Test labiryntu wodnego Morrisa: optymalizacja pod kątem obciążenia myszy i środowiska testowego

Summary

Ten manuskrypt opisuje protokół Morrisa wodnego labiryntu (MWM) dostosowany do użycia z powszechnie używanym mysim modelem choroby Alzheimera. MWM jest szeroko stosowany w transgenicznych modelach myszy. Implementacja procedury wrażliwej na odkształcenie tła modelu myszy jest niezbędna do wykrywania różnic grupowych.

Abstract

Labirynt wodny Morrisa (MWM) jest powszechnie używanym zadaniem do oceny zależnego od hipokampa uczenia się przestrzennego i pamięci w transgenicznych mysich modelach chorób, w tym zaburzeń neurokognitywnych, takich jak choroba Alzheimera. Jednak szczep tła zastosowanego modelu myszy może mieć znaczący wpływ na obserwowany fenotyp behawioralny, przy czym niektóre szczepy wykazują lepszą zdolność uczenia się w porównaniu z innymi. Aby zapewnić wykrywanie różnic między myszami transgenicznie ujemnymi i transgenicznie dodatnimi, niezbędna jest identyfikacja procedury treningowej wrażliwej na szczep tła. Niedostosowanie protokołu MWM do obciążenia tła modelu myszy może prowadzić do niedostatecznego lub nadmiernego trenowania, maskując w ten sposób różnice grupowe w próbach sondowych. W tym miejscu opisano protokół MWM dostosowany do użytku z tłem F1 FVB/N x 129S6. Jest to często używany szczep tła do badania zależnego od wieku wpływu zmutowanego P301L tau (rTg(TauP301L)4510 myszy) na deficyty pamięci związane z chorobą Alzheimera. Opisana jest również strategia ponownej optymalizacji, podyktowana przez konkretne wykorzystywane środowisko testowe.

Introduction

Transgeniczne modele myszy odegrały kluczową rolę w ocenie patofizjologii choroby Alzheimera (AD), jak również potencjału interwencji terapeutycznych. Zadania poznawcze, takie jak labirynt wodny Morrisa (MWM), są powszechnie stosowane w tych modelach do identyfikacji molekularnych korelatów deficytów pamięci i oceny skuteczności leków przedklinicznych. Kluczowe jest jednak, aby zakres dynamiczny zadania poznawczego był na tyle szeroki, aby można było dostrzec subtelne efekty leczenia. W mysich modelach AD deficyty poznawcze są zazwyczaj zależne od wieku, a myszy wykazują postępujące spadki wydajności (np. ¹). Wykorzystanie wrażliwego zadania poznawczego może pozwolić na wykrycie subtelnych różnic na wcześniejszym etapie życia zwierzęcia, zmniejszając w ten sposób koszty związane ze starzeniem się zwierząt. Na przykład zmniejszenie liczby prób treningowych w labiryncie Barnesa zależnym od hipokampa z 15 do 5 zwiększyło trudność zadania, co skutkowało wykryciem deficytów w modelu 3xTg w młodszym wieku niż wcześniej ^zgłaszano2. Wcześniejsze wykrycie deficytów nie tylko zapewnia znaczną oszczędność czasu i kosztów, ale także zwiększa prawdopodobieństwo zidentyfikowania zmian molekularnych leżących u podstaw deficytów poznawczych.

Jednym z czynników wpływających na czułość zadań poznawczych jest genetyczny szczep tła modelu mysiego. Na przykład myszy BALB/c wykazują lepszą wydajność w zadaniach uczenia się i zapamiętywania w porównaniu z innymi szczepami, takimi jak C57BL/6 ³. Tło F1 FVB/N x 129S6 jest używane w dwóch najczęściej stosowanych modelach AD, modelach Tg2576 i rTg(TauP301L)4510. Szczep ten wykazuje lepszą zdolność uczenia się w MWM w porównaniu z innymi szczepami, w tym myszami B6 / SJL ⁴. Ze względu na tę doskonałą zdolność uczenia się, użycie pojedynczej sondy po intensywnym szkoleniu może maskować różnice grupowe wynikające z nadmiernego trenowania. Ponadto czułość prób sondowych może być zależna od wieku. Wcześniej wykazaliśmy, że wcześniejsze próby sondowe, po ograniczonym treningu z ukrytą platformą, są bardziej wrażliwe na różnice w młodych Tg2576 w porównaniu z młodymi transgenicznymi przedstawicielami miotu niż są próbami sondowymi wprowadzonymi po bardziej intensywnym treningu ⁵. W przeciwieństwie do tego, próby sondy po intensywnym treningu są bardziej czułe u starszych (20-25 miesięcy) myszy Tg2576 w porównaniu ze starszymi rodzeństwem z miotu niż we wcześniejszych próbach sondowych ⁵. Dzięki przeplataniu prób z użyciem sondy w trakcie szkolenia, zwiększa się prawdopodobieństwo, że zostanie zidentyfikowana czuła próba, szczególnie jeśli przeprowadzane są testy podłużne, a czułość danej próby sondy zależy od wieku. Rysunek 1 przedstawia lepszą wydajność myszy F1 FVB/N x 129S6 w ramach protokołu zoptymalizowanego dla tego szczepu w porównaniu z myszami o tle B6/SJL trenowanymi zgodnie z protokołem z bardziej intensywnym treningiem.

