Powierzchniowo wzmocniona spektroskopia Ramana wykrywanie biomolekuł przy użyciu nanostrukturalnych substratów wytworzonych przez EBL

Podsumowanie

Opisujemy wytwarzanie i charakterystykę systemów nanobiologicznych łączących nanostrukturalne podłoża z unieruchomionymi białkami i aptamerami. Przedstawiono odpowiednie etapy eksperymentalne obejmujące litograficzną produkcję substratów nanostrukturalnych, biofunkcjonalizację i charakterystykę spektroskopii Ramana wzmocnionej powierzchniowo (SERS). Wykazano detekcję SERS białek unieruchomionych powierzchniowo oraz sondowanie wiązania białko-ligand i aptamer-ligand.

Streszczenie

Zgłoszono wytwarzanie i charakterystykę sprzężonych nano-biologicznych systemów łączących metaliczne nanostruktury na stałych podłożach z immobilizowanymi biomolekułami. Opisano całą sekwencję odpowiednich etapów eksperymentalnych, obejmujących wytwarzanie nanostrukturalnych substratów za pomocą litografii wiązką elektronów, immobilizację biomolekuł na podłożach i ich charakterystykę za pomocą powierzchniowo wzmocnionej spektroskopii Ramana (SERS). Zastosowano trzy różne projekty systemów nanobiologicznych, w tym białko A, białko wiążące glukozę i aptamer DNA wiążący dopaminę. W dwóch ostatnich przypadkach uwzględnia się również wiązanie odpowiednich ligandów, D-glukozy i dopaminy. Trzy rodzaje biomolekuł są unieruchamiane na nanostrukturalnych podłożach różnymi metodami, a wyniki obrazowania SERS są przedstawiane. Zademonstrowano możliwości SERS w zakresie wykrywania modów drgań z białek unieruchomionych powierzchniowo, a także do wychwytywania wiązania białko-ligand i aptamer-ligand. Wyniki ilustrują również wpływ geometrii nanostruktury powierzchniowej, strategii immobilizacji biomolekuł, aktywności ramanowskiej cząsteczek oraz obecności lub braku wiązania liganda na uzyskane widma SERS.

Wprowadzenie

Możliwości rozwoju i charakterystyki sprzężonych systemów nanobiologicznych łączących stałe nanostruktury i polimery biologiczne stają się coraz ważniejsze dla dalszego postępu w technologiach biodetekcji i bioaktywacji^{nowej generacji 1,2}. Obejmuje to multidyscyplinarne badania w wielu dziedzinach badawczych, takich jak wytwarzanie odpowiednich komponentów w stanie stałym (mikro- lub nanoelektrody, nanoinżynieryjne powłoki, nanodruty lub nanocząstki)^2,3,4; immobilizacja biomolekuł na powierzchniach w celu wytworzenia pożądanych biokoniugatów^5,6,7; i monitorowanie interfejsów nanobiologicznych¹. W większości przypadków wybór optymalnych metod wytwarzania, biofunkcjonalizacji i charakterystyki jest silnie ze sobą powiązany. Oczywiste jest, że wybór technik nanowytwarzania byłby podyktowany wymaganiami dotyczącymi komponentów systemu w stanie stałym, w dużej mierze zależałby od metody wykrywania, która z kolei zależy od charakteru zaangażowanych biopolimerów i celu monitorowania interfejsu.

Z szerokiej gamy technik stosowanych do charakteryzowania systemów biokoniugatowych^1,3, powierzchniowo wzmocniona spektroskopia Ramana (SERS) okazała się wysoce obiecującą metodą wykrywania związków chemicznych i biologicznych na powierzchniach^8,9,10,11. SERS wykorzystuje nieelastyczne rozpraszanie światła monochromatycznego przez biomolekuły unieruchomione powierzchniowo (ryc. 1), co pozwala na uchwycenie unikalnych sygnatur odpowiadających drganiom molekularnym. Ta zdolność do rozróżniania różnych cząsteczek bez angażowania etykiet, skomplikowanej chemii lub czasochłonnych etapów sprawia, że SERS jest potencjalnie bardzo skuteczną metodą biodetekcji. Kolejną ważną zaletą SERS jest jego wysoka czułość. Wzbudzenie zlokalizowanych plazmonów powierzchniowych przez światło oddziałujące z nanostrukturami metali szlachetnych (substratami SERS) dramatycznie zwiększa intensywność rozpraszania Ramana przez analit, umożliwiając wykrycie bardzo małych ilości cząsteczek, od monowarstw aż do granicy pojedynczej cząsteczki^8,9,10,11. Wreszcie, większość biomolekuł wymaga roztworów wodnych, aby były stabilne. Ponieważ woda często ma ograniczoną aktywność ramanowską, sygnał tła z próbek wodnych jest zminimalizowany⁹. W ciągu ostatniej dekady nastąpił gwałtowny wzrost zastosowań SERS¹⁰ . Jednak szeroko dyskutowanym wyzwaniem SERS jest to, że elektromagnetyczne wzmocnienie rozpraszania Ramana zależy krytycznie od rozmiaru, kształtu i odstępów między metalowymi nanostrukturami, w których indukowane są fale plazmoniczne^11,12,13. W celu uzyskania wydajnych i powtarzalnych pomiarów SERS wymagana jest kontrola geometrii podłoża w nanoskali.

Rysunek 1. Schemat powierzchniowo wzmocnionej spektroskopii Ramana.

Liczne metody stosowane do wytwarzania substratów SERS^11,12,13 można z grubsza podzielić na metody oddolne i odgórne. Metody pierwszego typu wykorzystują różne procesy samoorganizacji lub ukierunkowanej syntezy chemicznej w celu wytworzenia nanostruktur. Często przywoływanymi przykładami są immobilizacja nanocząstek monodyspersyjnych na podłogach stałych^11,12,13, osadzanie termiczne, rozpylane lub elektrochemiczne chropowatych warstw metalowych^11,12 oraz różne metody syntezy chemicznej¹³. Chociaż takie techniki są zwykle stosunkowo proste i niedrogie, większość z nich jest wyzwaniem ze względu na brak kontroli nad lokalizacją struktur i ograniczoną odtwarzalność między próbkami.

