Artykuł metodologiczny

In vivo (in vivo) Obrazowanie i śledzenie mezenchymalnych komórek macierzystych szpiku kostnego znakowanych technetem-99m w tendinopatii koni

9.2K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/52748

⸱

9 grudnia 2015

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Clinical Science and Services, The Royal Veterinary College, 2Hospital de Referencia La Equina, Manilva, 3Department of Nuclear Medicine, Barts & The London NHS Trust

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół opisuje znakowanie radioaktywne mezenchymalnych komórek macierzystych koni i ich implantację do urazów ścięgien u konia w celu określenia przeżycia komórek i dystrybucji tkanek za pomocą scyntygrafii gamma.

Streszczenie

Ostatnie postępy w stosowaniu mezenchymalnych komórek macierzystych szpiku kostnego (BMMSC) w leczeniu urazów ścięgien i więzadeł u konia sugerują poprawę wyników zarówno w badaniach eksperymentalnych, jak i klinicznych. Chociaż BMMSC są wszczepiane w uszkodzenie ścięgna w dużej liczbie (zwykle 10 - 20 milionów komórek), przeżywa tylko stosunkowo niewielka liczba (<10%), chociaż mogą one utrzymywać się do 5 miesięcy po implantacji. Wydaje się, że jest to powszechna obserwacja u innych gatunków, u których BMMSC zostały wszczepione do innych tkanek i ważne jest, aby zrozumieć, kiedy dochodzi do tej utraty, ile z nich przeżywa początkowy proces implantacji i czy komórki są usuwane do innych narządów. Śledzenie losów komórek można osiągnąć poprzez znakowanie radioizotopem BMMSC przed implantacją, co umożliwia nieinwazyjne obrazowanie in vivo lokalizacji komórek i ilościowe określenie liczby komórek.

Ten protokół opisuje procedurę znakowania komórek, która wykorzystuje technet-99m (Tc-99m), oraz śledzenie tych komórek po implantacji do uszkodzonych ścięgien zginaczy u koni. Tc-99m jest krótkożyciowym (t1/2 z 6,01 godz.) izotopem, który emituje promieniowanie gamma i może być internalizowany przez komórki w obecności lipofilowego związku oksymu heksametylopropylenoaminy (HMPAO). Te właściwości sprawiają, że idealnie nadaje się do stosowania w klinikach medycyny nuklearnej do diagnozowania wielu różnych chorób. Los znakowanych komórek można śledzić w krótkim okresie (do 36 godzin) za pomocą scyntygrafii gamma w celu ilościowego określenia zarówno liczby komórek zatrzymanych w zmianie, jak i rozmieszczenia komórek w płucach, tarczycy i innych narządach. Technika ta została zaadaptowana z znakowania leukocytów krwi i może być wykorzystana do obrazowania wszczepionego BMMSC w innych narządach.

Wprowadzenie

Strategie regeneracyjne do naprawy chorych lub uszkodzonych tkanek opierają się na multipotencjalnych komórkach macierzystych pochodzących z różnych tkanek i wszczepianych do dotkniętego obszaru. Ostatnie postępy w zastosowaniu autologicznego BMMSC w leczeniu urazów ścięgien i więzadeł u konia wykazały poprawę wskaźników wyników zarówno w badaniach eksperymentalnych1-5, jak i klinicznych6. Koń jest szczególnie atrakcyjnym modelem do oceny skuteczności leczenia związanego z komórkami macierzystymi, ponieważ cierpi z powodu związanych z wiekiem i przeciążeniami urazów ścięgien dystalnej kończyny przedniej, jest zwierzęciem atletycznym i jest dużym, ułatwiającym regenerację szpiku kostnego i dokładną implantację. Urazy ścięgien goją się naturalnie ze zwłóknieniem, ale wyleczone ścięgno jest funkcjonalnie gorsze7 i wiąże się z wysokim ryzykiem ponownego urazu8. Najczęściej dotknięte jest powierzchowne ścięgno zginacza cyfrowego (SDFT), ponieważ ewoluowało, aby działać jako elastyczny magazyn energii i doświadcza dużych naprężeń obciążeniowych, aby osiągnąć energooszczędną i szybką lokomocję. Przywrócenie funkcji po urazie ma zatem kluczowe znaczenie. Urazy te są podobne do tych, które dotyczą ścięgna Achillesa u ludzi, które pełni podobną funkcję9. Nie ma dobrych opcji leczenia, które można by leczyć lub osiągać dobrą naprawę takich urazów, dlatego strategie regeneracyjne oparte na komórkach stanowią atrakcyjną okazję do poprawy wyników i zmniejszenia liczby ponownych urazów.

