Method Article

Barwienie immunologiczne w celu wizualizacji rozwoju mysiego jelitowego układu nerwowego

DOI:

10.3791/52716

⸱

April 29th, 2015

 ,  ,  , 
1Department of Surgery, University of Wisconsin School of Medicine and Public Health, 2Department of Neurosciences, University of Wisconsin School of Medicine and Public Health, 3Department of Pediatrics, University of Wisconsin School of Medicine and Public Health

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Jelitowy układ nerwowy tworzą komórki grzebienia nerwowego, które namnażają się, migrują i kolonizują jelita. Komórki grzebienia nerwowego różnicują się w neurony z markerami specyficznymi dla ich fenotypu neuroprzekaźnika. Protokół ten opisuje technikę preparowania, utrwalania i barwienia immunologicznego mysiego embrionalnego przewodu pokarmowego w celu wizualizacji ekspresji neuroprzekaźników jelitowego układu nerwowego.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Jelitowy układ nerwowy tworzą komórki grzebienia nerwowego, które namnażają się, migrują i kolonizują jelita. Po kolonizacji komórki grzebienia nerwowego muszą następnie różnicować się w neurony z markerami specyficznymi dla ich fenotypu neuroprzekaźnika. Neurony cholinergiczne, główny fenotyp neuroprzekaźnika w jelitowym układzie nerwowym, są identyfikowane przez barwienie acetylotransferazy choliny (ChAT), enzymu syntetyzującego acetylocholinę. Historyczne wysiłki mające na celu wizualizację neuronów cholinergicznych były utrudnione przez przeciwciała o różnej swoistości dla ośrodkowego układu nerwowego w porównaniu z obwodowym układem nerwowym ChAT. My i inni przezwyciężyliśmy to ograniczenie, używając przeciwciała przeciwko łożyskowemu ChAT, które rozpoznaje zarówno centralny, jak i obwodowy ChAT, aby skutecznie uwidocznić embrionalne jelitowe neurony cholinergiczne. Dodatkowo porównaliśmy to przeciwciało z reporterami genetycznymi dla ChAT i wykazaliśmy, że przeciwciało jest bardziej niezawodne podczas embriogenezy. Protokół ten opisuje technikę preparowania, utrwalania i barwienia immunologicznego mysiego embrionalnego przewodu pokarmowego w celu wizualizacji ekspresji neuroprzekaźników jelitowego układu nerwowego.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Funkcjonujący jelitowy układ nerwowy (ENS), który kontroluje ruchliwość, wchłanianie składników odżywczych i miejscowy przepływ krwi, jest niezbędny do życia1. ENS jest tworzony przez komórki grzebienia nerwowego (NCC), które namnażają się, migrują i kolonizują jelita, gdzie różnicują się w zwoje zawierające neurony i komórki glejowe. Choroba Hirschsprunga (HSCR, Online Mendelian Inheritance in Man), wielogenowe zaburzenie wrodzone, występujące 1 na 4000 żywych urodzeń, może być uważana za chorobę prototypową do badania zaburzonego tworzenia ENS. W HSCR NCC nie migruje i nie kolonizuje zmiennych długości dystalnego jelita tylnego2. Ponadto inne powszechne wady rozwojowe przewodu pokarmowego (GI) w populacji pediatrycznej, takie jak wady rozwojowe odbytu, atrezje jelit i zaburzenia motoryki, są związane z zaburzeniami podstawowych funkcji ENS i prawdopodobnie są związane z subtelnymi, niedocenianymi zmianami anatomicznymi i zmianami funkcjonalnymi w ENS3-6. W związku z tym techniki, które pozwalają zrozumieć rozwojowe uwarunkowania powstawania ENS, mogą rzucić światło na patogenezę i potencjalne leczenie zaburzeń przewodu pokarmowego u dzieci.

