Sekwencjonowanie nowej generacji do wykrywania mutacji, które można podjąć w celu działania, w guzach litych i płynnych

Summary

Ten manuskrypt opisuje protokoły kliniczne dla dwóch paneli sekwencjonowania nowej generacji. Jeden panel bada nowotwory hematologiczne, podczas gdy drugi panel koncentruje się na genach powszechnie zmutowanych w guzach litych. Klasyfikacja molekularna mutacji powodujących nowotwory złośliwe u ludzi dostarcza cennych informacji prognostykujących i predykcyjnych.

Abstract

W miarę jak poprawia się nasze zrozumienie mutacji powodujących inicjację i progresję nowotworów, uzyskujemy kluczowe informacje na temat tego, jak określone profile molekularne guza mogą przewidywać reakcję na środki terapeutyczne lub dostarczać wiedzy na temat rokowania. W naszej placówce ustanowiono program genotypowania nowotworów w ramach rutynowej opieki klinicznej, badając zarówno guzy hematologiczne, jak i lite pod kątem szerokiego spektrum mutacji przy użyciu dwóch paneli sekwencjonowania nowej generacji (NGS): niestandardowego, 33-genowego panelu nowotworów hematologicznych do stosowania z krwią obwodową i szpikiem kostnym oraz komercyjnie produkowanego panelu guzów litych do stosowania z tkanką zatopioną w parafinie utrwalonej w formalinie, która jest ukierunkowana na 47 genów powszechnie zmutowanych w raku. Nasz przepływ pracy obejmuje przegląd biopsji przez patologa, aby upewnić się, że jest odpowiednia ilość guza do testu, a następnie przeprowadzana jest dostosowana ekstrakcja DNA na próbce. Kontrola jakości próbki obejmuje etapy dotyczące ilości, jakości i integralności, a dopiero po tym, jak wyekstrahowane DNA przejdzie te wskaźniki, generowana jest i sekwencjonowana biblioteka amplikonów. Uzyskane dane są analizowane za pomocą wewnętrznego systemu bioinformatycznego, a warianty są przeglądane i interpretowane pod kątem patogenności. W tym miejscu przedstawiamy migawkę użyteczności każdego panelu na przykładzie dwóch przypadków klinicznych, aby zapewnić wgląd w to, w jaki sposób dobrze zaprojektowany przepływ pracy NGS może przyczynić się do optymalizacji wyników klinicznych.

Introduction

Sekwencjonowanie nowej generacji (NGS) klinicznych próbek onkologicznych stało się szerzej dostępne w ciągu ostatnich kilku lat, ponieważ rosnąca literatura naukowa wskazuje na znaczenie identyfikacji docelowych zmian genetycznych i predykcyjnych/prognostycznych markerów molekularnych. Wielogenowe analizy panelowe i badania sekwencjonowania całego egzomu zarówno w nowotworach nabłonkowych^1,2, jak i hematologicznych³ ugruntowały koncepcję heterogeniczności guza i ewolucji klonalnej w miarę postępu choroby i nawrotów. Ponadto, w przeciwieństwie do konkurencyjnych technologii, takich jak reakcja łańcuchowa polimerazy (PCR) lub sekwencjonowanie Sangera, NGS może wykryć większość zmian genomowych we wszystkich klinicznie istotnych genach nowotworowych w jednym teście⁴.

Centrum Spersonalizowanej Diagnostyki początkowo uruchomione z dwoma klinicznymi panelami NGS, niestandardowym Panelem Hematologicznym (Panel Heme-NGS) i gotowym Panelem Raka dla próbek FFPE (Panel Solid-NGS) (zobacz Rysunek 1). Panele te obejmują klinicznie istotne lub wysoce interesujące regiony wybranych genów; Nie wszystkie geny lub eksony są w pełni pokryte. Amplikony są generowane przez hybrydyzację sondy, a następnie rozciąganie i ligację. Docelowe regiony są dalej amplifikowane za pomocą PCR z uniwersalnymi starterami o podwójnym indeksie, co pozwala na zebranie do 96 próbek do sekwencjonowania.

Rysunek 1: Lista genów uwzględnionych w panelach. Przygotowanie biblioteki odbywa się przy użyciu niestandardowego Panelu Hematologicznego (Heme-NGS Panel) składającego się z 33 genów lub gotowego Amplicon Cancer Panel (Solid-NGS) składającego się z 47 genów. Nie wszystkie geny lub eksony są w pełni pokryte, ponieważ niektóre amplikony mogą obejmować tylko niektóre punkty zapalne. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Zawartość panelu Heme-NGS pochodziła z wielu źródeł, ale skupia się wokół 16 genów zmutowanych w ostrej białaczce szpikowej (AML), które wcześniej opisano jako wykazujące wysoki poziom użyteczności klinicznej⁵. Panel Solid-NGS jest produkowany komercyjnie z docelowymi regionami opartymi na powszechnie zmutowanych genach w raku, zgodnie z bazą danych Katalogu Mutacji Somatycznych w Raku (COSMIC)⁶.

Kilka kluczowych kroków charakteryzuje ogólny przebieg pracy klinicznego NGS. Po tym, jak klinicysta zleci test, patolog określa adekwatność próbki po analizie procentowej guza i objętości próbki. W naszej placówce wymagamy co najmniej 10% guza ze względu na wskaźnik błędów sekwencjonowania tła ("szum") technologii i skuteczność docelowego podejścia. Jeśli tkanka jest odpowiednia do badania, ekstrahuje się genomowe DNA. To DNA jest następnie poddawane wielu etapom kontroli jakości (QC). Jeśli DNA przejdzie kontrolę jakości, generowana jest i sekwencjonowana biblioteka amplikonów. Uzyskane dane są analizowane za pomocą wewnętrznego potoku bioinformatycznego. Po analizie bioinformatycznej warianty są ręcznie sprawdzane i interpretowane pod kątem patogenności przed włączeniem do raportu klinicznego. Poniżej opisujemy dwa przypadki, które przeszły przez ten rygorystyczny przebieg pracy i ostatecznie doprowadziły do zmian w postępowaniu klinicznym.

Przypadek 1 - Ostra białaczka szpikowa

Biopsja szpiku kostnego od pacjenta A była diagnostyczna pod kątem AML, bez dojrzewania. Badania cytogenetyczne zostały przeprowadzone na próbce szpiku kostnego i wykazały prawidłowy kariotyp żeński. Stwierdzono obecność 95% krążących wybuchów, więc próbka krwi obwodowej została wysłana do spersonalizowanych testów diagnostycznych na panelu Heme-NGS.

Ostra białaczka szpikowa (AML) jest nowotworem hematologicznym linii szpikowej białych krwinek. Wykrywanie mutacji genowych w AML staje się coraz ważniejsze dla rokowania i leczenia, a nawracające mutacje genów są uznawane za ważne w patogenezie i rokowaniu⁷. Mutacje w NPM1 i CEBPA wiązały się z korzystnym ryzykiem prognostycznym, podczas gdy wewnętrzne duplikacje tandemowe (ITD) w FLT3 były związane z mniej korzystnym wynikiem⁸. Coraz więcej dowodów potwierdza patogenną rolę tych i innych mutacji w AML⁹.

Przypadek 2 - Gruczolakorak płuc

Biopsja lewej masy nadobojczykowej od pacjenta B wykazała gruczolakoraka płuc. Materiał biopsyjny z masy węzłów chłonnych zatopionych w parafinie (FFPE) utrwalonej w formalinie został wysłany do badań genomowych (Panel Solid-NGS) w postaci zwojów/zwojów z więcej niż 50% guzem, w celu określenia, czy występuje mutacja wymagająca ukierunkowanej interwencji terapeutycznej.

