Artykuł metodologiczny

In vivo (in vivo)Dynamika aktywacji mikrogleju siatkówki podczas neurodegeneracji: konfokalne obrazowanie oftalmoskopowe i morfometria komórkowa w jaskrze myszy

DOI:

10.3791/52731

⸱

11 maja 2015

 ,  ,  , 
1Department of Neurobiology & Anatomy, University of Utah, 2Department of Ophthalmology & Visual Sciences, University of Utah

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aktywacja mikrogleju i mikroglejoza są kluczowymi odpowiedziami na przewlekłą neurodegenerację. W tym miejscu przedstawiamy metody długoterminowej wizualizacji in vivo komórek mikrogleju CX3CR1-GFP+ siatkówki za pomocą oftalmoskopii konfokalnej oraz analiz progowych i morfometrycznych w celu identyfikacji i ilościowego określenia ich aktywacji. Monitorujemy zmiany mikrogleju we wczesnych stadiach jaskry związanej z wiekiem.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mikroglej, które są komórkami neuroimmunologicznymi rezydującymi w OUN, przekształcają swoją morfologię i rozmiar w odpowiedzi na uszkodzenie OUN, przechodząc do stanu aktywowanego z odrębnymi funkcjami i profilami ekspresji genów. Rola aktywacji mikrogleju w zdrowiu, urazach i chorobach pozostaje nie w pełni poznana ze względu na ich dynamiczną i złożoną regulację w odpowiedzi na zmiany w ich mikrośrodowisku. Dlatego tak ważne jest nieinwazyjne monitorowanie i analizowanie zmian w aktywacji mikrogleju w czasie w nienaruszonym organizmie. Badania in vivo aktywacji mikrogleju zostały opóźnione przez ograniczenia techniczne w śledzeniu zachowania mikrogleju bez zmiany środowiska OUN. Jest to szczególnie trudne w przypadku przewlekłej neurodegeneracji, gdzie konieczne jest śledzenie długoterminowych zmian. Siatkówka, narząd OUN podatny na nieinwazyjne obrazowanie na żywo, oferuje potężny system do wizualizacji i charakteryzowania dynamiki aktywacji mikrogleju podczas chorób przewlekłych.

Ten protokół przedstawia metody długoterminowego, in vivo obrazowania mikrogleju siatkówki, przy użyciu oftalmoskopii konfokalnej (cSLO) i myszy reporterowych CX3CR1GFP/+, do wizualizacji mikrogleju z rozdzielczością komórkową. Opisujemy również metody ilościowego określania miesięcznych zmian w aktywacji i gęstości komórek w dużych podzbiorach komórek (200-300 komórek na siatkówkę). Potwierdzamy użycie obszaru somalnego jako użytecznego wskaźnika do śledzenia na żywo aktywacji mikrogleju w siatkówce, stosując zautomatyzowaną analizę morfometryczną opartą na progach obrazów in vivo. Wykorzystujemy te strategie pozyskiwania i analizy obrazów na żywo do monitorowania dynamicznych zmian w aktywacji mikrogleju i mikrogleju we wczesnych stadiach neurodegeneracji siatkówki w mysim modelu przewlekłej jaskry. Takie podejście powinno być przydatne do zbadania wpływu mikrogleju na spadek neuronów i aksonów w przewlekłych zaburzeniach OUN, które wpływają na siatkówkę i nerw wzrokowy.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mikroglej to komórki neuroimmunologiczne, które znajdują się wyłącznie w ośrodkowym układzie nerwowym (OUN) od wczesnego rozwoju embrionalnego i przez cały okres dorosłości. Wyposażone w złożony repertuar receptorów, aktywność mikrogleju i niejednorodność regionalna są regulowane przez ich dwukierunkowe oddziaływanie z sąsiednimi neuronami, glejem, barierą krew-mózg i naciekającymi komórkami neurozapalnymi1,2. Podstawowe funkcje mikrogleju przyczyniają się do fizjologicznego utrzymania i naprawy, ponieważ pobierają próbki ze swojego terytorium pod kątem zaburzeń homeostazy3,4. Podczas uszkodzenia lub choroby OUN mikroglej jako pierwszy reaguje na sygnały neuronalne, które następnie wyzwalają ich przejście do reaktywnego fenotypu, zwanego "aktywowanym mikroglejem2,5-7. Aktywacja mikrogleju obejmuje skomplikowany cykl ekspresji genów i białek, które są sprzężone z somą komórkową i procesem zmiany rozmiaru i przebudowy6-9. Aktywacji mikrogleju, a także redystrybucji i grupowaniu komórek może towarzyszyć lokalny ogólny wzrost liczby komórek (określany jako mikroglejoza). Może to wynikać z proliferacji i samoodnawiania komórek, z rekrutacją lub bez rekrutacji monocytów pochodzących z krwi3,4,7,10-14. W szerokim zakresie zależnych od wieku, przewlekłych chorób OUN, utrzymująca się mikroglejoza i aktywacja mikrogleju przebiegają równolegle z progresją choroby15-19. To, w jaki sposób mikroglej wpływa na neurodegenerację, pozostaje niejasne, głównie dlatego, że odgrywają zarówno neuroprotekcyjne, jak i szkodliwe role, które mogą mieć różny wpływ na początek i postęp choroby. Badania obrazowe na żywo mające na celu zrozumienie przewlekłej choroby OUN monitorowały zachowanie mikrogleju w uszkodzonym OUN modeli zwierzęcych i ludzi oraz wykazały, że zmiany mikrogleju są wykrywalne już we wczesnych stadiach choroby15-17,19,20. W związku z tym tak ważne jest opracowanie metod wykrywania i monitorowania aktywacji mikrogleju in vivo.

