Artykuł metodologiczny

Izolacja nerwowych komórek macierzystych/progenitorowych z obszaru okołokomorowego dorosłego szczura i ludzkiego rdzenia kręgowego

DOI:

10.3791/52732

⸱

14 maja 2015

 , 
1Division of Genetics and Development, Toronto Western Research Institute and Krembil Neuroscience Center, 2Department of Surgery, Division of Neurosurgery, Toronto Western Hospital and University of Toronto

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rdzeń kręgowy dorosłego ssaka zawiera nerwowe komórki macierzyste/progenitorowe (NSPC), które mogą być izolowane i rozwijane w hodowli. Protokół ten opisuje pobieranie, izolację, hodowlę i pasażowanie NSPC generowanych z obszaru okołokomorowego dorosłego rdzenia kręgowego od szczura i od dawców narządów po przeszczepie.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dorosłe szczurze i ludzkie nerwowe komórki macierzyste/progenitorowe rdzenia kręgowego (NSPC) hodowane w pożywce wzbogaconej o czynnik wzrostu pozwalają na namnażanie się multipotencjalnych, samoodnawiających się i rozprężalnych nerwowych komórek macierzystych. W warunkach surowicy te multipotencjalne NSPC będą się różnicować, generując neurony, astrocyty i oligodendrocyty. Pobrana tkanka jest enzymatycznie dysocjowana w roztworze papainy-EDTA, a następnie mechanicznie dysocjowana i oddzielona przez nieciągły gradient gęstości, aby uzyskać zawiesinę pojedynczej komórki, która jest posiewana w podłożu neurobazalnym uzupełnionym naskórkowym czynnikiem wzrostu (EGF), podstawowym czynnikiem wzrostu fibroblastów (bFGF) i heparyną. Dorosłe NSPC rdzenia kręgowego szczura są hodowane jako swobodnie unoszące się neurosfery, a dorosłe ludzkie NSPC rdzenia kręgowego są hodowane jako kultury przylegające. W tych warunkach dorosłe NSPC rdzenia kręgowego namnażają się, wyrażają markery komórek prekursorowych i mogą być stale rozszerzane po pasażu. Komórki te mogą być badane in vitro w odpowiedzi na różne bodźce, a czynniki egzogenne mogą być wykorzystywane do promowania ograniczenia linii w celu zbadania różnicowania nerwowych komórek macierzystych. Multipotencjalne NSPC lub ich potomstwo można również przeszczepić do różnych modeli zwierzęcych w celu oceny naprawy regeneracyjnej.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

NSPC to multipotencjalne komórki związane z linią neuronalną, które mogą się samoodnawiać i łatwo rozwijać in vitro. Odnosimy się do tych komórek jako mieszanej populacji nerwowych komórek macierzystych/progenitorowych, ponieważ wykazują one właściwości samoodnawiających się multipotencjalnych komórek macierzystych i bardziej ograniczonych komórek progenitorowych. NSPC znajdują się zarówno w mózgu płodu, jak i dorosłego oraz w rdzeniu kręgowym1,2. U osoby dorosłej NSPC są zwykle w stanie spoczynku i znajdują się w określonych niszach, w tym w strefie podkomorowej wyściełającej komory boczne2-4 oraz w obszarze okołokomorowym otaczającym kanał centralny rdzenia kręgowego5,6.

Zazwyczaj, NSPC są hodowane jako swobodnie unoszące się neurosfery lub jako przylegające monowarstwy w pożywce bez surowicy uzupełnionej EGF i bFGF, mitogenami, które selekcjonują populacje komórek macierzystych/progenitorowych. Test neurosfery, pierwotnie opracowany przez Reynoldsa i Weissa2, jest najczęściej stosowany do hodowli i ekspansji nerwowych komórek macierzystych. NSPC wykazują wielomocność, gdy są posiane w pożywce wolnej od czynnika wzrostu zawierającej surowicę, różnicując się w neurony, astrocyty i oligodendrocyty. Multipotencjalne, samoodnawiające się NSPC można wyizolować i wyhodować z rdzenia kręgowego dorosłego gryzonia, gdy hodowana tkanka obejmuje obszary kanału centralnego6,7. Potencjalną zaletą stosowania NSPC generowanych z dorosłego rdzenia kręgowego w przeciwieństwie do generowania komórek z innych regionów jest to, że te specyficzne tkankowo komórki najbardziej przypominają komórki w rdzeniu kręgowym, które są tracone lub uszkodzone w wyniku urazu lub choroby.