Ogólnie uważa się, że MWM dostarcza wiarygodnych pomiarów, które są powtarzalne zarówno w czasie, jak i w laboratoriach ⁶. Na przykład podstawowy protokół pierwotnie używany przez nasze laboratorium ^1,7 w Minnesocie został pomyślnie wdrożony z niewielkimi modyfikacjami na Uniwersytecie ^{Zachodniej Wirginii 8}. Podobnie, równoważne poziomy upośledzenia zaobserwowano u myszy rTg(TauP301L)4510 w porównaniu z kontrolnymi rodzeństwem z miotu, jeśli były trzymane w warunkach wolnych od patogenów lub konwencjonalnych ⁹. Jednak środowisko testowe może mieć wpływ na czułość zadania MWM. Czynniki takie jak oświetlenie pomieszczenia, otwory wentylacyjne, gradienty temperatury i hałasy przyczyniają się do sygnałów środowiskowych ⁴, które ostatecznie mogą wpływać na wydajność. Kiedy nasze laboratorium i wiwarium w Minnesocie zostały przeniesione do nowego budynku, zaobserwowano do 38% zmniejszenie wydajności typu dzikiego, co znacznie zmniejszyło zakres dynamiki zadania i zdolność do wykrywania deficytów związanych z transgenami. Ta zmiana w wydajności nastąpiła pomimo zaprojektowania pomieszczenia testowego tak, aby miało równoważną wielkość i konfigurację oraz przy użyciu tych samych zastosowanych wskazówek wizualnych. "Ponowna optymalizacja" oryginalnego protokołu była konieczna, aby zwiększyć zakres dynamiczny zadania MWM w nowym środowisku testowym.

Tutaj opisany jest oryginalny protokół dostosowany do użycia z F1 FVB/N x 129S6 background ⁵. Ponieważ niektóre badania sugerują, że stres jest związany ze słabą wydajnością MWM ¹⁰, a wstępna obsługa może złagodzić ten wywołany stresem deficyt wydajności ¹¹, opracowano protokół wstępnej obsługi, aby przyzwyczaić myszy do wprowadzenia i usunięcia puli przed testami MWM. Po wstępnym użyciu myszy przechodzą widoczny trening platformy, w którym podniesiona platforma jest oznaczona flagą. Trening z widoczną platformą służy do identyfikacji myszy z problemami z wydajnością związanymi z nieprawidłowościami sensomotorycznymi. Korzystając z kryteriów wykluczenia opisanych w sekcji protokołu, myszy niekompetentne do działania są usuwane z kolejnych badań treningu z ukrytą platformą i prób sondowych. Upośledzenia w treningu z ukrytą platformą i próbach sondowych są interpretowane jako deficyty poznawcze, ponieważ wydajność sensomotoryczna jest uwzględniana w danych. Po zakończeniu treningu widocznej platformy, myszy rozpoczynają trening ukrytej platformy, w której platforma jest zanurzona w wodzie i pozostaje w tej samej pozycji względem zewnętrznych wskazówek. Próby, w których platforma jest usuwana (próby sondy) są przeplatane przez szkolenie z ukrytej platformy, aby ocenić wpływ dodatkowego szkolenia. Ze względu na to, że próby z użyciem sondy odbywają się na początku każdego dnia, przed dodatkowym szkoleniem z ukrytej platformy, próby sondy mierzą zdolność zwierzęcia do zapamiętania lokalizacji platformy po 20-godzinnym opóźnieniu, co jest uważane za miarę pamięci referencyjnej ¹². Na koniec opisano sposoby, w jakie ten oryginalny protokół został ponownie zoptymalizowany, gdy zmiany w środowisku testowym zakłóciły wydajność sterowania.

Protocol

Wszystkie procedury eksperymentalne zostały przeprowadzone zgodnie ze standardami Instytucjonalnego Komitetu ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) i zatwierdzone przez IACUC Uniwersytetu Zachodniej Wirginii.

