne markery epileptogenezy u pacjentów z padaczką ogniskową³. Obszary wewnątrz mózgu, z których pochodzą te IED, zwane strefami drażniącymi, mogą być w praktyce zlokalizowane na podstawie zapisów EEG⁴. Modele przedkliniczne są niezbędne do znalezienia korelacji między tymi strefami drażniącymi a rzeczywistymi regionami leżącymi u podstaw inicjacji napadów. Jednak rejestrowanie EEG od małych zwierząt jest trudne ze względu na małą powierzchnię głowy w porównaniu z ludzką skórą głowy. Chociaż można stosować inwazyjne metody przewlekłego zapisu u szczurów^{5, 6}, obecnie nie są dostępne techniki pozyskiwania tradycyjnych zapisów EEG u gryzoni w ostrych warunkach bez konieczności znieczulenia.

Aby rozwiązać ten problem, stosujemy opatentowaną mini-nasadkę EEG², która pozwala nam rejestrować 32-kanałowe dane EEG od gryzoni w sposób nieinwazyjny. W tym badaniu przedstawiliśmy również dowody na potrzebę stosowania leku przeciwbólowego w celu zachowania częstości występowania IED. W związku z tym, mimo że utrwalenie mini-czapki EEG przeprowadzono pod wpływem izofluranu, zapisy EEG uzyskano u szczurów tylko w sedacji (dekdomitor)⁷. Metoda zaproponowana w tym badaniu może być stosowana w każdym przedklinicznym szczurzym modelu padaczki ogniskowej. Aby zilustrować możliwości tej metodologii, stosujemy ją do zrozumienia korelatów między strefami podrażnienia i napadów w ogniskowej dysplazji korowej (FCD). W tym celu używamy modelu "podwójnego trafienia" FCD⁸ u szczurów Wistar.

Aby przeprowadzić analizę źródła mózgu, wymagane jest: a) dokładne wyodrębnienie IED z surowych danych EEG oraz b) uzyskanie modelu przewodnika objętościowego dla głowy pojedynczego zwierzęcia. Aby wygenerować praktyczny model przewodnika objętościowego, używamy atlasu MRI szczurów in vivo, zawierającego średnie obrazy intensywności/kształtu i uzyskanego poprzez nieliniową rejestrację obrazów T2 31 szczurów Wistar⁹. Model do przodu dla wygenerowanego przewodnika objętościowego obliczono za pomocą metody elementów granicznych (BEM)¹⁰. Podobnie jak w przypadku ludzi, wykryto dwa typowe wzorce IED (ostre fale i kolce) i podzielono je na różne klastry dzięki inteligentnej ekstrakcji cech, selekcji cech i procesowi klasyfikacji¹¹. Te podklasyfikowane sygnały są wykorzystywane do oszacowania lokalizacji źródeł w mózgu związanych z różnymi typami stref drażniących. Przedstawiamy etapy analizy źródłowej przy użyciu dobrze znanego publicznego oprogramowania o nazwie Brainstorm¹². Lokalizacje źródła EEG dla każdego podtypu IED oraz ramy czasowe początku napadu zostały wykonane przy użyciu standaryzowanej tomografii elektromagnetycznej mózgu o niskiej rozdzielczości (sLORETA)¹³, która jest dostępna w Brainstorm.

Oświadczenie etyczne: Wszystkie eksperymenty są przeprowadzane zgodnie z zasadami ustalonymi przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) na Międzynarodowym Uniwersytecie Florydy (IACUC 13-004).