Nieinwazyjne wykrywanie regionalnych zmian w aktywacji mikrogleju w mózgu zostało uznane za ważny wskaźnik in vivo postępu choroby neurodegeneracyjnej, przy użyciu obrazowania molekularnego lub bioluminescencji i pozytonowej tomografii emisyjnej lub rezonansu magnetycznego18,21,22. Te wysoce ilościowe i nieinwazyjne metody obrazowania molekularnego i jądrowego wykrywają glejozę z rozdzielczością regionalną. Alternatywnie, dwufotonowe obrazowanie konfokalne u myszy CX3CR1GFP / + pozwoliło na obserwację mikrogleju mózgu z rozdzielczością komórkową3,4,9,20,23-28. Jednak takie podejście ogranicza długotrwałą i powtarzającą się obserwację przewlekłych zmian mikrogleju, biorąc pod uwagę potencjalne ryzyko zakłócenia ich zachowania przez nawet minimalnie inwazyjne procedury obrazowania mózgu29. Alternatywnie, siatkówka oferuje optymalne warunki do bezpośredniej wizualizacji in vivo i wielokrotnego monitorowania mikrogleju w nienaruszonej niszy OUN przez cały okres starzenia, po ostrym urazie i potencjalnie podczas przewlekłych chorób neurodegeneracyjnych. W związku z tym ostatnie badania dowiodły wykonalności obrazowania w wysokiej rozdzielczości mikrogleju siatkówki wykazującego ekspresję GFP poprzez dostosowanie konfokalnej skaningowej oftalmoskopii laserowej (cSLO) do obrazowania żywych myszy CX3CR1GFP / +. Zostało to wykorzystane do śledzenia tygodniowych zmian liczby komórek GFP+ u poszczególnych myszy przez okres do 10 tygodni po ostrym urazie lub nadciśnieniu ocznym30-36.

Rozszerzyliśmy to podejście, aby wykonywać długoterminowe obrazowanie przez kilka miesięcy i ilościowo śledzić zmiany w aktywacji mikrogleju na podstawie wielkości somy za pomocą analizy morfometrycznej. Wielkość somalna została zdefiniowana jako użyteczny wskaźnik aktywacji mikrogleju w badaniach obrazowania na żywo przy użyciu dwufotonowej mikroskopii konfokalnej w wycinkach korowych w celu wykonania obrazowania in vivo mikrogleju CX3CR1-GFP+9. Te i inne badania wykazały również korelację między wielkością somalną a poziomem ekspresji białka Iba1, która również wzrasta wraz z aktywacją9,37. W ten sposób aktywowany mikroglej można zidentyfikować u żywych myszy, a jego liczbę i rozmieszczenie monitorować w czasie podczas zdrowia i choroby OUN.

Ten protokół opisuje metody pozyskiwania i analizy obrazów na żywo cSLO w celu monitorowania liczby komórek mikrogleju, dystrybucji i aktywacji morfologicznej podczas degeneracji komórek zwojowych siatkówki (RGC) (Rysunek 1). W związku z tym w badaniu wykorzystano: 1) mysi model jaskry dziedzicznej (DBA/2J), który ulega zależnej od wieku neurodegeneracji nerwu wzrokowego i siatkówki oraz wykazuje niezwykłą zmienność w postępie choroby między 5 a 10 miesiącem życia38,39, 2) miesięczne obrazowanie cSLO in vivo do długoterminowej wizualizacji komórek GFP+ w siatkówce i niezmielinizowanym nerwie wzrokowym heterozygotycznego Cx3cr1GFP/+ Myszy DBA / 2J w wieku 3-5 miesięcy, 3) analiza obrazowania na żywo poprzez segmentację i progowanie w celu wyizolowania somatów komórkowych i zmierzenia ich powierzchni. Strategie te są stosowane do oceny kinetyki stanów aktywacji mikrogleju siatkówki we wczesnych stadiach jaskry przewlekłej.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Obrazowanie in vivo jest wykonywane w obiektach wolnych od patogenów przy użyciu protokołów zatwierdzonych przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt na Uniwersytecie Utah.
UWAGA: Ten protokół obrazowania jest stosowany u myszy reporterowych, u których mikroglej siatkówki i naciekające monocyty/makrofagi wyrażają białko zielonej fluorescencji (GFP) pod kontrolą locus receptora fraktalkiny (CX3CR1).