1. Obsługa wstępna

1. Konfigurowanie puli
   1. Podeprzyj basen do obsługi wstępnej tak, aby został podniesiony na wygodną wysokość.
   2. Umieścić 2 l wody (21 °C) w basenie do poziomu około 1 cm.
      Uwaga: Nie dodawaj kolorowania.
2. procedura
   1. Przynieś myszy z wiwarium do pomieszczenia testowego.
   2. Sprawdź tożsamość podmiotu (numer podmiotu, tatuaż na ogonie, klips na ucho itp.).
   3. Oznacz ogon myszy trwałym markerem, aby odróżnić myszy w klatce, które przeszły testy przed obchodzeniem się z nimi, od tych, które pozostały do przetestowania. Zaznacz wszystkie myszy w jednej klatce tym samym kolorem.
   4. Umieścić mysz w zlewce transferowej na około 5 sekund. Następnie delikatnie wylej mysz ze zlewki do basenu do obsługi wstępnej.
   5. Korzystając z timera, pozwól myszy pozostać w basenie przez 20 sekund.
   6. Po 20 sekundach delikatnie umieść miarkę (bez pochylania jej) przed myszką. Na chwilę pozwól myszy zbadać miarkę, a jeśli to konieczne, zachęć ją do wejścia na miarkę, delikatnie wsuwając miarkę pod mysz, powoli podnosząc. Uważaj, aby nie przestraszyć myszy miarką.
   7. Gdy mysz znajdzie się w szufelce, przenieś ją z powrotem do klatki trzymającej.
   8. Powtarzaj te procedury dla każdej myszy w klatce raz dziennie przez 10 dni. W regularnych odstępach czasu (np. po każdym zwierzęciu) zbieraj kał i ściółkę z basenu za pomocą siatki.
   9. Zlewkę do przenoszenia płukać wodą w regularnych odstępach czasu (np. po zakończeniu budowy klatki dla myszy).
   10. Po wykonaniu tych czynności kilkakrotnie przepłukać zlewkę transferową wodą, wylać wodę z basenu i spłukać basen około dwa razy wodą.

2. Szkolenie z widocznej platformy

1. Skonfiguruj oprogramowanie do śledzenia wydajności myszy, np. przeglądarkę (patrz tabela materiałów).
   1. Skalibruj wideo, aby dopasować je do wymiarów labiryntu w zakładce "Konfiguracja" – "Filtry i obiekty".
   2. Ustaw filtry, aby oprogramowanie mogło odróżnić mysz od tła.
      1. Dostosuj "czułość" poniżej obszaru "Filtr tła" tak, aby oprogramowanie śledzące identyfikowało zwierzę.
      2. Kliknij opcję "akceptuj", gdy oprogramowanie śledzące zidentyfikuje zwierzę. Wybierz opcję "edytuj", aby zaciemnić obszary poza obszarem labiryntu.
      3. Wybierz odpowiedni "filtr zwierząt" i "min. rozmiar zwierzęcia".
2. Tworzenie arkuszy przebiegu
   1. Utwórz arkusz uruchamiania z listą każdej myszy, każdej potencjalnej lokalizacji oraz miejscem na notatki zawierające informacje o nieprawidłowym zachowaniu.
   2. Z góry określ lokalizacje testu widocznej platformy, które są takie same dla każdej grupy myszy. Tak więc, w przypadku pierwszej próby, ustal, że platforma zostanie umieszczona po stronie przeciwnej do miejsca, w którym mysz jest umieszczona w labiryncie, po prawej stronie blisko ściany. W przypadku drugiej próby należy wstępnie ustalić, że platforma zostanie umieszczona w innym miejscu wzdłuż tylnej ściany dla każdej myszy i że będzie to kontynuowane dla każdej z 6 prób.
3. Przygotuj pokój
   1. Zawieś zasłony w całym pomieszczeniu, aby wszelkie wskazówki przestrzenne były zasłonięte.
4. Ustaw wannę.
   1. Umieść wannę tak, aby pasowała do konfiguracji w oprogramowaniu śledzącym, upewniając się, że labirynt jest zgodny z konfiguracją w zakładce "Konfiguracja" – "Definicja strefy". Uwaga: Pomaga upewnić się, że wanna znajduje się we właściwym miejscu przed napełnieniem jej wodą, ponieważ wanny nie można łatwo przenieść po napełnieniu.