1. Zapisy EEG

1. Przygotowanie mini-czapki EEG
   1. Zanurz końcówki elektrod mini-nasadki EEG na co najmniej 12 godzin w wodzie destylowanej o zawartości 0.2% chlorku. Delikatnie opłucz mini-nasadkę EEG w wodzie destylowanej. Wysuszyć nasadkę i elektrody na powietrzu.
   2. Pastę elektrody EEG zmieszać z 0,9% roztworem NaCl w proporcji objętościowej 2 : 1. Dodaj kroplę błękitu metylenowego, który pomoże uwidocznić pastę elektrodową wewnątrz elektrod i na skórze. Weź zmieszaną pastę do strzykawki. Upewnij się, że w strzykawce nie ma pęcherzyków powietrza. Wstrzyknąć żel do każdej z 32 elektrod, wypełniając je bez wprowadzania pęcherzyków powietrza. Zaleca się wstrzykiwanie od dołu, a nie od góry. Zapewnia to lepszy dostęp do każdej elektrody i zmniejsza możliwość rozlania się żelu.
   3. Włącz system zapisu EEG i fizjologicznego, a następnie otwórz odpowiednie oprogramowanie do nagrywania na używanym komputerze.
2. Przygotowanie i znieczulenie zwierząt
   UWAGA: Padaczka przewlekła została stworzona przy użyciu protokołu FCD⁸ u szczurów Wistar. Zapis EEG przeprowadzono u dorosłych szczurów rasy Wistar (8 tygodni, 300 - 400 g).
   1. Zapisz wagę szczura w arkuszu doświadczenia. Na podstawie tych informacji można obliczyć dawkę leku uspokajającego (dexdomitor 0,25 mg/kg). Wywołać znieczulenie u szczura za pomocą 5% izofluranu i 100% tlenu (1 l/min przy 14,7 psi).
   2. Po przycięciu głowy szczura zmniejsz poziom izofluranu do 2% i utrzymuj go przez cały czas zakładania mini-czapki EEG. Sprawdź, czy odruchy szczura są nieobecne (szczypanie palców u stóp). Umieść szczura na poduszce grzewczej w aparacie stereotaktycznym, mocując kanały słuchowe za pomocą pasków nausznych. Upewnij się, że stożek nosowy anestezjologiczny jest bezpieczny.
   3. Nałóż smarującą maść okulistyczną na każde oko.
   4. Ogol dodatkowe włosy na głowie i uszach szczura za pomocą maszynki do golenia. Unikaj krwawienia podczas golenia.
      UWAGA: Wszelkie włosy pozostawione na skórze będą powodować szumy w zapisach EEG. Natrzyj skórę szczura 90% alkoholem izopropylowym, aby pobudzić naczynia krwionośne i odtłuścić skórę.
   5. Umieść wacik z soli fizjologicznej na skórze głowy i przykryj go całkowicie, aby utrzymać dobre przewodzenie skóry, dopóki mini-nasadka EEG nie będzie gotowa do umieszczenia.
   6. Podłącz sondy temperatury, oddychania i trzy odprowadzenia elektrokardiogramu. Należy pamiętać, że temperatura jest mierzona za pomocą sondy doodbytniczej. Stale monitoruj fizjologię szczura podczas procedur rejestrowania. Upewnij się, że normalna temperatura wynosi 37 °C, zakres oddychania wynosi 30 - 60 oddechów na minutę, a tętno wynosi około 350 - 450 uderzeń na minutę .