1. Obrazowanie in vivo mikrogleju siatkówki GFP+ za pomocą konfokalnej skaningowej oftalmoskopii laserowej (cSLO)

  1. Włącz system ogrzewania sterowany wodą, ustawiony tak, aby ustabilizował temperaturę myszy w zakresie 35-37 ºC podczas zabiegu i podłącz dwie poduszki grzewcze.
    1. Uruchom system konfokalnego skaningowego oftalmoskopu laserowego (cSLO) (Rysunek 2A). Otwórz program cSLO, wprowadź informacje, które pozwolą zidentyfikować pojedynczą mysz i ustaw krzywiznę rogówki na 2 mm (menu Dane pacjenta).
  2. Przygotuj się do obrazowania. Bezpiecznie zamontuj czystą soczewkę obiektywu szerokokątnego 55º w gnieździe. Przygotuj platformę do obrazowania oftalmoskopowego, zabezpieczając poduszkę grzewczą pokrytą czystym papierem. Użyj klipsów, aby spłaszczyć podkładkę i papier i nie dopuścić do tego, aby blokowały ruch soczewki obiektywu.
  3. Znieczulić mysz przez dootrzewnowe wstrzyknięcie 1,3% 2,2,2-tribromoetanolu i 0,8% alkoholu tert-amylowego (250 mg/kg masy ciała; 0,5 ml/25 g masy ciała) za pomocą igły 301/2 G umieszczonej w jednorazowej strzykawce o pojemności 1 ml. Umieść mysz z powrotem w klatce, trzymanej nad poduszką grzewczą.
    UWAGA: Podawanie środka znieczulającego przez wstrzyknięcie w porównaniu z inhalacją umożliwia łatwiejsze ustawienie myszy do obrazowania i niezakłócony dostęp do oczu, bez stożków nosowych i rurek.
  4. Gdy zwierzę przestanie się poruszać i nie będzie reagować na szczypanie ogona, należy wywołać rozszerzenie źrenicy za pomocą tropikamidu i fenylefryny (po 0,5%), ustawiając zwierzę w pozycji leżącej i zakrywając oba oczy kroplami na 7 minut.
  5. Po 5 minutach połóż mysz na brzuchu na środku platformy oftalmoskopowej i załóż soczewki kontaktowe na oba oczy, wywierając minimalny nacisk.
    UWAGA: Soczewki kontaktowe są małe i delikatne, ale można z nimi ostrożnie obchodzić się palcami, chociaż zamiast nich można użyć kleszczyków40. Stosowanie soczewek kontaktowych jest opcjonalne, ale zalecane, ponieważ minimalizuje suchość oczu i zachowuje przezroczystość rogówki podczas obrazowania.
  6. Po 7 minutach ustaw mysz tak, aby prawe oko było skierowane w stronę soczewki obiektywu, a orbita była równoległa do soczewki obiektywu, trzymając zwierzę nieskrępowane w pobliżu krawędzi platformy (rysunek 2B). Aby uzyskać obrazy o porównywalnym nasyceniu i orientacji, należy stale utrzymywać odległość od oka do soczewki obiektywu, a także wyrównanie oka do ścieżki światła podczas sesji obrazowania. Przytnij długie wąsy przeszkadzające w obserwacji oka.
    UWAGA: Przez następne 8-10 minut mysz nie będzie się ruszać ani mrugać i będzie oddychać delikatnymi ruchami, które są śledzone przez tryb cSLO Eye Tracking ART (automatyczny czas rzeczywisty), który dostosowuje pozycję głowicy skanującej na podstawie punktów orientacyjnych dna oka o wysokim kontraście. Po tym czasie myszy zaczynają dyszeć i mrugać, co sprawia, że obrazowanie jest niepraktyczne.
  7. Jeśli obrazowanie jest wykonywane bez użycia soczewek kontaktowych, krople PBS należy nakładać na oba oczy co 2-3 minuty, aby zapobiec ich wysuszeniu.
  8. Zbierz obraz dna oka układu naczyniowego siatkówki i tarczy nerwu wzrokowego, skoncentrowany na wewnętrznej siatkówce.
    1. Wybierz tryb podczerwieni (IR) i dostosuj ustawienia do wzbudzenia 820 nm, 100% mocy lasera, 40-60% czułości (rysunek 2C).
    2. Pracując w trybie dużej prędkości (12,6 klatki/s), zlokalizuj oko za pomocą joysticka do sterowania oftalmoskopem. Przy małym powiększeniu należy sprawdzić rogówkę i soczewkę pod kątem uszkodzeń lub zmętnienia i wykluczyć z badania oczy z wadami lub urazami, które będą miały wpływ na obrazowanie siatkówki (ryc. 3A).
    3. Zlokalizuj obszar tarczy nerwu wzrokowego (powierzchnia głowy nerwu wzrokowego, ONH), zbliżając obiektyw do oka, a następnie wyśrodkuj na nim obraz i zablokuj tę pozycję, przykręcając joystick. To ustawienie oka względem oftalmoskopu jest kluczem do uzyskania równomiernej ostrości i emisji na obrazie.