Rak płuc jest główną przyczyną zgonów związanych z rakiem w Stanach Zjednoczonych i dzieli się na dwa główne typy, niedrobnokomórkowego raka płuca (NSCLC) i drobnokomórkowego raka płuc (SCLC). NSCLC można dalej zdefiniować jako gruczolakoraka lub raka płaskonabłonkowego, na podstawie histologii zmiany. Gruczolakorak płuc jest najczęstszym podtypem raka płuc, obserwowanym zarówno u palaczy, jak i osób niepalących, i jest najczęstszą postacią raka płuc u osób niepalących¹⁰. Badania molekularne gruczolakoraka płuc zidentyfikowały mutację w wielu onkogenach¹¹. Najczęstszymi mutacjami powodującymi identyfikowanymi u palaczy są mutacje w KRAS i BRAF. Najczęstszymi mutacjami u osób niepalących są mutacje EGFR oraz rearanżacje obejmujące geny ALK, RET i ROS1. Guzy płuc zostały opisane z insercją eksonu 20 w ramce do genu ERBB2 (HER2 / neu). Najczęstszą nieprawidłowością w HER2/neu jest amplifikacja tego locus w raku piersi, dla której dostępna jest terapia celowana (trastuzumab: humanizowane przeciwciało monoklonalne przeciwko HER2/neu). Insercja HER2/neu eksonu 20, którą obserwuje się u 2-4% gruczolakowaków płuc¹², wykazała częściową odpowiedź na leczenie skojarzone inhibitorami HER2/neu i mTOR (odpowiednio neratynibem i temsyrolimusem)¹³.

Protocol

Ten protokół składa się z najważniejszych etapów dwóch zatwierdzonych testów laboratoryjnych do profilowania genomowego guzów litych i płynnych, odpowiednio. Badania wykonywane w laboratorium są wykonywane zgodnie z wymaganiami Poprawek do Clinical Laboratory Improvement (CLIA) z 1988 roku.

1. Ekstrakcja DNA z krwi obwodowej lub szpiku kostnego

1. Określ, ile krwi lub szpiku kostnego należy pobrać na podstawie Tabeli 1.

Próbka/WBC	Ilość, którą należy traktować jako 1 ml krwi
szpik kostny	250 μl
WBC krwi 12 000 – 50 000	Pojemność 1 ml
Krew WBC 50 000 – 100 000	500 μl
WBC krwi 100 000 – 200 000	200 μl
Krew WBC > 200 000	100 μl
* W przypadku krwi WBC < 12 000 weź 2 ml krwi

Tabela 1: Tabela objętości krwi/szpiku kostnego do użycia. Ponieważ liczba białych krwinek będzie się różnić w zależności od próbki, trudno jest określić konkretną objętość krwi do wykorzystania. W związku z tym ilość krwi do wykorzystania w teście należy określić, patrząc na liczbę białych krwinek (WBC) przed rozpoczęciem testu. Chociaż zużywa się mniej krwi, nadal należy ją traktować tak, jakby to był 1 ml, ponieważ objętość użytej krwi jest zmniejszona, ponieważ liczba obecnych komórek jest większa niż normalnie.

2. Postępuj zgodnie z dostępnym na rynku protokołem zestawu, aby wyizolować genomowe DNA.

2. Ekstrakcja DNA z tkanki zatopionej w parafinie (FFPE) utrwalonej w formalinie

1. Opierając się na regionie guza, który patolog zakreślił na szkiełku H&E, wyrównaj niebarwione szkiełka z prowadnicą H&E i nakreśl podobny obszar do ekstrakcji. W przypadku makrodysekcji należy przetwarzać tylko jeden zestaw preparatów pacjenta na raz.
2. Podgrzej szkiełka na bloku grzewczym o temperaturze 45 °C, aby lekko stopić parafinę. Ostrożnie zeskrob tkankę w obrębie linii zaznaczonych na szkiełku, używając nowego skalpela do każdej próbki, która ma zostać pobrana. Umieść zeskrobany wosk w odpowiednio oznakowanej tubce o pojemności 1,5 ml. Bądź ostrożny, ponieważ zeskrobany wosk jest bardzo elektrostatyczny i może wyskoczyć z tubki.
3. Dodać 320 μl roztworu deparafinowającego na każde pięć do sześciu sekcji 5 μm (łącznie 25 - 30 μm). Na przykład, jeśli ma być przetwarzana probówka zawierająca 3 sekcje rolki/zwijania o długości 10 μm, należy użyć 320 μl, ale jeśli uzyskano 5 odcinków o tej samej grubości, należy użyć 640 μl.
4. Wirować energicznie przez co najmniej 10 sekund i szybko odwirować w mikrowirówce, aby usunąć tkankę/wosk z boków i nakrętki do roztworu. Inkubować w temperaturze 56 °C przez 3 minuty, a następnie inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 - 10 minut.
5. Po inkubacji RT dodać 180 μl buforu ATL na każde 320 μl dodanego roztworu deparafinowającego. Zmiel tkankę dziesięć razy za pomocą sterylnego mini-tłuczka, używając nowego tłuczka dla każdej próbki. Upewnij się, że do tłuczka nie przykleiła się chusteczka, ponieważ może być bardzo lepka. Energicznie wirować zawiesinę przez 3 sekundy, a następnie wirować z maksymalną prędkością przez 1 minutę.
6. Dodać 10 μl proteinazy K do dolnej klarownej fazy. Delikatnie mieszać, pipetując w górę i w dół, aby upewnić się, że tkanka jest ponownie zawieszona. NIE wirować. Inkubować w temperaturze 56 °C przez noc z wytrząsaniem przy 400-500 obr./min.
7. Następnego ranka sprawdź, czy tkanka jest całkowicie rozpuszczona (nastąpiło to, jeśli dolny roztwór jest klarowny). Jeśli dolny roztwór nie jest klarowny, należy energicznie wirować przez 3 sekundy i wirować z maksymalną prędkością przez 1 minutę. Dodać dodatkowe 5 - 10 μl proteinazy K i inkubować w temperaturze 56 °C przez dodatkowe 30 - 60 minut.
8. Inkubować w temperaturze 90 °C przez 1 godzinę, aby odwrócić sieciowanie formaldehydu. Pozostawić próbki do ostygnięcia do temperatury pokojowej przez 5 - 10 minut, a następnie krótko odwirować każdą probówkę w celu konsolidacji cieczy.
9. Przenieś dolną klarowną fazę do oznakowanej probówki o pojemności 1,5 ml. Jeśli istnieje wiele probówek z tej samej próbki pacjenta (na przykład w przypadku, gdy używanych jest wiele rolek), w tym momencie ponownie połącz dolne fazy w jedną probówkę. Uwaga: Przenoszenie niewielkich ilości roztworu deparafinowającego nie powinno zakłócać procedury oczyszczania, ale istnieje ryzyko, jeśli przenoszona jest duża ilość.
10. Dodać 2 μl roztworu RNazy A. Delikatnie wiruj lub odwróć 25 razy i szybko odwiruj w mikrowirówce. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 minut.
11. Dodać 200 μl roztworu do wytrącania białek. Jeśli robisz jedną lub dwie bułki, użyj 200 μl. Jeśli robisz trzy rolki na raz, użyj 400 μl. Energicznie wirować z dużą prędkością przez 30 sekund, aby równomiernie wymieszać do lizy. Inkubować na lodzie przez 5 minut lub próbki mogą pozostać na lodzie do godziny.
12. Wirować przy 5 000 x g przez 5 min. Wytrącone białko powinno tworzyć zwartą, białą osadkę. Wlać supernatant do oznakowanej probówki o pojemności 1,5 ml, a następnie inkubować próbki na lodzie przez co najmniej 3 minuty. Wirować przy 5 000 x g przez 3 min.
13. Dodać 200 μl 2-propanolu (izopropanolu) na każde 180 μl buforu ATL dodanego wcześniej do oznakowanej probówki o pojemności 1,5 ml (może być konieczne użycie probówki o pojemności 2 ml). Na przykład, jeśli robisz trzy bułki, dodaj 600 μl izopropanolu. Dodać 1 μl glikogenu na każde 180 μl buforu ATL dodanego wcześniej do izopropanolu i kilkakrotnie odwrócić probówkę w celu wymieszania.
14. Ostrożnie dodać sklarkatant z etapu wytrącania białek do mieszaniny izopropanolu. Wymieszaj probówkę, delikatnie odwracając co najmniej 50 razy.
15. Wirować z maksymalną prędkością przez 3 min. DNA będzie widoczne jako mała biała osadka na dnie probówki.
16. Wlać lub odessać sklarowany nad osadem do odpowiedniej probówki odpływowej. Przechowywać oddzielną probówkę o pojemności 1,5 ml dla każdej próbki na wypadek, gdyby granulka została usunięta, aby nie została zgubiona lub zmieszana z odpadami innych próbek. Opróżnij tubkę na ręczniku papierowym i upewnij się, że większość izopropanolu została usunięta.
17. Dodaj 300 μl świeżo przygotowanego 70% etanolu. Delikatnie odwróć rurkę kilka razy, aby umyć granulkę. Postaraj się, aby granulki zostały usunięte, aby zapewnić dokładniejsze czyszczenie.
18. Wirować z maksymalną prędkością przez 5 minut, a następnie ostrożnie usunąć etanol. Pellet może być luźny, więc wlewaj lub zasysaj powoli i obserwuj pellet. Usuń nadmiar etanolu z wnętrza tuby, nie dotykając granulki. Pozostaw próbki do wyschnięcia na powietrzu przez 5 - 15 minut, uważając, aby nie przesuszyć próbki.
19. Dodaj od 25 do 100 μl roztworu hydratacyjnego DNA do każdej próbki w zależności od wielkości osadu DNA i początkowej ilości tkanki. Energicznie wirować probówki i krótko wirować w mikrowirówce. Inkubować przez 1 godzinę w temperaturze 65 °C, aby w pełni nawodnić DNA.