Poprzednie prace wykazały, że neurosfery pochodzące z rdzenia kręgowego dorosłego człowieka nie mogą być długo rozmnażane ani pasażowane, aby wytworzyć wystarczającą liczbę komórek8,9. Jednak wraz z modyfikacjami warunków hodowli opisaliśmy ekspansję i przeszczep NSPC pochodzących z rdzenia kręgowego u dorosłych ludzi, wykazując, że samoodnawiające się i multipotencjalne NSPC można wyizolować z dorosłego ludzkiego rdzenia kręgowego dawców narządów po przeszczepie10. Przede wszystkim usunięcie większości istoty białej podczas sekcji i hodowla tych komórek na przylegającym podłożu w pożywce wzbogaconej w czynnik wzrostu, wyselekcjonowane do proliferacji NSPC dorosłego człowieka rdzenia kręgowego. W tym protokole opisujemy pobieranie rdzenia kręgowego od dorosłych szczurów i od dawców narządów po przeszczepach ludzkich, preparację tkanki okołokomorowej oraz izolację, hodowlę i ekspansję NSPC.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie procedury dotyczące zwierząt są zatwierdzane przez Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami Uniwersyteckiej Sieci Zdrowia, Toronto ON Canada, zgodnie z zasadami ustalonymi w Przewodniku po Opiece i Użytkowaniu Zwierząt Doświadczalnych przygotowanym przez Kanadyjską Radę ds. Opieki nad Zwierzętami. Na pobieranie tkanki ludzkiego rdzenia kręgowego uzyskano zgodę Rady ds. Etyki Badań Naukowych Uniwersyteckiej Sieci Zdrowia oraz Fundacji Trillium-Gift of Life, która nadzoruje dawstwo narządów w Ontario w Kanadzie.

1. Przygotowanie rozwarstwiających i pożywek hodowlanych

  1. W celu wyizolowania rdzenia kręgowego szczura należy przygotować 100 ml buforu do wypreparowania (1x PBS + 0,6% glukozy + 2% penicyliny-streptomycyny) i przechowywać w lodówce. Dla ludzkiego rdzenia kręgowego przygotować 100 ml buforu do rozwarstwiania (1x HBSS + 0,6% glukozy + 2% penicyliny-streptomycyny) i przechowywać w lodówce.
  2. Przygotować 100 ml pożywki bez surowicy (SFM) i ogrzać w temperaturze 37 °C. Aby przygotować SFM, dodaj 2 mM L-glutaminy, 100 μg/ml penicyliny-streptomycyny, 2% B27 i 10% mieszanki hormonów do podłoża Neurobaseal-A. Aby przygotować mieszankę hormonalną, przygotuj pożywkę 1 : 1 DMEM/F12 zawierającą 0,6% glukozy, 3 mM NaHCO3, 5 mM HEPES, 25 μg/ml insuliny, 100 μg/ml apotransferyny, 10 μM putrescyny, 30 nM selenu i 20 nM progesteronu.
  3. Przygotować pożywkę galwaniczną wzbogaconą w czynnik wzrostu EFH (do SFM dodać 20 ng/ml EGF, 20 ng/ml bFGF i 2 μg/ml heparyny) i ogrzać w temperaturze 37 °C. Upewnić się, że EFH dla człowieka zawiera ludzkie rekombinowane czynniki wzrostu (patrz Tabela Materiałów).