    4. Wizualizuj wewnętrzne płaszczyzny siatkówki, a także ONH, używając głównych naczyń krwionośnych znajdujących się na powierzchni ciała szklistego siatkówki jako referencyjnej płaszczyzny ogniskowej (59 i 60 D) lub głębiej (55 D) w oczach pokazujących wykopane tarcze nerwu wzrokowego. Optymalna ostrość powinna rozdzielić krążące krwinki w głównych naczyniach krwionośnych, z wyraźnie wyraźnym światłem i ścianami.
    5. Zoptymalizuj nasycenie obrazu, regulując pokrętło na panelu sterowania ekranu dotykowego, aż biała aureola równomiernego oświetlenia obejmie większość pola dna oka 55º wokół tarczy nerwu wzrokowego (przy niewielkim prześwietleniu). Następnie zmniejsz nasycenie, aby zoptymalizować kontrast, aż do momentu, gdy komórki krwi poruszające się wzdłuż głównych naczyń krwionośnych będą mogły być wyraźnie rozdzielone. Jeśli ciemne obszary ogniskowe utrzymują się, nie z powodu uszkodzenia siatkówki, ustaw oko w aparacie, aż uzyskasz jednolicie jasny obraz. Ta regulacja ma zasadnicze znaczenie dla uchwycenia powtarzalnych zestawów obrazów w pozycji i jakości.
    6. Zbierz obraz w podczerwieni centralnej siatkówki (o średnicy 1,4-1,7 mm, w zależności od wieku), średnio 30 klatek w czasie rzeczywistym (4,7 klatki/s; znormalizowane), aby poprawić stosunek sygnału do szumu (rysunek 2D).
  9. Natychmiast uzyskaj obraz fluorescencyjny mikrogleju GFP+ i/lub naciekających monocytów zlokalizowanych w wewnętrznych płaszczyznach siatkówki i ONH.
    UWAGA: Optymalizacja obrazu dna siatkówki w podczerwieni określa rozdzielczość obrazu fluorescencyjnego komórek GFP+, a także zakres wewnętrznej siatkówki. Brak skupienia wewnętrznych płaszczyzn siatkówki, który można wykryć przez słabą rozdzielczość układu krwionośnego, spowoduje przyciemnienie widoków komórek GFP+ (Figura 3B). Brak prawidłowej i równomiernej regulacji nasycenia IR wpływa na obraz fluorescencyjny (FA), wprowadzając sztuczne zmiany w intensywności i wielkości komórek GFP+ (Figura 3C).
    1. Przełącz na tryb obrazowania fluorescencyjnego (FA) na panelu ekranu dotykowego, używając niebieskiego wzbudzenia laserowego 488 nm (zestaw filtrów barierowych 460-490 nm) i ustawień akwizycji (100% mocy lasera i czułości 100-125%), które są utrzymywane na stałym poziomie dla wszystkich myszy (rysunek 2E).
    2. Zbierz pojedynczy, dwuwymiarowy obraz fluorescencyjny siatkówki w punkcie xy i natychmiast uchwyć obraz dna oka w identycznej pozycji (średnia ze skanu 100x; kąt skanowania 55º dla obu obrazów; Rysunek 2F).
    3. Uchwyć obraz wielopunktowy, wybierając opcję "kompozyt" na panelu sterowania (Rysunek 2G) i przesuwając oftalmoskop w prawo i w lewo, przesuwając siatkówkę w poprzek osi nosowo-skroniowej (Rysunek 2H).
      UWAGA: Po zeskanowaniu pojedynczego obrazu w punkcie xy (średnia ze skanu 100x) oprogramowanie automatycznie uśrednia nowe skany tych samych i nowych obszarów (oznaczonych zielonym kółkiem podczas optymalnego skanowania lub czerwonym, gdy skanowanie jest niewykonalne) i łączy wszystkie pozycje xy w czasie rzeczywistym. Uzyskany obraz złożony ma zakres 1,5-1,7 mm w osi poziomej x 3-4 mm w osi pionowej (kąt skanowania 55º x 120-124º).
  10. Pełne obrazowanie każdej myszy w ciągu 15 minut po wywołaniu znieczulenia, przed mrugnięciem i ponownym uruchomieniem ruchu.
  11. Zdejmij soczewki kontaktowe, nawilż oczy PBS i włóż zwierzę z powrotem do ogrzanej klatki, sprawdzając zachowanie, aż do pełnego odzyskania ruchliwości.
  12. W przypadku badań podłużnych z zastosowaniem przerywanych sesji obrazowania cSLO u tej samej myszy, należy powtórzyć obrazowanie w odstępie nie krótszym niż 3 dni, aby uniknąć skumulowanej toksyczności znieczulenia, a także podrażnienia rogówki.