Po migracji i kolonizacji, NCC różnicuje się w neurony z markerami specyficznymi dla ich fenotypu neuroprzekaźnika. Neurony cholinergiczne stanowią około 60% neuronów jelitowych7 i można je wykryć poprzez barwienie na obecność acetylotransferazy choliny (ChAT), enzymu syntetyzującego neuroprzekaźnik pobudzający acetylocholinę. Historycznie rzecz biorąc, próby wizualizacji neuronów cholinergicznych były mylone przez różną swoistość antygenową przeciwciał skierowanych przeciwko ChAT ośrodkowego układu nerwowego (OUN) w porównaniu z obwodowym układem nerwowym (PNS) ChAT8-10. Jednak przeciwciała skierowane przeciwko łożyskowemu ChAT rozpoznają zarówno centralny, jak i obwodowy ChAT11-13, a ostatnio opisaliśmy techniki, które pozwalają na wizualizację neuronów cholinergicznych ENS o wysokiej czułości na wcześniejszym etapie rozwoju niż osiągnięto to w przypadku linii reporterowychChAT 14.

Tutaj prezentujemy technikę preparowania, utrwalania i barwienia immunologicznego mysiego embrionalnego przewodu pokarmowego w celu wizualizacji ekspresji neuroprzekaźników ENS w neuronach. Do tych badań wykorzystaliśmy myszy ChAT-Cre współpracujące ze zwierzętami R26R:floxSTOP:tdTomato do produkcji ChAT-Cre; R26R:floxSTOP:tdMyszy pomidorowe (zdefiniowane jako ChAT-Cre tdTomato w całym manuskrypcie). Zwierzęta te zostały następnie skrzyżowane z homozygotycznymi myszami reporterowymi ChAT-GFP, aby uzyskać myszy wykazujące ekspresję obu fluorescencyjnych reporterów, które wykrywają ekspresję ChAT14. Te dwa zwierzęta reporterskie są na tle C57BL/6J i są dostępne na rynku (Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami Uniwersytetu Wisconsin zatwierdził wszystkie procedury.

1. Przygotowanie roztworów

  1. Użyj 1x soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) jako buforu rozwarstwiającego i roztworu do płukania.
  2. Przygotuj 30% sacharozy, ważąc 30 g sacharozy i umieść w butelce. Dodać 99 ml 1x PBS i dodać 1 ml 10% azydku sodu. Dokładnie wymieszaj, aż cała sacharoza się rozpuści. Przechowywać w temperaturze 4 °C do czasu, gdy będzie to potrzebne.
  3. Przygotować roztwór blokujący, mieszając 1x PBS, 3% albuminę surowicy bydlęcej (BSA) i 0,1% Triton-X-100. Dokładnie wymieszaj i przechowuj w lodówce, aż będzie potrzebny.
  4. Przygotować 8% roztwór paraformaldehydu (PFA) w 1x PBS, ważąc odpowiednią ilość PFA do 1x PBS, a następnie inkubować w temperaturze 65 °C, aż do całkowitego rozpuszczenia. Przechowywać w 25 ml porcji w zamrażarce w temperaturze -20 °C do czasu, gdy będą potrzebne. Rozcieńczyć do 4% PFA w 1x PBS w dniu stosowania.

2. Rozwarstwienie zarodków i jelit

  1. Zgodnie z zatwierdzonymi protokołami Instytucjonalnego Komitetu ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt, poddaj eutanazji ciężarną mysz w czasie i przenieś macicę na 60-milimetrową szalkę Petriego zawierającą lodowaty 1x PBS.
  2. Pod mikroskopem preparacyjnym za pomocą ostrych nożyczek rozetnij ścianę macicy, aby odsłonić zarodki. Usuń zarodki z macicy i umieść je na czystej szalce Petriego o średnicy 60 mm zawierającej lodowatą płytkę 1x PBS.
  3. Eutanazja każdego zarodka przez dekapitację w lodowatym 1x PBS. Jeśli używasz myszy transgenicznych zawierających białka fluorescencyjne, w oświetleniu fluorescencyjnym zidentyfikuj dodatnie zarodki transgeniczne.
  4. Wypreparuj przewód pokarmowy z każdego zarodka za pomocą mikroskopu preparacyjnego. Za pomocą cienkich kleszczy ustaw zarodek tak, aby lewa strona była skierowana do góry, a prawa strona przylegała do dna szalki Petriego. Usuń górną ścianę ciała z zarodka, aby odsłonić narządy wewnętrzne. Włóż cienkie kleszcze między grzbietową ścianę ciała a narządy wewnętrzne. Skrzyżuj kleszcze ze sobą w ruchu tnącym przypominającym nożyczki, aby usunąć narządy wewnętrzne z zarodka.
  5. Następnie należy rozciąć przewód pokarmowy z dala od otaczających narządów, a następnie umieścić każdy przewód pokarmowy w probówce mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml zawierającej lodowaty 1x PBS.