3. Procedury nagrywania
   1. Usuń wacik z soli fizjologicznej ze skóry głowy szczura i umieść przygotowany mini-czepek EEG na jego skórze. Przymocuj mini-nasadkę za pomocą gumek. Umieść jedną gumkę z przodu skóry głowy, zwykle przed oczami, a drugą opaskę z tyłu skóry głowy między uszami a szyją. Użyj plastikowej osłony pod szyją, aby ułatwić normalne oddychanie.
   2. Nałóż warstwę pasty elektrodowej o wysokiej przewodności zarówno na elektrody uziemiające, jak i referencyjne. Umieść je na odpowiednim uchu.
      UWAGA: Elektrodę referencyjną można ewentualnie umieścić w innych miejscach.
   3. Podłącz mini-nasadkę EEG do amplifiers i obserwuj podgląd stołu warsztatowego pod kątem impedancji elektrody. Sprawdź działanie wszystkich elektrod. Aby uzyskać wysoką jakość nagrania, upewnij się, że wartość impedancji mieści się w zakresie 5 - 30 kΩ. Jeśli są jakieś hałaśliwe elektrody, zapewnij lepszy kontakt ze skórą głowy, przesuwając je wewnątrz rusztowania w kierunku skóry głowy lub delikatnie wstrzykując więcej żelu z górnej części elektrody.
   4. Leks dexdomitor (0,25 mg/kg) należy podawać dootrzewnowo i natychmiast zmniejszyć dawkę izofluranu do 0%. Jeśli częstość oddechów nie mieści się w zakresie 30 - 60 oddechów na minutę, zacznij delikatnie zwiększać częstość oddechów izofluranu. Nie należy przekraczać wartości 1% izofluranu. Należy uważnie monitorować ten krok, ponieważ mieszanina izofluranu i deksadomitoru może doprowadzić zwierzęta do stanu krytycznego.
      UWAGA: W przedklinicznym modelu padaczki ogniskowej izofluran wpływa na IED, podczas gdy deksadomitor nie. Pacjenci poddani izofluranowi mają słabsze właściwości padaczkowe, tj. można wykryć stosunkowo mniej IED w porównaniu z innymi schorzeniami^7,14. Dawka leku dexdomitor jest skuteczna przez około 2 godziny. Tak więc, aby zaoszczędzić czas na jego działanie, preparat przeprowadzono pod izofluranem.
   5. Przeprowadzaj zapisy EEG. Po nagraniu zaznacz pozycje trzech wystających okręgów mini-czepka EEG na wierzchu skóry, wkładając do nich kolorowy pisak przed zdjęciem mini-nasadki EEG. Użyj ich jako punktów orientacyjnych do wspólnej rejestracji MRI. Zrób zdjęcie głowy szczura z punktami orientacyjnymi. Umieść szczura z powrotem w klatce i monitoruj go aż do całkowitego wyzdrowienia po działaniu dexdomitor.
      UWAGA: W tym eksperymencie użyto koloru czerwonego (kolor przeciwstawny do zielonego) do odróżnienia od pozycji elektrod (zielony). Zaleca się jednak stosowanie innych kolorów (fioletowy/zielony), jeśli na skórze obserwuje się małe krwawiące plamki.

