Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Znakowanie i przeszczepianie za pośrednictwem wirusów komórek wyniosłości przyśrodkowej zwoju (MGE) do badań in vivo

11.1K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/52740

⸱

23 kwietnia 2015

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Psychiatry, University of California San Francisco, 2Department of Neurological Surgery, University of California San Francisco

W tym artykule

Podsumowanie

GABAergiczne pregenty interneuronów korowych rozpraszają się, rozwijają i synaptycznie integrują z korą gospodarza po przeszczepie. Komórki te mogą być łatwo transdukowane przed przeszczepem do badań in vivo genetycznie zmodyfikowanych prekursorów GABA-ergicznych. Tutaj pokazujemy techniki znakowania wirusów w celu ukierunkowania na określone podgrupy interneuronów przy użyciu istniejących linii Cre i reporterów zależnych od Cre.

Streszczenie

Wprowadzenie

GABAergiczne interneurony korowe stanowią ~20-30% neuronów w korze nowej ssaków, podczas gdy reszta odpowiada pobudzającym, glutaminergicznym neuronom głównym. Interneurony są bardzo zróżnicowane pod względem właściwości elektrofizjologicznych, morfologii aksonów i dendrytów oraz ukierunkowania synaptycznego 1, a przypuszcza się, że nierównowaga w tonie pobudzającym/hamującym leży u podstaw niektórych fenotypów zaburzeń neurologicznych/neuropsychiatrycznych, w tym autyzmu, schizofrenii i epilepsji 2. Ogólnym celem opisanego w niniejszym dokumencie protokołu jest zapewnienie środków do skutecznej genetycznej modyfikacji komórek progenitorowych interneuronów kory GABA-ergicznej przed przeszczepem do analiz in vivo.

Korowe interneurony GABA-ergiczne rodzą się w wypukłościach przyśrodkowych i ogonowych (odpowiednio MGE i CGE) 3,4 oraz w obszarze przedwzrokowym 5. Komórki progenitorowe interneuronów korowych przechodzą długodystansową migrację styczną, po której następuje migracja radialna, aby osiągnąć swoje ostateczne cele. Po dotarciu do miejsca przeznaczenia te interneurony korowe muszą prawidłowo zintegrować się z istniejącą siecią neuronalną, a każda unikalna podgrupa interneuronów będzie przyczyniać się do obwodów korowych w określony sposób. Na podstawie markerów molekularnych można wyróżnić cztery główne podgrupy: podgrupy somatostatyny (SST)+ i parwalbuminy (PV)+ pochodzące z MGE oraz wazoaktywny peptyd jelitowy (VIP)+ i reelina+ pochodzące z CGE; SST - podgrupy 6. Różne podgrupy interneuronów korowych rodzą się w różnym czasie rozwoju embrionalnego w MGE i CGE 7, 8. Te i inne korowe markery interneuronów GABA-ergiczny zostały wykorzystane do wygenerowania specyficznych linii sterownika Cre dla wielu z tych podgrup 9-11.

Przeszczep progenitorów MGE pojawił się jako potencjalna terapia komórkowa do leczenia zaburzeń, które mogą być spowodowane brakiem równowagi w pobudzeniu/hamowaniu 12–24. Te korzyści terapeutyczne mogą wynikać częściowo z unikalnej zdolności progenitorów MGE (do rozpraszania, różnicowania i integracji z mózgiem gospodarza) lub potencjalnie z tego, że wiele okołosomatycznych komórek hamujących PV+ pochodzi z MGE. Komórki MGE mogą być również szybko i skutecznie transdukowane lentiwirusami przed przeszczepem 15, co pozwala na badanie in vivo komórek, które są genetycznie modyfikowane in vitro. Uzasadnieniem dla opracowania tego podejścia było pokonanie przeszkód w badaniu rozwoju i dojrzewania interneuronów kory mózgowej GABA-ergiczne. W szczególności przeszczep MGE pozwolił naukowcom na zbadanie rozwoju zmutowanych komórek in vivo, podczas gdy w przeciwnym razie zmutowana mysz zmarłaby we wczesnym czasie. Co więcej, wprowadzając interesujące geny przed przeszczepem, można było skutecznie ocenić wpływ określonych genów na zmutowany fenotyp.