3. Utrwalenie przewodu pokarmowego

  1. Przepłucz każdy przewód pokarmowy 3 razy lodowatym 1x PBS, a następnie zastąp 4% PFA. Zamocuj przewód pokarmowy w probówkach do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml na platformie kołyszącej w temperaturze pokojowej przez 1,5 godziny. Opłucz przewód pokarmowy 3 razy przez 5 minut w temperaturze pokojowej, a następnie przez 1 godzinę na platformie do bujania. Na tym etapie należy przechowywać przewód pokarmowy w temperaturze 4 °C w 30% sacharozie w 1x PBS zawierającym 0,1% azydku sodu, aż będzie potrzebny.
    UWAGA: Alternatywnie, przechowuj zarodki w 30% sacharozie przez okres do jednego roku bez żadnego wpływu na integralność tkanek. Przechowywanie próbek w 30% sacharozie pozwala na późniejsze przetworzenie próbek do barwienia immunologicznego lub do OCT w celu kriosekcji. Alternatywnie postępuj zgodnie z protokołem barwienia immunologicznego opisanym poniżej.

4. Protokół barwienia immunologicznego

  1. Jeśli próbki były przechowywane w 30% sacharozy, przepłucz je 3 razy przez 20 minut w 1x PBS na platformie bujanej.
  2. Umieść odcinki przewodu pokarmowego w roztworze blokującym na platformie bujanej na 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
  3. Usunąć roztwór blokujący i inkubować drogi pokarmowe z odpowiednią ilością przeciwciał pierwszorzędowych rozcieńczonych w roztworze blokującym przez 4 godziny w temperaturze pokojowej lub O/N w temperaturze 4 °C na platformie kołyszącej. Stosować rozcieńczenie 1:1,000 ludzkiego przeciwciała anty-Hu (surowica uzyskana od pacjenta), rozcieńczenie 1:1,000 przeciwciała przeciwko białku zielonej fluorescencji (GFP) kurczaka i 1:100 rozcieńczenie koziego przeciwciała anty-ChAT.
    UWAGA: Używamy ludzkiego przeciwciała anty-Hu, które zostało uzyskane lokalnie od pacjenta, jednak przeciwciała anty-Hu są dostępne w handlu, na przykład mysie przeciwciała anty-Hu (stosować w rozcieńczeniu 1:500).
  4. Płucz przewód pokarmowy w 1x PBS 3 razy przez 5 minut, a następnie przez 1 godzinę w temperaturze RT na bujanej platformie.
  5. Zastąp 1x PBS przeciwciałami drugorzędowymi rozcieńczonymi w stosunku 1:500 w roztworze blokującym na platformie kołyszącej przez 4 godziny w temperaturze RT lub O/N w temperaturze 4 °C. Użyj barwnika anty-ludzkiego przeciw-ludzkiego reagującego z aminami, takiego jak Dylight, osła anty-kurczak Cy2 i ośła anty-koza Cy5. Jeśli używasz mysiego przeciwciała anty-Hu, użyj rozcieńczenia 1:500 barwnika anty-mysiego reagującego z aminami 405,
    UWAGA: Intensywność endogennej ekspresji GFP i tdTomato oraz klarowność barwienia immunologicznego wzrastają wraz z wiekiem rozwojowym. Zazwyczaj barwiemy immunologicznie jelita embrionalne pojedynczo w probówkach o pojemności 0,2 ml ze 150 μl roztworu barwiącego, aby zmniejszyć objętość użytego przeciwciała, a także zapewnić skuteczne barwienie tkanki.