Rysunek 1. Zdjęcie mini-czepka EEG umieszczonego na konkretnym szczurze.

Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

2. Obrazowanie źródła mózgu

1. Klasyfikacja IED
   UWAGA: Wykrywanie i klasyfikacja IED odbywa się przy użyciu samodzielnie opracowanych kodów w MATLAB na podstawie poprzedniego badania¹⁵. To oprogramowanie będzie dostępne na żądanie.
   1. Pozbądź się hałaśliwych kanałów, dokonując wizualnej kontroli znaczników EEG. Usuń artefakty EKG za pomocą automatycznej metody okresowego odejmowania przebiegów, która opiera się na szablonie i analizie korelacji.
      UWAGA: Zazwyczaj eksperymentator, który zarejestrował EEG, udostępnia pisemny arkusz eksperymentalny dla zaobserwowanych informacji o uszkodzonym kanale w oparciu o wartości impedancji. Oprogramowanie do usuwania artefaktów EKG będzie również dostępne na żądanie.
      
      Rysunek 2. Przykład zapisu EEG pokazującego różne rodzaje IED. Czerwone pole oznacza jeden typ urządzeń IED.
      Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.
       
   2. Zastosuj filtr pasmowo-przepustowy z częstotliwościami odcięcia od 3 do 150 Hz i filtrem wycinającym, aby usunąć komponent częstotliwości linii (ogólnie 60 Hz i 50 Hz w niektórych krajach) w trybie offline.
   3. Wykrywanie dwóch rodzajów improwizowanych ładunków wybuchowych (kolce i fale ostre). Skoki i fale ostre to duże zdarzenia elektryczne trwające odpowiednio 20 - 70 ms i 70 - 200 ms. W związku z tym, po zastosowaniu odpowiedniego filtra pasmowo-przepustowego (częstotliwości odcięcia 15 - 50 Hz dla skoków i 5 - 15 Hz dla fal ostrych), IED są wykrywane na podstawie progów amplitudy¹⁵,
      UWAGA: Progi są automatycznie ustawiane na 4σ, jak sugerowano w poprzednim badaniu dla aktywności wielojednostkowej¹⁵. Tutaj σ jest szacowanym odchyleniem standardowym sygnału filtrowanego pasmowo-przepustowego, σ = mediana{|przefiltrowany sygnał| ⁄ 0,6745}.
   4. Klasyfikuj skoki i fale ostre w różne klastry. Charakterystyczne cechy różnych skoków i ostrych fal są wyodrębniane za pomocą transformaty falkowej¹⁵. Są one podzielone na wiele klastrów przy użyciu k-średnich, a optymalna liczba klastra k jest określana za pomocą sylwetki.
   5. Uśrednić podklasyfikowane sygnały w tym samym klastrze. Średnie sygnały EEG dla każdego podtypu IED zostaną wykorzystane do analizy źródła mózgu.
2. Model przewodu objętościowego
   UWAGA: W poniższych sekcjach oprogramowanie open source, Brainstorm¹², będzie używane z atlasem MRI dla szczurów Wistar⁹. Jednak rezonans magnetyczny pojedynczego szczura może być również wykorzystany do wygenerowania modelu przewodnika objętościowego, jeśli jest dostępny. Atlas^{MRI 9} można pobrać ze strony http://www.idac.tohoku.ac.jp/bir/en/. Ta strona internetowa udostępnia atlas w formacie NIFTI w sekcji "Wistar Rat MRI Atlas" i może być dostępny po rejestracji. Oprogramowanie potrzebne do wstępnego przetwarzania można również znaleźć na tej stronie internetowej.
   1. Wprowadź MRI i powierzchnię mózgu do oprogramowania¹².
      
      Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.
   2. Generuj powierzchnię głowicy z ustawieniem domyślnym.
      
      Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.
   3. Generuj skórę głowy i wewnętrzne/zewnętrzne powierzchnie czaszki na podstawie MRI do obliczeń pola ołowiu¹².
      UWAGA: Rozdzielczość wierzchołków wpływa na dokładność szacowanego źródła, ale duża liczba wierzchołków powoduje wysoką złożoność obliczeniową. Zalecana liczba wierzchołków każdej warstwy wynosi 642, co zapewnia akceptowalną dokładność przy odpowiedniej złożoności obliczeniowej. Grubość czaszki można sprawdzić na podstawie rezonansu magnetycznego, a w przypadku atlasu rezonansu magnetycznego wynosi ona około 1 mm. Po wstawieniu powyższych wartości do oprogramowania zostaną utworzone odpowiednie siatki trójkątne ściana-wierzchołek dla każdej powierzchni.
      
      Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.
   4. Sprawdź orientację i położenie każdej powierzchni w stosunku do rezonansu magnetycznego za pomocą opcji wizualizacji. Zmodyfikuj odpowiednio, jeśli jakiekolwiek powierzchnie nie są współzarejestrowane¹².
      
      Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.
   5. Korzystając ze zdjęcia głowy szczura uzyskanego w 1.3.5, zarejestruj pozycje 3 punktów orientacyjnych (R1, R2 i R3) w MRI. Użyj punktów siatki punktów orientacyjnych jako odniesień, aby wygenerować pozycje elektrod, gdy elektrody są zamocowane na rusztowaniu (Rysunek 3B).
      
      Rysunek 3. (A) zdjęcie głowy szczura używane do uzyskania pozycji elektrod oraz (b) diagram mini-czapek EEG z układem współrzędnych. Czerwone kropki w (A) oznaczają punkty orientacyjne wymienione w ppkt 1.3.5. które odpowiadają czerwonym liczbom w (B). Ponadto zielone znaki w (A) przedstawiają 32 pozycje elektrod i odpowiadają niebieskim liczbom w (B).
      Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.
       