2. Pobieranie i preparowanie okołokomorowej tkanki rdzenia kręgowego dorosłego szczura

  1. Wysterylizuj narzędzia sekcyjne w etanolu i wcześniej spłucz w sterylnej soli fizjologicznej lub narzędziach w autoklawie. Daj szczurowi (w wieku 6-8 tygodni) śmiertelny zastrzyk pentobarbitalu sodu (1 cm³ przy 65 mg / ml) lub przedawkowaj środek znieczulający (tj. 4% izofluoranu) zgodnie z zatwierdzonym przez instytucję protokołem na zwierzętach. Oblaj grzbiet szczura 70% etanolem i usuń skórę z powierzchni grzbietowej dużymi nożyczkami preparacyjnymi.
  2. Trzymając nożyczki prostopadle do powierzchni grzbietowej, przetnij poprzecznie kręgosłup nad tylnymi kończynami. Użyj mniejszych nożyczek, aby podłużnie przeciąć mięsień grzbietowy leżący nad kręgosłupem w kierunku rostralnym, aby odsłonić wyrostki kolczyste.
  3. Zaczynając od odsłoniętego końca ogonowego, włóż rongeurs lub mały instrument do cięcia kości zewnątrzoponowo do bocznej części kanału kręgowego w przestrzeni między rdzeniem kręgowym a kręgosłupem. Wykonaj małe nacięcia w blaszce (łuki kostne po lewej i prawej stronie wyrostków kolczystych po obu stronach kręgów) i ostrożnie oderwij blaszkę, aby odsłonić rdzeń kręgowy (ryc. 1A-D). Upewnij się, że kąt ostrzy jest płytki i równoległy do rdzenia, aby leżący pod spodem rdzeń kręgowy nie został uszkodzony.
  4. Kontynuuj laminektomię w kierunku rostralnym, aby odsłonić rdzeń kręgowy w odcinku piersiowym i szyjnym.
  5. Delikatnie wytnij rdzeń kręgowy z kręgosłupa za pomocą kleszczy tkankowych i użyj mikronożyczek, aby ostrożnie odciąć korzenie, aby uwolnić pępowinę. Umieścić wycięty rdzeń kręgowy na szalce Petriego zawierającej 4 °C sterylny bufor do preparacji szczurów (opisany powyżej w ppkt 1.1). Wypłukać tkankę w świeżo przygotowanym buforze preparacyjnym o temperaturze 4 °C i za pomocą nożyczek przeciąć rdzeń kręgowy poprzecznie na segmenty o średnicy 1 cm (ryc. 1E).
  6. Dla każdego segmentu tkanki użyj jednej ręki, aby przytrzymać tkankę za pomocą cienkich kleszczy. Z drugiej strony użyj mikronożyczek, aby ostrożnie usunąć leżące nad nimi opony mózgowe, istotę białą i większość istoty szarej za pomocą lunety sekcyjnej. Alternatywnie, użyj cienkich kleszczyków (Dumont #4), aby usunąć większość istoty szarej i białej, pozostawiając tylko obszar okołokomorowy rdzenia kręgowego, który obejmuje wyściółczak i niewielką ilość otaczającej istoty szarej (ryc. 1F-H).
  7. Zebrać wypreparowaną tkankę okołokomorową na sterylnej szalce Petriego o średnicy 10 cm, zawierającej zimny bufor do preparowania szczurów.

3. Pobieranie i sekcja tkanek rdzenia kręgowego u dorosłych ludzi

Uwaga: Ludzka tkanka rdzenia kręgowego jest pobierana od dorosłych dawców przeszczepów narządów (dawców w wieku od 2 do 60 lat) po pobraniu innych narządów do przeszczepu. Program Trillium-Dar Życia uzyskuje zgodę na pobranie tkanki do celów badawczych od rodziny pacjenta i powiadamia nasz zespół pobierający w odpowiednim czasie, tak abyśmy byli w stanie pobrać pępowiny w ciągu 2 godzin od zaciśnięcia krzyżowego aorty. Przyjmowani są dorośli dawcy płci męskiej i żeńskiej z ujemnym wynikiem badań serologicznych i bez zakażeń.

  1. Pobranie tkanki w sterylny sposób na sali operacyjnej poprzez dostęp przedni, przy użyciu tej samej przedniej ekspozycji, która została już wypreparowana w celu usunięcia narządu przez zespół ds. przeszczepu narządów.
  2. Odsłoń przedni kręgosłup poprzez retrakcję za pomocą dużych rozpieraczy żeber i dużych retraktorów łopatkowych pozostałych tkanek i narządów, w tym dużych naczyń krwionośnych.
  3. Użyj piły mostkowej zamontowanej z długim ostrzem, aby przeciąć krążki międzykręgowe na końcach rostralnych i ogonowych o pożądanej długości kręgosłupa, który ma być wycięty. Ustaw piłę pod kątem około 45° przyśrodkowo, aby przeciąć trójkątne koryto z bocznej części trzonów kręgów, zatrzymując się tuż przed kanałem kręgowym.
  4. Usuń en bloc przyśrodkowe aspekty trzonów kręgów pożądanych segmentów za pomocą zakrzywionych osteotomów i młotka, uważając, aby nie przeciąć opony twardej. Następnie delikatnie podnieś rdzeń kręgowy pokryty oponą twardą za pomocą kleszczy zębatych i ostro naciąć rostralne i ogonowe końce rdzenia. Użyj długich nożyczek i kleszczy, aby obustronnie przeciąć poszczególne korzenie.
  5. Umieścić wycięty odcinek rdzenia kręgowego w sterylnym buforze o temperaturze 4 °C (1x HBSS + 0,6% glukozy + 2% penicyliny-streptomycyny) w dużej probówce w celu transportu do pomieszczenia do hodowli tkankowej.