Dla kontrastu, techniki litografii z góry na dół wykorzystują manipulacyjne narzędzia, takie jak wiązki cząstek, do tworzenia pożądanych wzorów na powierzchniach. Jedna z najczęściej stosowanych metod nanolitografii, litografia wiązką elektronów (EBL), zapewnia doskonałą kontrolę nad cechami do poniżej 10 nm, a także elastyczność pozwalającą na różne projekty podłoża na solidnych podłożach^11,12. W EBL wiązka elektronów skupiona w dół do punktu o średnicy kilku nanometrów skanuje powierzchnię materiału wrażliwego na elektrony (rezystu), powodując zmianę chemiczną w odsłoniętych obszarach. W przypadku dodatnich rezystorów tonowych, takich jak polimetakrylan metylu (PMMA), ekspozycja wiązką elektronów powoduje rozszczepienie łańcuchów polimerowych tworzących rezyst, co prowadzi do zwiększenia rozpuszczalności w odpowiednim rozpuszczalniku (wywoływaczu). Proces litografii wiązką elektronów obejmuje powlekanie przędzą jednolitej warstwy rezystu na podłożu; naświetlanie docelowego materiału oporowego w komorze próżniowej z wiązką elektronów; i opracowanie próbki w celu usunięcia rozpuszczalnych regionów.

Wykazano, że podpory dielektryczne pod metalicznymi nanostrukturami, takimi jak stopiona krzemionka, znacznie zwiększają intensywność w SERS ze względu na lokalizację fal plazmonicznych w porównaniu z innymi materiałami, takimi jak krzem^14,15. Jednak wzorowanie EBL na podłożach dielektrycznych, zwłaszcza w nanoskali, wiąże się z poważnymi wyzwaniami ze względu na gromadzenie się ładunku podczas ekspozycji. Wcześniej wykazaliśmy^16,17, że trudności te można pokonać, umieszczając przewodzące warstwy polimeru powyżej oporu. Rysunek 2 przedstawia schemat całego procesu wytwarzania z wykorzystaniem ekspozycji i rozwoju EBL, a następnie osadzania i podnoszenia metalu w celu wytworzenia metalicznych nanostruktur na stopionych nośnikach krzemionkowych. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2. Schemat etapów litografii wiązką elektronów, osadzania metalu i liftingu stosowanych do wytwarzania nanostruktur metalicznych na podłożach dielektrycznych^16-19. W artykule przedstawiono całą sekwencję etapów procesu obejmujących wytwarzanie substratów SERS za pomocą EBL, biofunkcjonalizację substratów oraz zbieranie widm Ramana. Omówiono trzy projekty analizowane w naszych ostatnich pracach^{18, 19, 20} (patrz rysunki 3 i 4 oraz tabela 1). W Projekcie 1 rekombinowane białko A jest unieruchamiane na biofunkcjonalizowanych nanostrukturach Au na podporze ze stopionej krzemionki (FS)¹⁸ i demonstruje się wykrywanie białka metodą SERS. W Projekcie 2 rekombinowane białko wiążące glukozę^22,27,28 z ligandem (D-glukozą) i bez niego (D-glukoza) jest unieruchamiane za pomocą znaczników histydyny w przestrzeniach między nanostrukturami Ag na FS pokrytym niklem i wykrywane jest wiązanie glukozy z białkiem. W Projekcie 3 tiolowany aptamer DNA wiążący dopaminę^20,24 jest unieruchomiony na nanostrukturach Au na FS i pokazano wiązanie dopaminy przez unieruchomiony aptamer. Obejmując wszystkie istotne etapy eksperymentalne, od przygotowania substratu do pozyskiwania widm Ramana, oraz reprezentujące różne biomolekuły i strategie immobilizacji, przykłady te są przydatne w szerokiej gamie zastosowań, od badań eksploracyjnych badających nanobiologiczne interfejsy przez SERS po rozwój biosensorów SERS małych cząsteczek wykorzystujących wiązanie białka lub aptameru z ligandem jako metodę rozpoznawania. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3. Schematy trzech reprezentatywnych projektów wykorzystujących różne biomolekuły, metody immobilizacji i materiały substratowe: (A) białko A unieruchomione na nanokropkach z metalu szlachetnego funkcjonalizowane przez samoorganizującą się monowarstwę (SAM) kwasu 11-merkaptodekanowego (MUA) w wodzie DI; (B) białko wiążące glukozę (GBP) znakowane histydyną, skompleksowane z D-glukozą unieruchomioną na powierzchni podłoża między nanokropkami z metali szlachetnych; (C) aptamer wiążący dopaminę zakończony tiolami uzupełniony dopaminą (DBA) unieruchomioną na nanokropkach z metali szlachetnych. Więcej informacji na ten temat znajduje się w tabeli 1. W projekcie 2 zilustrowanym przez panel (B) przygotowano również próbkę bez odpowiadającego jej liganda do porównania. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 4. Biomolekuły zastosowane w trzech projektach: (A) białko A; (B) białko wiążące glukozę i D-glukoza; (C) aptamer DNA wiążący dopaminę i dopamina. Trzeciorzędowe struktury białkowe w (a) i (b) są pobrane z Banku Danych o Białkach, PDB ID 1BDD²¹ i 2HPH²², odpowiednio, i narysowane za pomocą VMD dla LINUXAMD64, wersja 1.9.1²³. Struktura drugorzędowa aptameru w (c) jest przewidywana na podstawie sekwencji²⁴ za pomocą oprogramowania ValFold²⁵ i rysowana za pomocą PseudoViewer 3.0²⁶. Litery G, A, T i C odpowiadają odpowiednio nukleotydom guaniny, adeniny, tyminy i cytozyny. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

	Wzór 1	Wzór 2	Wzór 3
Biopolimer	Białko A	Białko wiążące glukozę (GBP)	Aptamer wiążący dopaminę (DBA)
spoiwo	Samoorganizująca się monowarstwa kwasu 11-merkaptoundekanowego (MUA)	Znaczniki histydyny	Łączniki tiolowe
Ligand	żaden	D-glukoza	dopamina
rozwiązanie	Woda dejonizowana (DI)	Bufor fosforanu potasu	bufor tris(hydroksymetylo)aminometanu (TRIS) i kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA); Solanka fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)
substrat	Struktury Au na FS	Konstrukcje Ag na FS z powłoką niklową	Struktury Au na FS
Wzorzysty obszar	4 μm x 10 μm	4 μm x 8 μm	4 μm x 10 μm
Wzorzec	Au kropki, raster 50 nm	Kropki Ag, raster 40 nm	Sześciokąty Au, podziałka 200 nm
		Sześciokąty Ag, podziałka 200 nm	Au niestrukturalne pady
		Podkładki bez struktury Ag
Dawki ekspozycji na EBL	Kropki:	Kropki: 105 μC/cm2	Sześciokąty: 180 μC/cm2
	Tablica I 120 μC/cm2	Sześciokąty: 170 μC/cm2
	Tablica II 96 μC/cm2
	Tablica III 72 μC/cm2
Długość fali wzbudzenia laserowego	532 nm	532 nm	780 nm

Tabela 1. Trzy projekty systemów nanobiologicznych.