   2. Napełnij wannę wodą z kranu i za pomocą termometru upewnij się, że temperatura wody wynosi około 21 °C. Upewnij się, że woda pozostaje w granicach jednego stopnia tej temperatury podczas testowania, ponieważ zimniejsza woda może wpłynąć na wydajność, szczególnie w przypadku używania starych myszy ⁸.
      Uwaga: Nie dodawaj kolorowania.
   3. Korzystając z wcześniej ustalonych miejsc, umieść platformę, która ma zamontowaną flagę osiągającą wysokość 13 cm i wymiary 4,5 cm x 4,5 cm z wytłoczonym na niej pogrubionym znakiem w kształcie litery "S", w pierwszym miejscu wanny tak, aby znajdowała się około 1 cala nad powierzchnią wody.
5. procedura
   1. Wyjmij pierwszą mysz z klatki, zweryfikuj tożsamość obiektu, zaznacz ogon za pomocą trwałego markera w odpowiednim kolorze i umieść w zlewce.
   2. Delikatnie umieść mysz w wannie, uruchom minutnik i upewnij się, że oprogramowanie śledzące śledzi zwierzę. Pozwól myszy na zlokalizowanie platformy do 2 minut. Gdy mysz zlokalizuje platformę, pozwól myszy na 20 sekund na platformie.
   3. Jeśli zwierzę znajdzie platformę i zacznie skakać lub spadać, zgarnij mysz i umieść ją na platformie. Jeśli mysz nadal skacze lub spada z platformy, przytrzymaj ją na platformie, aby mysz nauczyła się, że pozostanie na platformie prowadzi do ucieczki z wanny.
      Uwaga: Mysz powinna pozostać na platformie przez łączny czas 20 sekund; Tak więc, jeśli mysz zeskoczy po 5 sekundach, czas pozostały na platformie wynosi 15 sekund i nie resetuje się do 20 sekund.
   4. Jeśli zwierzę nie znajdzie platformy w ciągu 2 minut, zgarnij mysz i umieść ją na platformie na 20 sekund.
   5. Po 20 sekundach na platformie zdejmij mysz z platformy, tak jak to zrobiono podczas treningu przed obsługą i umieść mysz w podgrzewanej klatce wyłożonej ręcznikami papierowymi i ogrzanej do ~31 °C przez poduszkę grzewczą i lampę grzewczą przez 30 sekund. Wykonuj okresową ocenę temperatury ciała za pomocą termometru doodbytniczego, aby upewnić się, że niektóre szczepy myszy lub myszy w pewnym wieku nie są różnie podatne na hipotermię wywołaną hipotermią przez wystawienie na działanie wody.
   6. Po 2 minutach do klatki trzymającej z lampą grzewczą, przenieś mysz do klatki trzymającej tylko z poduszką grzewczą, ale bez lampy grzewczej, aby odzyskać siły między próbami. Ostatecznie umieść wszystkie myszy z jednej klatki domowej w tej samej klatce podczas testowania.
   7. Oczyść labirynt z zanieczyszczeń siatką po tym, jak każda mysz zakończy próbę, aby zakłócić sygnały węchowe.
6. Powtórz te kroki dla każdej myszy w grupie. Po tym, jak każda mysz ukończy pierwszą próbę, przenieś platformę do drugiej, wcześniej określonej lokalizacji.
   Uwaga: Platforma pozostanie w tym samym miejscu dla każdej myszy podczas pojedynczej próby i zostanie przeniesiona do innych wcześniej określonych lokalizacji na kolejne próby. Ma to na celu zapewnienie, że myszy 1) uczą się, że istnieje platforma, z której mogą uciec, 2) pływają bezpośrednio do widocznej platformy, demonstrując w ten sposób nienaruszone kompetencje wzrokowe, oraz 3) nie mają deficytów motorycznych.
7. Wykonaj te procedury dla 6 prób przez pierwsze 3 dni testowania. W związku z tym wykonuj widoczne szkolenie w dniach testowych 1, 2 i 3, z około 10-minutową przerwą między każdą próbą (Rysunek 2).
8. Podczas treningu na widocznej platformie użyj oprogramowania do śledzenia zwierząt, aby zmierzyć opóźnienie dotarcia na platformę, śledzić długość ścieżki zwierzęcia i prędkość pływania. Uzyskaj te pomiary z zakładki "Labirynt wodny" w sekcji "Lista eksperymentalna" i wyeksportuj bezpośrednio do arkusza kalkulacyjnego Excel.
   Uwaga: Korzystanie z timera ręcznego może być również korzystne dla zapewnienia dokładności oprogramowania śledzącego.