  6. Uwaga: Ogólnie rzecz biorąc, 3-6 cm odcinek rdzenia kręgowego z górnej części klatki piersiowej i/lub środkowego do niskiego poziomu klatki piersiowej jest usuwany na sali operacyjnej w sterylnych warunkach tak szybko, jak to możliwe po ustaniu krążenia i umieszczany w zimnym sterylnym buforze. Czas, jaki upłynął między zatrzymaniem krążenia a usunięciem rdzenia kręgowego, zmienia się w zależności od czasu potrzebnego do pobrania docelowych narządów do dawstwa i wynosi od 45 minut do 2 godzin. Jeśli usunięto również serce i płuca, sekcję można przeprowadzić daleko w celu pobrania części dolnego odcinka szyjki macicy.
  7. Wypreparuj ludzką tkankę rdzenia kręgowego tak szybko, jak to możliwe po pobraniu, zwykle w ciągu 3 godzin. Usuń oponę twardą i inne opony mózgowe za pomocą kleszczy. Wypłukać tkankę rdzenia kręgowego w świeżo przygotowanym buforze do preparacji o temperaturze 4 °C i pokroić poprzecznie na segmenty o średnicy 1 cm.
  8. Za pomocą lunety preparacyjnej wyciąć leżące nad nią opony mózgowe, istotę białą i większość istoty szarej za pomocą kleszczy do tkanek, cienkich kleszczy i mikronożyczek dla każdego segmentu tkanki. Wypreparowaną tkankę okołokomorową, która obejmuje wyściółczak i niewielką ilość otaczającej go istoty szarej, umieścić na sterylnej szalce Petriego o średnicy 10 cm zawierającej zimny ludzki bufor preparacyjny.