Protokół

1. Przygotowanie podłoża

1. Użyj piły do krojenia półprzewodników, aby pokroić płytkę ze stopionej krzemionki (FS) na 1 cm × 1 cm lub mniejszą kostkę.
2. Czyste próbki w roztworze piranii (H₂SO₄:H₂O₂, 3:1; UWAGA: silny utleniacz) kąpać²⁹ przez 15 min, następnie opłukać kostkę w wodzie dejonizowanej i wysuszyć w azocie.
3. Umieścić próbki na płycie grzejnej stroną zadrukowaną do góry w temperaturze 180 °C na 15 minut. Schłodź próbki po wyjęciu z płyty grzejnej do temperatury regulowanej.
4. W przypadku wzorów 1 i 3 przejdź do kroku 2.
5. W przypadku projektu 2 należy umieścić próbkę w komorze parowania wiązką elektronów i pokryć warstwą niklu o długości 10 nm.

2. Wytwarzanie nano-wzorzystych masek PMMA przy użyciu litografii wiązką elektronów (EBL)

1. Powłoka spinowa warstw odpornych i przewodzących PMMA na podłożach.
   1. Użyj wirówki waflowej z uchwytem próżniowym i umieść próbki pojedynczo na środku uchwytu. Umieść 1 kroplę rezystancji polimetakrylanu metylu (PMMA) na środku próbki za pomocą szklanej pipety i wiruj z prędkością 3,500 obr./min przez 60 sekund z 2-sekundowym czasem narastania.
   2. Piecz podłoża w temperaturze 180 °C przez 3-5 minut. Po wypaleniu substratów schłodzić próbki do temperatury suchej.
   3. Po schłodzeniu podłoży i powrocie do uchwytu obrotowego, rozprowadź kroplę przewodzącego polimeru na podłożu. Wiruj podłoże przez 40 sekund z prędkością 3,000 obr./min z 2-sekundowym czasem narastania. Piecz próbki w temperaturze 80 °C przez 1 minutę.
2. Wykonaj ekspozycję na EBL zgodnie ze standardową procedurą^16,17,18,30.
   1. Korzystając z instrukcji producenta, należy przygotować projekt ekspozycji, w którym zastosowano dawki cech z tabeli 1 o najmniejszym możliwym rozmiarze kroku wiązki.
   2. Załaduj próbkę do komory litografii wiązką elektronów. Jeśli system EBL nie ma autofokusa, użyj małego zadrapania z dala od miejsca, w którym wzór ma być naświetlony, i z dala od krawędzi koralika do ustawiania ostrości.
   3. Korzystając z instrukcji producenta, wykonaj wymaganą korekcję ostrości i astygmatyzmu, a także napisz odpowiednie wyrównanie pola i naświetl próbkę. Aby umożliwić prawidłowy profil ekspozycji i najlepszą jakość wzoru, do ekspozycji należy użyć energii wiązki elektronów 30 keV i apertury 7,5 μm.
3. Usuń przewodzący polimer i wywołaj odsłonięte próbki.
   1. Przygotować zlewkę z wodą dejonizowaną (DI) w celu usunięcia polimeru przewodzącego oraz drugą zlewkę z mieszaniną wywoływacza (IPA:H₂O, 7:3) i mieszać przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Przygotować izopropanol (o wysokiej czystości) w trzeciej zlewce jako środek nabłyszczający.
   2. Za pomocą pęsety umieść próbki w wodzie na 3 sekundy, aby usunąć przewodzący film polimerowy, następnie umieść próbkę w wywoływaczu i powoli przesuwaj pęsetę w górę iw dół przez 20 sekund. Natychmiast przenieś substraty do izopropanolu i płucz jeszcze przez 10 sekund, a następnie wysusz próbkę azotem.

3. Wytwarzanie nanostruktur z metali szlachetnych

1. Załaduj próbki do góry nogami do systemu parownika wiązki elektronów, aby umożliwić osadzenie się odparowanego metalu na przedniej powierzchni próbek. Na próbkach należy nałożyć warstwę Au o grubości 10 nm w przypadku wzorów 1 i 3 oraz warstwę Ag o grubości 10 nm w przypadku wzoru 2 z szybkością około 0,1 nm/s.
2. Napełnij system sonikacyjny do zalecanej wysokości wodą i napełnij oddzielną zlewkę acetonem. Umieścić próbkę na dnie zlewki stroną zadrukowaną do góry i pozostawić próbkę do namoczenia przez 10 minut. Trzymając zlewkę, umieść ją w łaźni wodnej i pozwól, aby wysokość acetonu odpowiadała wysokości wody i włącz system sonikacji. Pozwól na wystąpienie sonikacji przez maksymalnie 60 sekund.
3. Stosując tę samą procedurę, jak opisano w kroku 3.1, przygotuj jednolite podłoża padów Au i Ag poprzez osadzanie folii metalowych o grubości 10 nm na podłożach FS (Wzór 1 i 3) i FS powlekanych Niklem (Projekt 2), pomijając krok 2.