3. Kontrola jakości genomowego DNA

Uwaga: Istnieją trzy niezależne etapy kontroli jakości DNA (QC). Patrz Tabela 2, aby uzyskać dalsze wyjaśnienie, dlaczego wykonywany jest każdy etap kontroli jakości.

powiedział: powiedział: powiedział:

instrument	wynik	wskazanie	Idealny zasięg
Zmysł kropli96	A260/A230	Identyfikacja zanieczyszczeń chemicznych (np. etanolu)	1,50 – 2,2
Zmysł kropli96	A260/A280	Identyfikacja zanieczyszczeń białkowych	1,60 – 2,2
Zmysł kropli96	koncentracja	Kwantyfikacja DNA	> 1 ng/μl
Stacja taśmowa	Rozmaz DNA	Oznaczanie integralności DNA (np. degradacja/fragmentacja wyekstrahowanego DNA)	50% > 1 000 punktów bazowych
Kubit 2.0	koncentracja	Dokładniejsza kwantyfikacja DNA	> 1 ng/μl

Tabela 2: Oczekiwane wyniki kontroli jakości DNA. Wszystkie te wartości są brane pod uwagę przed uruchomieniem, co pozwala próbce przejść do etapu przygotowania biblioteki.

1. Postępując zgodnie z protokołem producenta, należy prześledzić 2 μl wyekstrahowanego DNA na fluorometrze, aby uzyskać stężenie robocze (ng/μl) próbki.
2. Uruchomić 1 - 2 μl każdej próbki na spektrofotometrze UV/VIS, aby sprawdzić jakość próbki (proporcje A260/A230 i A260/A280) zgodnie z instrukcjami producenta.
3. W przypadku próbek FFPE: Postępując zgodnie z instrukcjami producenta, należy umieścić 1 μl każdej próbki w mikroprzepływowym systemie elektroforezy żelowej w celu oceny degradacji/fragmentacji DNA. Przykłady przedstawiono na rysunku 2.

Rysunek 2: Przykład żelu QC genomowego DNA. Zielona linia nad dolnymi paskami ma wskazywać dolny znacznik. Dodana czerwona linia ma wskazywać około 1000 pz. Pas A2 reprezentuje w pełni nienaruszone DNA, jak można by się spodziewać po świeżym tissue (np. krwi obwodowej lub szpiku kostnym). Pasy B1, C1, D1, B2, C2, E2 są przykładami dobrego, nienaruszonego DNA FFPE. DNA w pasie F2 wydaje się być nienaruszone, ale w zbyt niskim stężeniu. DNA na torze G2 jest zdegradowane lub pofragmentowane i nie będzie działać w teście. Pasy E1, F1, G1, H1, D2, H2 reprezentują DNA, które znajduje się w "szarej strefie", co oznacza, że test może działać dobrze, ale część DNA może być zbyt uszkodzona lub usieciowana, a zatem nie będzie dobrze działać w teście. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