4. Izolacja i hodowla dorosłych szczurów i ludzi NSPC rdzenia kręgowego

  1. Następujące czynności należy wykonać aseptycznie w okapie z przepływem laminarnym.
    1. Wypreparowaną tkankę okołokomorową szczura lub człowieka rozdrobnić na 1 mm3 kawałki za pomocą mikronożyczek.
    2. Enzymatycznie zdysocjować tkankę mieloną za pomocą enzymów proteolitycznych za pomocą zestawu do dysocjacji papainy, jak wskazano w tabeli materiałów/odczynników. Uwaga: Składniki odczynnika obejmują 4 fiolki; Fiolka 1: Zbilansowany roztwór soli Earle'a (EBSS), Fiolka 2: Papaina zawierająca L-cysteinę i EDTA, Fiolka 3: Deoksyrybonukleaza I (DNaza), Fiolka 4: Inhibitor proteazy jajomkoidalnej z albuminą surowicy bydlęcej (BSA).
      nuta: Uwaga: Papaina jest proteazą sulfhydrylową, która ma szeroką specyficzność dla substratów białkowych. Papaina w tym miejscu pochodzi z lateksu z rośliny Carica papaya i rozkłada większość substratów białkowych w większym stopniu niż proteazy trzustkowe. Podczas procesu dysocjacji dochodzi do uszkodzenia komórek, które powoduje uwolnienie DNA do podłoża dysocjacyjnego, co zwiększa lepkość i utrudnia pipetowanie. W ten sposób DNaza jest włączana do procedury izolacji komórek w celu strawienia DNA bez uszkadzania nienaruszonych komórek. Jajomukoidy to inhibitory proteazy glikoproteinowej stosowane w celu hamowania aktywności papainy po etapie dysocjacji.
  2. Przy pierwszym użyciu należy rozpuścić mieszaninę inhibitorów albuminy owomkoidów (fiolka 4) w 32 ml EBSS (fiolka 1), a następnie przechowywać w temperaturze 4 °C i stosować do kolejnych izolacji. Uwaga: W ten sposób otrzymuje się roztwór o efektywnym stężeniu 10 mg inhibitora owamukoidów i 10 mg albuminy na ml.
  3. Dodać 5 ml EBSS (fiolka 1) do fiolki z papainą (fiolka 2), otrzymując roztwór o stężeniu 20 jednostek papainy/ml w 1 mM L-cysteinie z 0,5 mM EDTA. Sprawdzić, czy roztwór papainy wydaje się przezroczysty po całkowitym rozpuszczeniu, w przeciwnym razie umieścić fiolkę w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C na dziesięć minut, aż papaina całkowicie się rozpuści, aby zapewnić pełną aktywność enzymu.
  4. Dodać 500 μl EBSS (fiolka 1) do fiolki DNazy (fiolka 3) i delikatnie wymieszać, ponieważ DNaza jest wrażliwa na denaturację ścinającą. Dodać 250 μl roztworu DNazy do fiolki zawierającej papainę, otrzymując końcowe stężenie około 20 jednostek/ml papainy i 0,005% DNazy. Zachowaj pozostałą ilość fiolki DNazy do późniejszego wykorzystania.
  5. Umieścić rozdrobnioną tkankę szczura lub człowieka w roztworze papainy, jak przygotowano w kroku 4.4 powyżej. W celu wyizolowania tkanek ludzkich należy podzielić zmieloną tkankę równo między dwie fiolki z papainą (około 0,2 g/fiolkę).
  6. Inkubować w temperaturze 37 °C ze stałym mieszaniem na platformie kołyskowej w celu dysocjacji tkanki w aktywowanym roztworze papainy. Inkubuj tkankę szczura przez 45 minut do 1 godziny, a tkankę ludzką przez 1 do 2 godzin, w zależności od ilości zmielonej tkanki, odpowiednio około 0,2 – 0,4 g.
  7. Rozprowadzić mieszaninę za pomocą pipety o pojemności 10 ml w celu dysocjacji pozostałych fragmentów tkanki w celu uzyskania mętnej zawiesiny komórek. Przenieść zawiesinę komórkową (nie zawierać żadnych kawałków niezdysocjowanej tkanki) do sterylnej probówki stożkowej o pojemności 15 ml i odwirować przy 300 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
  8. Ponownie zawiesić granulowane komórki w pożywce zawierającej ovomucoid, inhibitor papainy.
    1. Przygotować roztwór jajomkoidów, mieszając 2,7 ml EBSS (fiolka 1) z 300 μl odtworzonego roztworu inhibitora albuminy i owomukoidu (fiolka 4) w stożkowej probówce o pojemności 15 ml. Dodać 150 μl roztworu DNazy (fiolka 3) zapisanego w kroku 4.4 powyżej.
    2. Wyrzucić supernatant z granulowanych komórek i natychmiast ponownie zawiesić osad komórkowy w rozcieńczonej mieszaninie DNazy i inhibitora albuminy.
  9. Oddziel nienaruszone komórki od błon komórkowych przez odwirowanie przez jednoetapowy nieciągły gradient gęstości.
    1. Przygotować nieciągły gradient gęstości, dodając 5 ml roztworu inhibitora albuminy (fiolka 4) do probówki o pojemności 15 ml i używając pipety o pojemności 5 ml, delikatnie i powoli nałożyć zawiesinę komórkową (przygotowaną w sposób opisany powyżej w kroku 4.8) na wierzch roztworu inhibitora albuminy.
    2. Wirować przy 70 x g przez 6 minut w temperaturze pokojowej.
    3. Uwaga: Interfejs między dwiema warstwami gradientu powinien być wyraźnie widoczny, chociaż minimalne mieszanie na tej granicy nie ma wpływu na wynik. Fragmenty błony pozostają na granicy faz, a zdysocjowane komórki osadzają się na dnie probówki.
  10. W przypadku komórek szczurzych należy odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w 1 ml pożywki EFH dla szczurów (wstępnie podgrzanej w temperaturze 37 °C). Policz gęstość żywych komórek za pomocą hemocytometru i umieść komórki w kolbie hodowlanej T25 o gęstości 10 komórek/μl w EFH. Typowa wydajność komórek z tkanki szczura wynosi około 2 x 106 komórek o około 80% żywotności. Jeśli pożądane są hodowle klonów, należy nasiać komórki o gęstości mniejszej niż 10 komórek/μl. Inkubować kolby w temperaturze 37 °C w 5% CO2 i pozostawić kultury do niezakłóconego wzrostu przez 1 tydzień, aby uniknąć agregacji kulek.
  11. W przypadku komórek ludzkich należy odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w 10 ml ludzkiego podłoża EFH (wstępnie podgrzanego w temperaturze 37 °C). Przefiltruj zawiesinę komórkową przez nylonowe sitko o średnicy 40 μm, a następnie dodaj 30 ml EFH w celu usunięcia mieliny i fragmentów błony komórkowej. Wirować przy 300 x g przez 5 minut i ponownie zawiesić osad komórkowy w 1 ml pożywki EFH.
  12. Policz gęstość żywych komórek za pomocą hemocytometru i umieść komórki ludzkie na 6-dołkowych płytkach hodowlanych o gęstości 10-5 komórek/basenik w całkowitej objętości 5 ml EFH/basenik. Typowa wydajność komórek z tkanki ludzkiej wynosi około 1 x 106 komórek o około 70% żywotności. Wstępnie pokryj studzienki przylegającym podłożem, takim jak Matrigel (patrz uwaga poniżej). Rozcieńczyć w proporcji 40 μl Matrigel: 1 ml SFM.
  13. Uwaga: Alternatywnie można użyć innych przylegających substratów, takich jak poli-D-lizyna/laminina, fibronektyna lub kolagen.
  14. Inkubować płytki w temperaturze 37 °C w 5% CO2 i pozostawić kultury do niezakłóconego wzrostu przez 1 tydzień.