W większości badań 5 - 20 milionów autologicznych BMMSC jest wstrzykiwanych bezpośrednio do zmiany, która zwykle występuje w rdzeniu ciała ścięgna, które dlatego działa jak pojemnik dla komórek. Los komórek po wstrzyknięciu nie jest jasny, a ostatnio opisano różne metody znakowania komórek w celu śledzenia komórek. Wykazano, że komórki znakowane znacznikiem fluorescencyjnym przeżywają tylko w stosunkowo niewielkiej liczbie (<10%)10,11. Znaczniki fluorescencyjne wymagają ekstrakcji tkanek i sekcji do analizy histologicznej, co jest czasochłonne i nie ułatwia analizy czasowej w dużym modelu zwierzęcym lub w przypadkach klinicznych. W nowszych pracach użyliśmy radioizotopu 99mTc do znakowania komórek i śledzenia ich losów za pomocą scyntygrafii gamma1. Metoda ta pozwala na szybkie porównanie różnych dróg dostarczania komórek, w tym doogniskowej, dożylnej przez żyłę szyjną1 lub perfuzji regionalnej przez wstrzyknięcia dotętnicze12 lub dożylne1,12. Trwałość i rozmieszczenie komórek można następnie zobrazować za pomocą scyntygrafii gamma różnych narządów. Wykazało to, że tylko 24% komórek, którym wstrzyknięto doogniskowo, pozostało w zmianie przez 24 godziny1 i jest to poparte innym badaniem, w którym wykorzystano eksperymentalnie utworzone zmiany i zastosowano ten sam radioznacznik5. Co więcej, komórki wykazują ograniczoną zdolność do wrastania w uszkodzenia ścięgien, gdy są dostarczane przez perfuzję regionalną lub dożylnie, ale są rozpraszane do płuc przez te ostatnie drogi4.

BMMSC oznaczone nanocząstkami żelaza to alternatywna metoda śledzenia komórek wszczepionych w ścięgna kończyn przednich13. Chociaż komórki znakowane nanocząstkami żelaza umożliwiają śledzenie komórek in vivo za pomocą rezonansu magnetycznego, badania czasowe na dużym zwierzęciu są ograniczone przez liczbę przypadków, w których można podać znieczulenie w każdym punkcie czasowym w celu wykonania skanów MRI. Co więcej, nanocząstki żelaza są hipointensywne w MRI, co ogranicza informacje o migracji znakowanych komórek do ciała ścięgna. Inne radioizotopy, które mogą być stosowane, to ind-111, ale ma on wadę w postaci dłuższego okresu półtrwania niż Tc-99m (2,8 dnia vs 6,0 godziny) i wyższej energii emisji promieniowania gamma. Ponadto doniesiono, że żywotność komórek jest zmniejszona po znakowaniu indu-11114. Z drugiej strony Tc-99m jest rutynowo stosowany zarówno w medycynie nuklearnej koni, jak i ludzi, do znakowania komórek jednojądrzastych krwi obwodowej i śledzenia ich dystrybucji in vivo za pomocą scyntygrafii. Może być stosunkowo łatwo wchłonięty przez komórki wykorzystujące HMPAO jako cząsteczkę łącznikową do wiązania technetu, jako Tc-99m-HMPAO, z komórkami. BMMSC oznaczone znakiem Tc-99m-HMPAO wykazują dobrą żywotność i mogą rozmnażać się in vitro4. Protokół ten szczegółowo opisuje znakowanie i śledzenie autologicznego BMMSC koni wszczepionego w naturalnie występujące zmiany w SDFT kończyny przedniej.

Ważne jest, aby pamiętać, że protokół jest przeznaczony tylko do wykorzystania jako narzędzie badawcze. Nie zaleca się jego stosowania jako klinicznej metody terapeutycznej, ponieważ wpływ radioznacznika na fenotyp komórkowy nie został w pełni wyjaśniony.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Przypadki opisane tutaj zostały przeprowadzone na podstawie pozwolenia etycznego udzielonego przez Komitet ds. Etyki i Dobrostanu Zwierząt Colegio de Veterinarios de Malaga, Hiszpania, oraz Royal Veterinary College, North Mymms, Wielka Brytania. Procedury stosowane u koni oparte są na zatwierdzonych protokołach, które są stosowane w klinice u koni otrzymujących terapie oparte na komórkach macierzystych, które obejmują sedację, aspirację szpiku kostnego, wstrzyknięcie dościęgniste, perfuzję regionalną, wstrzyknięcie dożylne, leczenie pozabiegowe oraz leczenie bólu i monitorowanie po implantacji.