   6. Wygeneruj matrycę położenia elektrod N × 3 na podstawie 3 punktów orientacyjnych. Tutaj N to liczba kanałów (N = 32), a kolumna reprezentuje odpowiednie wartości współrzędnych x, y i z.
      UWAGA: Mini-czepek EEG to sztywne rusztowanie. Dlatego po uzyskaniu 3 siatek odniesienia (R1, R2 i R3) położenie elektrod jest ustawiane automatycznie. Użytkownik będzie musiał tylko przedefiniować wartości Z w taki sposób, aby mini-cap był odpowiednio rzutowany na skórę głowy. Siatki punktów N można numerować sekwencyjnie, jak pokazano na rysunku 3B niebieskie liczby. Standardowe rusztowanie do mini-czepka EEG jest dostępne na rynku (tabela materiałów). Oprogramowanie do wspólnej rejestracji jest również dostępne dla społeczności.
   7. Wprowadź wygenerowany plik kanału.
      
      Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.
   8. Wyświetl i potwierdź położenie wszystkich elektrod. Zmodyfikuj wszelkie zagubione elektrody¹². Ostateczny układ współrzędnych dla pozycji elektrod powinien pokrywać się z układem współrzędnych używanym dla wyżej wymienionych powierzchni.
      UWAGA: Utworzone powierzchnie można wizualnie sprawdzić za pomocą opcji wizualizacji "Rejestracja MRI\Sprawdź MRI/rejestrację powierzchni". Następnie wybrana powierzchnia zostanie wyświetlona jako żółta linia na MRI. Ponadto 3 punkty orientacyjne i 32 pozycje elektrod można wyświetlić w rezonansie magnetycznym, wybierając opcję zestawu narzędzi "Wyświetl czujniki\Przeglądarka MRI". Lokalizacje można sprawdzić wizualnie, porównując rozkłady na podstawie lokalizacji oka i ucha szczura (ryc. 4).
      
      Rysunek 4. (A) atlas MRI z współzarejestrowaną powierzchnią mózgu (żółta linia), (B) utworzony model przewodnika objętościowego z wyrównanymi 32 elektrodami i 3 punktami orientacyjnymi (czerwone kropki), oraz (C) atlas MRI ze współzarejestrowaną siatką odniesienia R1.
      Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.
3. Obrazowanie źródła mózgu
   1. Oblicz macierz pola ołowiu¹³. Wprowadź wartości przewodności, które spełniają stosunek skóry, czaszki i mózgu, jako 1 : 1/80 : 1. Uzyskać matrycę pola ołowiu na podstawie modelu przewodnika objętościowego i pozycji elektrod utworzonych w 2.2.
      UWAGA: Toolbox¹² oferuje interfejs z innym oprogramowaniem do obliczania BEM¹⁰. W związku z tym jako dane wejściowe wymagane są tylko wartości przewodności.
      
      Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.
   2. Wprowadź średnie sygnały EEG dla każdego podtypu IED przechowywanego w 2.1.4.
      
      Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.
   3. Otrzymać roztwór sLORETA¹³ na podstawie obliczonej matrycy pola ołowiu i wejściowych sygnałów EEG. Wybierając opcję metody estymacji źródła, można uzyskać rozwiązanie odwrotne¹²,
      
      Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.
   4. Wykreśl szacowane źródła.

Gdy wszystkie procedury zostaną poprawnie zakończone, szacunkowe źródła mogą być wizualizowane na powierzchni mózgu modelu przedklinicznego. Rysunek 5 przedstawia szacunkowe źródła z jednego konkretnego podtypu skoków (na górze) i ostrych fal (na dole) z IED. Ponadto na rysunku 6 pokazano, w jaki sposób zmienia się rozkład źródła w sekwencyjnych ramach czasowych podczas zakładu napadu. Wyniki te potwierdzają zdolność proponowanych metodologii do rejestrowania EEG o wysokiej rozdzielczości u szczurów z padaczką ogniskową oraz do przeprowadzania analizy źródłowej przy użyciu zarejestrowanego EEG.

Rysunek 5. Szacowane lokalizacje źródeł IED w mózgu w odniesieniu do różnych skupisk w kolcach (na górze) i na falach ostrych (na dole). (A) szeregi czasowe, (B) topografia EEG i (C) źródła prądów korowych. Ocena jest wykonywana w określonym czasie oznaczonym czerwoną pionową linią w (A).
Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 6. Szacowane źródła mózgu podczas napadu. Momenty czasu są oznaczone czerwonymi pionowymi liniami.
Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Nie stwierdzono konfliktu interesów.