Artykuł metodologiczny

Naiwna izolacja mysich limfocytów T CD4 + i różnicowanie in vitro w podzbiory limfocytów T

DOI:

10.3791/52739

⸱

16 kwietnia 2015

 , 
1Department of Microbiology and Immunology, The Chicago Medical School, Rosalind Franklin University of Medicine and Science

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Naiwne limfocyty T CD4+ polaryzują się na różne podzbiory w zależności od środowiska w momencie aktywacji. Różnicowanie naiwnych limfocytów T CD4 + do różnych podzbiorów efektorowych można osiągnąć in vitro poprzez dodanie bodźców receptora limfocytów T i specyficznych sygnałów cytokin.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Antygenowe niedoświadczone (naiwne) limfocyty T CD4+ ulegają ekspansji i różnicowaniu do podzbiorów efektorowych w momencie rozpoznania receptora limfocytów T (TCR) pokrewnego antygenu prezentowanego na MHC klasy II. Sygnały cytokin obecne w środowisku w momencie aktywacji TCR są głównym czynnikiem decydującym o losie efektorowym naiwnych limfocytów T CD4 +. Chociaż środowisko cytokin podczas naiwnej aktywacji limfocytów T może być złożone i obejmować zarówno nadmiarowe, jak i przeciwstawne sygnały in vivo, dodanie różnych kombinacji cytokin podczas naiwnej aktywacji limfocytów T CD4 + in vitro może łatwo sprzyjać ustaleniu efektorowych linii pomocniczych T z charakterystyczną ekspresją cytokin i czynników transkrypcyjnych. Takie eksperymenty różnicowania są powszechnie stosowane jako pierwszy krok do oceny celów, które uważa się za promujące lub hamujące rozwój niektórych podzbiorów pomocniczych T CD4 +. Dodanie mediatorów, takich jak agoniści sygnałowi, antagoniści lub inne cytokiny, podczas procesu różnicowania może być również wykorzystane do zbadania wpływu określonego celu na różnicowanie limfocytów T. W tym miejscu opisujemy podstawowy protokół izolacji naiwnych limfocytów T od myszy i kolejne kroki niezbędne do polaryzacji naiwnych komórek do różnych linii efektorowych T pomocniczych in vitro.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Koncepcja odrębnych linii lub podzbiorów komórek pomocniczych (Th) CD4+ istnieje od drugiej połowyXX wieku 1. Rozpoznanie pokrewnego antygenu w obecności sygnałów kostymulujących powoduje kilka rund proliferacji komórkowej i ostateczne różnicowanie się w efektorowe komórki Th. Rodzaj limfocytów Th powstających podczas tego procesu zależy od środowiska cytokin obecnego podczas aktywacji2. Początkowo uważano, że naiwne limfocyty Th polaryzują się w 2 odrębne linie po aktywacji receptora komórek T (TCR), ligacji kostymulacyjnej CD28 i sygnalizacji cytokin. Komórki pomocnicze typu 1 (Th1) charakteryzują się efektorowym wytwarzaniem cytokiny IFNγ, a także zapotrzebowaniem na sygnalizację IL-12 podczas procesu różnicowania3,4. Ostatecznie odkryto, że zróżnicowane komórki Th1 mają profil genetyczny, który jest najbardziej charakterystycznie scharakteryzowany przez ekspresję czynnika transkrypcyjnego z rodziny T box, Tbx21 (T-bet), który jest uważany za główny regulator programu genetycznego Th15. Co więcej, IL-12 oraz IFNγ mogą promować ekspresję T-bet6,7. W odpowiedzi immunologicznej komórki Th1 są ważne dla obrony gospodarza przed patogenami wewnątrzkomórkowymi, a także silnymi promotorami zapalenia autoimmunologicznego. W przeciwieństwie do tego, komórki pomocnicze typu 2 (Th2) wymagają IL-4 do swojego rozwoju, a ich cytokiny efektorowe, w tym IL-4, IL-5 i IL-13, są ważne dla kierowania odpowiedziami komórek B i są patogenne w alergii8,9. Podobnie jak w przypadku komórek Th1, stwierdzono, że komórki Th2 wyrażają swój własny główny regulator transkrypcji, określany jako GATA-310,11. Co ciekawe, obecność cytokin polaryzujących i generowanie określonej linii Th są antagonistyczne w stosunku do rozwoju innych2,12, co sugeruje, że tylko określony podzbiór Th może stać się dominujący podczas odpowiedzi immunologicznej.