2. Przetwarzanie i analiza obrazu na żywo

  1. Sekwencyjne wyrównywanie obrazu:
    1. Wyrównaj obrazy dna oka dla serii czasowej tego samego oka, używając układu naczyniowego i tarczy nerwu wzrokowego jako punktów orientacyjnych. Otwórz wszystkie obrazy w komercyjnym programie do prezentacji pokazów slajdów, przeciągając każdy obraz na poprzedni, aż ich tarcze wzrokowe zrównają się na płaszczyźnie xy (górny obraz wydaje się półprzezroczysty podczas przeciągania), a następnie obróć górny obraz, aż jego główne naczynia krwionośne nałożą się na unaczynienie na obrazie poniżej (skup się na naczyniach najbardziej oddalonych od tarczy nerwu wzrokowego). Zapisz kąt obrotu dla każdego obrazu i zapisz ten szereg czasowy do wykorzystania w przyszłości, śledząc tożsamość myszy i oka.
    2. Wyrównaj odpowiednią serię obrazów fluorescencyjnych z pojedynczym punktem xy, stosując zarejestrowany kąt, aby skorygować obrót x-y w każdym punkcie czasowym, za pomocą programu do edycji grafiki rastrowej. Dodatkowo dostosuj rozdzielczość do 300 dpi (bez przeskalowania) i tło (w trybie RGB wybierz Poziomy i pobierz światło naczynia krwionośnego jako czarne). Zapisz te obrazy jako pliki TIF, dodając "wyrównany" do ich nazw.
  2. Segmentacja komórek mikrogleju:
    1. Aby zidentyfikować komórki GFP+ w centralnej siatkówce, otwórz w FluoRender "wyrównany" plik TIF odpowiadający najwcześniejszemu punktowi czasowemu/wiekowi. Powiększ obraz, aby dopasować go do ekranu, a następnie zdefiniuj widok renderowania (kompozytowy, ortogonalny, interpolowany) i jego właściwości (gamma 0,58, punkt nasycenia 255, luminancja 255, 195 alfa i 1,00 cieniowanie), zaznaczając oba kanały RG jako widoczne (ukryj kanał B, klikając go dwukrotnie w ramce przestrzeni roboczej; Rysunek 4A).
    2. Aby zaznaczyć poszczególne komórki, należy określić próg kanału koloru czerwonego (musi być podświetlony w ramce obszaru roboczego), zwiększając dolny próg do momentu, aż większość komórek zostanie zamaskowana (kolor biały) z minimalnym nakładaniem się i procesami komórkowymi (kolor niebieskozielony), zachowując stały wysoki próg (255). Dolna wartość progowa waha się od 100 do 170, w zależności od intensywności fluorescencji (rysunek 4B).
    3. Zapisz ten widok z widocznym tylko czerwonym kanałem (polecenie Przechwyć) jako nowy plik TIF, dodając "cellsegm" do jego oryginalnej nazwy (Rysunek 4C). Korzystając z ogólnego edytora grafiki rastrowej, odwróć skalę szarości i dostosuj rozdzielczość do 300 dpi, jak powyżej, a następnie zapisz ponownie jako RGB (Rysunek 4D).
      UWAGA: Usuń foldery (projekty) utworzone automatycznie przez FluoRender i zapisz zastosowany próg do wykorzystania w przyszłości.
  3. Segmentacja i morfometria somy mikrogleju:
    1. Aby zidentyfikować somaty komórkowe GFP+ w celu ilościowego określenia obszaru, należy użyć oprogramowania do analizy obrazu z automatycznymi pomiarami intensywności i możliwościami progowymi, a także zliczaniem i pomiarem obiektów na podstawie progów. Otwórz plik TIF "cellsegm" i wybierz metodę przeskalowania (splajn) oraz czerwony kanał (kliknij czerwoną zakładkę w RGB). Popraw wizualizację, usuwając zaznaczenie opcji "wyświetl kanał w kolorze" (kliknij prawym przyciskiem myszy czerwoną kartę RGB) i wybierając opcję "uzupełnij kolory" (Obraz/Dostosuj obraz), aby odwrócić skalę szarości i zobaczyć komórki na szarym/czarnym tle na białym tle (Rysunek 4E).
    2. Skalibruj obraz do 1,4-1,7 mm w zależności od wieku, rysując poziomą linię w poprzek całego obrazu (Kalibracja, Szybka kalibracja).
    3. Segmentuj somaty poszczególnych komórek, stosując progowanie intensywności (ryc. 4B). W tym celu należy popracować nad czerwonym kanałem RGB i otworzyć funkcję Threshold Intensity (Object Count; wybór polecenia "count update") w celu śledzenia parametrów dwuwymiarowych dla każdego progowego obszaru zainteresowania (ROI) reprezentującego poszczególne somaty.
    4. Zdefiniuj próg intensywności na histogramie intensywności, wybierając najniższe 50-60% z 255 poziomów i doprecyzowując ostateczną wartość progową, wizualnie oceniając nakładanie się progowej maski koloru (niebieski) i obwodu somy komórki (szary) w poszczególnych komórkach (rysunek 4E).
    5. Oszacuj dokładność masek soma komórek w celu odwzorowania wymiarów somalnych, mierząc obszar przed i po segmentacji w 10 komórkach i zaakceptuj wybrany zakres progowy, jeśli pomiary różnią się o mniej niż 10% (użyj paska narzędzi binarnych i pomiarów z adnotacjami).
    6. Ręcznie zidentyfikuj somalne ROI, które zawierają wiele komórek, i oddziel te elementy (wyeliminuj lub oddziel ROI za pomocą kontrolek binarnego paska narzędzi lub katalogu obiektów), jednocześnie włączając/wyłączając plik binarny w celu bezpośredniej wizualizacji komórek (Rysunek 4F).