Tutaj udostępniamy szczegółowy protokół transdukcji komórek MGE za pomocą lentiwirusów przed przeszczepem. Ponadto pokazujemy, w jaki sposób technikę tę można dostosować do ekspresji interesującego genu w określonych podgrupach interneuronów z heterogenicznej grupy prekursorów interneuronów korowych, wykorzystując kombinację lentiwirusów o ekspresji Cre i dostępnych linii myszy Cre-driver. Co więcej, protokół ten wprowadza techniki i platformę dla naukowców do genetycznej modyfikacji prekursorów interneuronów korowych GABA-ergiczne do badań in vivo w unikalny sposób. Jedną z zalet tej techniki w porównaniu z innymi obecnymi podejściami jest to, że przeszczepione komórki MGE rozpraszają się z dala od miejsca wstrzyknięcia. Ponadto, w przeciwieństwie do ogniskowych zastrzyków wirusowych, po rozproszeniu komórek MGE ich morfologia jest łatwiejsza do oceny. Podejście to można wykorzystać do zbadania wpływu wprowadzenia interesujących genów do komórek typu dzikiego lub zmutowanego, wprowadzenia reportera specyficznego dla typu komórki w celu oceny morfologii lub potencjalnie do zbadania wpływu alleli choroby in vivo.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Oświadczenie etyczne: Następujące procedury zostały zatwierdzone przez naszą instytucję i protokół dla zwierząt. Upewnij się, że uzyskałeś zgodę na wszystkie procedury obejmujące operacje przetrwania przed rozpoczęciem eksperymentów i sprawdź, czy wszystkie protokoły są aktualne.

1. Przygotowanie do lentiwirusa (krok opcjonalny)

  1. Podziel trzy 10 cm płytki z HEK293T komórek dla każdego lentiwirusa, który ma zostać wykonany, w obecności 10 ml DMEM/10% FBS i osiągnij ~60-70% konfluencji. Hodować komórki w inkubatorze w temperaturze 37 °C z 5% CO2 .
  2. Transfekcję następujących plazmidów DNA (łącznie 10 μg) na każdą płytkę przy użyciu dowolnego odczynnika do transfekcji: 6,4 μg wektora lentiwirusowego CAG-Flex-GFP (sekwencja wektora DNA podana w tabeli 1), 1,2 μg pMD2.G (koduje VSV-g), 1,2 μg pRSV-Rev i 1,2 μg pMDLg/pRRE. Trzy wektory opakowania lentiwirusowego są dostępne w handlu (tabela
    Uwaga: To konkretne podejście wykorzystuje wektory lentiwirusowe 3. generacji, ale wektory 2. generacji i związane z nimi plazmidy również będą działać.
  3. Przygotuj pojemnik na odpady zawierający 10% roztwór wybielacza w okapie z certyfikatem BSL2, aby dezaktywować wszelkie roztwory lub urządzenia, które miały kontakt z lentiwirusem lub je zawierały. Następnie całkowicie usuń pożywkę 4-6 godzin po transfekcji do roztworu wybielacza, zastąp taką samą objętością nowego podłoża i pozwól komórkom rosnąć.
  4. Po 4 dniach zebrać pożywkę do stożkowych probówek o pojemności 50 ml i odwirować przy 1 000 x g przez 15 minut, aby osadzać wszelkie resztki komórek. Następnie przefiltrować supernatant przez membranę 0,45 μm. Każdy filtr o niskim poziomie wiązania białek, taki jak PVDF, działa dobrze. Uwaga: w roztworze wybielacza należy umieścić zarówno stałe, jak i płynne odpady wirusowe.
  5. Załadować 30 ml przefiltrowanego supernatantu do probówek ultrawirówek i do ultrawirówki. Wirować przy 100 000 x g przez 2,5 godziny w temperaturze 4 °C. Otwórz probówki wirówkowe w okapie BSL2 i usuń supernatant do 10% wybielacza. Dodaj ~100 μl PBS do osadu, co daje miano 1x10^7-8 jednostek zakaźnych/ml. Porcję podwielokrotności należy podać następnego dnia i przechowywać w temperaturze -80 °C. Podwielokrotności lentiwirusa są stabilne w temperaturze -80 °C przez co najmniej sześć miesięcy.
  6. Ważna uwaga: Wiele instytucji ma teraz rdzenie wirusowe. Pozyskać skoncentrowany wirus o minimalnym mianie 1x107 jednostek zakaźnych/ml, aby uzyskać optymalne wyniki.