Od czasu identyfikacji linii Th1 i Th2, dalsze prace wykazały jeszcze więcej unikalnych podzbiorów limfocytów T pomocniczych, w tym pomocnika pęcherzykowego (TFH), wytwarzającego IL-9 (Th9) i wytwarzającego IL-22 (Th22) (ostatnio omówionego w13). Dla celów eksperymentów różnicowania in vitro protokół ten skupi się tylko na dwóch dodatkowych podzbiorach Th, zwanych limfocytami T regulatorowymi (Treg) i limfocytami T CD4 + wytwarzającymi IL-17 (Th17). Limfocyty T regulatorowe CD25+ mogą występować naturalnie (nTreg) w grasicy; Naiwne limfocyty Th mogą być również indukowane (iTreg), aby stały się regulatorowe na obrzeżach (przegląd w14,15). Oba typy limfocytów Treg wyrażają charakterystyczny czynnik transkrypcyjny, określany jako skrzynka widłowa P3 (Foxp3), który ma kluczowe znaczenie dla ich mechanizmów supresji efektorów, które obejmują produkcję rozpuszczalnych mediatorów przeciwzapalnych, konsumpcję IL-2 i mechanizmy zależne od kontaktu komórkowego14,15. Brak ekspresji Foxp3 powoduje ciężką, wielonarządową chorobę autoimmunologiczną określaną jako dysregulacja immunologiczna, poliendokrynopatia, enteropatia, zespół sprzężony z chromosomem X (IPEX), co pokazuje krytyczną rolę tej podgrupy Th w rozwiązywaniu stanu zapalnego i regulacji obwodowej tolerancji na własne antygeny16. In vitro naiwne limfocyty pomocnicze T CD4 + regulują w górę Foxp3 i angażują się w program Treg po stymulacji IL-2 i TGF-β14,15. W liniach limfocytów T CD4 + może występować umiarkowana lub znaczna plastyczność, zwłaszcza gdy bierze się pod uwagę tylko produkcję cytokin (przegląd w 17,18). Jednak na potrzeby protokołów różnicowania in vitro będziemy omawiać każdy podzbiór jako unikalną linię.

Niedawno, podzbiór komórek Th17, który wytwarza cytokinę IL-17, został zidentyfikowany jako unikalna linia o funkcjach prozapalnych, które są szczególnie patogenne podczas autoimmunologicznego zapalenia19-21. Komórki Th17 wyrażają unikalny czynnik transkrypcyjny, określany jako receptor sierocy gamma t związany z retinoidami (RORγt), który koordynuje program genetyczny Th1722. TGFβ jest ważny dla generowania linii Th17 poprzez indukcję RORγt. Uważa się jednak, że efekt sygnalizacji TGFβ indukuje zaangażowanie Th17 tylko po synergii z IL-6 (omówione w12). Dalsze badania wykazały, że wiele innych sygnałów, które mogą pozytywnie regulować zaangażowanie Th17, w tym IL-1β, zwiększona zawartość sodu i sygnalizacja TLR23-26. Inne doniesienia sugerują, że patogenne komórki Th17 in vivo to te, które faktycznie omijają sygnalizację TGFβ i zamiast tego polegają na kombinacji IL-1, IL-6 i IL-23 w celu ich różnicowania27. Tak więc komórki Th17 mogą pochodzić z różnych szlaków sygnałowych; Dla celów niniejszego protokołu przedstawiona zostanie powszechnie stosowana (TGFβ i IL-6) ścieżka zobowiązania linii Th17.

Opisane poniżej protokoły różnicowania dla wszystkich linii efektorowych opierają się na stałym przeciwciałie jako bodźcu dla TCR i CD28 przez cały czas trwania eksperymentu. Jednak inni wykazali, że aktywacja TCR za pomocą komórek prezentujących antygen28 lub sieciowanie przeciwciał anty-CD3 i anty-CD28 z przeciwciałem chomika przez 2 dni29 są również wysoce skutecznymi sposobami indukowania wytwarzania różnych podzbiorów Th. Przedstawiony tutaj protokół opiera się na wcześniej opisanych metodach izolowania mysich limfocytów T CD4 + z wtórnych narządów limfatycznych30 i generowania komórek Th1731. Jedną z głównych różnic jest to, że protokół ten opiera się na użyciu sortera komórek do izolowania naiwnych limfocytów T CD4 + z tkanek limfatycznych. Jednak wiele firm oferuje obecnie zestawy do szybkiej separacji, które mogą wzbogacić o naiwne limfocyty T CD4 +, które mogą być w stanie ominąć wymóg sortowania w zależności od eksperymentu. Metody i odczynniki przedstawione w tym protokole są tym, co rutynowo stosujemy i uważamy za najbardziej skuteczne. Należy jednak pamiętać, że dla wielu z przedstawionych poniżej kroków istnieją alternatywne odczynniki i metodologie i to od poszczególnych laboratoriów zależy, co najlepiej sprawdzi się w ich celach.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie procedury eksperymentalne są wykonywane przy użyciu protokołów zatwierdzonych przez Biuro Bezpieczeństwa i Higieny Pracy na Uniwersytecie Medycyny i Nauki Rosalind Franklin. Myszy C57BL/6 (zakupione od NCI) użyte do tego protokołu były trzymane w określonych warunkach wolnych od patogenów, a wszystkie eksperymenty na zwierzętach przeprowadzono przy użyciu protokołów zatwierdzonych przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Wykorzystania Zwierząt (IACUC) na Uniwersytecie Medycyny i Nauki Rosalind Franklin.