4. Przygotowanie biblioteki Amplicon

1. Hybrydyzacja puli oligonukleotydów i przedłużenie-ligacja związanych oligonukleotydów
   1. W pomieszczeniu Pre-PCR dodaj niezbędną objętość Low EDTA TE, 5 μl Oligo Tube panelu (np. Panel Solid-NGS lub Panel Heme-NGS) i 100 - 250 ng genomowego DNA do każdej odpowiedniej studzienki w pół-spódniczce 96-dołkowej oznaczonej jako płytka hybrydyzacji (HYB).
   2. Dodać 40 μl odczynnika do sekwencjonowania oligonucyklocytyzacji 1 (OHS1) do każdej próbki na płytce HYB. Delikatnie pipetować w górę i w dół co najmniej 5-6 razy, aby wymieszać. Zmieniaj końcówki po każdej kolumnie, aby uniknąć zanieczyszczenia krzyżowego.
   3. Uszczelnij płytkę HYB samoprzylepną folią aluminiową i odwiruj przy 1 000 x g przez 30 sekund.
   4. Inkubować płytkę HYB w wstępnie podgrzanym inkubatorze do hybrydyzacji w temperaturze 95 °C przez 1 minutę. Ustawić temperaturę inkubatora do hybrydyzacji na 40 °C. Kontynuować inkubację tak długo, aż inkubator obniży się z 95 °C do 40 °C (~ 90 min). Uwaga: To stopniowe chłodzenie ma kluczowe znaczenie dla prawidłowej hybrydyzacji.
   5. W ciągu ostatnich 15 - 20 minut inkubacji hybrydyzacji należy wstępnie umyć zespół płyty filtracyjnej (FPU). Należy przygotować tylko studzienki, które mają być użyte w bieżącym badaniu, tj. należy używać wyłącznie świeżych/nieużywanych studzienek z uprzednio otwartej płytki filtracyjnej, ale nigdy nie należy ponownie używać studzienek, które zostały użyte. Uwaga: Powinno to być jasne na podstawie numeru zestawu na płycie filtra, oznaczeń na płycie filtra i szczeliwa użytego na płycie.
      1. Za pomocą pipety wielokanałowej dodaj 45 μl Stringent Wash 1 (SW1) do każdego dołka.
         UWAGA: Zawiera formamid. Przykryć i odwirować FPU przy 2 250 x g przez 3 minuty w temperaturze 20 °C. Sprawdzić każdy dołek pod kątem pozostałości cieczy (> 15 μl/studzienkę).
      2. Jeśli pozostały resztki cieczy, obróć FPU o 180° i powtórz etap wirówki ponownie przez dodatkowe 3 minuty. Jeśli resztkowa ciecz przewróci się po raz drugi, przejdź do następnego kroku, jeśli nie, może to oznaczać wadę płyty filtracyjnej i konieczna będzie wymiana obecnej płyty.
   6. Po ostygnięciu inkubatora do hybrydyzacji do temperatury 40 °C, odwirować płytkę o stężeniu 1 000 x g przez co najmniej 30 sekund w temperaturze 20 °C w celu zebrania kondensatu. Przenieść całą objętość każdej próbki z płytki HYB na środek odpowiednich wstępnie umytych studzienek FPU. Zmieniaj końcówki po każdej kolumnie, aby uniknąć zanieczyszczenia krzyżowego. Przykryć FPU i odwirować przy 2 250 x g przez 3 minuty w temperaturze 20 °C.
   7. Dodać 45 μl SW1 i odwirować przy 2,250 x g przez 3 minuty w temperaturze 20 °C. Powtórzyć tę czynność, w sumie przez dwa płukania. Obróć FPU o 180° i ponownie odwiruj przy 2,250 x g przez 3 minuty, aby całkowicie usunąć cały SW1.
   8. Zdemontuj FPU. Wyrzucić cały płyn (zawierający formamid) do odpowiedniego pojemnika na odpady. Zmontuj FPU za pomocą innej płytki do zbierania odpadów MIDI. Dodać 45 μl uniwersalnego buforu 1 (UB1) do każdej studzienki na próbkę i odwirować przy 2 250 x g przez 3 minuty w temperaturze 20 °C. UWAGA: Zawiera formamid.
   9. Dodaj 45 μl Extension Ligation Mix 3 (ELM3) do każdej studzienki na próbkę na płytce FPU i pipetuj 3 razy w górę i w dół, aby wymieszać. Uwaga: Reakcja przedłużenia-podwiązania zachodzi na membranie płyty filtracyjnej.
   10. Uszczelnić płytkę FPU samoprzylepną folią aluminiową i inkubować cały zespół FPU w inkubatorze podgrzanym do temperatury 37 °C przez 45 minut.
2. Indeksowanie i amplifikacja PCR
   1. Podwielokrotnić używane indeksy do odpowiednich dołków na indeksowanej płytce wzmacniającej (IAP), układając startery w oprawie płytki indeksującej, ułożone w następujący sposób: probówki ze starterem i5 (białe nakrętki, klarowny roztwór) pionowo, wyrównane z rzędami od A do H, probówki ze starterem i7 (pomarańczowe nakrętki, żółty roztwór) poziomo, wyrównane z kolumnami od 1 do 12. Za pomocą pipety wielokanałowej p10 dodać 4 μl starterów i7 (żółty roztwór) do każdego rzędu IAP i dodać 4 μl starterów i5 (klarowny roztwór) do każdej kolumny IAP.
   2. Na lodzie lub bloku chłodzącym przygotować PCR Master Mix, dodając 0,5 μl DNA Polymerazy 1 (TDP1) do 25 μl PCR Master Mix 2 (PMM2) na próbkę. Odwróć, szybko odwiruj i krótko odwiruj PCR Master Mix do wymieszania.
   3. Dodaj 22 μl PCR Master Mix do każdego dołka IAP i pipetuj 3 razy w górę i w dół, aby wymieszać. Zmieniaj końcówki między studzienkami. Przechowywać IAP w temperaturze 4 °C.
   4. Po 45-minutowej reakcji przedłużenia-podwiązania (krok 4.1.10) wyjąć FPU z inkubatora i ostrożnie usunąć uszczelkę z folii aluminiowej. Przykryć pokrywką i odwirować przy 2,250 x g przez 3 minuty w temperaturze 20 °C.
   5. Dodać 25 μl 50 mM NaOH do każdej studzienki na próbce na FPU. Pipetować w górę i w dół co najmniej 6 razy; Upewnij się, że końcówki pipet stykają się z membraną. Zmieniaj wskazówki po każdej kolumnie. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 minut.
   6. Przenieść próbki eluowane z FPU do IAP w następujący sposób:
      1. Używając pipety wielokanałowej p100 ustawionej na 20 μl, odpipetuj NaOH na płytce FPU w górę i w dół co najmniej 6 razy. Lekko przechyl płytkę FPU, aby zapewnić całkowite zassanie z płytki.
      2. Przenieść 20 μl z FPU do odpowiedniej kolumny IAP. Delikatnie pipetuj w górę i w dół co najmniej 6 razy, aby dokładnie połączyć DNA z PCR Master Mix. Uszczelnić IAP folią samoprzylepną i odwirować przy 1 000 x g przez 1 minutę w temperaturze 20 °C.
   7. Przynieś płytkę PCR do pomieszczenia post-PCR i załaduj płytkę do termocyklera. Uruchomić program PCR składający się z etapu denaturacji cieplnej w temperaturze 95 °C przez 3 minuty; następnie 25 cykli w temperaturze 95 °C przez 30 sekund, 62 °C przez 30 sekund, 72 °C przez 60 sekund; następnie końcowe przedłużenie temperatury o 72 °C na 5 minut; wykończenie z utrwaleniem w temperaturze 10 °C. Jeśli po zakończeniu PCR nie przejdzie się do następnego etapu, płytka może pozostać na termocyklerze przez noc lub może być przechowywana w temperaturze od 2 do 8 °C do dwóch dni.
3. Oczyszczanie PCR i normalizacja na podstawie kulek
   1. Wyjąć magnetyczne kulki oczyszczające, bufor elucyjny (EBT) i odczynniki do elektroforezy żelowej z lodówki o temperaturze 4 °C i umieścić w temperaturze pokojowej co najmniej 20 minut przed następnym etapem.