  6. Płucz przewód pokarmowy w 1x PBS 3 razy przez 5 minut, a następnie przez 1 godzinę w temperaturze RT na bujanej platformie.
  7. Umieść kilka kropli fluorescencyjnego podłoża montażowego z DAPI na szklanym szkiełku. Zanurz przewód pokarmowy w pożywce do montażu fluorescencji i dodaj szkło nakrywkowe bezpośrednio na chusteczkę. Fluorescencyjny nośnik montażowy -G jest rozpuszczalnym w wodzie związkiem, który zapewnia półtrwałe uszczelnienie.
    UWAGA: Użyj pożywki do montażu fluorescencji, takiej jak Vectashield, która jest pożywką montażową na bazie glicerolu, która zapobiega blaknięciu i fotowybielaniu przeciwciał. Oba te produkty umożliwiają przechowywanie tkanek przez długi czas w temperaturze 4 °C.
  8. Uchwyć obrazy każdego z fluoroforów za pomocą mikroskopu konfokalnego. Dla zastosowanych fluoroforów i filtrów należy stosować długości fal wzbudzenia przedstawione w tabeli 3.
  9. Wykonuj komputerową analizę obrazu za pomocą odpowiedniego oprogramowania w zależności od typu konfokalnego używanego do przechwytywania obrazów.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wcześniej opisaliśmy pokolenie myszy wykazujących ekspresję zarówno GFP, jak i tdTomato fluorescencyjne reportery, które wykrywają ekspresję ChAT14. Krótko mówiąc, myszy ChAT-Cre zostały skrzyżowane ze zwierzętami R26R:floxSTOP:tdTomato w celu wytworzenia ChAT-Cre; R26R:floxSTOP:tdMyszy pomidorowe (zwane ChAT-Cre tdTomato). Zwierzęta te zostały następnie skrzyżowane z homozygotycznymi myszami reporterowymi ChAT-GFP. Zarodki izolowano, a tkanki preparowano przed utrw...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nasze laboratorium i inne wykazały, że wady jelitowe w HSCR nie ograniczają się do okrężnicy zwojowej, ale rozciągają się proksymalnie, nawet do zwojowego jelita cienkiego5,15,16. Zmiany te obejmują zmiany w gęstości neuronów ENS i fenotypie neuroprzekaźników i mogą odpowiadać za dysmotorykę, którą zaobserwowano u pacjentów z HSCR. Wykorzystaliśmy powyższe techniki w naszych wysiłkach na rzecz zrozumienia determinantów powstawania ENS. W szczególności techniki te zostały wykorzystane do wizualizacji neuronów n...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez Nagrodę Fundacji Amerykańskiego Towarzystwa Chirurgicznego Dziecięcego (AG) oraz National Institutes of Health K08DK098271 (AG).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Sól fizjologiczna buforowana fosforanamiOxoidBR0014G
SacharozaFisherS2
Azydek soduFisherBP9221
Albumina surowicy bydlęcejFisherBP1605
Triton X-100SigmaX100
ParaformaldehydSigma158127
60 mm Szalki PetriegoFisherFB0875713A
Mikroskop fluorescencyjnyNikonSMZ-18 stereoskop
Mikroskop preparacyjnyNikonSMZ-18 stereoskop
Cienkie kleszczeNarzędzia precyzyjne11252-20
1,5 ml Probówki EppendorfVWR20170-038
Fluoromount-GSouthernBiotech, Birmingham, AL0100-01
Szkiełka szklaneFisher12-550-15
Szkło nakrywkoweVWR16004-330
Mikroskop konfokalnyNikon NikonA1
Nikon ElementyNikon