3. Trening z ukrytą platformą Morris Water Maze

1. Przygotuj pokój
   1. Zawieś zasłony w pokoju, aby zasłonić wskazówki przestrzenne w laboratorium.
   2. Umieść wskazówki strategicznie na zasłonach. Upewnij się, że wskazówki są duże i zawierają kontrastujące kolory (np. i biały), aby zapewnić lepszą widoczność. Zawieś kije w odległości i wysokości, w miejscu, w którym są widoczne dla myszy z wnętrza wanny. Uwaga: Wskazówki są statyczne i nie poruszają się w trakcie testowania.
2. Skonfiguruj oprogramowanie do śledzenia wydajności myszy
   1. Skalibruj wideo, aby dopasować je do wymiarów labiryntu w zakładce "Konfiguracja" – "Filtry i obiekty".
   2. Ustaw filtry tak, aby oprogramowanie mogło odróżnić myszy od tła.
      1. Użyj tych samych procedur, które opisano w testowaniu widocznej platformy (kroki 2.1.2.1-2.1.2.3), aby skonfigurować filtry do treningu ukrytej platformy Morris Water Maze.
   3. Utwórz cztery równe ćwiartki w labiryncie
      1. Najpierw kliknij opcję "Elipsa" w zakładce "Definicja strefy" i utwórz okrąg pasujący do labiryntu na ekranie. Uwaga: Na tej karcie wyświetlana jest rzeczywista konfiguracja labiryntu, więc umożliwia ona dopasowanie konfiguracji komputera do rzeczywistej konfiguracji labiryntu.
      2. Kliknij opcję "Prostokąt" i utwórz cztery równe kwadraty. Umieść te kwadraty na ekranie, aby utworzyć cztery równe ćwiartki w nowo utworzonym okręgu.
   4. Stwórz platformy w labiryncie.
      1. Wybierz opcję "Elipsa" i utwórz okrąg wielkości platformy, która będzie używana. Uwaga: Wcześniejsze umieszczenie platformy w labiryncie może być korzystne dla stworzenia elipsy o dokładnym rozmiarze platformy.
      2. Umieść nowo utworzone położenie platformy w środku kwadrantu docelowego. (Zaleca się nazwanie tego obiektu "Target", aby odróżnić właściwe platformy od reszty). Krok krytyczny: W polu tuż pod "Siatką" wybierz opcję "zatrzymaj" w sekcji "wyzwalacz" dla platformy docelowej. Spowoduje to, że program zatrzyma się, gdy mysz dotrze do platformy.
      3. Utwórz trzy inne identyczne obszary platformy i umieść je dokładnie w tych samych miejscach, w których znajdują się pozostałe ćwiartki. Nie wybieraj "stop" w opcji "spust".
3. Tworzenie arkuszy przebiegu
   1. Utwórz arkusz uruchamiania z listą każdej myszy, każdej próby, miejsce na zapisanie czasu dotarcia do platformy oraz miejsce na odnotowanie nieprawidłowego zachowania (Tabela 1).
   2. Określ z góry punkt zwolnienia każdej myszy w sposób pseudolosowy. Użyj selekcji pseudolosowej w taki sposób, aby odległość do platformy była równa każdego dnia, każda z 4 lokalizacji była używana jednakowo, a kąt od początku do platformy (tj. od lewej lub prawej) był zrównoważony w ciągu dni i między dniami.
      Uwaga: położenie platformy na arkuszu bieżni, aby zapewnić, że położenie platformy nie przesuwa się z pierwotnej pozycji. Upewnij się, że platforma znajduje się w środku jednej z czterech stref, które zostały utworzone w oprogramowaniu śledzącym.
      Uwaga: Jeśli badania podłużne są przeprowadzane w różnym wieku, przenieś platformę w nowe miejsce w każdym wieku.
4. Ustawianie labiryntu
   1. Dostosuj labirynt wodny lub kamerę tak, aby labirynt był zgodny z konfiguracją w zakładce "Konfiguracja" – "Definicja strefy".
   2. Oznacz cztery niewidoczne ćwiartki labiryntu (N, S, E, W). Sprawdź, czy są one zgodne z konfiguracją w oprogramowaniu śledzącym, aby upewnić się, że myszy są wypuszczane z właściwych punktów początkowych.
      Krok krytyczny: Umieść te etykiety na zewnątrz labiryntu i poza zasięgiem wzroku pływającego zwierzęcia, biorąc pod uwagę, że wskazówki w labiryncie stanowią zadanie nieprzestrzenne, niezależne od hipokampa.
   3. Napełnij labirynt wodą z kranu (około 21 °C) tak, aby platforma znajdowała się około 5 mm pod powierzchnią wody.
   4. Umieść platformę w ustalonym wcześniej miejscu.
      Uwaga: Lokalizacja platformy pozostanie taka sama dla wszystkich myszy testowanych we wszystkich dniach i próbach.
   5. Użyj nietoksycznej białej farby temperowej, aby woda była nieprzezroczysta. Zrób to, aby upewnić się, że górna część platformy jest niewidoczna z poziomu oczu zwierząt podczas pływania.
5. procedura
   1. Wyjmij mysz z klatki, zaznacz ogon za pomocą trwałego markera o odpowiednim kolorze i umieść w zlewce.
   2. Delikatnie wlej mysz do labiryntu, tak aby weszła twarzą do ściany. Uwaga: Każda mysz zostanie umieszczona w tym samym miejscu startowym w celu przeprowadzenia unikalnej próby.
   3. Po pierwszym zwolnieniu myszy uruchom stoper i stań w miejscu, w którym tester nie jest łatwo widoczny dla myszy. Upewnij się, że oprogramowanie do śledzenia zwierząt prawidłowo śledzi zwierzę.
   4. Gdy zwierzę dotrze do platformy, pozwól mu pozostać na platformie przez 15 sekund.
      Uwaga: Dzięki temu zwierzę może zorientować się w swoim położeniu przestrzennym w pomieszczeniu.
   5. Po 15 sekundach na platformie usuń zwierzę z labiryntu i włóż mysz z powrotem do podgrzewanej klatki.
   6. Jeśli mysz znajdzie platformę i zacznie skakać lub spadać przed upływem 15 sekund, zgarnij mysz i umieść ją z powrotem na platformie na pozostałą część 15 sekund, aby mysz nauczyła się kojarzyć platformę z ucieczką.
   7. Jeśli mysz nie zlokalizuje platformy w ciągu 60 sekund, delikatnie zgarnij mysz i umieść ją na platformie. Pozostaw zwierzę na platformie przez 15 sekund, a następnie wyjmij zwierzę za pomocą miarki i przynieś je z powrotem do podgrzewanej klatki.
   8. Oczyść labirynt z zanieczyszczeń siatką, aby zakłócić sygnały węchowe.
   9. Powtórz te procedury dla pozostałych myszy w grupie. Tak więc, w dniach testowych od 4 do 9, przeprowadź cztery próby treningu z ukrytą platformą dziennie, z około 20-minutową przerwą między każdą próbą.
   10. Zmień lokalizację początkową pseduolosowo dla każdej próby. Tak więc podczas próby 1 wypuść wszystkie myszy z tego samego miejsca początkowego, a następnie powtórz procedurę z innej pozycji początkowej dla kolejnych prób. Każdego dnia zmieniaj punkty uwalniania, aby upewnić się, że zwierzęta nie rozwiną nieprzestrzennej, niezależnej od hipokampa strategii motorycznej. Na przykład, jeśli myszy zostaną wypuszczone z punktów N, S, E i W pierwszego dnia, nie wypuszczaj ich w tej samej kolejności następnego dnia.
   11. Podczas treningu na ukrytej platformie użyj oprogramowania do śledzenia zwierząt, aby zmierzyć opóźnienie dotarcia na platformę, długość ścieżki zwierzęcia oraz procent czasu lub odległości, jaką zwierzę spędza w każdym kwadrancie labiryntu. Uzyskaj te pomiary z zakładki "Labirynt wodny" w sekcji "Lista eksperymentów" i można je wyeksportować bezpośrednio do arkusza kalkulacyjnego Excel.
       Uwaga: Użycie timera ręcznego zapewnia dokładność oprogramowania śledzącego.