   2. Po zakończeniu PCR odwirować przy 1 000 x g przez 1 minutę w temperaturze 20 °C w celu zebrania kondensatu. Przenieść 1 μl każdej reakcji PCR do probówek paskowych/dołków płytkowych zawierających 4 μl wody w celu rozcieńczenia próbek w stosunku 1:5. Pipetować w górę i w dół, aby wymieszać.
   3. Dodać 2 μl rozcieńczonych próbek PCRed do 2 μl buforu mikroprzepływowo-żelowego. Uszczelnij paski/płytkę. Wytrząsać z prędkością 1 800 obr./min przez co najmniej 30 sekund i wirować przy 1 000 x g przez 30 sekund. Postępując zgodnie z protokołem producenta, uruchom mieszaninę na żelu mikroprzepływowym, aby ocenić, czy preparat biblioteczny dał akceptowalną bibliotekę (patrz rysunek 3).
   4. Wiruj magnetyczne kulki oczyszczające, aż będą dobrze zawieszone, a kolor będzie jednorodny. Dodać 45 μl kulek do każdej próbki.
   5. Uszczelnić płytkę przezroczystą folią samoprzylepną i wstrząsać płytką z prędkością 1 800 obr./min przez 2 min. Inkubować w temperaturze pokojowej bez wstrząsania przez 10 minut.
   6. Umieść płytkę na stojaku magnetycznym. Po oczyszczeniu supernatantu ostrożnie usunąć i wyrzucić supernatant. Jeśli jakiekolwiek kulki zostaną przypadkowo zassane do końcówek, dozuj koraliki z powrotem do płytki i pozwól płytki spoczywać na magnesie przez 2 minuty i upewnij się, że supernatant został usunięty.
   7. Za pomocą płytki na stojaku magnetycznym dodaj 200 μl świeżo przygotowanego 80% etanolu do każdej studzienki próbki. Przesuń talerz kilka razy do przodu i do tyłu. Inkubować płytkę na stojaku magnetycznym przez 30 sekund. Ostrożnie usunąć i wyrzucić supernatant. Powtórz w sumie dwa prania.
   8. Usunąć nadmiar etanolu, krótko odwirowując płytkę o masie 1,000 x g, aby usunąć etanol po bokach probówki, umieszczając płytkę z powrotem na stojaku magnetycznym i używając pipety wielokanałowej p10 ustawionej na 10 μl w celu usunięcia etanolu. Pozostaw koraliki do wyschnięcia na powietrzu przez 5 - 8 minut.
   9. Za pomocą pipety wielokanałowej p100 dodaj 30 μl EBT do każdego dołka. Odpipetuj kilka razy w górę i w dół, aby upewnić się, że koraliki odchodzą od boku probówki. Uszczelnij płytkę przezroczystą folią samoprzylepną i potrząsaj płytką z prędkością 1 800 obr./min przez 2 minuty.
   10. Inkubować w temperaturze pokojowej bez wstrząsania przez 3 minuty. Jeśli istnieją próbki, w których kulki nie są całkowicie zawieszone, delikatnie pipetuj w górę i w dół, aby ponownie zawiesić kulki.
   11. Umieść talerz na stojaku magnetycznym. Za pomocą pipety wielokanałowej p100 przenieś 20 μl supernatantu na zupełnie nową płytkę zwaną płytką normalizacyjną biblioteki (LNP). Przenieś pozostałe ~ 10 μl z poszczególnych bibliotek sekwencjonowania na osobną płytkę zwaną pozostałą oczyszczoną płytką biblioteczną (RCLP). Przechowuj tę płytkę wraz z końcowym przygotowaniem biblioteki, ponieważ w razie potrzeby może być używana jako rezerwa do drugiego przebiegu sekwencjonowania. Jeśli nie przejdzie do następnego etapu, LNP i RCLP można przechowywać w temperaturze od -15 do -25 °C.
   12. Energicznie zawiruj i ponownie zawieś koraliki normalizujące bibliotekę 1 (LNB1). Bardzo ważne jest, aby całkowicie ponownie zawiesić granulkę kulki LNB1 na dnie tuby. Przygotować mieszaninę normalizacyjną, mieszając 8 μl LNB1 z 44 μl dodatków normalizacyjnych 1 (LNA1) na próbkę. Energicznie wirować mieszankę normalizacyjną przez 10 - 20 sek.
       UWAGA: LNA1 zawiera formamid.
   13. Przy przerywanej inwersji i wirowaniu mieszanki normalizacyjnej dodać 45 μl do każdej próbki LNP. Uszczelnić płytkę przezroczystą folią samoprzylepną i potrząsać płytką z prędkością 1 800 obr./min przez 30 minut. Ta 30-minutowa inkubacja ma kluczowe znaczenie dla prawidłowej normalizacji biblioteki, ponieważ inkubacje trwające dłużej lub mniej niż 30 minut mogą wpływać na reprezentację biblioteki i gęstość klastrów.
   14. Podczas 30-minutowej inkubacji należy przygotować odczynniki do sekwencjonowania, rozmrażając wkład z odczynnikiem i bufor Hyb (HT1) [UWAGA: oba zawierają formamid]. Ponadto zaopatrz się w lód na późniejszy etap i upewnij się, że blok grzewczy odpowiedni dla probówek wirówkowych o pojemności 1,5 ml jest ustawiony na 96 °C.
   15. Po zakończeniu 30-minutowego etapu mieszania umieść LNP na stojaku magnetycznym. Po oczyszczeniu supernatantu należy użyć pipety wielokanałowej, aby ostrożnie usunąć i wyrzucić supernatant do odpowiedniego pojemnika na odpady.
   16. Wyjmij LNP ze stojaka magnetycznego i umyj koraliki za pomocą Library Normalization Wash 1 (LNW1) w następujący sposób:
       1. Dodać 45 μl LNW1 do każdej studzienki próbki.
          UWAGA: Zawiera formamid. Uszczelnij płytkę przezroczystą folią samoprzylepną i potrząsaj płytką z prędkością 1 800 obr./min przez 5 minut. Powtórz w sumie dwa prania. Upewnij się, że wyjąłeś cały LNW1 po drugim praniu.
   17. Wyjmij LNP ze stojaka magnetycznego i za pomocą pipety wielokanałowej dodaj 30 μl 0,1 N NaOH (mniej niż tydzień) do każdego dołka w celu wymycia próbki. Uszczelnij płytkę przezroczystą folią samoprzylepną i potrząsaj płytką z prędkością 1 800 obr./min przez 5 minut.
   18. Podczas 5-minutowej elucji dodaj 30 μl bufora pamięci normalizującej bibliotekę 1 (LNS1) do każdej studzienki, która ma być użyta w nowej płytce o nazwie StoraGe Plate (SGP).
   19. Umieść LNP na stojaku magnetycznym. Po oczyszczeniu supernatantu przenieść elucję o wielkości 30 μl do LNS1 w SGP. Wymieniaj końcówki między próbkami, aby uniknąć zanieczyszczenia krzyżowego.
   20. Uszczelnić płytkę folią samoprzylepną i odwirować przy 1 000 x g przez co najmniej 30 sekund.
   21. Dodać 5 μl każdej próbki do sekwencjonowania do oznaczonej probówki o pojemności 1,5 ml z puli amplikonów (PAL). Zmieszaj PAL w celu wymieszania i krótko odwiruj w mikrowirówce.
   22. W zależności od użytej chemii sekwencjonowania (V2 lub V3) dodaj 4 - 10 μl PAL do 590 - 596 μl HT1. Ogólnie rzecz biorąc, dodaj 5,8 μl PAL do 595 μl HT1 dla chemii V2 i 8,5 μl PAL do 592 μl HT1 dla chemii V3. Oznacz tę probówkę jako probówkę Diluted Amplicon Library (DAL).
   23. Zwirować DAL i krótko odwirować w mikrowirówce. Inkubować DAL w temperaturze 96 °C przez 2 minuty. Odwróć rurkę DAL 3 razy i umieść DAL na lodzie na co najmniej 5 minut, przygotowując sekwencer do sekwencjonowania. Po upływie 5 minut DAL jest gotowy do załadunku.
   24. Po zakończeniu SGP uszczelnij płytkę samoprzylepną folią z folii aluminiowej i oznacz ją datą i identyfikatorem tabliczki. Przechowuj zapieczętowane SGP i PAL w temperaturze od -15 do -25 °C.