1. Przygotowanie instrumentów, materiałów eksploatacyjnych i odczynników

  1. Pokryć płytki 48-dołkowe lub 24-dołkowe anty-CD3 i anty-CD28 (Tabela 1) sterylnym PBS, przykryć i zawinąć w parafilm, aby zapobiec parowaniu i zanieczyszczeniu, a następnie inkubować O/N w temperaturze 4 oC na dzień przed izolacją limfocytów T. Alternatywnie, powlekaj studzienki przez 1 godzinę w temperaturze 37 oC. Wykonaj warunki Th0, Th1, Th2 i iTreg, pokrywając zarówno anty-CD3, jak i anty-CD28 w ilości 1 μg/ml w całkowitej objętości 0,5-1 ml (płytka 48-dołkowa). W przypadku Th17 zwykle pokrywamy anty-CD3 w stężeniu 2 μg/ml i anty-CD28 w ilości 1 μg/ml.
    UWAGA: Odkryliśmy, że niższe stężenie anty-CD3 jest optymalne dla generacji Th1, Th2 i iTreg, podczas gdy wyższe stężenie anty-CD3 jest optymalne dla generacji Th17. W związku z tym stężenia anty-CD3 i anty-CD28 powinny być miareczkowane i optymalizowane dla poszczególnych laboratoriów (Tabela 2).
  2. Wysterylizuj zestaw narzędzi preparacyjnych (nożyczki i kleszcze) w autoklawie lub roztworze dezynfekującym. Do szybkiej sterylizacji narzędzi między sekcjami potrzebna będzie probówka lub mała zlewka zawierająca 70% etanolu. Wreszcie, butelka z rozpylaczem zawierająca 70% etanolu będzie potrzebna do sterylizacji powierzchni myszy przed preparacją.
  3. Przygotuj powierzchnię do preparowania, owijając płaski kawałek styropianu lub tablicę korkową folią aluminiową. Szpilki lub igły preparacyjne służą do zamocowania zwierzęcia na miejscu.
  4. Przygotuj naczynia lub talerze do pobrania chusteczek. W przypadku łączenia tkanek wystarczy oddzielne 60-milimetrowe szalki zawierające 3 ml sterylnego PBS + 1% FBS (PBS+) dla tkanek śledziony i węzłów chłonnych. Jeśli trzymasz tkanki od pojedynczych myszy oddzielnie, przygotuj 24-dołkową płytkę zawierającą 1 ml PBS+ w żądanej liczbie dołków.
  5. Przygotuj kompletną pożywkę RPMI do hodowli komórkowej i wstępnie podgrzej przed użyciem (Tabela 1).
    UWAGA: Rutynowo używamy RPMI, ale inne media, takie jak IMDM i DMEM, mogą być równie skuteczne lub lepsze w zależności od laboratorium i eksperymentu.
  6. Wytnij kwadraty siatki nylonowej o wymiarach 2x2 cm z porami o wielkości 120 μm i umieść w autoklawie do sterylizacji (Tabela 1).
  7. Opcjonalnie: w przypadku korzystania z szybkiego magnetycznego systemu sortowania komórek, takiego jak autoMACS do wzbogacania komórek CD4+, należy wstępnie podgrzać do pracy i płukania w łaźni wodnej o temperaturze 37 oC, aby zapobiec uszkodzeniu maszyny.
  8. UWAGA: Wzbogacanie jest zalecane w celu zwiększenia wydajności sortowania i skrócenia czasu sortowania.
  9. Wszystkie etapy przygotowania, z wyjątkiem sekcji, powinny być wykonywane w sterylnym kapturze do hodowli tkankowych.