5. Pasażowanie NSPC dorosłego szczura i ludzkiego rdzenia kręgowego

  1. Szczurze NSPC utworzą małe neurosfery o średnicy około 70 μm w ciągu 1 tygodnia od początkowego wysiewu; NSPC szczurów pasujących co tydzień, zbierając zawiesinę komórkową, wirując przy 300 x g przez 5 minut i mechanicznie rozcierając osad komórkowy w celu dysocjacji neurosfer
    2. .
  2. Wysiewać zdysocjowane komórki do kolb T25 zawierających świeżą pożywkę EFH dla szczurów. Alternatywnie użyj 50% kondycjonowanej pożywki dla szczurów do pasażowania. Typowa wydajność szczurzych NSPC podczas pasażu wynosi około 5 x 106 komórek, która rośnie wykładniczo wraz z liczbą pasaży.
  3. W przypadku kultur ludzkich, tydzień po początkowym posiewie, należy zastąpić połowę pożywki hodowlanej świeżym EFH dwa razy w tygodniu, aby umożliwić komórkom przyleganie do substratu. Ogólnie rzecz biorąc, 1 - 2 tygodnie później, gdy komórki przyłączą się do podłoża, należy dwa razy w tygodniu zastąpić całą objętość pożywki hodowlanej świeżym EFH.
  4. Subkultura komórek przed osiągnięciem konfluencji między 4 a 8 tygodniami.
    1. Subkultura komórkowa poprzez enzymatyczne oddzielenie komórek od substratu (patrz Tabela Materiałów) za pomocą 2 ml enzymu na dołek inkubowany przez około 10 minut w temperaturze 37 °C. Zebrać zawiesinę komórkową, odwirować przy 300 x g przez 5 minut i delikatnie zawiesić osad komórkowy w 1 ml świeżo przygotowanej pożywki EFH.
    2. Policz żywe komórki za pomocą hemocytometru i umieść komórki na 6-dołkowych płytkach hodowlanych (wstępnie pokrytych jak powyżej w kroku 4.12) o gęstości 10-5 komórek/basenik w całkowitej objętości 5 ml EFH/basenik. Typowa wydajność ludzkich NSPC podczas pasażowania wynosi około 2 x 106 komórek i generalnie podwaja się wraz z pasażem. Ogólnie rzecz biorąc, utrzymuj kultury z 50% kondycjonowaną pożywką EFH 2 - 3 razy w tygodniu między pasażami.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Komórki rdzenia kręgowego dorosłego szczura hodowane w kulturze zawiesinowej w pożywce EFH utworzą małe neurosfery (kolonie niezróżnicowanych komórek) w ciągu 1 tygodnia od pierwotnego wysiewu. W kulturach pierwotnych większość wysianych komórek obumrze, natomiast komórki macierzyste reagujące na czynniki wzrostu będą proliferować i zostaną wyselekcjonowane w pożywce EFH. Do 3. pasażu powstanie liczna ilość wolno pływających neurosfer o średnicy około 100 µm (Ryc. 2A). Neurosfery są okrągłe i jasne w kon...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Podczas sekcji rdzenia kręgowego szczura należy zachować ostrożność, aby nie uszkodzić rdzenia kręgowego podczas wykonywania laminektomii. Łatwiej jest wyizolować tkankę okołokomorową, gdy segmenty rdzenia kręgowego są nienaruszone. Segmenty tkanki powinny być całkowicie zanurzone w buforze preparacyjnym, a leżące nad nimi opony mózgowe i istotę białą można odciąć jako podłużne paski za pomocą mikronożyczek. Alternatywnie można użyć kleszczyków do cienkich tkanek do odklejania istoty białej.