    7. Sklasyfikuj komórki mikrogleju jako ROI z obszarami somalnymi większymi i mniejszymi niż 50-60 μm2, aby rozróżnić somaty komórkowe odpowiadające odpowiednio aktywowanemu i dezaktywowanemu mikroglejowi, stosując ograniczenie obszaru.
      UWAGA: Każdy podzbiór somalny komórki jest identyfikowany za pomocą innej pseudokolorowej warstwy binarnej i może być dalej charakteryzowany dla innych parametrów morfologicznych (obwód, okrągłość itp.), a także określany ilościowo w dyskretnych sektorach siatkówki (Figura 4G). Zapisz analizowany obraz jako plik ND2.
    8. Zweryfikuj proces i złożoność rozgałęzień w poszczególnych aktywowanych komórkach mikrogleju, nakładając maskę somalną i pojedynczy obraz punktu xy (kontrast zwiększony o 50%; Rysunek 4H). Ręcznie policz procesy bezpośrednio wychodzące z somy komórki lub zmierz średnicę wielokąta obejmującego trzpień (użyj paska narzędzi binarnych i pomiarów z adnotacjami).
      UWAGA: Aktywowane komórki nie mają wyrostków lub mają niewiele (<4) i krótkich (<2x średnica somalna), w przeciwieństwie do nieaktywowanych procesów komórkowych, które obejmują rozgałęzioną i rozległą altanę (> 3-10x średnicę somalną) otaczającą ich stosunkowo małą somę.
    9. Ręczna identyfikacja komórek z somatami mniejszymi niż <20μm2 i/lub ekspresją GFP poniżej granicy wykrywalności, które w związku z tym nie są wykrywane przez progi intensywności. Użyj polecenia Taksonomia w adnotacjach, aby policzyć ręcznie zidentyfikowane elementy.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nasze ostatnie badania in vivo wykorzystały te metody akwizycji i analizy obrazów na żywo w celu wizualizacji i śledzenia kinetyki oraz wzorców zmian mikrogleju w obrębie ONH i siatkówki we wczesnych stadiach przewlekłej jaskry oraz ich związku z późną neurodegeneracją59. Tutaj przedstawiamy protokół akwizycji obrazów cSLO do wizualizacji komórek mikrogleju na dużym obszarze centralnej siatkówki w poszczególnych siatkówkach młodych heterozygotycznych myszy Cx3CR1-GFP DBA/2J (Rycina 5)...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Monitorowanie na żywo liczby komórek mikrogleju i aktywacji morfologicznej podczas choroby neurodegeneracyjnej wymaga zastosowania nieinwazyjnych metod obrazowania, które pozwalają na szczegółową wizualizację cech komórek. Po zobrazowaniu komórki mikrogleju muszą zostać wyizolowane (podzielone na segmenty) w celu przeprowadzenia analizy morfometrycznej przy użyciu wielu etapów progowych w celu oceny wielkości somalnej i/lub złożoności procesu jako odczytów dla aktywacji mikrogleju. W tym protokole opisujemy metody pozysk...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy Naukowemu Instytutowi Obliczeń i Obrazowania Uniwersytetu Utah za korzystanie z oprogramowania FluoRender (R01GM09815). Prace te były wspierane przez granty z Glaucoma Research Foundation, Melsa M. and Frank Theodore Barr Foundation oraz US National Institute of Health, (R01EY020878 i R01EY023621) dla M.L.V. oraz (R01EY017182 i R01EY017950) dla B.K.A.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Myszy DBA/2J i CX3CR1-GFP/+Myszy Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME000671 i 00582są hodowane w domu, wprowadzając nowych hodowców co 3-4 pokolenia, aby zapobiec dryfowi genetycznemu.
30½ Igła G i strzykawka tuberkulinowa o pojemności 1 mlBD, East Rutherford, NJ305106 i 309659
2,2,2-tribromoetanol, alkohol tert-amylowy 99% i bukrem fosforanowy w tabletkach solifizjologicznej Sigma-Aldrich, St. Louis, MOT48402, 152463 i P4417Roztwór avertin (pH 7,3, sterylnie przefiltrowany) muszą być świeżo przygotowanym roztworem lub przechowywanym w temperaturze 4 stopni Celsjusza; C przez okres do 1 tygodnia.
Terapia cieplna T / PumpGaymar Industries, Orchard Park, NYTP-650
Aplikatory z bawełnianą końcówkąFisher Scientific, Pittsburgh, PA23-400-100
Tropicamid 1%Bausch & Lomb, Rochester, NYNDC 24208-585-64
Soczewki kontaktowe PMMA, krzywa bazowa 1,70, średnica całkowita 3,2 mm, środek o grubości 0,40 mmCantor & Nissel Ltd., Northamptonshire, Wielka BrytaniaG003709Soczewki są płukane sterylnym PBS i przechowywane w pudełkach polipropylenowych.
Skaning konfokalny HRA/Spectralis oftalmoskop laserowy i oprogramowanie Eye ExplorerHeidelberg Engineering GmbH, Carlsbad, CAWersja 1.7.1.0
PowerPointMicrosoft, Redmond, WAWersja 14.4.3
Adobe PhotoshopAdobe, San Jose, CAWersja CS3
FluoRenderScientific Computing and Imaging Institute, University of UtahWersja 2.13Darmowe oprogramowanie. http://www.sci.utah.edu/software/13-software/127-fluorender.html
NIS-Elements CNikon, Melville, NYWersja 4.30.01