2. Izolacja węzłów chłonnych i śledziony od myszy

  1. Poddać eutanazji wymaganą liczbę zwierząt przy użyciu techniki zatwierdzonej przez instytucję. Użyj samic myszy C57BL/6 w wieku 5-10 tygodni, ze względu na wysoki odsetek naiwnych limfocytów T i niższą zawartość tkanki tłuszczowej w porównaniu z samcami lub starszymi myszami.
    UWAGA: Komórki pochodzące od samców myszy będą działać podobnie in vitro, a kroki protokołu pozostają takie same. Samice myszy, w wieku 5-10 tygodni, zazwyczaj produkują 3-6 x 106 naiwnych limfocytów T CD4 + na mysz. Jednak używanie różnych szczepów myszy może mieć wpływ na plon i wydajność. Na przykład komórki myszy C57BL / 6 są lepsze do generowania komórek Th1, podczas gdy komórki myszy Balb.c są lepsze do generowania komórek Th2.
  2. Rozłóż kończyny zwierzęcia i przypnij je w miejscu, jak pokazano na rysunku 1. Przetnij skórę wzdłuż od odbytu do podbródka, uważając, aby nie przebić głębszej tkanki.
  3. Rozprowadź skórę za pomocą kleszczy i przypnij skórę na miejscu, aby umożliwić łatwy dostęp do węzłów chłonnych, jak pokazano na rysunku 1.
  4. Zbierz dostępne węzły chłonne z miejsc pokazanych na rysunku 1. Złapanie węzła chłonnego za pomocą kleszczy przy jednoczesnym oddzieleniu tkanki inną parą kleszczyków pozwoli na łatwe usunięcie. Umieść chusteczkę w naczyniu zbiorczym.
  5. Zbierz śledzionę z miejsca pokazanego na rysunku 1. W takim przypadku konieczne jest ostrożne nacięcie otrzewnej, aby uzyskać dostęp do śledziony. Umieść chusteczkę w naczyniu zbiorczym.
  6. Powtórz procedurę, jeśli zostanie pobranych więcej tkanek. W przeciwnym razie przejdź do następnych kroków. W tym momencie wykonaj wszystkie pozostałe kroki na lodzie, aż do posiewu limfocytów T po sortowaniu.

3. Przetwarzanie tkanek i wzbogacanie CD4+

  1. Przetwarzaj węzły chłonne i śledzionę w różnych naczyniach, aby zwiększyć wydajność, ponieważ preparaty komórek węzłów chłonnych nie wymagają lizy erytrocytów, co może skutkować niewielką śmiercią leukocytów. W związku z tym w poniższych krokach opisano metodę oddzielnego przetwarzania populacji śledziony i węzłów chłonnych, a następnie łączenia przed etykietowaniem w celu sortowania.
  2. Usunąć tkankę (śledzionę lub połączone węzły chłonne) z naczynia zbiorczego i umieścić w nowym naczyniu o średnicy 60 mm zawierającym 3 ml PBS+. Umieść kwadrat sterylnej nylonowej siatki na tkance za pomocą wysterylizowanych kleszczy.
  3. Weź tłok strzykawki od strony kciuka (3-10 ml) i delikatnie roztrzaskaj tkankę o siatkę. Prawie cała tkanka powinna trafić do zawiesiny. Alternatywnie, umieść tkankę między dwoma autoklawowanymi matowymi szkiełkami i zmieloną na zawiesinę.
  4. Kilkakrotnie odpipetować zawiesinę w górę i w dół, aby rozbić pozostałe rozpuszczalne grudki. Umieść nowy kwadratowy kawałek nylonowej siatki nad otworem stożkowej rurki o pojemności 15 ml i przefiltruj zawiesinę, aby usunąć pozostałe zanieczyszczenia.
  5. Powtórz kroki 2-4 dla dodatkowego węzła chłonnego i tkanki śledziony.
  6. Po przefiltrowaniu zawiesiny do probówki o pojemności 15 ml napełnij pozostałą część probówki PBS+ i odwróć kilka razy. Odwirować komórki przy 475 x g przez 5 minut w temperaturze 4 oC.
  7. W przypadku komórek śledziony odessać supernatant po odwirowaniu i ponownie zawiesić osad komórkowy w 1 ml lodowatego roztworu 1X ACK na śledzionę przez 1 minutę w celu lizy erytrocytów. Następnie dodać 10 ml PBS+ na wierzch ACK, odwrócić probówkę i odwirować 475 x g przez 5 minut w temperaturze 4 oC.
  8. W przypadku komórek węzłów chłonnych odessać supernatant i ponownie zawiesić w 2 ml PBS+. W razie potrzeby można je połączyć z komórkami śledziony po ich lizie ACK i etapie mycia.
  9. Odessać supernatant po odwirowaniu splenocytów i ponownie zawiesić w kolejnych 10 ml PBS+. W tym momencie zawiesinę węzłów chłonnych można dodać do zawiesiny śledziony, jeśli do sortowania wymagane jest gromadzenie tkanek. Ponownie odwirować probówkę o sile 475 x g przez 5 minut w temperaturze 4 oC.
  10. Osad komórkowy można teraz przygotować do wzbogacenia w CD4. Jeśli ten krok nie zostanie wykonany, przejdź do etapów przygotowania sortowania.
  11. W celu wzbogacenia CD4 za pomocą szybkiego magnetycznego systemu sortowania komórek, ponownie zawiesić granulkę komórkową za pomocą kulek CD4. Zazwyczaj 15 μl kulek rozcieńczonych w 85 μl PBS+ używa się do oznaczania tkanek od 1 myszy. W razie potrzeby zwiększyć objętość mieszanki kulek, ponownie zawiesić osad i inkubować przez 15-30 minut w temperaturze 4 oC.
  12. Przemyć komórki 10 ml PBS+, przepuścić zawiesinę przez nylon do nowej probówki o pojemności 15 ml w celu usunięcia zanieczyszczeń i ponownie odwirować przy 475 x g przez 5 minut w temperaturze 4 oC.
  13. Ponownie zawiesić osad w 100 μl PBS+ na mysz i przystąpić do pozytywnej selekcji w szybkim magnetycznym systemie sortowania komórek. W przypadku korzystania z ręcznego systemu separacji należy postępować zgodnie z instrukcjami producenta dotyczącymi wzbogacania. Alternatywnie, ponownie zawiesić próbki w buforze FACS: PBS z 1mM EDTA (pH = 8) i 1% BSA, sterylnie przefiltrowane.
  14. Usuń frakcję dodatnią i ponownie przemyj 10 ml PBS+. Wzbogacona frakcja CD4+ jest teraz gotowa do etykietowania do sortowania.