2. Myszy dawcy do sekcji MGE

  1. Najpierw ustaw krycie w czasie między linią zainteresowania wyrażającą Cre a myszą typu dzikiego (WT) lub myszą, która wyrazi reportera po rekombinacji za pośrednictwem Cre.
    Uwaga: Wiele linii Cre-driver jest transgenicznych i jest utrzymywanych i hodowanych w stanie hemizygotycznym. W związku z tym tylko połowa zarodków będzie zawierała transgen Cre. DNA można szybko przygotować z zarodków do krótkiej reakcji PCR w celu wykrycia allelu Cre. Zarodki Cre+ mogą być następnie pobrane tak, aby wykorzystana została tylko tkanka MGE o pożądanym genotypie. Alternatywnie można użyć osoby zgłaszającej zależnej od Cre, aby wybrać zarodki do sekcji i przeszczepienia MGE.
  2. Oblicz, który dzień będzie odpowiadał E13.5. Jeśli zwierzęta zostały sparowane poprzedniego wieczoru, dzień wtyczki wynosi 0,5. Zamów myszy w ciąży w ciąży w czasie lub samicę WT ze szczeniętami P1, aby mieć myszy po urodzeniu (P)1 w dniu, w którym tkanka dawcy będzie E13.5. Alternatywnie, należy zorganizować te krycia w domu na tydzień przed sparowaniem zwierząt-dawców.
    Uwaga: Poprzednia strategia polegająca na generowaniu zarówno zarodków/młodych E13,5, jak i P1 na ten sam dzień jest często trudna do niezawodnego wykonania.

3. Przygotowanie mediów, narzędzi i sprzętu.

  1. Przygotować odczynniki i narzędzia do przygotowania komórek MGE (Tabela 2).
    1. Przygotuj czystą powierzchnię i umieść na niej czyste kleszcze, nożyczki i nóż mikrochirurgiczny lub cienkie kleszcze (do precyzyjnego wycięcia tkanek).
    2. Przygotuj zbilansowany roztwór soli Hanka (HBSS) do sekcji oraz zmodyfikowaną pożywkę orła (DMEM) firmy Dulbeco z 10% płodowym surem bydlęcym (FBS) do transdukcji.
    3. Wstępnie inkubować 20-30 ml DMEM/10% FBS w inkubatorze do hodowli tkankowych w temperaturze 37 °C przez około 1 godzinę. Pokrywę należy poluzować, aby umożliwić wymianę gazową i wyrównanie pH pożywki.
      Uwaga: Preinkubację pożywki można przygotować tuż przed rozpoczęciem sekcji.

4. Przygotowanie komórek MGE

  1. Złożyć ciężarną mysz w ofierze zgodnie z zatwierdzonym protokołem zwierzęcym i usunąć zarodki na 10-centymetrową szalkę Petriego zawierającą lodowaty HBSS.
  2. Usuń mózg z każdego zarodka za pomocą lunety preparacyjnej (wykonuj pojedynczo, pozostawiając resztę zarodków w lodowatym HBSS), a następnie przystąp do wycinania tkanki MGE.
    Uwaga: Poniżej i na rysunku 1 szczegółowo opisano kluczowe kroki pokazujące, jak usunąć MGE. Ponadto na rysunku 2 znajduje się film przedstawiający całą procedurę sekcji.
    1. Ustaw mózg brzuszną stroną skierowaną do góry (ryc. 1A, A'). Uwaga: nie ma nic złego w tym, aby strona grzbietowa była skierowana do góry. Przetnij mózg na pół wzdłuż płaszczyzny szoskowej, aby uzyskać dwa kawałki. Pokazano przykład mózgu podzielonego na półkę (ryc. 1B, B'), zauważ, że grzbietowe (leżąca nad nim kora) i brzuszne aspekty mózgu pokrywają i otaczają tkankę wypukłości zwojowej (GE).
    2. Następnie, ręką dominującą, trzymaj albo bardzo cienkie kleszcze, albo nóż kłujący (Tabela 2), jednocześnie unieruchamiając półkulę kleszczami trzymanymi przez rękę niedominującą. (Przyśrodkowy aspekt półkuli powinien być skierowany do góry). Rozłóż tkankę grzbietową i brzuszną za pomocą kleszczy i noża kłującego, aby odsłonić leżącą pod spodem tkankę GE (ryc. 1C i zilustrowana na rycinie 1C').
      Uwaga: Usunięcie części pożywki z szalki Petriego może ułatwić stabilizację tkanki podczas wykonywania sekcji MGE.
    3. Wykonuj proste cięcia nożem lub cienkimi kleszczami, aby oddzielić tkanki CGE, LGE i przegrody (patrz przykładowe cięcia oznaczone czerwonymi przerywanymi liniami, rysunki 1D i D'). Cięcia te mogą być wykonywane w dowolnej kolejności.
      Uwaga: Wyobraź sobie MGE jako "pudełko", które jest wycięte z otaczającej tkanki. Pomaga to w powtarzalnym wykonywaniu podobnych cięć dla każdej sekcji, zmniejszając w ten sposób zmienność sekcji tkanek.
    4. Na koniec obróć MGE na bok i odetnij spód (co było bocznym aspektem mózgu). Powoduje to usunięcie strefy płaszcza MGE (odrzucić na rysunkach 1E i 1E') od reszty MGE. Pozostały aspekt MGE zawiera głównie część MGE ze strefą komorową i podkomorową, która zawiera prawie wszystkie komórki progenitorowe MGE. Kontynuuj z tą tkanką.
  3. Ważna uwaga: Dodanie żelu silikonowego na dno szalki Petriego może służyć jako doskonała powierzchnia do rozwarstwiania, ponieważ chroni delikatne końcówki kleszczy i zapewnia miękką powierzchnię do przypinania tkanki kleszczami.