4. Biofunkcjonalizacja substratów

1. Przygotuj próbki Projektu 1:
   1. Przygotować 1 mM roztwór kwasu 11-merkaptodekanowego (MUA) w etanolu w temperaturze pokojowej w temperaturze pokojowej. Sonikować przez 10 min.
   2. Zanurzyć właściwy substrat nanostrukturalny w roztworze MUA na 48 godzin. Przepłukać próbkę trzykrotnie etanolem i suszyć przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
   3. Przygotować 75 mM roztwór N-etylo-N'-(3-(dimetyloamino)propylo)karbodimidu (EDC) w wodzie demineralizowanej. Przygotować 15 mM roztwór N-hydroksysukcynimidu (NHS) w wodzie DI.
   4. Za pomocą mikropipety nanieś 100 μl NHS na Au na podłożu i natychmiast dodaj 100 μl EDC na tym samym obszarze. Inkubować przez 1 minutę, aby aktywować samoorganizującą się monowarstwę (SAM) MUA.
   5. Umieścić 100 μl kropli roztworu białka A (47 μM) na tym samym obszarze podłoża i przechowywać próbkę przez 24 godziny w temperaturze 5 °C na wielokomorowej szalce Petriego z 1 ml wody demineralizowanej w innej komorze i pod szczelną pokrywą.
   6. Przepłukać próbkę w wodzie detonowanej 3 razy, ciągle mieszając próbki w oddzielnych zlewkach przez 20 sekund w każdej zlewce. Nie dopuścić do wyschnięcia próbek po płukaniu lub podczas płukania.
   7. Przejdź do kroku 5.
2. Przygotuj próbki Design 2:
   1. Przygotować 0,9 mM roztwór białka wiążącego glukozę (GBP) w buforze fosforanu potasu (_K2HPO4, 25 mM, pH 7,5). Przygotować 100 mM roztwór D-glukozy w buforze.
   2. Zmieszać 30 μl 100 mM roztworu D-glukozy i 30 μl 0,9 mM roztworu GBP za pomocą plastikowego pojemnika na mikroprobówki o pojemności 1 ml i mikropipety. Inkubować przez 30 minut.
   3. Za pomocą mikropipety nanieść po 20 μl roztworu GBP bez ligandu i roztworu GBP związanego z ligandem na przygotowane podłoża. Próbki należy przechowywać w temperaturze 5 °C przez 24 godziny na szalce Petriego ze szczelnie zamkniętą pokrywą.
   4. Przepłukać próbki 3 razy w roztworze buforowym fosforanu potasu w temperaturze pokojowej (RT).
   5. Przejdź do kroku 5.
3. Przygotuj 3 próbki projektu:
   1. Rozcieńczyć roztwór aptameru wiążącego dopaminę (DBA) do stężenia 1 μM przy użyciu buforu TRIS EDTA o końcowym pH 7,4.
   2. Przygotować roztwór dopaminy o stężeniu 5 μM, odmierzając proszek dopaminy na wadze analitycznej i mieszając go w roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) z kulką mieszającą przez 5 minut.
   3. Umieścić 20 μl kropli roztworu DBA na powierzchni każdego podłoża i pozostawić próbki na 1 godzinę w temperaturze pokojowej z przykryciem na szalce Petriego.
   4. Przepłukać próbki 3 razy w buforze fosforanu potasu (_K2HPO₄, 25 mM, pH 7,5).
   5. Umieść próbki pionowo na chusteczce do pomieszczeń czystych, aby wysuszyć tylną stronę, zachowując folię z przodu podłoża. Odłóż próbkę na bok jako kontrolę.
   6. Umieścić kroplę 5 μl roztworu dopaminy na powierzchni istniejącej kropli roztworu buforowego PBS na pozostałych próbkach o pożądanych stężeniach dopaminy. Inkubować próbkę przez 10 minut.
   7. Umieść kroplę roztworu dopaminy na powierzchni podkładki Au bez aptameru. Inkubować przez 10 minut.
   8. Przepłukać próbki w roztworze buforowym fosforanu potasu 3 razy.

5. Spektroskopia Ramana

1. Umieść każdą próbkę w wodoodpornej komorze, aby uniknąć parowania przez naświetlanie laserem.
   1. Napełnij plastikową strzykawkę chemicznie obojętnym smarem wysokopróżniowym, umieść próbki na szkiełkach podstawowych i napełnij kilka milimetrów tłuszczu otaczającego próbki, nie dotykając ich.
   2. Umieść szkiełko nakrywkowe mikroskopu na wierzchu podłoży i delikatnie dociśnij, aby utworzyć uszczelnienie, tworząc cienką ciecz między podłożami a szkiełkami nakrywkowymi, nie dopuszczając do kontaktu buforu ze smarem próżniowym.
2. Korzystając z optycznego mikroskopu Ramanowskiego, uzyskaj ostrość na powierzchni obszaru z nanowzorem metalu, który ma być próbkowany, bez włączania lasera.
3. Wykonaj próbkowanie Ramana^18,19 z natężeniem lasera w zakresie 2,4-3,1 mW o łącznym czasie trwania krótszym niż 20 sekund, aby zapobiec uszkodzeniu próbki przy obiektywie o 10-krotnym powiększeniu. Uzyskaj widma Ramana dla próbek ze wzorów 1, 2 i 3, używając długości fal wzbudzenia, jak wskazano w Tabeli 1. Uzyskaj również kontrolne widma Ramana dla roztworów białka A, GBP i D-glukozy oraz dla proszku dopaminy, wykorzystując szkiełka bez nanostruktur metalowych jako nośniki do porównania.

Wyniki

Zbieranie kontrolnych widm Ramana dla głównych składników, w tym wolnych białek w roztworze i wolnych ligandów w roztworze lub w formie proszku, bez użycia substratów zawierających metale, jest ważne dla umożliwienia prawidłowego porównania, jak również dla celów interpretacji. Rysunek 5A przedstawia typowe widmo Ramana dla wolnego białka A w wodzie DI na szkiełku podstawowym bez substratów nanostrukturalnych. Dwa pasma o największym natężeniu Ramana, pasmo o wysokości 2 931 ^cm-1 i o długości 1 091 ^cm-1, odpowiadają drganiom obejmującym odpowiednio wiązania C-H i C-S. Inne pasma o niższym natężeniu Ramana, takie jak 563 ^cm-1, 1,450 ^cm-1, 1,653 ^cm-1 i 2,426 ^cm-1, można przypisać superpozycji modów drgań^18,33,34,35. Kontrolne widma Ramana dla wolnego od ligandów GPB w roztworze buforowym o trzech różnych stężeniach, 0,3, 0,9 i 1,3 mM, pokazano na rysunku 5B. Na rysunku szerokie pasmo około 3,400 ^cm-1 odpowiada rozpuszczalnikowi³⁶, podczas gdy pasmo na 2,935 ^cm-1reprezentuje drgania obejmujące wiązania C-H białka^33,34. Rysunek 5C przedstawia widmo Ramana o wysokiej długości fali dla D-glukozy w roztworze buforowym dla różnych stężeń: 1, 6, 100, 200 i 400 mM. Gdy stężenie glukozy wzrasta, wiązania C-H tworzą pasma drgań na 2,890 ^cm-1 i 2,960 ^cm-1. Kontrolne widma Ramana dopaminy w postaci krystalicznej uzyskane zarówno przy długości fali wzbudzenia 532 nm, jak i 780 nm przedstawiono na rysunku 5D. Znaczna część widma Ramana pochodzi z wygięcia pierścienia benzenowego i rozciągnięcia wiązań C-H cząsteczki^20,37. Niektóre z pasm na wysokości około 3000 ^cm-1 są obserwowane tylko przy długości fali wzbudzenia 532 nm, ale nie 780 nm.