4. Sortowanie naiwnych limfocytów T CD4+

  1. Oznakuj osad komórkowy PBS + zawierającym przeciwciała fluorescencyjne skierowane przeciwko CD62L, CD44, CD25 i CD4. W przypadku stosowania przeciwciał wymienionych w Tabeli 1 podaje się rozcieńczenia dla każdego z nich. Do barwienia stosuje się 100 μl objętości koktajlu przeciwciał na tkankę z jednej myszy.
  2. Zawiesić osad w koktajlu przeciwciał i inkubować przez 15-30 minut w temperaturze 4 oC w ciemności.
  3. Przemyć komórki 10 ml PBS+ i odwirować 475 x g przez 5 minut w temperaturze 4 oC.
  4. Przełóż mieszaninę na inny nylonowy filtr lub nasadkę sitka komórkowego, aby usunąć wszelkie resztki zanieczyszczeń. Odpipetuj oznaczone komórki do probówki kompatybilnej z sortownikiem komórek. Utrzymuj komórki na lodzie i chroń przed światłem do czasu sortowania.
  5. Przygotuj probówki zbiorcze, pipetując 1-2 ml kompletnego podłoża RPMI lub FBS na dno probówek kompatybilnych z pobieraniem na sortowniku komórek.
  6. Posortuj naiwne limfocyty T CD4 + jako populację CD4 + CD25-CD62L + CD44- (Figura 2). Umyj zebrane komórki kompletną pożywką RPMI i odwiruj, jak opisano powyżej.
  7. Ponownie zawiesić osad w pełnym RPMI, policzyć naiwne komórki i dostosować stężenie do 1 x 106 komórek/ml.