4.3 Dodatkowe strategie dla MGE Dissection.

  1. Przetnij skórę zarodka za pomocą kleszczy jak nożyczek, aby szybko usunąć mózg. Gdy zarodek leży na boku, przytrzymaj tkankę u podstawy głowy za pomocą kleszczy używanych do zakotwiczenia tkanki. Najpierw przetnij przednią brzuszną do mózgu i tylną brzuszną do mózgu, a następnie połącz dwa cięcia wzdłuż boku zarodka. Następnie chwyć płat skóry i przeciągnij go przez górną część mózgu. Mózg można następnie szybko wypreparować z pozostałej tkanki.
  2. Alternatywnie, zakotwicz tylną część całego mózgu za korą mózgową. W międzyczasie chwyć każdą półkulę w najbardziej grzbietowym ogonowym aspekcie kory i oderwij korę od zakotwiczonej tkanki w kierunku przednim. W ten sposób można usunąć obie korowe i ujawnić obustronne wypukłości zwojowe, nadal przyczepione do reszty tkanki, zachowując anatomię przyśrodkowo-boczną.
  3. Przełącz się na nóż kłujący, aby wykonywać precyzyjne cięcia wokół MGE na każdej półkuli. Użyj oddzielnego czystego zestawu kleszczyków do pobrania MGE lub pipety z dużą końcówką (np. P1000).
    nuta: Pobraną tkankę należy trzymać z dala od wszelkiego innego wypreparowanego materiału, ponieważ niektóre podłoża są nieuchronnie przenoszone podczas pobierania MGE.
  4. Pobrać MGE i umieścić tkankę w probówce o pojemności 1,5 ml zawierającej DMEM/10% FBS (objętość 500 μl jest wystarczająca do zebrania MGE). Powtórz dla drugiej półkuli i umieść w tej samej probówce zbiorczej. Próbki należy przechowywać na lodzie do momentu zebrania całej tkanki.

5. Znakowanie i przeszczepianie lentiwirusów

  1. Przenieś probówki z tkanką MGE do kaptura z certyfikatem BSL2 i wyjmij nośnik.
    Uwaga: Tkanka MGE jest wystarczająco duża, aby była widoczna dla oka i osiada na dnie tubki, umożliwiając łatwe i delikatne usunięcie zimnego podłoża.
  2. Dodaj ~ 500 ul pożywki DMEM/10% FBS, która była wstępnie inkubowana w inkubatorze do hodowli tkankowych w temperaturze 37 °C. Następnie dodać polibren, aby ułatwić transdukcję do każdej probówki w końcowym stężeniu 8 μg/ml. Potarytuj tkankę MGE, aby utworzyć zawiesinę pojedynczej komórki, używając końcówki pipety P1000. Na koniec dodaj ~15-20 μl skoncentrowanego lentiwirusa do każdej probówki.
  3. Ważna uwaga: Tryturacja 10-12 razy jest wystarczająca do rozbicia tkanki MGE z pojedynczego zarodka, ale może być wymagane więcej trituracji, jeśli wiele MGE jest połączonych razem. Wypróbuj różne warunki trituracji, aby określić, co działa najlepiej.
  4. Dokładnie zamknij każdą probówkę, odwróć do mieszania, a następnie umieść wszystkie probówki w inkubatorze o temperaturze 37 °C. Inkubować komórki w lentiwirusie przez co najmniej 30 minut i do 1 godziny. Dłuższe czasy spowodowały zmniejszoną żywotność komórek. Odwracaj rurki co 10 minut, aż skończy się czas.
  5. Po inkubacji z lentiwirusem wyjmij probówki z inkubatora i odwiruj przy ~700 x g przez 3 minuty w celu osadzenia komórek. W okapie BSL2 usuń supernatant i wyrzuć do 10% wybielacza. Następnie dodaj 1 ml DMEM/10% FBS i rozetrzyj osad 2-3 razy w celu umycia, a następnie ponownie odwiruj z tą samą prędkością, aby osadzać komórki. Powtórz ten krok prania jeszcze 2-3 razy, aby usunąć nadmiar wirusa.
    Uwaga: Etapy wirowania należy wykonywać w temperaturze 4 °C, jednak nie zaobserwowano zmniejszonej żywotności w przypadku krótkich wirowań w temperaturze pokojowej.
  6. Po ostatnim umyciu usuń jak najwięcej pożywki i połóż każdą tubkę na lodzie. Ze względu na resztki pożywki po bokach probówki, ~2-3 μl pożywki pokryją osad komórkowy do czasu rozpoczęcia procedury przeszczepu.