Rysunek 5. Kontrolne widmo Ramana białka A w wodzie DI otrzymane przy długości fali wzbudzenia 532 nm¹⁸ (A); widma ramanowskie białka wiążącego glukozę bez ligandów w roztworze buforowym otrzymanym przy długości fali wzbudzenia 532 nm (B); widma Ramana D-glukozy w roztworze buforowym otrzymane przy długości fali wzbudzenia (C) 532 nm; oraz widma proszku dopaminy otrzymane przy długościach fal wzbudzenia 532 nm i 780 nm²⁰(D). Wszystkie widma są regularnymi widmami Ramana roztworów (a,b,c) i proszku (d) na szkiełkach podstawowych bez substratów nanostrukturalnych. W (D) przypisanie reżimów przesunięcia Ramana do różnych drgań molekularnych zostało wykonane przy użyciu oprogramowania General Atomic and Molecular Electronic Structure System (GAMESS)³² i MacMolPlt³¹, jak opisano w innym miejscu20. Przedruk panelu (a) za zgodą¹⁸ American Vacuum Society. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Aby uzyskać widma SERS dla biomolekuł unieruchomionych powierzchniowo, substraty zawierające metaliczne nanostruktury na stopionych nośnikach krzemionkowych są wytwarzane zgodnie z opisem w krokach 1-3. Jakość wytwarzanych podłoży jest monitorowana za pomocą skaningowej mikroskopii elektronowej (SEM). Standardowe procedury SEM są opisane w innym miejscu^16,17,18,19 i nie są zawarte w niniejszym protokole. Rysunek 6 przedstawia reprezentatywne obrazy SEM nanokropek Au i Ag oraz struktur podobnych do nano-sześciokątów (panele a-d), a także niestrukturalnych padów Au i Ag (odpowiednio panele e i f). Kolejnym krokiem jest unieruchomienie materiału biologicznego na podłożach nanostrukturalnych z wykorzystaniem trzech wzorów wymienionych w tabeli 1 oraz pozyskanie ich widm SERS. W celu utrzymania środowiska wodnego podczas obrazowania ramanowskiego, każdą próbkę umieszcza się w odpowiednim roztworze (patrz Tabela 1), przykrywa cienką szklaną pokrywą i uszczelnia, jak pokazano na rysunku 7.

Rysunek 6. Obrazy nanostruktur powierzchniowych Au i Ag o grubości 10 nm ze skaningowego mikroskopu elektronowego (SEM) stosowanych jako substraty SERS: (A,B) układy nanokropek; (C,D) tablice nano-sześciokątów; (E,F) podkładki bez struktury. Podłoża ze strukturą Au (po lewej) wykorzystują podpory FS, podczas gdy podłoża ze strukturą Ag (po prawej) wykorzystują powłokę Ni o grubości 10 nm na FS. Obrazy uzyskano zgodnie z opisem w innym miejscu^16,17,18. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 7. Schemat wodoszczelnej komory do obrazowania ramanowskiego próbek biofunkcjonalizowanych w roztworze.

W Projekcie 1, rekombinowane białko A jest unieruchomione na podłożach funkcjonalizowanych przez samoorganizującą się monowarstwę kwasu 11-merkaptodekanowego (MUA) w wodzie DI¹⁸. Podłoża w tym projekcie składają się z trzech układów kropek Au o rastrze 50 nm i różnych odległościach między punktami na stopionej krzemionce (patrz rysunki 6A i 8). Proces immobilizacji białek rozpoczyna się od wytworzenia SAM na podłożach. Aby uzyskać kowalencyjne wiązanie między SAM a białkiem, grupy kwasów karboksylowych SAM są przekształcane w aminoaktywny ester NHS przez traktowanie mieszaniną roztworu N-etylo-N'-(3-(dimetyloamino)propylo)karbodimidu (EDC) i roztworu N-hydroksysukcynimidu (NHS) w wodzie DI. Immobilizacja białka A następuje poprzez przemieszczenie grupy NHS przez reszty lizyny białka³⁸. Przykład próbek obrazowych dla Projektu 1 z białkiem A unieruchomionym na nanostrukturach Au pokazano na rysunku 9. Rysunek 9A przedstawia obraz próbek pod mikroskopem optycznym, które składają się z trzech układów biofunkcjonalizowanych nanokropek Au z różnymi przerwami między punktami (patrz również rysunki 3Aa i 8), a rysunek 9B przedstawia mapowanie widmowe Ramana na tych matrycach. Można zauważyć, że najwyższe intensywności Ramana występują dla Tablicy I, gdzie przerwy między punktami są najwęższe, podczas gdy niższe intensywności uzyskuje się dla Tablicy III z najszerszymi przerwami między kropkami. Można to wytłumaczyć silniejszym efektem sprzężenia plazmonów wytwarzanym przez wyższe pola elektryczne w wąskich przestrzeniach między punktami¹⁸. Rysunek 9C przedstawia najsilniejsze widma SERS uzyskane dla macierzy I i II. Widma wykazują kilka pasm (1630 ^cm-1, 1964 ^cm-1, 2280 ^cm-1, 2577 ^cm-1 i 2916 ^cm-1) w pobliżu modów Ramana wolnego białka A w roztworze widocznym na rysunku 5A. Ze względu na wibracje różnych wiązań występujących w białkach, prążki te pojawiają się w podobnych miejscach zarówno w unieruchomionym białku, jak i w roztworze, lub są nieznacznie przesunięte do nieco wyższych liczb falowych po unieruchomieniu. W przeciwieństwie do tego, widma SERS podobnych nanostrukturalnych substratów funkcjonalizowanych przez MUA SAM bez białka wykazują zupełnie inny wzór¹⁸, potwierdzając, że rysunek 9 reprezentuje mapowanie SERS unieruchomionego powierzchniowo białka A. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