4. Próby sondy

1. Skonfiguruj oprogramowanie do śledzenia wydajności myszy
   1. Użyj tych samych procedur, co w procedurze ukrytej platformy w labiryncie wodnym Morrisa (kroki 3.2.1-3.2.4.3) z jednym wyjątkiem. Krok krytyczny: W przypadku prób sondy upewnij się, że opcja "stop" dla "wyzwalacza" jest wyłączona podczas prób sondy. Zapobiegnie to zatrzymaniu się programu, gdy mysz przekroczy obszar platformy.
2. Tworzenie arkuszy przebiegu
   1. Utwórz arkusz uruchamiania z listą każdej myszy, każdej próby i miejscem, aby zanotować nieprawidłowe zachowanie. Określ z góry punkt zwolnienia podczas prób sondy tak, aby zmieniały się między dwiema stronami po przeciwnej stronie platformy. W ten sposób wstępnie określ punkty uwalniania tak, aby myszy nie były uwalniane z dwóch stron przylegających do platformy.
3. procedura
   1. Przeprowadzaj próby sondy podobne do treningu z ukrytą platformą, z wyjątkiem tego, że w labiryncie nie ma żadnej platformy.
   2. Zwolnij przycisk myszy z ustalonego punktu zwolnienia. Podczas próby sondy zdejmij platformę, a mysz będzie miała 60 sekund na pływanie w labiryncie.
   3. Podczas testowania przeprowadź 4 próby sondy. Zmień punkt uwalniania myszy między próbami sondy. W związku z tym zmień punkt zwolnienia bieżącej próby sondy z punktu poprzedniej próby sondy.
   4. Podczas prób sondy użyj oprogramowania do śledzenia zwierząt, aby śledzić długość ścieżki zwierzęcia, procent czasu, jaki zwierzę spędza w każdym kwadrancie labiryntu oraz ile razy zwierzę przepływa nad wcześniej wyznaczonym obszarem. Uzyskaj te pomiary z zakładki "Analiza danych" i zakładki "Labirynt wodny" w sekcji "Lista eksperymentalna" i wyeksportuj bezpośrednio do arkusza kalkulacyjnego Excel.
      Uwaga: Korzystanie z timera ręcznego może być również korzystne dla zapewnienia dokładności oprogramowania śledzącego.
   5. Przeprowadź próbę sondy przed szkoleniem z ukrytej platformy w dniach 6, 7, 8 i 10. (Rysunek 2). Po tych próbach sondy przeprowadź 4 próby treningu z ukrytą platformą każdego dnia. Dlatego najpierw wykonaj sondę, a zaraz po niej szkolenie z ukrytej platformy dla wszystkich myszy przy użyciu tych samych procedur, jak opisano w sekcji 3. W przeciwieństwie do tego, nie wykonuj dodatkowego treningu z ukrytą platformą po próbie sondy w dniu 10.