6. Transplantacja i walidacja

  1. Zdobądź szczenięta żywiciela P1 i przygotuj obszar zabiegu, spryskując go 70% etanolem. W celu zachowania sterylności podczas zabiegu zaleca się wykonywanie tych zabiegów w dedykowanym czystym pomieszczeniu zabiegowym. Ponadto użyj autoklawowanych narzędzi chirurgicznych, sterylizuj powierzchnie, z którymi szczenięta będą miały kontakt, używając 70% etanolu. Przykład reprezentatywnego sprzętu potrzebnego do przeprowadzenia przeszczepów oraz reprezentatywnego obszaru zabiegowego przedstawiono na rysunku 3.

Uwaga: Chociaż ta procedura polega na wstrzykiwaniu małych objętości, a nie na zabiegu chirurgicznym, który wymagałby nacięcia, otwartej rany lub szwów, nadal zaleca się, aby dla każdej myszy do wstrzyknięcia była używana nowa mikropipeta. Mikropipety są sterylizowane termicznie po pociągnięciu i ukosowaniu na powierzchni, która została spryskana 70% etanolem i jest przechowywana w szczelnie zamkniętym pojemniku.

  1. Mikropipety należy wytwarzać tak, aby miały średnicę końcówki między 40-80 μm. Przestrzeganie tych wymiarów przyniesie optymalne wyniki. Wysterylizuj na gorąco mikropipety po pociągnięciu i ukosowaniu na powierzchni, a następnie spryskaj 70% etanolem przed przechowywaniem mikropipet w szczelnie zamkniętym pojemniku.
    Uwaga: Alternatywnie, jeśli dostęp do urządzeń potrzebnych do wytworzenia tych igieł (Tabela 2) jest ograniczony, należy użyć innego urządzenia do wstrzykiwań. Jednak mogą one nie być tak dobrze dopasowane jak mikropipety ze względu na różne średnice.
  2. Pobrać olej mineralny do strzykawki o pojemności 1 ml i za pomocą igły 30 1/2 G całkowicie napełnić szklaną pipetę olejem mineralnym. Następnie zamontuj tłok na urządzeniu stereotaktycznym, a następnie przymocuj szklaną pipetę do urządzenia stereotaktycznego i załaduj na tłok. Za pomocą napędu hydraulicznego przesunąć tłok mniej więcej do połowy szklanej pipety, usuwając rozlewający się olej mineralny za pomocą czystego ręcznika papierowego.
    1. Zamiast używać strzykawki, zanurz tylny koniec pipety w oleju mineralnym i napełnij go kapilarnie. Aby zapobiec powstawaniu pęcherzyków powietrza w pipecie, należy utrzymywać nadciśnienie na strzykawce aż do całkowitego wyjęcia ze szklanej pipety.
      Uwaga: Do skutecznego przeszczepu komórek MGE 14 można użyć innych urządzeń. Każde urządzenie, które może dostarczyć objętość mniejszą lub zbliżoną do 100 nl, dobrze sprawdza się w tej procedurze.
  3. Następnie użyj sterylnego ręcznika papierowego lub dowolnego materiału chłonnego, z rogiem skręconym w drobny punkt, aby delikatnie usunąć nadmiar pożywki nad granulką komórek MGE. Ten etap koncentruje gęstość komórek, dzięki czemu można uzyskać mniejsze objętości iniekcji. Następnie użyj pipety o małej objętości (preferowany jest P2), aby powoli wyciągnąć osad komórkowy i rozcierać 1-2 razy przed przeniesieniem zawiesiny komórek na powierzchnię hydrofobową. Objętość powinna wynosić nieco poniżej 1 μl. Wsunąć końcówkę igły do zawiesiny kuwety i za pomocą napędu hydraulicznego wciągnąć zawiesinę do pipety.