Rysunek 8. Obrazy SEM trzech macierzy nanokropek Au na podłożu FS użytych w projekcie 1,¹⁸. Matryce mają ten sam odstęp 50 nm i nieco inne promienie punktów, co skutkuje różnymi szerokościami przerw między punktami. Osiąga się to poprzez zastosowanie różnych dawek ekspozycji na EBL w celu wytworzenia masek PMMA dla trzech matryc (patrz Tabela 1). Wyższe dawki ekspozycji skutkują szerszymi otworami w maskach PMMA, co pozwala na uzyskanie większych rozmiarów kropek Au po metalizacji i liftingu. Przedruk za zgodą¹⁸ American Vacuum Society. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 9. Obrazowanie SERS białka A unieruchomionego substratem w projekcie 1,¹⁸. (A) Obraz próbki pod mikroskopem optycznym, składający się z trzech układów nanokropek Au o rastrze 50 nm i różnych przerwach między punktami na podłożu ze stopionej krzemionki (patrz również rysunek 6), biofunkcjonalizowanej, jak pokazano na rysunku 3A. (B) Mapowanie ramanowskie próbki. (C) Widma SERS z tablicy punktowej I i II. W panelu (B) oś pionowa reprezentuje odległość w poprzek podłoża, oś pozioma reprezentuje przesunięcie Ramana, a pasek legendy wskazuje intensywność Ramana. Pionowe linie przerywane w panelach (B) i (C) reprezentują wzorcowe pasma Ramana wolnego białka A w roztworze, a (*) w panelu (C) wskazują pasma SERS z tablicy I. Widma Ramana uzyskano o długości fali wzbudzenia 532 nm. Przedruk za zgodą¹⁸ American Vacuum Society. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

W Projekcie 2, rekombinowane białko wiążące glukozę (GBP)²² skompleksowane z D-glukozą (ligandem) jest unieruchomione na odpowiednich podłożach w roztworze buforowym fosforanu potasu. Do porównania przygotowuje się również próbki z unieruchomionym GBP wolnym od ligandów. W tym projekcie białko wiążące glukozę jest przyłączone do powierzchni za pomocą znacznika histydyny, który dobrze wiąże się z Ni, ale nie z metalami szlachetnymi⁶. Ponieważ podłoża składają się z układów nano-kropek Ag, nano-sześciokątów i nieustrukturyzowanych padów Ag na FS pokrytym Niklem (odpowiednio rysunki 6B, 6D i 6F), można oczekiwać, że większość unieruchomionych cząsteczek białka będzie zlokalizowana w przerwach między nanostrukturami Ag, w których dostępna jest powłoka Ni. Widma Ramana uzyskane dla unieruchomionego GBP wolnego od glukozy i związanego z glukozą przedstawiono odpowiednio na rysunkach 10A i 10B. Wszystkie te widma wykazują szerokie pasmo na wysokości około 3300 ^cm-1, co odpowiada roztworowi buforowemu³⁶. Widma uzyskane za pomocą nieustrukturyzowanej podkładki Ag zawierają tylko to pojedyncze pasmo i nie wykazują żadnych trybów drgań białka, co potwierdza, że unieruchomione białko nie znajduje się na powierzchni Ag zgodnie z oczekiwaniami. Natomiast widma uzyskane za pomocą układów nano-kropek Ag i nano-sześciokątów wykazują pasma około 1,550 ^cm-1 i 2,900 ^cm-1, które reprezentują analit^33,34. W szczególności szerokie pasmo wokół 1,550 ^cm-1, znane jako pasmo amidu II, można przypisać wibracjom wiązań peptydowych w białkach^34,35. W rozważanym przypadku pasmo to stanowi superpozycję modów drgań z GBP unieruchomionych na powierzchni Ni pomiędzy cechami Ag i wskazuje na wzmocnienie tych modów SERS w pobliżu nanostruktur metali szlachetnych, gdy stosowane są podłoża zawierające nanokropki lub nanosześciokąty. Prążek ten jest bardzo słaby dla białka w roztworze przy braku wzmocnienia SERS (Figura 5B) i nieobecny na podkładkach Ag bez powierzchni Ni dostępnej do wiązania białka, ale jest dobrze zaznaczony dla substratów nanostrukturalnych z pewną powierzchnią Ni dostępną dla białka do wiązania. Jednak jeszcze ważniejsze dla niniejszego badania są inne, węższe pasma około 2900 ^cm-1, które można przypisać wibracjom wiązań C-H^33,34. Widmo GBP wolnego od glukozy pokazuje wyraźne pasmo na wysokości 2,933 ^cm-1 z substratem nano-kropek i słabe, ale dostrzegalne pasmo o podobnej długości fali z podłożem nano-sześciokątów (ryc. 10A). W odróżnieniu od przypadku białka bezglukozowego, widma SERS GBP związanego z glukozą pokazane na rysunku 10B wykazują dwa pasma odpowiadające reżimom wibracji wiązań C-H, na 2,850 ^cm-1 i 2,910 ^cm-1. Pasma są dobrze wyraźne w widmie GBP związanego z glukozą na podłożu nano-sześciokątów, a także można je zobaczyć w widmie GBP na podłożu nano-kropek. Prążek na 2,850 ^cm-1 jest dość zbliżony do 2,890 ^cm-1 w kontrolnym widmie Ramana od D-glukozy w roztworze, a zatem można go przypisać glukozie związanej z białkiem, podczas gdy drugi prążek (przy 2,910 ^cm-1) można przypisać wibracjom wiązań C-H zarówno białka, jak i glukozy. Można wywnioskować, że różnica w sygnaturach SERS od GBP wolnego od glukozy i związanego z glukozą substratu jest obserwowalna w tym regionie, a drgania wiązań C-H glukozy związanej z białkami są wykrywalne przy użyciu opisanego projektu.

Rysunek 10. Widma SERS białka wiążącego glukozę bez ligandu (A) i związanego z ligandem (B) unieruchomionego na trzech różnych podłożach w Projekcie 2. Widma uzyskano przy długości fali wzbudzenia 532 nm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

W Projekcie 3, dostosowany aptamer wiążący dopaminę (DBA) z terminacją tiolową²⁴ jest unieruchomiony na podłożu w roztworze buforowym kwasu tris(hydroksymetylo)aminometanowego (TRIS) etylenodiaminotetraoctowego (EDTA), a następnie dopamina jest wiązana z unieruchomionym aptamerem²⁰. Podłoża dla tego projektu zawierają tablice nano-sześciokątów Au na FS (rysunek 6C). Nieustrukturyzowane Au pady (rysunek 6E) są również używane do celów kontrolnych. Ponieważ DNA jest wewnętrznie fluorescencyjne³⁹, w Projekcie 3 zastosowano długość fali wzbudzenia 780 nm w celu zmniejszenia tego czynnika. W tym projekcie element rozpoznający (aptamer) nie jest aktywny ramanowsko w regionie przesunięć ramanowskich uwzględnionych na rysunku 11, podczas gdy dopamina wykazuje znaczącą aktywność ramanowską w tym regionie. Ponieważ sygnał z próbek wystawionych na działanie tylko dopaminy bez unieruchomionego aptameru nie wykazuje wynikowych prążków dopaminy²⁰, oczekuje się, że obserwowane prążki SERS pochodzą z dopaminy związanej z aptamerem. Rysunek 11 porównuje widma SERS unieruchomionego aptameru na nanostrukturach złota przed i po dodaniu dopaminy. Zgodnie z oczekiwaniami, unieruchomiony aptamer wolny od dopaminy nie wykazuje prążków Ramana. W przeciwieństwie do tego, wiele wyraźnych prążków Ramana obserwuje się dla unieruchomionego aptameru związanego z dopaminą. Pozycje większości pasm na rysunku 11 są zbliżone do tych w krystalicznej dopaminie, aczkolwiek z różnicami w amplitudach.