Rysunek 3: Przykład żelu QC do przygotowania biblioteki. Zielona linia nad dolnymi paskami oznacza dolny znacznik, a fioletowa linia nad górnymi paskami wskazuje wyższy znacznik. Wszystko działało dobrze na pasach H1, A2, B2, C2, E2 i G2. Przygotowanie biblioteki nie działało optymalnie dla pasów D2, F2 i H2, ale nadal będą uzyskiwane wyniki, które mogą nie mieć odpowiedniego zasięgu. W przypadku A3 przygotowanie biblioteki prawie nie działało i najprawdopodobniej ta próbka DNA nie była odpowiednia do testu. Dolne prążki powyżej dolnego znacznika to niewykorzystane startery, ponieważ podwielokrotność jest pobierana bezpośrednio z dołka PCRed. Próbka NTC powinna mieć tylko nieużywane pasmo startera i nic więcej. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

5. Sekwencjonowanie

1. Upewnij się, że wykonano prawidłowe SampleSheet.csv dla przebiegu. Przykład znajduje się na rysunku uzupełniającym 1.
2. Przepłukać i osuszyć celę przepływową i dodać 600 μl DAL do rozmrożonego wkładu z odczynnikiem.
3. Przygotuj sekwencer do sekwencjonowania, postępując zgodnie z instrukcjami wyświetlanymi na ekranie.

6. Analiza danych

1. Wykonaj potok bioinformatyczny. Wykorzystaj wewnętrzny, specjalnie zaprojektowany potok bioinformatyczny do identyfikacji mutacji, insercji, delecji i amplifikacji¹⁸.
2. Po zakończeniu potoku sprawdź pliki dziennika pod kątem błędów/ostrzeżeń, ponieważ wszelkie istotne błędy/ostrzeżenia pomagają w kontroli jakości przetwarzania potoku.
3. Przeanalizuj statystyki przebiegu (Tabela 3), aby upewnić się, że sekwencjonowana biblioteka przeszła określone przez laboratorium metryki kontroli jakości (Rysunek 4). Ręcznie przejrzyj każdy wariant, przeglądając pliki .bam w przeglądarce danych genomicznych (np. Integrative Genomics Viewer¹⁶ (IGV)).
   UWAGA: Zgłaszane są tylko warianty w zwalidowanym zakresie częstości alleli i powyżej minimalnej głębokości pokrycia po filtrowaniu jakości (przy użyciu nomenklatury Towarzystwa Zmienności Genomu Ludzkiego (HGVS)). W celu końcowego raportowania każdy wariant egzoniczny został podzielony na: patogenny, prawdopodobnie związany z chorobą, wariant o nieznanym znaczeniu (VUS), prawdopodobnie łagodny i łagodny. Zgłoszono wszystkie warianty powyżej kryteriów raportowania 5% częstości występowania alleli, z wyjątkiem wariantów uznanych za warianty łagodne i zmiany synonimiczne.

Rysunek 4. Przegląd etapów kontroli jakości dla NGS. Kontrola jakości każdego etapu procesu jest konieczna, aby zapewnić, że sekwencjonowanie przyniesie wyniki takie, jakie uwzględniają wskaźniki przed i po sekwencjonowaniu. Odpowiednia obróbka próbek jest niezbędna dla uzyskania wysokiej jakości DNA. Krew i szpik kostny w nieodpowiednich utrwalaczach mogą dawać DNA niskiej jakości. Niewłaściwe utrwalenie próbek guzów litych może spowodować degradację DNA (np. utrwalenie w B5). Jakość DNA powinna być oceniana pod kątem zanieczyszczenia białkami i RNA za pomocą środków spektrofotometrycznych i dokładnie oceniana pod kątem ilości i integralności DNA. Wskaźniki sekwencjonowania muszą być empirycznie określone w laboratorium sekwencjonowania i przestrzegane dla każdej reakcji sekwencjonowania i każdej próbki. Przed zgłoszeniem wyniki sekwencjonowania dla każdej próbki powinny zostać ocenione pod kątem zasięgu, głębokości i odpowiedniego wykonania kontroli pozytywnych i ujemnych. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Results

Przypadek 1 - Panel Heme-NGS

DNA wyekstrahowane z białaczkowej krwi obwodowej było wystarczającej jakości i ilości (176 ng/μl) dla panelu Heme-NGS. Ogólna średnia głębokość pokrycia wyniosła 4 933x (powyżej minimalnej średniej głębokości pokrycia wynoszącej 1 000x). Dodatkowe statystyki przebiegów znajdują się w tabeli 3. Spośród 8 regionów poniżej 250-krotnego pokrycia, 3 były spowodowane niewłaściwym przycinaniem starterów (tj. sekwencja startera nie została prawidłowo usunięta z powodu błędów sekwencjonowania), 1 był znanym artefaktem testu, a pozostałe 4 były częściowymi regionami eksonów różnych genów bez zgłaszalnych wariantów. Chociaż nasz protokół kliniczny obejmuje tylko warianty raportowania objęte co najmniej 250 odczytami, wszystkie dane z co najmniej 100 odczytami są importowane do bazy danych w celu przeglądu.

Przetwarzanie danych z potoku bioinformatycznego wykryło trzy podlegające zgłoszeniu mutacje związane z chorobą; mutację missense w FLT3, mutację missense w IDH2 i mutację przesunięcia ramki w NPM1. Warianty egzoniczne wraz z częstością występowania alleli opisano w tabeli 4. Powszechną mutacją w FLT3 jest wewnętrzna duplikacja tandemowa FLT3 (ITD), która nie jest automatycznie wywoływana przez nasz potok i wymaga oględzin eksonu 14. Oględziny eksonu 14 FLT3 nie wykazały wprowadzenia ani duplikacji w dostarczonej próbce. FLT3 I836del miał częstość alleli 1% i nie został uwzględniony w raporcie końcowym, ponieważ spadł poniżej zatwierdzonej minimalnej częstości alleli wynoszącej 5%. Mutacja ta nie występuje w tej samej cząsteczce DNA, co zmiana FLT3 D835Y (tj. zaobserwowana w tym samym regionie amplikonu, ale nie w "cis" w żadnym z odczytów sekwencjonowania) i została zaobserwowana tylko przez ręczny przegląd plików .bam podczas weryfikacji zmiany p.D835Y. Niższe częstości alleli dwóch mutacji FLT3 sugerują, że mutacje te mogą reprezentować heterogeniczność i/lub ewolucję klonalną; jednak różnica może wynikać z wydajności testu dla tego amplikonu lub polimorfizmu pojedynczego nukleotydu (SNP) w pobliżu lub nakładającego się na sekwencję startera, która wpłynęła na amplifikację tego allelu.

Wyniki panelu Heme-NGS dla przypadku 1 z AML zidentyfikowały mutacje w FLT3, IDH2 i NPM1, trzech powszechnie zmutowanych genach w AML. Mutacje w FLT3 obserwuje się u ~ 25% dorosłych pacjentów z AML (baza danych COSMIC¹⁷) i są to albo wewnętrzne duplikacje tandemowe (ITD), albo mutacje typu missense w domenie kinazy tyrozynowej. FLT3-ITD są bardziej powszechną mutacją i są związane ze słabą odpowiedzią na standardową chemioterapię, podczas gdy znaczenie prognostyczne mutacji punktowych kinazy FLT3, obserwowane u tego pacjenta z AML, ma niejasny wpływ na rokowanie¹⁴. Dehydrogenaza izocytrynianowa 2 (NADP+), mitochondrialna (IDH2) to gen kodujący modyfikator epigenetyczny, który jest powszechnie zmutowany w AML. Mutacje w modyfikatorach epigenetycznych są stosunkowo powszechne w AML, przy czym mutacje w IDH1 i DNMT3A reprezentują inne mutacje w tej klasie genów, które prowadzą do dysregulacji genów. Mutacje w genie nukleofosminy (NPM1) są jedną z najczęstszych nabytych mutacji w AML i są ogólnie uważane za dobry czynnik prognostyczny (przy braku FLT3-ITD).