  4. Znieczulić szczeniaka P1 przez hipotermię (zawinąć w lateksową rękawiczkę i położyć na lodzie na ~ 2-4 min). Sprawdź skuteczność znieczulenia szkodliwym bodźcem. Ściśnij skórę między palcami cienkimi kleszczami: szczenię powinno przestać reagować, jeśli zostanie uszczypnięte. Następnie umieść szczeniaka na formie, która znajduje się pod urządzeniem do wstrzykiwania, a następnie napnij skórę, odciągając skórę na głowie i zabezpieczając standardową taśmą laboratoryjną.
    Uwaga: Chociaż hipotermia jest bardzo skuteczna u nowonarodzonych myszy i powoduje niską śmiertelność, zabiegi należy wykonywać szybko, ponieważ młode zaczną wracać do zdrowia w mniej niż 10 minut. Ponadto 4 minuty na lodzie to górna granica tego, co można tolerować. Proszę próbować wywołać hipotermię tylko raz, jeśli potrzeba więcej czasu na wstrzyknięcia. Jeśli jednak szczenię wcześnie wyzdrowieje, najpierw pozwól mu w pełni wyzdrowieć, zanim ponownie wywołasz hipotermię. Co więcej, wywołaj hipotermię tylko raz jeszcze raz, aby wykonać zastrzyki. Szczenięta wyzdrowieją w ciągu 5-10 minut od hipotermii. Można to ułatwić, umieszczając szczenięta z miotem i mamą lub umieszczając szczenię na ciepłej powierzchni, aby mogło dojść do siebie.
  5. Za pomocą urządzenia stereotaktycznego umieść końcówkę szklanej pipety na powierzchni głowy szczeniaka, prostopadle do powierzchni głowy. Gdy pipeta styka się z głowicą, należy to uznać za wartość "0". Następnie wepchnij pipetę przez powierzchnię skóry i czaszki do kory mózgowej, a następnie włóż i wsuń pipetę ~ 2 razy przed zatrzymaniem. W celu optymalnego ukierunkowania komórek do kory nowej, iniekcje wykonuje się, gdy mikropipeta znajduje się na głębokości 0,1 mm. Jednak powinno to zostać zoptymalizowane przez użytkownika (patrz uwaga poniżej).
    Uwaga: Chociaż głębokość ta niezawodnie celuje w głębsze warstwy kory nowej za pomocą urządzeń opisanych powyżej, kilka głębokości powinno zostać przetestowanych empirycznie. Ponadto należy przetestować zakres głębokości w różnych pozycjach ogonowo-ogonowych i przyśrodkowo-bocznych, aby określić, jaka głębokość jest optymalna w każdym miejscu. Również początkowe nakłucie powinno być szybkie, ponieważ powolna penetracja kory nowej zmniejsza zdolność do czystej penetracji tkanki. Wypróbuj różne prędkości przy pierwszym uruchomieniu tej procedury, aby znaleźć to, co działa najlepiej. Ponadto, do testowania współrzędnych, nic nie zastąpi używania oznaczonych komórek, ponieważ barwniki nie są w stanie oznaczyć pozycji.
  6. Gdy igła znajdzie się na swoim miejscu, obróć urządzenie hydrauliczne, aby przesunąć tłok do szklanej pipety, wpychając określoną objętość zawiesiny komórek do kory mózgowej. Wstrzyknąć 50-70 jl na miejsce. Powtórz tę procedurę w 3-6 różnych miejscach na różnych poziomach rostralno-ogonowych, jeśli celem jest uzyskanie szerokiego rozmieszczenia komórek w całej korze nowej.
    Uwaga: Objętości 100 nl lub większe mogą powodować zmiany chorobowe i prowadzić do dużych skupisk wstrzykniętych komórek, które nie są w stanie skutecznie wyemigrować z miejsca wstrzyknięcia. W związku z tym mniejsze objętości iniekcji (~70 nl lub mniej) są optymalne, w większej liczbie miejsc, jeśli pozwala na to czas.
  7. Po zakończeniu wstrzyknięć usuń szczenię ze sceny i oznacz je (obcinanie palców u nóg jest niezawodnym sposobem późniejszej identyfikacji szczeniąt). Gdy szczenię wyzdrowieje i będzie w stanie samodzielnie się poruszać (następuje to w ciągu kilku minut od usunięcia go ze sceny), umieść je z powrotem z mamą i miotem.