1. Kluczowe ustalenia, które należy poczynić z wyprzedzeniem

  1. Przed rozpoczęciem pracy należy uzyskać zgodę na etykę instytucjonalną i dobrostan zwierząt oraz przestrzegać lokalnych wymogów prawnych.
  2. Ubiegaj się o zgodę instytucji na pracę z promieniowaniem jonizującym, zgodnie z lokalnymi i prawnymi przepisami, w tym odpowiednim poziomem ochrony personelu i środowiska oraz utylizacją skażonych odpadów.
  3. Należy zastosować następujące kryteria włączenia: konie z nieurazowym urazem przeciążeniowym (tendinopatia lub desmopatia) ścięgna palca zginacza powierzchownego kończyny przedniej oraz zmianami powodującymi wadę w obrębie ścięgna, a wada jest otoczona nienaruszonym ścięgnem i/lub paratenonem.
    Uwaga: Badanie i diagnostyka takich urazów oraz przygotowanie kliniczne koni do implantacji komórek zostały szczegółowo opisane w innym miejscu6,15.
    Uwaga: Izolacja i ekspansja w hodowli BMMSC pochodzącego ze szpiku kostnego koni została szczegółowo opisana wcześniej6,16. Obecny protokół wstrzykiwania BMMSC w przypadku urazów SDFT u konia wykorzystuje 10 milionów komórek na ml4 autologicznego supernatantu szpiku kostnego (BMS)16.
  4. Do implantacji in vivo należy używać komórek, które przeszły nie więcej niż 4 pasaże, aby uniknąć potencjalnego fenotypu komórkowego lub zmian genetycznych związanych z komórkami o dużej liczbie pasaży.
  5. Dostarczyć wymaganą liczbę komórek w BMS (w ciągu 24 godzin w chłodziarce w temperaturze 4 – 8 oC) do kliniki weterynaryjnej, w której ma być wykonana implantacja komórek.
    Uwaga: Kliniczne zastosowanie mezenchymalnych komórek macierzystych w supernatancie szpiku kostnego jest opatentowaną procedurą będącą własnością ReCellerate Inc (USA) i jej stosowanie może wymagać autoryzacji.
    Uwaga: Tc-99m jest emiterem promieniowania gamma (140 keV) o stosunkowo krótkim okresie połowicznego rozpadu (6,0058 godziny, dlatego prawie 94% rozpada się do stabilnej formy 99Tc w ciągu 24 godzin). Energia gamma sprawia, że nadaje się do wykrywania za pomocą kamer gamma (scyntygrafia), a krótki okres półtrwania skutkuje bardzo ograniczonym czasem ekspozycji na promieniowanie zarówno dla konia, jak i personelu zajmującego się zwierzętami. Protokół ten opisuje znakowanie komórek na miejscu przy użyciu Tc-99m-HMPAO [HMPAO znakowane Tc-99m (jako nadtechnecjan sodu)].
  6. Zamów Tc-99m prosto od dostawcy, tak aby został dostarczony i użyty do etykietowania komórek w ciągu 2 godzin od elucji z generatora Tc-99m. Upewnij się, że Tc-99m jest dostarczany w postaci 1 GBq w roztworze o pojemności 1 ml (standardowy bufor dostawcy).
  7. Zużyć wszystkie w RT. Przeprowadzić procedurę znakowania, implantacji komórek i obrazowania (scyntygrafia gamma) w pomieszczeniu do przechowywania izotopów z całym sprzętem oczyszczonym chusteczkami nasączonymi alkoholem przed rozpoczęciem pracy.