Komutacje NPM1 i IDH2 zostały opisane w literaturze jako korzystny wskaźnik prognostyczny⁵, z 3-letnim całkowitym przeżyciem wynoszącym 89%. Stanowi to znaczącą korzyść w zakresie przeżycia w porównaniu z całkowitym 3-letnim przeżyciem NPM1 i IDH2 typu dzikiego wynoszącym 31%. Na przykład standardowa praktyka opieki obejmuje analizę mutacji NPM1 i FLT3-ITD. W tym scenariuszu wykrycie tylko mutacji NPM1 nie pozwoliłoby na odpowiednią stratyfikację pacjenta pod względem ryzyka, ponieważ mutacje wtórne mogą być korzystne (np. IDH2) lub niekorzystne (np. TET2), zmniejszając pewność złagodzenia przeszczepu szpiku kostnego.

Przypadek 2 - Panel Solid-NGS

DNA wyekstrahowane z tkanki FFPE było wystarczającej jakości i ilości dla Panelu Solid-NGS, o stężeniu 252 ng/μl i tylko 4% DNA poniżej 1,000 par zasad (bp). Po analizie danych średnia głębokość pokrycia wyniosła 9 167 odczytów (znacznie powyżej naszego minimalnego limitu głębokości wynoszącego 1 000 odczytów), przy czym żadne obszary nie miały głębokości poniżej 250 odczytów. Dodatkowe wskaźniki kontroli jakości przedstawiono w tabeli 3.

Dane przetworzone przez potok bioinformatyczny wykryły dwie mutacje związane z chorobą: insercję w eksonie 20 ERBB2 (Her2/neu) w ramce oraz mutację typu missense w TP53. Wszystkie warianty egzoniczne wraz z częstością występowania alleli przedstawiono w tabeli 5. Insercja w ERBB2 w rzeczywistości reprezentuje tandemowo zduplikowaną sekwencję (Her2/neu), jak odzwierciedlono w nomenklaturze. Identyfikacja i potwierdzenie włożenia w ramkę wymagało ręcznego przeglądu odczytów sekwencjonowania przez IGV. Wykrycie częstości mutacji większej niż 50%, obserwowanej zarówno dla mutacji TP53, jak i Her2/neu, sugeruje zdarzenie utraty heterozygotyczności (LOH) (patrz dyskusja).

Wyniki panelu Solid-NGS dla przypadku 2 z gruczolakorakiem płuc wykryły mutacje w ERBB2 (HER2/neu) i TP53, dwóch genach, które nie są powszechnie testowane jako część obecnego standardu opieki nad pacjentami z rakiem płuc. HER2/neu koduje receptor kinazy tyrozynowej podobny do innego powszechnie zmutowanego genu w raku płuc, EGFR. Aktywacja insercji HER2/neu eksonu 20 obserwuje się w 2-4% gruczolakoraków płuc, odpowiada za większość mutacji HER2/neu obserwowanych w raku płuc i jest zwykle obserwowana w guzach bez mutacji w innych genach napędowych, takich jak EGFR i ALK ¹². Istnieje kilka linii dowodów wskazujących na potencjał różnych opcji leczenia u pacjentów z aktywacją insercji HER2/neu, w tym częściowej odpowiedzi na terapię skojarzoną z inhibitorami HER2/neu i mTOR¹³ oraz znaczącej kontroli choroby za pomocą przeciwciała monoklonalnego Trastuzumabu w połączeniu z chemioterapią¹⁵. Odkrycie zmiany TP53 nie jest rzadkością w przypadku raka, ale w tej chwili nie ma terapii, które można by zastosować.

osób osób

	Przypadek 1	Przypadek 2
Łączna liczba odczytów początkowych	2 215 926	2 129 110
Procent mapowania odczytów	98,42%	98,29%
Procent odczytów na miejscu docelowym	99,01%	97,29%
Procent odczytów na miejscu docelowym po filtrze	97,60%	95,45%
Procent użytecznych odczytów	94,87%	91,79%
Procent baz powyżej 250x pokrycia	98,40%	W 100%
Procent baz powyżej 1000x pokrycia	95,90%	99,70%
Pokrycie poniżej 250x - liczba amplikonów	8	0

Tabela 3: Sekwencjonowanie przebiegu metryk QC. Jest to podsumowanie najważniejszych statystyk przebiegu, bez uwzględnienia średniego pokrycia, które są używane do przeglądu danych w celu określenia, czy próbka przygotowania biblioteki przeszła kontrolę jakości. Cały proces kończy się sukcesem, jeśli wszystkie wartości procentowe są powyżej 90%, ale możliwe jest, dzięki przeniesieniu SW1 lub UB1 na etapie mycia FPU lub przesłuchu podkładu, uzyskanie niższego "procentu na celu" w zakresie 80 - 90%. Jeśli "Procent zmapowany" jest zbyt niski, wskazywałoby to na zanieczyszczenie bakteriami lub innym DNA, ponieważ wszystkie próbki powinny być zgodne z ludzkimi. Jeśli którakolwiek z tych specyfikacji jest niższa niż 80%, próbka jest oznaczana do dalszego przeglądu, aby pomóc określić sposób postępowania i ulepszyć proces.

Tabela 4: Wyniki Przypadku 1. Wymieniono wykryte patogenne, związane z chorobą warianty o nieznanym znaczeniu (VUS) i prawdopodobne łagodne warianty egzoniczne powyżej kryteriów raportowania 5% częstości alleli. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Tabela 5: Wyniki Przypadku 2. Wymieniono wykryte patogenne, związane z chorobą warianty o nieznanym znaczeniu (VUS) i prawdopodobne łagodne warianty egzoniczne powyżej kryteriów raportowania 5% częstości alleli. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Rysunek uzupełniający 1: Przykład SampleSheet.csv opartej na amplikonie. Ten arkusz przekazuje sekwencerowi, jaką chemię należy uruchomić (w tym przypadku Amplicon), jaki przepływ pracy (np. GenerateFastq), jaką aplikację i test (np. FastqOnly), ile zasad (lub odczytów) sekwencjonować (w tym przypadku 186 pz x 186 pz) i wreszcie, jakie próbki są powiązane z określonymi indeksami (w tym przypadku podwójne indeksowanie). Części, które są podświetlone na żółto, można zmienić na dowolne, czego chce eksperymentator, ale w tym przypadku laboratorium używa tych parametrów. Kliknij tutaj, aby pobrać ten rysunek.