5. Ustawianie różnicowania in vitro

  1. Odessać dołki płytek pokrytych anty-CD3 i anty-CD28 i umyć każdą studzienkę 1 ml sterylnego PBS (bez FBS). W przypadku płytek 48-dołkowych, płytka 0,5 x 106 komórek/basenik w 0,5 ml RPMI. W przypadku płytek 24-dołkowych należy przeprowadzić hodowlę 1 x 106 komórek/basenik w 1,0 ml RPMI.
  2. W przypadku badania wpływu czynnika, takiego jak narkotyk, dodaj substancję do odpowiednich studzienek przed, w trakcie lub po procesie różnicowania, w zależności od eksperymentu. Następnie uzupełnij pożywkę hodowlaną odpowiednio cytokinami i przeciwciałami blokującymi. Th0: 30 U/ml hIL-2. Th1: 15 ng/ml rmIL-12, 30 U/ml hIL-2 i 5 000 ng/ml 11B11.Th2: 10 ng/ml rmIL-4, 30 U/ml hIL-2, 2,000 ng/ml rozpuszczalny 37,51 i 5,000 ng/ml XMG1.2. iTreg: 15 ng/ml hTGFβ, 30 U/ml hIL-2, 5 000 ng/ml XMG1.2 i 5 000 ng/ml 11B11. Th17: 20 ng/ml rmIL-6, 3 ng/ml hTGFβ, 5 000 ng/ml XMG1.2 i 5 000 ng/ml 11B11.
    UWAGA: Warunki przedstawione powyżej uznano za optymalne dla maksymalizacji produkcji cytokin mierzonej na końcu eksperymentu różnicowania (sekcja Reprezentatywne wyniki). Jednak każdy warunek powinien być zoptymalizowany dla poszczególnych laboratoriów (Tabela 2). Ponadto stwierdzono, że dodanie rozpuszczalnego anty-CD28 oprócz związanego z płytką anty-CD28 zwiększa produkcję cytokin Th2 w naszym laboratorium, ale nie ma wpływu na inne podzbiory limfocytów T:
  3. Inkubować płytkę w temperaturze 37 oC z 5% CO2 przez 4-5 dni przed analizą ekspresji genów i produkcji cytokin. Alternatywnie, usuń komórki z bodźców TCR po 2 dniach, dostosowanych do 1 x 106 komórek/ml ze świeżą pożywką i umieść w nowych dołkach (niepowlekanych) w celu zwiększenia proliferacji i końcowej wydajności. W takim przypadku świeże cytokiny polaryzujące i przeciwciała nie są potrzebne, ale 10 U/ml IL-2 należy dodać do nowych pożywek dla kultur Th0, Th1, Th2 i iTreg.

6. Analiza zróżnicowania

  1. W przypadku analizy cytokin metodą cytometrii przepływowej, należy ponownie stymulować każdą studzienkę 10 ng / ml PMA i 1 000 ng / ml jonomycyny lub 1 μg / ml anty-CD3 przez 4-6 godzin w obecności inhibitora Golgiego, takiego jak brefeldyna A (Tabela 1). Wykonaj barwienie cytokin wewnątrzkomórkowych w zależności od eksperymentu (ryc. 3).
    UWAGA: Barwienie cytokin lub czynników transkrypcyjnych niespecyficznych dla linii, takich jak IL-4 (nie pokazano) i IFNγ (Figura 3) dla kultur Th17, dla każdego warunku jako kontrole ujemne i jako wskaźnik skuteczności różnicowania. Ponadto barwienie Foxp3 dla kultur Th17, ponieważ wzajemny rozwój Treg może wystąpić z dodatkiem TGFβ.
  2. W celu ilościowego określenia białka należy zebrać supernatanty z każdej studzienki i oznaczyć za pomocą testu ELISA specyficznego dla cytokin (ryc. 3). Jeśli istnieje obawa, że badany czynnik wpłynął na proliferację w porównaniu z próbkami kontrolnymi, komórki można umyć, policzyć, znormalizować, a następnie ponownie emulować za pomocą 1 μg/ml anty-CD3 przez 24 godziny przed pobraniem supernatantów do testów ELISA. W przypadku oznaczania IL-4 z warunków Th2 konieczne jest przemycie i ponowna stymulacja w celu usunięcia IL-4, która może pozostać po początkowej kulturze różnicowania.