5. Analizy

1. Szkolenie z widocznej platformy
   1. Przeprowadzaj powtarzane pomiary ANOVA oddzielnie dla (a) długości ścieżki, (b) opóźnienia w znalezieniu platformy i (c) prędkości pływania, z transgenem (lub inną zmienną, taką jak leczenie) jako zmienną międzyosobniczą i dniami lub blokami treningowymi jako zmienną wewnątrzobiektową. Uwaga: W przypadku bardziej złożonych projektów przydatna może być konsultacja ze statystykiem. Patrz ^8,13 dla informacji o rozmiarach grup wystarczających do prawidłowego wykonania tego zadania za pomocą powszechnie stosowanych modeli choroby Alzheimera.
   2. Niekompetencja w zakresie wydajności
      1. Zidentyfikuj myszy niekompetentne do działania, w tym myszy wykazujące niekompetencję wzrokową lub motoryczną, lub zwierzęta, które nie nabywają proceduralnych składników testu, i usuń te myszy z kolejnych analiz statystycznych wydajności ukrytej platformy i sondy.
         1. Oblicz średnie opóźnienie i prędkość pływania dla ostatniego dnia treningu na widocznej platformie dla każdej myszy. Usuń myszy ze średnimi 2 odchyleniami standardowymi powyżej średniej grupy, ponieważ może to wskazywać na upośledzenie motoryczne lub wzrokowe.
         2. Identyfikuj i usuwaj myszy, które nie orientują się w kierunku lub nie podążają za czerpakiem ucieczkowym, lub myszy wykazujące nienormalne zachowanie, takie jak pływanie korkociągiem lub pływanie.
2. Szkolenie z ukrytej platformy Morris Water Maze
   1. Przeprowadź powtarzane pomiary ANOVA na (a) długości ścieżki, (b) opóźnieniu w znalezieniu ukrytej platformy, (c) prędkości pływania oraz (d) procentowym czasie lub procentowej odległości w kwadrancie z transgenem jako zmienną międzyobiektową i próbami jako zmienną wewnątrzobiektową.
3. Próby sondy
   1. Prędkość pływania
      1. Przeprowadź powtarzane pomiary ANOVA dotyczące prędkości pływania w próbach sondy z transgenem jako zmienną międzyobiektową i próbami jako zmienną wewnątrzobiektową.
   2. Indeks przekroczenia peronu
      1. Korzystając z konfiguracji próbnej sondy dla każdej myszy, wskaźnik skrzyżowania platformy (PCI) jest obliczany przy użyciu następującego wzoru: PCI = liczba przekroczeń przez mysz lokalizacji docelowej – średnia liczba przecięć równoważnej lokalizacji w pozostałych 3 kwadrantach.
         Uwaga: Jest to przeprowadzane w celu określenia, czy mysz korzysta ze strategii wyszukiwania przestrzennego, na co wskazuje większa liczba przekroczeń wytrenowanej platformy, czy też nieprzestrzennej strategii pływania tigmotaktycznego, na co wskazują w przybliżeniu równe przejścia we wszystkich czterech lokalizacjach.
      2. Przeprowadzaj powtarzane pomiary ANOVA na PCI z transgenem jako zmienną międzyosobniczą i próbami jako zmienną wewnątrzosobniczą.
   3. Procent czasu lub procentu odległości w kwadrancie
      1. Oblicz procent czasu lub odległości, jaką każda mysz spędza w czterech kwadrantach labiryntu. Przeprowadzaj powtarzane pomiary ANOVAS na procentowym czasie lub odległości, z transgenem jako zmienną międzyobiektową i próbami jako zmienną wewnątrzobiektową. Użyj procentu czasu, aby określić, czy jest używana strategia wyszukiwania przestrzennego; Wyniki około 25% czasu w kwadrancie docelowym wskazują, że myszy działają na poziomie szansy i nie stosują strategii wyszukiwania przestrzennego.
   4. O/N zapominanie
      1. Porównaj opóźnienie przejścia przez obszar platformy w próbie sondy z opóźnieniem, aby zlokalizować platformę w ostatniej próbie poprzedniego dnia. Uwaga: Jeśli opóźnienie przejścia przez platformę w próbie sondy jest znacznie większe niż opóźnienie znalezienia platformy podczas ostatniej próby ukrytej platformy poprzedniego dnia, oznacza to, że O/N zapomina o lokalizacji platformy.
4. Analiza post hoc
   1. Śledź istotne RMANOVA z porównaniami post hoc transgenu w każdym badaniu.