    Uwaga: Ponieważ jest to procedura minimalnie inwazyjna, nie ma zabiegów pooperacyjnych, gdy szczenię swobodnie się porusza i jest ogrzane. Jednak szczenięta powinny być badane nie tylko po zabiegu, ale także następnego dnia, aby upewnić się, że nie mają oznak pogarszającego się stanu zdrowia.
  8. Przed rozpoczęciem procedury na następnym szczeniaku spryskaj obszar 70% etanolem, aby utrzymać sterylne miejsce pracy. Pozwolić młodym, którym wstrzyknięto implanty, rozwinąć się, a następnie ocenić tkankę na odpowiednim etapie rozwoju.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Ponieważ komórki MGE posiadają unikalną zdolność do migracji i integracji po przeszczepieniu do neokory gospodarza 16, stanowią one doskonały system modelowy do manipulacji genetycznych przed badaniami in vivo. W niniejszej pracy pokazujemy, w jaki sposób można wyizolować tkankę MGE z embrionów E13.5 (Ryciny 1 i 2), która może być następnie transdukowana lentiwirusami albo in vitro, albo w sposób szybki przed przeszczepieniem do badań in vivo. Znakowanie MGE za pomoc...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Zastosowanie prekursorów interneuronów korowych GABA-ergiczne z eminencji embrionalnych zwojów (GE) w terapiach komórkowych jest obiecujące w przypadku wielu schorzeń 12-1 4. Potrzebne są precyzyjne techniki molekularne do śledzenia i ekspresji genów będących przedmiotem zainteresowania w określonych podgrupach interneuronów. W tym miejscu przedstawiamy szczegółowy protokół znakowania embrionalnych komórek MGE lentiwirusami przed przeszczepem i pokazujemy, w jaki sposób ta technika może b...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez granty dla JLRR od: Autism Speaks, Nina Ireland, Weston Havens Foundation, NIMH R01 MH081880 i NIMH R37 MH049428. PRW było wspierane przez stypendium Narodowej Rady Nauki Tajwanu. SFS był wspierany przez F32 (MH103003).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Odczynniki i sprzęt do przeszczepu komórek MGE
1 ml strzykawkaREF 309602BD, Becton Dickinson and company
30 1/2 Gigła 305106BD, Becton Dickinson and company
Precyzyjny otwór do dostarczania 5 &mikro; l (w zestawie z tłokiem)5-000-1005naukowa Drummond
ParafilmPM-999Polysciences, Inc.
Mikroskop stereoskopowy ze statywem **MZ6Leica
Digital tylko dla myszy instrument stereotaktyczny **51725DFirma
Jednoosiowy mikromanipulator olejowo-hydrauliczny **MO-10Narishige
Ukosowanie obrotowe z powłoką diamentowąprodukcji własnej
instrumenty
OlejKażda apteka lub apteka
Dowolna pipeta i końcówki, które mogą polegać na pomiarze 1 i mikro; l objętości
** To są konkretne modele, których używamy, ale wiele innych konfiguracji powinno działać
Opcjonalne odczynniki (do produkcji lentiwirusów)
25 mm, 0,45 i mikro; m filtr09-719BFisher Scientific
Ultra-przezroczyste probówki wirówkowe (25 x 89 mm)344058Beckman Coulter®
Lipofectamine 2000 (rozmiar 1,5 ml)11668019Invitrogen
Inne dostępne na rynku materiały eksploatacyjne
pMDLg/pRRE kodowanie plazmidu gag/pol12251Addgene
kodowanie plazmidu pRSV-Rev Rev12253Addgene
kodowanie plazmidu pMD2.G VSVG12259Addgene
pAAV-Flex-GFP28304Addgene
Firma StoeltingŚciągacz do pipet igłowych 730 Kopf mineralny