  3. W przypadku analizy ekspresji genów metodą PCR w czasie rzeczywistym, zbierz komórki po okresie inkubacji, umyj, normalizuj i ponownie stymuluj przez 2-6 godzin 1 μg / ml anty-CD3 przed pobraniem mRNA (Figura 3).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Punkt czasowy dla analizy różnicowania może się różnić w zależności od badanego stanu Th, jak również od siły aktywacji receptora limfocytów T. Po 2-3 dniach różnicowania komórki można uwidocznić za pomocą mikroskopii świetlnej w celu określenia stopnia proliferacji limfocytów T. Studzienki wykazujące rozległą proliferację i zlepianie się komórek będą najprawdopodobniej gotowe do analizy w 4 dniu. Warunki różnicowania polegające na dodaniu egzogennej IL-2, takiej jak Th1 i Th2, prawdopodobnie wyczerpią pożywkę po 4 dniac...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Chociaż śledziona zawiera naiwne komórki Th, odsetek tej populacji w węzłach chłonnych jest znacznie wyższy. Brak prawidłowej identyfikacji i usunięcia węzłów chłonnych w tym protokole spowoduje słabą wydajność naiwnych komórek. Może to być szczególnie trudne u starszych myszy lub samców myszy, które mają więcej tkanki tłuszczowej. Jak pokazano na rycinie 1, prawidłowe zamocowanie i przypięcie kończyn i skóry zwierzęcia pozwoli na łatwiejszą wizualizację dostępnych zewnętrznych węzłów chłonnych. Po przet...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów finansowych.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy chcieliby podziękować wszystkim członkom laboratorium Reynoldsa na Uniwersytecie Medycyny i Nauki Rosalind Franklin oraz laboratorium Chen Dong na Uniwersytecie Teksańskim MD Anderson Cancer Center za optymalizację tego protokołu. Prace te zostały wsparte grantem dla J.M.R. z National Institutes of Health (K22AI104941).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Kompletny RPMI:Przed użyciem podgrzej się w kąpieli wodnej o temperaturze 37 oC
RPMI 1640 MediaLife Technologies11875119
10 % FBSLife Technologies26140-079
1000X 2-merkaptoetanolLife Technologies21985023
100X Pen/StrepLife Technologies15140122
100X L-glutaminaLife Technologies25030081
120 mikronów nylonowasiatka AmazonCMN-0120-10YDPokrój na kwadraty 2 cm2 i autoklaw
Alternatywa: sitka do komórek 100 mikronówFisher08-771-19Alternatywa dla cięcia siatki nylonowej
autoMACS bufor do bieganiaMiltenyi130-091-221Przed użyciem podgrzej w kąpieli wodnej o temperaturze 37 oC
Roztwór do płukania autoMACSMiltenyi130-091-222Przed użyciem podgrzej w kąpieli wodnej 37 oC
Koraliki CD4Miltenyi130-049-201
Bufor do lizy ACKLife TechnologiesA10492-01
Cytokiny:
Ludzkie (h) IL-2Peprotech200-02
Mysz rekombinowana (rm) IL-4Peprotech214-14
rmIL-6R & D Systems406-ML-025
rmIL-12Peprotech210-12
hTGFbR & Przeciwciała D Systems240-B-010
:
2C11 (anty-CD3)BioXcellBE0001-1
37,51 (anty-CD28)BioXcellBE0015-1
11B11 (anty-IL-4)BioXcellBE0045
XMG1.2 (anty-IFNg)BioXcellBE0055
anty-CD62L-FITCBioLegend104406Stosować w stosunku 1:100
anty-CD25-PEBioLegend102008Stosować w stosunku 1:400
anty-CD4-PerCPBioLegend100434Stosować w proporcji 1:1000
anty-CD44-APCBioLegend103012stosować w proporcji 1:500
Phorbol  Octan 12-mirystynianu 13 (PMA)Sigma-AldrichP-8139Przygotować zapas w ilości 0,1 mg/ml w DMSO i zamrozić podwielokrotności w temperaturze -20 oC
IonomycynaSigma-AldrichI-0634Przygotować zapas w dawce 0,5 mg/ml w DMSO i zamrozić podwielokrotności w temperaturze -20 oC
Brefeldin AeBioscience00-4506-51Stosować w stosunku 1:1000