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hanisch, U. K. Functional diversity of microglia - how heterogeneous are they to begin with. Front. Cell. Neurosci. 7 (65), 1-18 (2013).
  2. Kettenmann, H., Hanisch, U. K., Noda, M., Verkhratsky, A. Physiology of microglia. Physiol. Rev. 91 (2), 461-553 (2011).
  3. Davalos, D., et al. ATP mediates rapid microglial response to local brain injury in vivo. Nat. Neurosci. 8 (6), 752-758 (2005).
  4. Nimmerjahn, A., Kirchhoff, F., Helmchen, F. Resting microglial cells are highly dynamic surveillants of brain parenchyma in vivo. Science. 308 (5726), 1314-1318 (2005).
  5. Ransohoff, R. M., Perry, V. H. Microglial physiology: unique stimuli, specialized responses. Annu. Rev. Immunol. 27, 119-145 (2009).
  6. Stence, N., Waite, M., Dailey, M. E. Dynamics of microglial activation: a confocal time-lapse analysis in hippocampal slices. Glia. 33 (3), 256-266 (2001).
  7. Streit, W. J., Walter, S. A., Pennell, N. A. Reactive microgliosis. Prog. Neurobiol. 57 (6), 563-581 (1999).
  8. Jonas, R. A., et al. The spider effect: morphological and orienting classification of microglia in response to stimuli in vivo. PloS One. 7 (2), e30763(2012).
  9. Kozlowski, C., Weimer, R. M. An automated method to quantify microglia morphology and application to monitor activation state longitudinally in vivo. PloS One. 7 (2), 1-9 (2012).
  10. Ajami, B., Bennett, J. L., Krieger, C., Tetzlaff, W., Rossi, F. M. Local self-renewal can sustain CNS microglia maintenance and function throughout adult life. Nat. Neurosci. 10 (12), 1538-1543 (2007).
  11. Elmore, M. R., et al. Colony-stimulating factor 1 receptor signaling is necessary for microglia viability, unmasking a microglia progenitor cell in the adult brain. Neuron. 82 (2), 380-397 (2014).
  12. Lawson, L. J., Perry, V. H., Dri, P., Gordon, S. Heterogeneity in the distribution and morphology of microglia in the normal adult mouse brain. Neuroscience. 39 (1), 151-170 (1990).
  13. Ransohoff, R. M., Cardona, A. E. The myeloid cells of the central nervous system parenchyma. Nature. 468, 253-262 (2010).
  14. Solomon, J. N., et al. Origin and distribution of bone marrow-derived cells in the central nervous system in a mouse model of amyotrophic lateral sclerosis. Glia. 53, 744-753 (2006).
  15. Ajami, B., Bennett, J. L., Krieger, C., McNagny, K. M., Rossi, F. M. Infiltrating monocytes trigger EAE progression, but do not contribute to the resident microglia pool. Nat. Neurosc. 14 (9), 1142-1149 (2011).
  16. Sapp, E., et al. Early and progressive accumulation of reactive microglia in the Huntington disease brain. J. Neuropathol. Exp. Neurol. 60 (2), 161-172 (2001).
  17. Maeda, J., et al. In vivo positron emission tomographic imaging of glial responses to amyloid-beta and tau pathologies in mouse models of Alzheimer's disease and related disorders. J. Neurosc. 31 (12), 4720-4730 (2011).
  18. Jacobs, A. H., Tavitian, B. Noninvasive molecular imaging of neuroinflammation. J. Cereb. Blood Flow Metab. 32 (7), 1393-1415 (2012).
  19. Ouchi, Y., et al. Microglial activation and dopamine terminal loss in early Parkinson's disease. Ann. Neurol. 57 (2), 168-175 (2005).
  20. Fuhrmann, M., et al. Microglial Cx3cr1 knockout prevents neuron loss in a mouse model of Alzheimer's disease. Nat. Neurosci. 13 (4), 411-413 (2010).
  21. Trapani, A., Palazzo, C., de Candia, M., Lasorsa, F. M., Trapani, G. Targeting of the translocator protein 18 kDa (TSPO): a valuable approach for nuclear and optical imaging of activated microglia. Bioconjug. Chem. 24 (9), 1415-1428 (2013).
  22. Venneti, S., Lopresti, B. J., Wiley, C. A. Molecular imaging of microglia/macrophages in the brain. Glia. 61 (1), 10-23 (2013).
  23. Davalos, D., et al. Fibrinogen-induced perivascular microglial clustering is required for the development of axonal damage in neuroinflammation. Nat. Comm. 3 (1227), 1-15 (2012).
  24. Dibaj, P., et al. In Vivo imaging reveals distinct inflammatory activity of CNS microglia versus PNS macrophages in a mouse model for ALS. PloS One. 6 (3), e17910(2011).
  25. Evans, T. A., et al. High-resolution intravital imaging reveals that blood-derived macrophages but not resident microglia facilitate secondary axonal dieback in traumatic spinal cord injury. Exp. Neurol. 254 (214), 109-120 (2014).
  26. Nayak, D., Zinselmeyer, B. H., Corps, K. N., McGavern, D. B. In vivo dynamics of innate immune sentinels in the CNS. Intravital. 1 (2), 95-106 (2012).
  27. Tremblay, M. E., Lowery, R. L., Majewska, A. K. Microglial interactions with synapses are modulated by visual experience. PLoS Biol. 8 (11), 1-16 (2010).
  28. Wake, H., Moorhouse, A. J., Jinno, S., Kohsaka, S., Nabekura, J. Resting microglia directly monitor the functional state of synapses in vivo and determine the fate of ischemic terminals. J. Neurosci. 29 (13), 3974-3980 (2009).
  29. Marker, D. F., Tremblay, M. E., Lu, S. M., Majewska, A. K., Gelbard, H. A. A thin-skull window technique for chronic two-photon in vivo imaging of murine microglia in models of neuroinflammation. J. Vis. Exp. 19 (43), (2010).
  30. Alt, C., Runnels, J. M., L, T. G. S., P, L. C. In vivo tracking of hematopoietic cells in the retina of chimeric mice with a scanning laser ophthalmoscope. Intravital. 1 (2), 132-140 (2012).