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Gershon, M. D. Developmental determinants of the independence and complexity of the enteric nervous system. Trends Neurosci. 33 (10), 446-456 (2010).
  2. Amiel, J., Sproat-Emison, E., et al. Hirschsprung disease, associated syndromes and genetics: a review. J Med Genet. 45 (1), 1-14 (2008).
  3. Erickson, C. S., Barlow, A. J., et al. Colonic enteric nervous system analysis during parenteral nutrition. J Surg Res. 184 (1), 132-137 (2013).
  4. Erickson, C. S., Zaitoun, I., Haberman, K. M., Gosain, A., Druckenbrod, N. R., Epstein, M. L. Sacral neural crest-derived cells enter the aganglionic colon of Ednrb(-/-) mice along extrinsic nerve fibers. J Comp Neurol. 20 (3), 620-632 (2011).
  5. Zaitoun, I., Erickson, C. S., et al. Altered neuronal density and neurotransmitter expression in the ganglionated region of Ednrb null mice: implications for Hirschsprung's disease. Neurogastroenterol Motil. , (2013).
  6. Margolis, K. G., Stevanovic, K., et al. Enteric neuronal density contributes to the severity of intestinal inflammation. Gastroenterology. 141 (2), 588-598 (2011).
  7. Qu, Z. -D., Thacker, M., Castelucci, P., Bagyánszki, M., Epstein, M. L., Furness, J. B. Immunohistochemical analysis of neuron types in the mouse small intestine. Cell Tissue Res. 334 (2), 147-161 (2008).
  8. Bian, X. -C., Bornstein, J. C., Bertrand, P. P. Nicotinic transmission at functionally distinct synapses in descending reflex pathways of the rat colon. Neurogastroenterol Motil. 15 (2), 161-171 (2003).
  9. Johnson, C. D., Epstein, M. L. Monoclonal antibodies and polyvalent antiserum to chicken choline acetyltransferase. J Neurochem. 46 (3), 968-976 (1986).
  10. Tooyama, I., Kimura, H. A protein encoded by an alternative splice variant of choline acetyltransferase mRNA is localized preferentially in peripheral nerve cells and fibers. J Chem Neuroanat. 17 (4), 217-226 (2000).
  11. Koga, T., Bellier, J. -P., Kimura, H., Tooyama, I. Immunoreactivity for Choline Acetyltransferase of Peripheral-Type (pChAT) in the Trigeminal Ganglion Neurons of the Non-Human Primate Macaca fascicularis. Acta histochemica et cytochemica. 46 (2), 59-64 (2013).
  12. Sang, Q., Young, H. M. The identification and chemical coding of cholinergic neurons in the small and large intestine of the mouse. Anat Rec. 251 (2), 185-199 (1998).
  13. Lei, J., Howard, M. J. Targeted deletion of Hand2 in enteric neural precursor cells affects its functions in neurogenesis, neurotransmitter specification and gangliogenesis, causing functional aganglionosis. Development (Cambridge, England). 138 (21), 4789-4800 (2011).
  14. Erickson, C. S., Lee, S. J., Barlow-Anacker, A. J., Druckenbrod, N. R., Epstein, M. L., Gosain, A. Appearance of cholinergic myenteric neurons during enteric nervous system development: comparison of different ChAT fluorescent mouse reporter lines. Neurogastroenterol Motil. 26 (6), 874-884 (2014).
  15. Teitelbaum, D. H., Caniano, D. A., Qualman, S. J. The pathophysiology of Hirschsprung's-associated enterocolitis: importance of histologic correlates. J Pediatr Surg. 24 (12), 1271-1277 (1989).
  16. Aslam, A., Spicer, R. D., Corfield, A. P. Children with Hirschsprung's disease have an abnormal colonic mucus defensive barrier independent of the bowel innervation status. J Pediatr Surg. 32 (8), 1206-1210 (1997).
  17. Puig, I., Champeval, D., De Santa Barbara, P., Jaubert, F., Lyonnet, S., Larue, L. Deletion of Pten in the mouse enteric nervous system induces ganglioneuromatosis and mimics intestinal pseudoobstruction. J Clin Invest. 119 (12), 3586-3596 (2009).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Enteric Nervous SystemMurine Embryonic GutCholine AcetyltransferaseImmunostaining TechniquePlacental ChAT AntibodyNeural Crest CellsCholinergic NeuronsGastrointestinal Tract DissectionEmbryonic DevelopmentNeurotransmitter Phenotype

Related Articles