2. Przygotowanie konia i ultrasonografia ścięgna kończyny przedniej

  1. Rejestruj skany ultrasonograficzne przy pierwszym przyjęciu z powodu urazu (gdy odsysany jest szpik kostny), a następnie w momencie, w którym wstrzykuje się komórki znakowane radioaktywnie.
  2. Wykonaj ultrasonografię i implantację komórek z koniem równomiernie przenoszącym ciężar ciała w boksie i w sedacji (zamiast znieczulenia ogólnego). Podać sedację za pomocą mieszaniny HCl detomidyny i winianu butorfanolu, każdy w dawce od 0,01 do 0,02 mg/kg IV.
    Uwaga: Rekonwalescencja jest szybka, a leczenie pooperacyjne nie wymaga specjalnych względów.
  3. Po zastosowaniu znieczulenia okołonerwowego (krok 2.6) w chorej kończynie, należy utrzymać konia na stacji w sedacji, aby zmniejszyć ruchy konia podczas leczenia. Sprawdzić wzrokowo, czy odpowiedni poziom sedacji oceniany jest na podstawie opuszczonej pozycji głowy i postawy konia oraz czy koń czuje się komfortowo podczas wstrzykiwania komórek i ruchów gammakamery podczas pozyskiwania obrazów scyntygraficznych.
    Uwaga: Nie jest konieczne nakładanie maści weterynaryjnej na oczy (aby zapobiec wysuszeniu), ponieważ w sedacji mruganie nie jest zakłócone, a koń jest w stanie utrzymać nawilżenie oczu. Monitorowanie po implantacji komórek jest nieinwazyjne (ultradźwięki i scyntygrafia gamma).
  4. Przytnij dokładnie włosy przylegające do ścięgna (za pomocą maszynki do strzyżenia włosia konia), a następnie oczyść przycięty obszar za pomocą kombinacji peelingu chirurgicznego z chlorheksydyną i na koniec alkoholu.
  5. Nałóż akustyczny żel sprzęgający na obszar i skanuj metodycznie, aby zarejestrować skany całego obszaru kości dłoniowej śródręcza, sekwencyjnie znakowane poziomy 1 - 717, za pomocą przetwornika liniowego (12 MHz lub podobnego) w celu uzyskania seryjnych obrazów poprzecznych i podłużnych w momencie padania. Przechowuj obrazy w formie cyfrowej, aby za pomocą oprogramowania do analizy obrazu można było uzyskać pole przekroju poprzecznego i maksymalną strefę uszkodzenia4
    6. .
  6. Przygotuj obszar nad nerwami dłoniowymi bezpośrednio dystalnie do nadgarstka do aseptycznego wstrzyknięcia środka znieczulającego miejscowo, aby zapewnić całkowite odczulenie skóry pokrywającej ścięgno i powierzchowne ścięgno zginacza palca. Wstrzyknąć 2 ml mepiwikainy zarówno podskórnie, jak i w sąsiedztwie nerwów dłoniowych (w ich położeniu podpowięziowym) między ścięgnami zginaczy a więzadłem wieszadłowym bezpośrednio dystalnie do nadgarstka po obu stronach kończyny.
  7. Po wykonaniu wstępnego skanu przygotuj miejsce implantacji, szorując je roztworem do peelingu chirurgicznego z chlorheksydyną przez co najmniej 5 minut, a na koniec alkoholem nasączoną gazą. Wszystkie kolejne kroki należy wykonywać w sposób aseptyczny.

3. Znakowanie Tc-99m mezenchymalnych komórek macierzystych koni

Uwaga: Etapy znakowania komórek można wykonać podczas ultrasonografii kończyny przedniej, ponieważ zminimalizuje to rozpad izotopów między znakowaniem komórek a implantacją znakowanych komórek do ścięgna.

  1. Usuń BMS z komórek, ponieważ zakłóca on wychwyt izotopu. W tym celu należy pobrać fiolkę z BMMSC (10 milionów komórek w 1 ml BMS) z pojemnika chłodzącego i rozbić komórki w mikrowirówce o stężeniu 350 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Ostrożnie usunąć supernatant za pomocą igły 18G lub 19G (dołączonej do strzykawki o pojemności 2 ml), pozostawiając małą kroplę (≤0,1 ml) w probówce, aby ułatwić ponowne zawieszenie komórek. Zachowaj supernatant (BMS) w sterylnej probówce do mikrowirówki i przechowuj na lodzie do późniejszego ponownego użycia.
  2. Ponownie zawiesić komórki w resztkowej kropli supernatantu, delikatnie przesuwając probówkę palcami (zamiast wiru) i pozostawiając probówkę w stojaku w temperaturze pokojowej. Upewnij się, że komórki są całkowicie ponownie zawieszone i że nie ma widocznych grudek komórek.
  3. Przygotuj Tc-99m w następujący sposób. Przenieść 1 ml nadtechnetianu technetu do fiolki HMPAO za pomocą strzykawki i igły o pojemności 1 ml. Wymieszaj delikatnie, ale dokładnie i pozostaw na 5 minut za osłoną ołowianą. Uwaga: Ten krok można wykonać, gdy komórki obracają się w kroku 2.1.
  4. Dodaj całą mieszaninę Tc-99m-HMPAO za pomocą strzykawki i igły o pojemności 1 ml do komórek i delikatnie wymieszaj. Inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej za osłoną ołowiu.
  5. W kolejnych krokach użyj kleszczyków (lub kawałka bibuły), aby otworzyć pokrywę probówki do mikrowirówki, aby zminimalizować zanieczyszczenie izotopowe kciuka (w rękawiczce), a następnie innego sprzętu. Za pomocą strzykawki o pojemności 2 ml i igły 21 G dodać lub usunąć bufor do płukania.
    Uwaga: Zaleca się korzystanie z monitora izotopów terenowych w celu monitorowania zanieczyszczenia powierzchni i sprzętu.
  6. Dodać 1 ml PBS do mieszaniny komórek Tc-99m-HMPAO, zamknąć pokrywkę, delikatnie wymieszać i odwirować, aby komórki zostały osadzone, jak w kroku 3.1.
  7. Ostrożnie wyjmij PBS do nowej probówki (zachowaj ją za osłoną ołowiu i oznacz jako W1). Zawiesić osad komórkowy w 1 ml świeżego PBS. Odwirować probówkę i usunąć supernatant jak powyżej (zapisz to i oznacz jako W2).
  8. Oblicz skuteczność etykietowania, mierząc liczbę w probówkach W1 i W2 oraz w granulce komórki. W tym celu należy umieścić każdą probówkę w przyrządzie do kalibrowania dawki izotopów Wella i zarejestrować radioaktywność w postaci liczby na minutę (CPM). Oblicz skuteczność znakowania jako (Radioaktywność jako CPM komórek) / (Radioaktywność komórek + supernatant) x 100.
  9. Dokładnie zawieś ogniwa w pozostałym PBS, a następnie dodaj BMS zapisany w kroku 3.1. Komórki są gotowe do implantacji wewnątrzogniskowej.