Rysunek 11. Widma SERS aptamera wiążącego dopaminę wolnego od ligandu (linia fioletowa) i związanego z ligandem (niebieska linia) unieruchomionego na podłożach nano-sześciokątnych Au w Projekcie 3²⁰. Czerwona linia pokazuje widmo kontrolne SERS dopaminy w proszku. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dyskusja

SERS zyskuje uznanie jako niezwykle skuteczna technika biodetekcji, oferująca wiele unikalnych zalet. Związek z drganiami molekularnymi pozwala na selektywną identyfikację "odcisków palców" konkretnych analitów z widm SERS, natomiast niezwykle wysoka czułość umożliwia wykrycie bardzo małych ilości analitu^9,10,11,36. Co więcej, SERS jest techniką nieniszczącą, która jest również stosunkowo niewrażliwa na wodę, a zatem bardzo dobrze nadaje się do badania materiałów biologicznych w ich naturalnym środowisku wodnym⁹. Przedstawione wyniki podkreślają te zalety, a także dodatkowo pokazują duży potencjał SERS jako bardzo elastycznej, bezznacznikowej techniki biodetekcji. W trzech projektach wykorzystujących monowarstwy różnych biomolekuł unieruchomionych przez substrat wykryto mody Ramana, które można z całą pewnością przypisać poszczególnym analitom. Fakt, że detekcja tych biomolekuł lub ich odpowiednich ligandów została zademonstrowana przy użyciu płaskich powierzchni stopionej krzemionki jako nośnika dla substratów SERS, sprawia, że projekty są kompatybilne z obecnymi ustawieniami elektroniki i mikrofluidyki, obiecując liczne zastosowania w związku z powstającymi architekturami bioelektronicznymi łączącymi materiały biologiczne z powierzchniami urządzeń elektronicznych i elektrochemicznych^2,3. Co ważne, w dwóch z trzech projektów detekcja SERS została zademonstrowana dla specyficznego wiązania małych cząsteczek, takich jak glukoza i dopamina, wykorzystując monowarstwy odpowiednio białka unieruchomionego powierzchniowo i aptameru jako elementów rozpoznających.

Należy jednak zwrócić uwagę na kilka aspektów, aby osiągnąć skuteczną biodetekcję SERS w warunkach "na chipie". Przede wszystkim dobrze znanym wyzwaniem, które jest wspólne dla większości biomolekuł, jest ich skłonność do degradacji, szczególnie pod wpływem warunków nienaturalnych, takich jak suche środowisko lub intensywne światło lasera. W całym protokole podkreślaliśmy, jak ważne jest, aby biofunkcjonalizowane próbki były zawsze zanurzone w odpowiednich roztworach podczas całego eksperymentu, od przygotowania próbek do uzyskania widm Ramana. W tym ostatnim przypadku zaprojektowano niestandardową wodoodporną komorę (ilustracja 7), aby uniknąć parowania cieczy podczas ekspozycji laserowej. Czas ekspozycji i intensywność lasera powinny być również ograniczone, jak opisano w kroku 5.3 protokołu, aby uniknąć uszkodzenia próbek.

Wyniki detekcji SERS są wrażliwe na geometrię zastosowanego podłoża, a w szczególności na separację międzycechową nanostruktur metalicznych. Jak wynika z rys. 8 i 9, intensywność SERS próbek projektu 1 zależy w dużym stopniu od szerokości przerw między nanokropkami Au na stopionej krzemionce. Spośród trzech matryc nanokropek Au testowanych w tym projekcie (ilustracja 8), najwyższą intensywność Ramana osiągnięto w przypadku Array I, która ma najwęższe odstępy między cechami Au, a zatem zapewnia bardziej efektywne wzmocnienie pola elektromagnetycznego. Jak pokazano na rysunku 9 , wymagana jest kontrola separacji międzycechowych na poziomie 10-20 nm lub mniejszym. Zastosowanie EBL do wytwarzania podłoży SERS, jak pokazano tutaj, zapewnia wydajną rozdzielczość specjalnie do kontrolowania szerokości przerw między cechami. Dzięki odporności na EBL o dodatnim tonie, takiej jak PMMA, rozmiar otworów w maskach PMMA można zmieniać, po prostu zmieniając dawki ekspozycji. Po starcie skutkuje to różnymi rozmiarami wytwarzanych metalowych kropek, a szerokość przerw między kropkami można dostosować, dobierając odpowiednie dawki ekspozycji EBL¹⁸.

Innym wyzwaniem jest optymalizacja geometrii podłoża SERS pod kątem konkretnego zastosowania biodetekcji. Chociaż efekt wzmocnienia zwiększa się wraz ze spadkiem przerw między cechami, stosunkowo duży rozmiar cząsteczek biologicznych nakłada ograniczenia na to, jak wąskie mogą być przerwy. Wynika to wyraźnie z wyników dla Projektu 2, gdzie metoda immobilizacji jest taka, że białko skutecznie wiąże się tylko z powierzchnią między kropkami z metalu szlachetnego, ale nie z samymi kropkami (patrz Rysunek 3B). Jak wynika z rysunku 10, widma SERS dla niestrukturalnych pól Ag nie wykazują żadnych pasm z analitu. Chociaż poduszki wykazują strukturę nanokrystaliczną z bardzo cienkimi przerwami między wyspami (patrz rysunek 6F), przerwy te są zbyt wąskie, aby pomieścić cząsteczkę białka. Jeszcze inny wymiar złożoności pojawia się, gdy trzeba wykryć wiązanie białko-ligand. Na rysunku 10 pasma SERS C-H są bardziej wyraźne w widmach od GBP związanego z ligandem niż w przypadku bezligandowego, co można hipotetycznie wytłumaczyć zmianą konformacji GBP po związaniu D-glukozy^27,28, co skutkuje bardziej sztywną strukturą o zwiększonej aktywności Ramana. Jeśli porównamy dwa nanostrukturalne substraty, pasmo C-H z białka wolnego od ligandów jest silniejsze w widmach SERS uzyskanych z substratem nano-kropek, podczas gdy zarówno pasma C-H białka, jak i glukozy z białka związanego z ligandem są bardziej wyraźne w przypadku substratu nano-sześciokątów. Oczekuje się, że dwa czynniki spowodują te różnice: dostępność przestrzeni między cechami Ag, w której GBP może wiązać się z Ni, oraz podatność białka związanego z ligandem i wolnego od ligandów na elektromagnetyczne wzmocnienie rozpraszania Ramana w "gorących punktach" między tymi cechami. Z jednej strony, wzór nano-kropek oferuje stosunkowo większy obszar między cechami, w którym powłoka Ni jest dostępna do wiązania białka, co może wyjaśniać bardziej wyraźne pasmo C-H obserwowane dla GBP wolnego od glukozy na podłożu nano-kropek Ag. Z drugiej strony, ze względu na ich niejednorodną strukturę (patrz rysunek 6D), nano-sześciokąty Ag mogą być podatne na wykazywanie silniejszego wzmocnienia elektromagnetycznego w wąskich przerwach między wyspami Ag w nano-sześciokątach, co skutkuje silniejszymi pasmami drgań C-H z GBP związanego z glukozą na podłożu nano-sześciokątów. Niektóre szczegóły tej zależności wymagają dalszej weryfikacji, a optymalizacja substratów SERS dla złożonych analitów obejmujących duże białka, takie jak GBP, jest nadal w przygotowaniu.