D...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy chcieliby podziękować za wsparcie ze strony Spinal Cord Injury Ontario, Ontario-China Research and Innovation Fund, Toronto General and Western Hospital Foundation oraz Physicians' Services Incorporated Foundation. Autorzy dziękują dr Tasneemowi Zahirowi za fachowe porady dotyczące hodowli NSPC ludzkiego rdzenia kręgowego oraz dr Cindi Morshead i Iris Kulbatski za ich fachowe porady dotyczące izolacji rdzenia kręgowego szczurów z rdzenia kręgowego.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
1x PBSLife Technologies#10010023Bufor do rozwarstwiania
1x HBSSLife Technologies#14175095Bufor do rozwarstwiania
D-glukozySigma# G-6152Przygotuj 30% roztwór podstawowy glukozy do buforu preparacyjnego i mieszanki hormonów
Penicylina-StreptomycynaLife Technologies#15140-148Bufor rozpiskowy i pożywka hodowlana
Neurobazal-A Life Technologies#10888-022Pożywka hodowlana
L-glutamina, 200 mMLife Technologies#25030-081Pożywka
B27Life Technologies#12587010Pożywka
hodowlana DMEMLife Technologies#11885084Mieszanka hormonalna
F12Life Technologies#21700-075Mieszanka hormonów
NaHCO 3Sigma# S-5761Przygotuj 7,5% roztwór podstawowy NaHCO3 do mieszanki hormonalnej
HEPESSigma#H9136Przygotuj roztwór podstawowy 1M HEPES do mieszanki hormonalnej
InsulinaSigma#I-5500Mieszanka hormonalna
Apo-transferynaSigma#T-2252Mieszanka hormonalna
PutrescineSigma# P7505Hormon mix
SeleniumSigma#S-9133Mieszanka hormonalna
ProgesteronSigma#P-6149Mieszanka hormonalna
EGF, myszSigma#E4127Przygotuj 100 μ zapasy w g/ml w B27 i podwielokrotnościach; EFH podłoże
EGF, ludzka rekombinowanaSigma#E9644Przygotuj 100 μ zapasy w g/ml w B27 i podwielokrotnościach; EFH medium
bFGF, ludzka rekombinowanaSigma#F0291Przygotuj 100 μ zapasy w g/ml w B27 i podwielokrotnościach; EFH średnie 
Heparyna, 10 000 USigma#H3149Przygotuj zapasy 27,3 mg / ml w mieszance hormonalnej i podwielokrotności; EFH średni
zestaw do dysocjacji papainyWorthington Biochemicals#LK003150Zawiera EBSS, papainę, DNazę, inhibitor proteazy ovomukoid z BSA
Pentobarbital soduBimeda – MTC Animal Health IncDIN 00141704
Kleszczyki do tkanek: AddisonsFine Science Tools#11006-12 Ząbkowana końcówka standardowa; dostępna również mikrokońcówka
Kleszcze precyzyjne: Dumont #4Narzędzia do nauki#11241-30
MikronożyczkiNarzędzia do nauki pięknej#15024-10okrągłym
uchwytemBausch & LombN1430
10 mm szalki Petriego Nunc1501
T25 Kolby hodowlaneNunc156367
40 μ m nylonowy sitko komórkoweVWRCA21008-949
Płytki 6-dołkoweNuncCA73520-906
Matrigel, zredukowany czynnik wzrostu (100x)Corning354230Rozmrozić zgodnie z instrukcjami i zamrozić podwielokrotności; Stosować rozcieńczony w stosunku 40 μ l Matrigel: 1 ml SFM
hodowlana pięknej Vannas Rongeurs z