4. Implantacja komórek znakowanych Tc-99m-HMPAO

  1. Implantacja śródzmianowa do ścięgna pod kontrolą USG
    1. Powoli wprowadzić igłę o długości 1,5 lub 2 cali (50 mm) o wadze 20 G do strefy maksymalnego uszkodzenia zmiany w orientacji wzdłużnej za pomocą głowicy ultradźwiękowej, pokrytej sterylną serwetą, w jednej linii z igłą, tak aby długość igły można było określić ultrasonograficznie, a końcówkę, jeśli igła jest dokładnie zlokalizowana w środku zmiany.
    2. Stosując odpowiednie osłony, zebrać komórki do strzykawki o pojemności 2 ml (Luer-lock, aby zminimalizować ryzyko zanieczyszczenia zewnętrznego i w osłonie strzykawki z ołowiem) za pomocą igły 20 G. Wyrzuć igłę, uważając, aby nie stracić płynu. Teraz przymocuj strzykawkę z oznaczonymi komórkami do igły znajdującej się wcześniej w ścięgnie.
    3. Umieść sondę ultradźwiękową pod igłą tak, aby droga igły w tkance była wyraźnie widoczna. Wstrzyknij komórki w powolnym, ale stałym tempie do zmiany. Upewnij się, że nie ma oporu przy wstrzykiwaniu. W takim przypadku należy ostrożnie zmienić położenie igły pod kontrolą ultradźwięków. Sprawdź, czy płyn wyrzucany do zmiany jest widoczny na obrazie ultrasonograficznym jako płyn bezechowy zawierający hiperechogeniczne pęcherzyki powietrza.
    4. Wyjąć igłę i natychmiast przycisnąć otwór igły, aby zapobiec utracie wstrzykniętych komórek i zminimalizować rozprzestrzenianie się izotopu po zewnętrznej powierzchni kończyny. Natychmiast opatruj kończynę jedną warstwą bandaża samoprzylepnego. Koń jest teraz gotowy do scyntygrafii gamma. Zrób to natychmiast.
      Uwaga: Po wstrzyknięciu komórek do ścięgna należy pobrać liczbę pustej strzykawki i igły, aby ocenić możliwą bezpośrednią utratę komórek, które mogą pozostać w strzykawce.
  2. Regionalna perfuzja komórek znakowanych Tc-99m-HMPAO
    1. Wykonaj krok 2.4.
    2. Nałóż gumowy bandaż uciskowy o średnicy 100 mm na proksymalną część śródręcza za pomocą dwóch 100 mm bawełnianych bandaży z gazy umieszczonych przyśrodkowo i bocznie.
    3. Przygotować aseptycznie skórę nad boczną żyłą dłoniową na poziomie bocznej bliższej kości trzeszczkowej, szorując obszar roztworem do peelingu chirurgicznego z chlorheksydyną przez co najmniej 5 minut, a na koniec gazą nasączoną alkoholem. Wszystkie kolejne kroki należy wykonywać w sposób aseptyczny.
    4. Przygotuj zestaw przedłużaczy 100 mm z igłą motylkową 21 G x 3/4" (0,8 x 19 mm) do nakłucia żyły poprzez wypełnienie heparynizowanym sterylnym roztworem soli fizjologicznej, a następnie wprowadź igłę do bocznej żyły dłoniowej palcowej. Po wprowadzeniu do żyły krew częściowo wypełni zestaw przedłużający. Na złączu Luer lock przymocuj gumową nasadkę Luer lock, aby ułatwić późniejsze wstrzyknięcie oznakowanych komórek.
    5. Rozcieńczyć MSCs w 19 ml PBS, zbierając komórki do strzykawki o pojemności 20 ml wstępnie załadowanej PBS. Wprowadzić komórki za pomocą gumowej miseczki za pomocą igły podskórnej 18 G (1,2 x 40 mm) powoli, ale równomiernie (30 – 40 sekund). Przepłukać cewnik 1 ml PBS wstępnie załadowanego do strzykawki.
    6. Wyjąć igłę i natychmiast przycisnąć skórę nad otworem igły warstwą pięciu bawełnianych gaziczek 4 x 4. Następnie umieść lekki bandaż z elastycznym klejem na bliższym obszarze trzeszczki i pozostaw opaskę uciskową na miejscu przez 30 minut po wstrzyknięciu.
    7. Zdejmij opaskę uciskową po 30 minutach. Koń jest teraz gotowy do scyntygrafii gamma.
      Uwaga: Po wstrzyknięciu komórek należy pobrać liczbę pustych strzykawek i igły, aby ocenić możliwą bezpośrednią utratę komórek, które mogą pozostać w strzykawce.