Bibliografia

  1. Huang, Z. J., Di Cristo, G., Ango, F. Development of GABA innervation in the cerebral and cerebellar cortices. Nat. Rev. Neurosci. 8 (9), 673-686 (2007).
  2. Rubenstein, J. L. R., Merzenich, M. M. Model of autism: increased ratio of excitation/inhibition in key neural systems. Genes, brain, and behavior. 2 (5), 255-267 (2003).
  3. Anderson, S. A., Eisenstat, D. D., Shi, L., Rubenstein, J. L. Interneuron migration from basal forebrain to neocortex: dependence on Dlx genes. Science. 278 (5337), 474-476 (1997).
  4. Wonders, C. P., Anderson, S. A. The origin and specification of cortical interneurons. Nat. Rev. Neurosci. 7 (9), 687-696 (2006).
  5. Gelman, D., et al. A Wide Diversity of Cortical GABAergic Interneurons Derives from the Embryonic Preoptic Area. J. Neurosci. 31 (46), 16570-16580 (2011).
  6. Miyoshi, G., et al. Genetic fate mapping reveals that the caudal ganglionic eminence produces a large and diverse population of superficial cortical interneurons. J. Neurosci. 30 (5), 1582-1594 (2010).
  7. Batista-Brito, R., Fishell, G. The developmental integration of cortical interneurons into a functional network. Curr. Top. Dev. Bio. 87, 81-118 (2009).
  8. Inan, M., Welagen, J., Anderson, S. A. Spatial and Temporal Bias in the Mitotic Origins of Somatostatin. and Parvalbumin-Expressing Interneuron Subgroups and the Chandelier Subtype in the Medial Ganglionic. 22 (4), 820-827 (2012).
  9. Taniguchi, H., et al. A Resource of Cre Driver Lines for Genetic Targeting of GABAergic Neurons in Cerebral Cortex. Neuron. 71 (6), 995-1013 (2011).
  10. Madisen, L., et al. A robust and high-throughput Cre reporting and characterization system for the whole mouse brain. Nature Neuroscience. 13 (1), 133-140 (2010).
  11. Hippenmeyer, S. A developmental switch in the response of DRG neurons to ETS transcription factor signaling. PLoS Bio. 3 (5), e159(2005).
  12. Southwell, D. G., et al. Interneurons from embryonic development to cell-based therapy. Science. 344 (6180), 1240622(2014).
  13. Hunt, R. F., Girskis, K. M., Rubenstein, J. L., Alvarez-Buylla, A., Baraban, S. C. GABA progenitors grafted into the adult epileptic brain control seizures and abnormal. Nature Neuroscience. 16 (6), 692-697 (2013).
  14. Braz, J. M., et al. Forebrain GABAergic Neuron Precursors Integrate into Adult Spinal Cord and Reduce Injury-Induced Neuropathic Pain. Neuron. 74, 663-675 (2012).
  15. Vogt, D., et al. Lhx6 Directly Regulates Arx and CXCR7 to Determine Cortical Interneuron Fate and Laminar Position. Neuron. 82 (2), 350-364 (2014).
  16. Alvarez-Dolado, M., et al. Cortical inhibition modified by embryonic neural precursors grafted into the postnatal brain. J. Neurosci. 26 (4), 7380-7389 (2006).
  17. Du, T., Xu, Q., Ocbina, P. J., Anderson, S. A. NKX2.1 specifies cortical interneuron fate by activating Lhx6. Development. 135 (8), 1559-1567 (2008).
  18. Arguello, A., et al. Dapper Antagonist of Catenin-1 Cooperates with Dishevelled-1 during Postsynaptic Development in Mouse Forebrain GABAergic Interneurons. PLoS ONE. 8 (6), e67679(2013).
  19. Lee, A., et al. Pyramidal neurons in prefrontal cortex receive subtype-specific forms of excitation and inhibition. Neuron. 81 (1), 61-68 (2014).
  20. Chen, Y. J. J., et al. Use of “MGE Enhancers” for Labeling and Selection of Embryonic Stem Cell-Derived Medial Ganglionic Eminence (MGE) Progenitors and Neurons. PLoS ONE. 8 (5), e61956(2013).
  21. Pattabiraman, K. Transcriptional regulation of enhancers active in protodomains of the developing cerebral cortex. Neuron. 82 (5), 989-1003 (2014).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Transdukcja lentiwirusowatransplantacja komórekinterneurony GABAergicznewtryskiwanie stereotaksycznemikroskopia fluorescencyjnalinie z kierującym białkiem Creizolacja komórekznakowanie wirusowe
Znakowanie i przeszczepianie za pośrednictwem wirusów komórek wyniosłości przyśrodkowej zwoju (MGE) do badań in vivo
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.