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Gage, F. H. Mammalian neural stem cells. Science. 287, 1433-1438 (2000).
  2. Reynolds, B. A., Weiss, S. Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system. Science. 255, 1707-1710 (1992).
  3. Gritti, A., et al. Multipotential stem cells from the adult mouse brain proliferate and self-renew in response to basic fibroblast growth factor. J Neurosci. 16, 1091-1100 (1996).
  4. Morshead, C. M., et al. Neural stem cells in the adult mammalian forebrain: a relatively quiescent subpopulation of subependymal cells. Neuron. 13, 1071-1082 (1994).
  5. Weiss, S., et al. Multipotent CNS stem cells are present in the adult mammalian spinal cord and ventricular neuroaxis. J Neurosci. 16, 7599-7609 (1996).
  6. Martens, D. J., Seaberg, R. M., van der Kooy, D. In vivo infusions of exogenous growth factors into the fourth ventricle of the adult mouse brain increase the proliferation of neural progenitors around the fourth ventricle and the central canal of the spinal cord. Eur J Neurosci. 16, 1045-1057 (2002).
  7. Kulbatski, I., et al. Oligodendrocytes and radial glia derived from adult rat spinal cord progenitors: morphological and immunocytochemical characterization. J Histochem Cytochem. 55, 209-222 (2007).
  8. Akesson, E., et al. Long-term culture and neuronal survival after intraspinal transplantation of human spinal cord-derived neurospheres. Physiol Behav. 92, 60-66 (2007).
  9. Dromard, C., et al. Adult human spinal cord harbors neural precursor cells that generate neurons and glial cells in vitro. J Neurosci Res. 86, 1916-1926 (2008).
  10. Mothe, A. J., Zahir, T., Santaguida, C., Cook, D., Tator, C. H. Neural stem/progenitor cells from the adult human spinal cord are multipotent and self-renewing and differentiate after transplantation. PLoS One. 6, e27079(2011).
  11. Huettner, J. E., Baughman, R. W. Primary culture of identified neurons from the visual cortex of postnatal rats. J Neurosci. 6, 3044-3060 (1986).
  12. Azari, H., Rahman, M., Sharififar, S., Reynolds, B. A. Isolation and expansion of the adult mouse neural stem cells using the neurosphere assay. J Vis Exp. , (2010).
  13. Reynolds, B. A., Rietze, R. L. Neural stem cells and neurospheres--re-evaluating the relationship. Nat Methods. 2, 333-336 (2005).
  14. Singec, I., et al. Defining the actual sensitivity and specificity of the neurosphere assay in stem cell biology. Nat Methods. 3, 801-806 (2006).
  15. Louis, S. A., Azari, H., Sharififar, S., Vedam-Mai, V., Reynolds, B. A. Neural-colony forming cell assay: an assay to discriminate bona fide neural stem cells from neural progenitor cells. J Vis Exp. , (2011).
  16. Louis, S. A., et al. Enumeration of neural stem and progenitor cells in the neural colony-forming cell assay. Stem Cells. 26, 988-996 (2008).
  17. Conti, L., et al. Niche-independent symmetrical self-renewal of a mammalian tissue stem cell. PLoS Biol. 3, e10(2005).
  18. Pollard, S. M., Conti, L., Sun, Y., Goffredo, D., Smith, A. Adherent neural stem (NS) cells from fetal and adult forebrain. Cereb Cortex. 16, Suppl 1. i112-i120 (2006).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

neuronalne kom rki macierzysteizolacja z rdzenia kr gowegodysocjacja enzymatycznawirowanie w gradiencie g sto citworzenie neurosfermikroskopia immunofluorescencyjnapo ywka z czynnikami wzrostuekspansja hodowli kom rkowychrestrykcja linii kom rkowych

Powiązane artykuły