5. Scyntygrafia gamma

  1. Obrazy scyntygraficzne
    1. Uzyskuj obrazy scyntygrafii planarnej za pomocą kamery gamma (ustawionej na pik fotoelektryczny 140 KeV przy użyciu 20% symetrycznego okna) wyposażonej w niskoenergetyczny kolimator z otworami równoległymi.
      1. Uzyskaj wszystkie obrazy po czasie 0 na stojących koniach w sedacji, jak w kroku 2.2. Po upływie czasu 0 należy wymienić lekki bandaż na miejscu implantacji na bandaż wyściełany. Usuń ten bandaż przed każdym badaniem scyntygraficznym.
      2. Uzyskuj statyczne obrazy przez 60 sekund każdy (matryca 256 na 256) za pomocą oprogramowania do przetwarzania z opcjami "akwizycja" – "wybór badania" – "statyczność kości". Istotne jest, aby koń nie poruszał się w okresie akwizycji obrazu, ponieważ opcja trybu statycznego nie posiada modułu do korekcji ruchu.
      3. W przypadku wstrzyknięcia doogniskowego należy uzyskać obrazy boczne z obszaru zmiany chorobowej od nadgarstka do dystalnej kończyny, równoważnego obszaru kończyny przeciwległej, lewego pola płucnego i lewej tarczycy. Podczas wykonywania zdjęć kończyn przednich należy umieścić ekran ołowiany między nogami, aby uniknąć obrazowania kończyny po przeciwnej stronie. Obrazy należy uzyskać po 5 minutach od wstrzyknięcia (czas 0), a następnie po 1, 3, 6, 12, 24, 36 i 48 godzinach.
      4. Dla perfuzji regionalnej należy uzyskać obrazy gamma boczne i grzbietowe, jak w ppkt 5.1.1.3. Uzyskaj zdjęcia 5 minut po zwolnieniu opaski uciskowej. To będzie czas 0. Przydatne może być zobrazowanie kończyny natychmiast po wstrzyknięciu komórek w celu oceny liczby przed zwolnieniem opaski uciskowej. Uzyskaj obrazy gamma po 1, 3, 6, 12, 24, 36 i 48 godzinach po podaniu komórek.
    2. Po uzyskaniu obrazów przetwórz obrazy ręcznie, korzystając z opcji "przetwarzanie" oprogramowania z opcjami wybranymi dla koloru "Sokoloff" i koloru "Odwróć". Następnie wybierz "obszar zainteresowania" (ROI) i "elipsę", ponieważ umożliwia to zmianę kształtu maski zaznaczenia i ruch nad obszarem zmiany. Uzyskaj zliczenia dotyczące zwrotu z inwestycji, wybierając opcję "dodaj do statystyk". Upewnij się, że regiony zainteresowania o identycznej wielkości (ROI) są rejestrowane dla każdego zwierzęcia w różnych punktach czasowych.
    3. Następnie skoryguj liczby przewidywanego rozpadu technetu w każdym punkcie czasowym. Użyj następującego równania, aby skorygować rozpad: A = Aoe-(0,693t/T1/2), gdzie Ao jest początkową aktywnością izotopu, A jest promieniotwórczością skorygowaną o rozpad w czasie zero, t jest czasem, który upłynął, a T1/2 jest okresem półtrwania izotopu. Następnie wyraź skorygowane liczby w każdym punkcie czasowym jako procent zwrotu z inwestycji w czasie 0, aby obliczyć procent pozostałych komórek, używając następującego wzoru:

%Pozostałe komórki (t) = 100 – {[(Przewidywany rozpad(T) – Rozpad(T))/ Przewidywany rozpad(T)]} x 100

rozpad (t) = ROI (t) / ROI (0) x 100.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Włączenie Tc-99m-HMPAO do BMMS nie wpływa negatywnie na ich zdolność do przylegania do tworzywa sztucznego stosowanego w hodowlach tkankowych, a choć wykazują one zdolność do proliferacji i tworzenia monowarstw (Rysunek 1), nie ustalono w pełni, czy tempo proliferacji lub inne fenotypy komórkowe uległy zmianie. Ich morfologia jest podobna do nieznakowanych komórek i charakteryzuje się typowym wrzecionowatym kształtem. Efektywność znakowania komórek (t.j. pobór znacznika) zazwyczaj waha się od ok...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Oprócz szpiku kostnego, komórki macierzyste wyizolowane ze źródeł takich jak tkanka tłuszczowa nadają się do znakowania za pomocą tego protokołu. Ponadto komórki ze stanu zamrożonego mogą zostać ożywione i namnażone w hodowli do pożądanej liczby do badań znakowania12.

Krytycznym czynnikiem decydującym o skuteczności znakowania BMMSC jest czas pomiędzy wymyciem Tc-99m z generatora molibdenu w radioaptece, przygotowaniem Tc-99m-HMPAO i zastosowaniem radiofarmaceutyku w klinice. Istnie...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

JD i RKS są członkami Naukowej Rady Doradczej ReCellerate Inc.

Podziękowania

Autorzy chcieliby podziękować za dofinansowanie z Horserace Betting Levy Board U.K. (grant numer 721) i VetCell BioScience Ltd, Wielka Brytania oraz przez Consejerìa de Innovaciòn, Ciencia y Empresa, Junta de Andalucìa, Hiszpania.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Technet99m Prosimy o kontakt z lokalnym dostawcą promieniowania jonizacyjnego zgodnie z wymogami prawnymi. Izotop musi być zużyty w ciągu 2 godzin od elucji z generatora molibdenu-99
Ceretec - oksym heksametylenopropyloaminy (HMPAO) GE HealthCareProsimy o bezpośrednie kontakt z GE HealthCare
Microfuge, Minispin/Minispin PlusEpendorf22620100
18 G i 19 G IgłyTerumo MedicalNN-1838R (18 G);                 NN1938R (19 G)
Strzykawki 1 ml i 2 mlScientific Laboratory Supplies LtdSYR6200 (1 ml); SYR6003 (2 ml)
Probówki do mikrowirówek 1,5 mlGreiner Bio-One Ltd616201
PBS - Sól fizjologiczna buforowana fosforanamiLifeTechnologies14190
Sterylne waciki z gazyShermond LtdUNG602
Bandaż samoprzylepny CoflexVetAndover Healthcare, Inc.3540RB-018
Oprogramowanie do obrazowania ultrasonograficznegoScion Image, Scion Corporation, USA
Oprogramowanie do przetwarzania MicasXplus ScintigramBartec Technologies Ltdhttp://www.bartectechnologies.com/veterinaryscintigraphy.html
Licznik izotopów terenowych do monitorowania izotopuJohn Caunt Wielka BrytaniaGMS1800ahttp://www.johncaunt.com/
Licznik studzienek do pomiarów izotopów, kalibrator dawkiCapintec Southern ScientificCRC-25R