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Mosmann, T. R., Cherwinski, H., Bond, M. W., Giedlin, M. A., Coffman, R. L. Two types of murine helper T cell clone. I. Definition according to profiles of lymphokine activities and secreted proteins. J Immunol. 136 (7), 2348-2357 (1986).
  2. Dong, C., Flavell, R. A. Cell fate decision: T-helper 1 and 2 subsets in immune responses. Arthritis Res. 2 (3), 179-188 (2000).
  3. Hsieh, C. S., et al. Development of TH1 CD4+ T cells through IL-12 produced by Listeria-induced macrophages. Science. 260 (5107), 547-549 (1993).
  4. Seder, R. A., Gazzinelli, R., Sher, A., Paul, W. E. Interleukin 12 acts directly on CD4+ T cells to enhance priming for interferon gamma production and diminishes interleukin 4 inhibition of such priming. Proc Natl Acad Sci U S A. 90 (21), 10188-10192 (1993).
  5. Szabo, S. J., et al. A novel transcription factor, T-bet, directs Th1 lineage commitment. Cell. 100 (6), 655-669 (2000).
  6. Afkarian, M., et al. T-bet is a STAT1-induced regulator of IL-12R expression in naive CD4. T cells. Nat Immunol. 3 (6), 549-557 (2002).
  7. Zhu, J., et al. The transcription factor T-bet is induced by multiple pathways and prevents an endogenous Th2 cell program during Th1 cell responses. Immunity. 37 (4), 660-673 (2012).
  8. Le Gros, G., Ben-Sasson, S. Z., Seder, R., Finkelman, F. D., Paul, W. E. Generation of interleukin 4 (IL-4)-producing cells in vivo and in vitro: IL-2 and IL-4 are required for in vitro generation of IL-4-producing cells. J Exp Med. 172 (3), 921-929 (1990).
  9. Swain, S. L., Weinberg, A. D., English, M., Huston, G. IL-4 directs the development of Th2-like helper effectors. J Immunol. 145 (11), 3796-3806 (1990).
  10. Zhang, D. H., Cohn, L., Ray, P., Bottomly, K., Ray, A. Transcription factor GATA-3 is differentially expressed in murine Th1 and Th2 cells and controls Th2-specific expression of the interleukin-5 gene. J Biol Chem. 272 (34), 21597-21603 (1997).
  11. Zheng, W., Flavell, R. A. The transcription factor GATA-3 is necessary and sufficient for Th2 cytokine gene expression in CD4 T cells. Cell. 89 (4), 587-596 (1997).
  12. Dong, C. TH17 cells in development: an updated view of their molecular identity and genetic programming. Nat Rev Immunol. 8 (5), 337-348 (2008).
  13. Jiang, S., Dong, C. A complex issue on CD4(+) T-cell subsets. Immunol Rev. 252 (1), 5-11 (2013).
  14. Rudensky, A. Y. Regulatory T cells and Foxp3. Immunol Rev. 241 (1), 260-268 (2011).
  15. Sakaguchi, S., Yamaguchi, T., Nomura, T., Ono, M. Regulatory T cells and immune tolerance. Cell. 133 (5), 775-787 (2008).
  16. Barzaghi, F., Passerini, L., Bacchetta, R. Immune dysregulation, polyendocrinopathy, enteropathy, x-linked syndrome: a paradigm of immunodeficiency with autoimmunity. Front Immunol. 3, 211(2012).
  17. Shea, J. J., Paul, W. E. Mechanisms underlying lineage commitment and plasticity of helper CD4 T cells. Science. 327 (5969), 1098-1102 (2010).
  18. Zhou, L., Chong, M. M., Littman, D. R. Plasticity of CD4+ T cell lineage differentiation. Immunity. 30 (5), 646-655 (2009).
  19. Harrington, L. E., et al. Interleukin 17-producing CD4+ effector T cells develop via a lineage distinct from the T helper type 1 and 2 lineages. Nat Immunol. 6 (11), 1123-1132 (2005).
  20. Langrish, C. L., et al. IL-23 drives a pathogenic T cell population that induces autoimmune inflammation. J Exp Med. 201 (2), 233-240 (2005).
  21. Park, H., et al. A distinct lineage of CD4 T cells regulates tissue inflammation by producing interleukin 17. Nat Immunol. 6 (11), 1133-1141 (2005).
  22. Ivanov, I. I., et al. The orphan nuclear receptor RORgammat directs the differentiation program of proinflammatory IL-17+ T helper cells. Cell. 126 (6), 1121-1133 (2006).
  23. Chung, Y., et al. Critical regulation of early Th17 cell differentiation by interleukin-1 signaling. Immunity. 30 (4), 576-587 (2009).
  24. Reynolds, J. M., Martinez, G. J., Chung, Y., Dong, C. Toll-like receptor 4 signaling in T cells promotes autoimmune inflammation. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (32), 13064-13069 (2012).
  25. Reynolds, J. M., et al. Toll-like receptor 2 signaling in CD4(+) T lymphocytes promotes T helper 17 responses and regulates the pathogenesis of autoimmune disease. Immunity. 32 (5), 692-702 (2010).
  26. Wu, C., et al. Induction of pathogenic TH17 cells by inducible salt-sensing kinase SGK1. Nature. 496 (7446), 513-517 (2013).
  27. Ghoreschi, K., et al. Generation of pathogenic T(H)17 cells in the absence of TGF-beta signalling. Nature. 467 (7318), 967-971 (2010).
  28. Veldhoen, M., Hocking, R. J., Atkins, C. J., Locksley, R. M., Stockinger, B. TGFbeta in the context of an inflammatory cytokine milieu supports de novo differentiation of IL-17-producing T cells. Immunity. 24 (2), 179-189 (2006).
  29. Avni, O., et al. T(H) cell differentiation is accompanied by dynamic changes in histone acetylation of cytokine genes. Nat Immunol. 3 (7), 643-651 (2002).
  30. Matheu, M. P., Cahalan, M. D. Isolation of CD4+ T cells from mouse lymph nodes using Miltenyi MACS purification. J Vis Exp. (9), (2007).
  31. Bedoya, S. K., Wilson, T. D., Collins, E. L., Lau, K., Larkin, J. 3rd Isolation and th17 differentiation of naive CD4 T lymphocytes. J Vis Exp. (79), e50765(2013).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Izolacja naiwnych limfocyt w T CD4separacja za pomoc kulek magnetycznychr nicowanie subpopulacji limfocyt w Tanaliza cytometrycznaocena metod PCR w czasie rzeczywistymprocesowanie w z w ch onnychprzygotowanie kom rek ledzionypolaryzacja cytokinaktywacja TCRlinie limfocyt w T pomocniczych

Powiązane artykuły