Oczywiste jest, że wykrywanie wiązania ligandów metodą SERS przy użyciu unieruchomionych biomolekuł jako elementu rozpoznającego jest ułatwione, gdy tylko ligand jest aktywny ramanowsko w wybranym regionie, podczas gdy inne składniki nie są. Tak jest w przypadku Projektu 3, w którym uzyskuje się wyraźne prążki SERS dopaminy związanej z aptamerem (ryc. 11). Para aptamer-dopamina wykazuje doskonałą specyficzność, a widmo SERS składa się z wyraźnych pasm bez znaczącego sygnału tła.

Przyszły postęp w technologii SERS opartej na opłatach za etykietowanie będzie wymagał szeroko zakrojonych testów wzmocnienia sygnału SERS w biomolekułach z szerokim zakresem różnych projektów nanostruktur powierzchniowych. Wykorzystanie litografii wiązką elektronów z bezpośrednim zapisem do wytwarzania różnych nanostruktur z doskonałym poziomem kontroli nad rozmiarem, kształtem i separacją między cechami, w połączeniu z przedstawionymi tutaj protokołami przygotowania próbek ułatwiłoby porównanie i walidację krzyżową wyników uzyskanych przez różne grupy badawcze. Rozwiązałoby to główne wyzwanie, jakim jest odtwarzalność, gdy substraty SERS są wytwarzane przy użyciu alternatywnych metod "od dołu do góry"^11,12,13, co pozwoliłoby na lepszą kontrolę rozmiaru i położenia nanostruktury metalu w celu wiarygodnej identyfikacji optymalnego projektu podłoża dla szerokiej gamy zastosowań. Skalowalność tych technik może zostać następnie poprawiona poprzez połączenie EBL z uzupełniającymi metodami nanolitografii, takimi jak litografia nanoodcisków²⁰ , w kierunku przyszłej masowej produkcji projektów w nanoskali zoptymalizowanych przy użyciu przestrajalnych technik EBL.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Kwas 11-merkaptoundekanowy (MUA)	Sigma Aldrich	450561  ALDRICH	Używany do funkcjonalizacji powierzchni w Design 1
	przewodzący	aquaSAVE-57xs	Warstwa o grubości 70 nm jest stosowana jako powłoka zapobiegająca ładowaniu do ekspozycji na EBL
D-glucose	Collaborator Lab.		Ligand w laboratorium współpracującym z
dopaminą	.		Ligand w projekcie 3
Aptamer wiążący dopaminę (DBA)	Integrated DNA Technologies Inc.	5'- /Modyfikator tiolu C6 S-S/  AAAAAAAAAAA GTCTCTGTGT GCGCCAGAGA ACACTGGGGC AGATATGGGC CAGCACAGAA TGAGGCCC-3'	Biopolimer w projekcie 3
Stopione wafle	krzemionkowe Mark Optics
Białko wiążące glukozę (GBP)	Collaborator Lab.	PDB ID 2HPH	Biopolimer w projekcie 2
	wysokopróżniowy		Służy do uszczelniania wodoszczelnych komór
Nadtlenek wodoru 30%, H2O2	J.T. Baker		Używany do roztwór pirahny
N-etylo-N'-(3-(dimetyloamino)propylo)karbodimid (EDC)	Sigma Aldrich 03450 FLUKA Służy do immobilizacji biopolimeru w Projekcie 1N-Hydroksysukcynimid (NHS)
	Sigma Aldrich	130672 ALDRICH	Służy do immobilizacji biopolimeru w Bufor
fosforanu potasu	Collaborator Lab.		Bufor stosowany do pobierania próbek Ramana
Buforowane fosforany (PBS)	Collaborator Lab.		Rozpuszczalnik w projekcie 3
Polimetakrylan metylu (PMMA) 950 A2	MicroChem		Warstwa o grubości 90 nm jest używana jako
rekombinowane białko
Protein Mods Inc	PDB ID 1BDD	Biopolimer w projekcie 1
Kwas siarkowy 96%, H2SO4	J.T. Baker		Używany do roztworu
Bufor tris(hydroksymetylo)aminometanu (TRIS) i kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA)
Equipment
Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Piła do krojenia w kostkę	Diamond Touch Technology Inc. (17301 W Colfax Ave #  152, Golden, CO)		Służy do cięcia wafla
	wiązki elektronów		Używany do odparowywania
Parownik	wiązki elektronów Johnsen Ultravac (JUV)	JuV E-gun	używany do odparowywania Ni
Szkiełka nakrywkowe mikroskopu (25 mm)	Fisher Scientific	12-545-102	Używany w wodoszczelnej komorze
Szkiełka mikroskopowe (3& razy; 1 w.)	Fisher Scientific		Używany w wodoszczelnej komorze
Raith 150TWO System ekspozycji	EBL Raith Inc.	System Raith 150TWO	Używany do ekspozycji
	Ramana	Nicolet Almega XR	Używany do spektroskopii
System	Sonicator Branson		Służy do startu i mieszania
Spinner	Browar Spinner i płyta grzejna	Cee 200X i Cee 1300X	Służy do wirowania PMMA i polimeru przewodzącego