Bibliografia

  1. Becerra, P., et al. Distribution of injected technetium(99m)-labeled mesenchymal stem cells in horses with naturally occurring tendinopathy. Journal of Orthopaedic Research. 31, 1096-1102 (2013).
  2. Nixon, A. J., Dahlgren, L. A., Haupt, J. L., Yeager, A. E., Ward, D. L. Effect of adipose-derived nucleated cell fractions on tendon repair in horses with collagenase-induced tendinitis. American Journal of Veterinary Research. 69, 928-937 (2008).
  3. Schnabel, L. V., et al. Mesenchymal stem cells and insulin-like growth factor-I gene-enhanced mesenchymal stem cells improve structural aspects of healing in equine flexor digitorum superficialis tendons. Journal of Orthopaedic Research. 27, 1392-1398 (2009).
  4. Smith, R. K., et al. Beneficial effects of autologous bone marrow-derived mesenchymal stem cells in naturally occurring tendinopathy. PloS one. 8, e75697(2013).
  5. Sole, A., et al. Distribution and persistence of technetium-99 hexamethyl propylene amine oxime-labelled bone marrow-derived mesenchymal stem cells in experimentally induced tendon lesions after intratendinous injection and regional perfusion of the equine distal limb. Equine Veterinary Journal. 45, 726-731 (2013).
  6. Godwin, E. E., Young, N. J., Dudhia, J., Beamish, I. C., Smith, R. K. Implantation of bone marrow-derived mesenchymal stem cells demonstrates improved outcome in horses with overstrain injury of the superficial digital flexor tendon. Equine Veterinary Journal. 44, 25-32 (2012).
  7. Crevier-Denoix, N., et al. Mechanical properties of pathological equine superficial digital flexor tendons. Equine Veterinary Journal. 29, Suppl S23. 23-26 (1997).
  8. O'Meara, B., Bladon, B., Parkin, T. D., Fraser, B., Lischer, C. J. An investigation of the relationship between race performance and superficial digital flexor tendonitis in the Thoroughbred racehorse. Equine Veterinary Journal. 42, 322-326 (2010).
  9. Alexander, R. M. Energy-saving mechanisms in walking and running. The Journal of Experimental Biology. 160, 55-69 (1991).
  10. Guest, D. J., Smith, M. R., Allen, W. R. Monitoring the fate of autologous and allogeneic mesenchymal progenitor cells injected into the superficial digital flexor tendon of horses: preliminary study. Equine Veterinary Journal. 40, 178-181 (2008).
  11. Guest, D. J., Smith, M. R., Allen, W. R. Equine embryonic stem-like cells and mesenchymal stromal cells have different survival rates and migration patterns following their injection into damaged superficial digital flexor tendon. Equine Veterinary Journal. 42, 636-642 (2010).
  12. Sole, A., et al. Scintigraphic evaluation of intra-arterial and intravenous regional limb perfusion of allogeneic bone marrow-derived mesenchymal stem cells in the normal equine distal limb using (99m) Tc-HMPAO. Equine Veterinary Journal. 44, 594-599 (2012).
  13. Carvalho, A. M., et al. Evaluation of mesenchymal stem cell migration after equine tendonitis therapy. Equine Veterinary Journal. 46, 635-638 (2014).
  14. Welling, M. M., Duijvestein, M., Signore, A., van der Weerd, L. In vivo biodistribution of stem cells using molecular nuclear medicine imaging. Journal of Cellular Physiology. 226, 1444-1452 (2011).
  15. Dowling, B. A., Dart, A. J., Hodgson, D. R., Smith, R. K. Superficial digital flexor tendonitis in the horse. Equine Veterinary Journal. 32, 369-378 (2000).
  16. Kasashima, Y., Ueno, T., Tomita, A., Goodship, A. E., Smith, R. K. Optimisation of bone marrow aspiration from the equine sternum for the safe recovery of mesenchymal stem cells. Equine Veterinary Journal. 43, 288-294 (2011).
  17. Avella, C. S., et al. Ultrasonographic assessment of the superficial digital flexor tendons of National Hunt racehorses in training over two racing seasons. Equine Veterinary Journal. 41, 449-454 (2009).
  18. de Vries, E. F., Roca, M., Jamar, F., Israel, O., Signore, A. Guidelines for the labelling of leucocytes with (99m)Tc-HMPAO. Inflammation/Infection Taskgroup of the European Association of Nuclear Medicine. European Journal of Nuclear Medicine and Molecular Imaging. 37, 842-848 (2010).
  19. Trela, J. M., et al. Scintigraphic comparison of intra-arterial injection and distal intravenous regional limb perfusion for administration of mesenchymal stem cells to the equine foot. Equine Veterinary Journal. 46, 479-483 (2014).
  20. Barbash, I. M., et al. Systemic delivery of bone marrow-derived mesenchymal stem cells to the infarcted myocardium: feasibility, cell migration, and body distribution. Circulation. 108, 863-868 (2003).
  21. Heckl, S. Future contrast agents for molecular imaging in stroke. Current Medicinal Chemistry. 14, 1713-1728 (2007).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Znakowanie Technetem 99mscyntygrafia gammaledzenie kom rekzwi zek HMPAOoczyszczanie radioizotopurozk ad w narz dachwstrzykni cie w zmian chorobow

Powiązane artykuły