  31. Eter, N., et al. In vivo visualization of dendritic cells, macrophages, and microglial cells responding to laser-induced damage in the fundus of the eye. Invest. Ophthalmol., & Vis. Sci. 49 (8), 3649-3658 (2008).
  32. Liu, S., et al. Tracking retinal microgliosis in models of retinal ganglion cell damage. Investigative ophthalmology & visual science. 53, 6254-6262 (2012).
  33. Maeda, A., et al. Two-photon microscopy reveals early rod photoreceptor cell damage in light-exposed mutant mice. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 111 (14), E1428-E1437 (2014).
  34. Paques, M., et al. High resolution fundus imaging by confocal scanning laser ophthalmoscopy in the mouse. Vision Res. 46 (8-9), 1336-1345 (2006).
  35. Seeliger, M. W., et al. In vivo confocal imaging of the retina in animal models using scanning laser ophthalmoscopy. Vision Res. 45 (28), 3512-3519 (2005).
  36. Alt, C., Runnels, J. M., Mortensen, L. J., Zaher, W., Lin, C. P. In vivo imaging of microglia turnover in the mouse retina after ionizing radiation and dexamethasone treatment. Invest. Ophthalmol., & Vis. Sci. 55 (8), 5314-5319 (2014).
  37. Bosco, A., et al. Reduced retina microglial activation and improved optic nerve integrity with minocycline treatment in the DBA/2J mouse model of glaucoma. Invest. Ophthalmol., & Vis. Sci. 49 (4), 1437-1446 (2008).
  38. Anderson, M. G., et al. Mutations in genes encoding melanosomal proteins cause pigmentary glaucoma in DBA/2J mice. Nat. Genet. 30 (1), 81-85 (2002).
  39. Chang, B., et al. Interacting loci cause severe iris atrophy and glaucoma in DBA/2J mice. Nat. Genet. 21 (4), 405-409 (1999).
  40. Smith, R. S., Korb, D., John, S. W. A goniolens for clinical monitoring of the mouse iridocorneal angle and optic nerve. Mol. Vis. 8, 26-31 (2002).
  41. Buckingham, B. P., et al. Progressive ganglion cell degeneration precedes neuronal loss in a mouse model of glaucoma. J. Neurosci. 28 (11), 2735-2744 (2008).
  42. Howell, G. R., et al. Axons of retinal ganglion cells are insulted in the optic nerve early in DBA/2J glaucoma. J. Cell Biol. 179 (7), 1523-1537 (2007).
  43. Jakobs, T. C., Libby, R. T., Ben, Y., John, S. W., Masland, R. H. Retinal ganglion cell degeneration is topological but not cell type specific in DBA/2J mice. J. Cell Biol. 171 (2), 313-325 (2005).
  44. Soto, I., et al. Retinal ganglion cells downregulate gene expression and lose their axons within the optic nerve head in a mouse glaucoma model. J. Neurosci. 28 (2), 548-561 (2008).
  45. Bosco, A., Steele, M. R., Vetter, M. L. Early microglia activation in a mouse model of chronic glaucoma. J. Comp. Neurol. 519 (4), 599-620 (2011).
  46. Jung, S., et al. Analysis of fractalkine receptor CX(3)CR1 function by targeted deletion and green fluorescent protein reporter gene insertion. Mol. Cell. Biol. 20 (11), 4106-4114 (2000).
  47. Broux, B., et al. CX(3)CR1 drives cytotoxic CD4(+)CD28(-) T cells into the brain of multiple sclerosis patients. J. Autoimmun. 38 (1), 10-19 (2012).
  48. Paques, M., et al. In vivo observation of the locomotion of microglial cells in the retina. Glia. 58 (14), 1663-1668 (2010).
  49. Charbel Issa, P., et al. Optimization of in vivo confocal autofluorescence imaging of the ocular fundus in mice and its application to models of human retinal degeneration. Invest. Ophthalmol., & Vis. Sci. 53 (2), 1066-1075 (2012).
  50. Beynon, S. B., Walker, F. R. Microglial activation in the injured and healthy brain: what are we really talking about? Practical and theoretical issues associated with the measurement of changes in microglial morphology. Neuroscience. 225 (2012), 162-171 (2012).
  51. Chan, J. W. Recent advances in optic neuritis related to multiple sclerosis. Acta Ophthalmol. 90 (3), 203-209 (2012).
  52. Frost, S., Martins, R. N., Kanagasingam, Y. Ocular biomarkers for early detection of Alzheimer's disease. J. Alzheimer's Dis. 22 (1), 1-16 (2010).
  53. Guo, L., Duggan, J., Cordeiro, M. F. Alzheimer's disease and retinal neurodegeneration. Curr. Alzheimer Res. 7 (1), 3-14 (2010).
  54. Ikram, M. K., Cheung, C. Y., Wong, T. Y., Chen, C. P. Retinal pathology as biomarker for cognitive impairment and Alzheimer's disease. J. Neurol. Neurosurg. Psychiatry. 83 (9), 917-922 (2012).
  55. Kersten, H. M., Roxburgh, R. H., Danesh-Meyer, H. V. Ophthalmic manifestations of inherited neurodegenerative disorders. Nat. Rev. Neurol. 10 (6), 349-362 (2014).
  56. Kesler, A., Vakhapova, V., Korczyn, A. D., Naftaliev, E., Neudorfer, M. Retinal thickness in patients with mild cognitive impairment and Alzheimer's disease. Clin. Neurol. Neurosurg. 113 (7), 523-526 (2011).
  57. Petzold, A., et al. Optical coherence tomography in multiple sclerosis: a systematic review and meta-analysis. Lancet Neurol. 9 (9), 921-932 (2010).
  58. Satue, M., et al. Retinal thinning and correlation with functional disability in patients with Parkinson's disease. Br. J. Ophthalmol. 98 (3), 350-355 (2014).
  59. Bosco, A., Romero, C. O., Breen, K. T., Chagovetz, A. A., Steele, M. R., Ambati, B. K., Vetter, M. L. Neurodegeneration severity can be predicted from early microglia alterations monitored in vivo in a mouse model of chronic glaucoma. Dis Model Mech. , (2015).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

mikrogleja siatk wkowakonfokalna oftalmoskopiamyszy CX3CR1 GFPkwantyfikacja powierzchni cia a kom rkimysi model jaskryobrazowanie in vivoobrazowanie fluorescencyjnesegmentacja progowa

Powiązane artykuły