6. Przykład ponownej optymalizacji dla nowego środowiska testowego

1. Obsługa wstępna. Przeprowadź wstępną obsługę w pomieszczeniu mieszkalnym. Umieść klatki bez pokryw na wózku transportowym na całą sesję.
   Uwaga: Celem modyfikacji procedury postępowania wstępnego jest stopniowe wprowadzanie manipulacji osoby prowadzącej i ekspozycji na urządzenia transportowe (zlewka i szufelka) oraz wydłużenie czasu przebywania myszy w klatce domowej bez pokryw mikroizolatorów i na zewnątrz klatki na otwartym polu i w jaśniejszych warunkach oświetleniowych.
   1. Dzień 1 i 2
      1. Pozwól myszom przyzwyczaić się do rąk znajdujących się w klatce, a następnie delikatnie dotknij, a następnie podnieś w celu sprawdzenia tatuażu i oznaczenia ogona. Począwszy od 2 dnia wstępnego obchodzenia się, umieść dodatkowy materiał do gniazdowania w klatce, aby zapewnić dodatkowy materiał do budowy gniazda i schronienia, podczas gdy pokrywy zostały zdjęte ⁹.
   2. Dzień 3 i 4
      1. Umieść zlewkę transportową, szufelkę i flagę widocznej platformy w pudełku do wstępnego przenoszenia i pozwól myszom na eksplorację przez 2 próby w ciągu 2 minut na próbę.
      2. Nie używaj wody w tym protokole podczas wstępnego obchodzenia się z wodą. Zamiast tego upewnij się, że pudełko zawiera wystarczającą ilość czystej ściółki, aby pokryć podłogę i jest pachnące niewielką ilością zabrudzonego żwirku dla kobiet i mężczyzn, jeśli testowane są obie płcie. Zmieniaj pościel każdego dnia.
   3. Dzień 5
      1. Umieść myszy w pudełku do wstępnego przenoszenia, zawierającym lekko zabrudzoną ściółkę i widoczną flagę platformy na 3 próby, po 20 sekund każda. Użyj zlewki i szufelki, aby przetransportować myszy do i z pudełka.
2. Szkolenie z widocznej platformy
   1. Ustaw temperaturę wody na 27 °C (rutynowo używaną w środowisku testowym w stanie Minnesota).
   2. Przywróć myszy do klatki domowej po zdobyciu platformy z sygnalizacją.
   3. Pozwól myszom na uzyskanie widocznej platformy do 60 sekund.
   4. Przeprowadzaj sesje treningowe składające się z 3 prób dziennie przez 5 dni.
3. Szkolenie z ukrytej platformy
   1. Modyfikowanie podpowiedzi wizualnych. Z wyjątkiem jednej dużej zasłony, która zasłania przewodnika, wyeliminuj lub zwęź inne zasłony otaczające basen, aby mieć bardziej otwarte pomieszczenie. Umieść dodatkowe przedmioty w pomieszczeniu (np. odsłonięte półki, plakat z czarnej tkaniny z białym symbolem, czarno-białą piłkę plażową, duże czarne lejki, zeszyty i czarnego pluszaka), co stworzy zrównoważony, ale bardziej zróżnicowany zestaw wskazówek wizualnych niż poprzednio.
   2. Rozpocznij szkolenie z ukrytej platformy po 72 godzinach od zakończenia treningu z widoczną platformą, w odstępie około 30 minut między próbami.
   3. Przeprowadzaj sesje szkoleniowe składające się z 2 prób przez 8 dni.
4. Próby sondy
   1. Wykonuj próby sondy przez 72 godziny po ukrytych próbach treningowych 8, 12 i 16.Uwzględnij 3-dniowy odstęp między próbami 8-9 i 12-13 treningu.
   2. Ustaw czas trwania sondy na 30 sekund.

Results

Użyliśmy wodnego labiryntu Morrisa do zbadania wpływu beta-amyloidu (myszy Tg2576) i zmutowanego Tau P301L (myszy rTg(TauP301L)4510) na pamięć odniesienia przestrzennego (np. ^1,5,7,8). Rysunek 3 jest reprezentatywnym wynikiem przedstawionym w naszym badaniu badającym wpływ ekspresji tau P301L u dorosłych, na uczenie się i pamięć ⁸, z wykorzystaniem środowiska testowego A. Aby ocenić zdolności motoryczne i wzrokowe, myszy porównano w widocznych blokach treningowych platformy...

Discussion

Zadanie MWM jest szeroko stosowane do oceny uczenia się przestrzennego i pamięci. Jednak na solidność tego zadania może mieć wpływ wiele czynników i wymaga optymalizacji zarówno pod kątem obciążenia tła, jak i środowiska testowego. Jak pokazano na rysunku 4, ten sam protokół treningowy i zastosowane wskazówki wizualne użyte w dwóch różnych pomieszczeniach testowych (równoważny rozmiar i układ) dały znacznie różną wydajność sondy. Ponieważ wiele cech pokoju testowego może przyczyniać się do wskazówek prze...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Przeglądarka Oprogramowanie do śledzenia	Biobserve		To konkretne oprogramowanie nie jest wymagane - dostępne są inne systemy śledzenia
Basen			Wymiary około 1 stopy szerokości x 2 stopy długości x 1,5 stopy głębokości
Plastikowa zlewka			1 L
Szufelka
Mała siatka
Stoper
Nietoksyczna biała farba			Można użyć dowolnej farby kolorystycznej, jednak większość programów śledzących wymaga, aby farba kontrastowała z kolorem zwierzęcia.
Widoczna platforma			Kolor powinien kontrastować z labiryntem
Karnisz
Zasłony
Okrągła wanna			Zwykle w kolorze białym; około 4 stopy średnicy
Ukryta platforma			Pomalowana na ten sam kolor co woda