Discussion

Ponieważ dwa testy NGS opisane w tym manuskrypcie są oferowane klinicznie, najważniejszą kwestią praktyczną jest kontrola jakości. W szczególności należy zwrócić szczególną uwagę na jakość i ilość wyekstrahowanego DNA. Jest to szczególnie ważne w przypadku próbek FFPE, które często są silnie zdegradowane ze zmienną wydajnością DNA. Opracowano metodę wytrącania izopropanolu w celu maksymalizacji wydajności DNA z próbek FFPE, ponieważ stwierdzono, że metody oparte na kolumnach czasami prowadzą do ścinania DNA przy ograniczonych objętościach elucji. Dlatego w większości przypadków, gdy próbka ma zbyt niskie stężenie lub jest zbyt zdegradowana do testu, najprawdopodobniej jest to spowodowane rozmiarem, typem lub utrwaleniem tkanki, a nie procesem ekstrakcji. W przypadku próbek krwi/szpiku kostnego, jeśli nie dojdzie do ekstrakcji, jest to zwykle spowodowane hemodylucją próbki (tj. niewystarczającą liczbą białych krwinek lub komórek nowotworowych w tym pobraniu) lub ablacją chemioterapii.

Podczas walidacji należy ustalić wartości graniczne dla akceptowalności jakości i ilości DNA. W teście często stosuje się zalecane wejście 100 - 250 ng; jednak jeśli jakość DNA jest dobra, niższe ilości wejściowe mogą być skuteczne. Ponadto, jeśli jakość DNA jest słaba (tj. ilość amplifikowanego DNA jest mniejsza niż 100 - 250 ng), wówczas wyższe ilości wejściowe mogą poprawić jakość wyników sekwencjonowania (ponieważ ilość amplifikowanego DNA osiągnie zalecany wejście). Wskaźniki jakości i ilości DNA powinny być stosowane do każdej próbki przed przekazaniem DNA do przygotowania biblioteki. Próbki znajdujące się w "szarej strefie" (zob . rysunek 2) powinny być badane według uznania dyrektora laboratorium lub osoby przez niego wyznaczonej. Obecnie najlepszym sposobem przewidywania, czy DNA nie będzie działać dobrze podczas sekwencjonowania, jest wykonanie testu opartego na qPCR, który pozwala na kwantyfikację i ocenę jakości wejściowego DNA. Podejście to dotyczy biodostępności fragmentów o różnych rozmiarach w próbce poprzez amplifikację fragmentów o różnych rozmiarach (np. 100 pz, 150 pz, 200 pz i 300 pz) oraz wydajność porównawczą.

Obecnie przygotowanie biblioteki obejmuje dużą liczbę ręcznych kroków, w których błąd w jednym z kilku momentów może spowodować awarię biblioteki lub jej niską jakość. Analiza żelu mikroprzepływowego jest jedynym krokiem kontroli jakości, który pozwala sprawdzić problem z przygotowaniem biblioteki przed sekwencjonowaniem. W związku z tym istnieje kilka krytycznych kroków, w których dodatkowa uważność może zwiększyć prawdopodobieństwo udanej reakcji. Konieczne jest zagwarantowanie, że dla każdej próbki używana jest właściwa próbka i pula oligonukleotydów. Upewnienie się i prawidłowe zarejestrowanie, że każda próbka zawiera jedną z 96 unikalnych kombinacji podwójnie indeksowanych par starterów PCR, zmniejsza ryzyko pomieszania próbki. Ważne jest również, aby upewnić się, że płyta filtracyjna (FPU) prawidłowo opróżnia; Jeśli nie zostanie odpowiednio opróżniony, może to spowodować, że etap przedłużenia-ligacji przygotowania biblioteki będzie działał nieoptymalnie i doprowadzi do niskiej jakości danych sekwencjonowania. Po kontroli jakości biblioteki ważne jest, aby upewnić się, że kulki LNB1 są w pełni zawieszone i że roztwór LNB1 / LNA1 jest dobrze wymieszany przed dodaniem go do próbek, ponieważ stężenie tej mieszaniny służy do określenia molowości biblioteki. Wreszcie, jeśli etap elucji kulek prowadzi do nieoptymalnej ilości elucji biblioteki z koralików, zmniejszy to gęstość grupowania i prawdopodobnie spowoduje, że biblioteka nie uzyska odpowiedniego średniego pokrycia. I odwrotnie, nadmiar biblioteki doprowadzi do gorszej jakości odczytów. Dlatego ważne jest, aby zachować spójność na etapie normalizacji opartej na koralikach, aby zapewnić optymalne łączenie i grupowanie bibliotek w sekwencerze.

Oprócz przygotowania biblioteki, kluczowe znaczenie ma walidacja potoku bioinformatycznego, który będzie generował dokładne wywołania mutacji z surowych, zdemultipleksowanych plików fastq. Wybór niestandardowego rozwiązania może być czasochłonny, ponieważ istnieje wiele dostępnych nakładek typu open source i komercyjnie, wywoływania wariantów i pakietów oprogramowania NGS, które trzeba by przesiać. Konieczne będzie zaprojektowanie niestandardowych algorytmów, aby wyodrębnić podstawowe statystyki wydajności, zidentyfikować unikalne powtarzające się mutacje, które wymknęły się większości narzędzi open source, oraz określić status liczby kopii dla każdego z loci. Podczas procesu walidacji potoku bioinformatycznego ważne jest, aby określić możliwe do zgłoszenia wartości odcięcia dla wariantów, które spełniają lub przekraczają zarówno minimalną głębokość pokrycia po filtrowaniu jakości (np. co najmniej 250 odczytów), jak i minimalną częstość alleli (np. 4%). Ponieważ jest to multipleksowany test oparty na amplikonie, ważne jest, aby określić minimalną średnią głębokość pokrycia (np. 1,000x), którą biblioteka musi osiągnąć, aby móc uzyskać najniższy wydajność amplikonu do minimalnej głębokości odczytów. Ponadto multipleksowy charakter testu powoduje efekty niedocelowe, a te "artefakty" będą musiały zostać odkryte i w pełni zweryfikowane przed uruchomieniem. Innym ważnym ograniczeniem opisanego testu jest potrzeba, aby próbki zawierały więcej niż 10% guza, aby osiągnąć zwalidowaną minimalną częstość alleli.

Wykrycie insercji FLT3 o niskiej częstotliwości, 1%, jest dowodem na to, że ręczny przegląd jest nadal pożądany w tym procesie. Nawet przy odcięciu częstości alleli wynoszącym 5%, niektóre ważne mutacje mogą zostać pominięte, a zatem ręczny przegląd będzie niezbędny do ustalenia tych wariantów. W przypadku FLT3-ITD kontrola wzrokowa eksonu 14 jest wykonywana u wszystkich pacjentów z AML, aby upewnić się, że niski poziom lub duża insercja/duplikacja nie pozostanie niezauważona. Ponadto insercje eksonu HER2 20, które zwykle znajdują się obok sekwencji startera, wymagają ręcznej interwencji. Pomimo solidnego rurociągu bioinformatycznego, niektóre warianty mogą zostać przeoczone, co jest po prostu naturą twardego odcięcia dla większości wyżej wymienionych statystyk. Aby złagodzić ten problem, potrzebna byłaby lepsza bioinformatyka, a także lepsze przygotowanie bibliotek i/lub metodologie sekwencjonowania, ponieważ korzystniejsze jest posiadanie dobrej jakości danych przy jeszcze niższych wartościach granicznych, które zawierają mniej artefaktów i wyników fałszywie dodatnich.

Wykrywanie i interpretacja częstości alleli może być trudna ze względu na trudności w określeniu procentu guza i odchylenie amplifikacji niektórych regionów genomu. Ponadto można wykryć częstość alleli powyżej 50%, jak zaobserwowano w przypadku 2. Jest to interpretowane jako utrata heterozygotyczności (LOH), albo z powodu utraty normalnego allelu, co prowadzi do pozornego wzrostu odczytów mutantów, przyrostu zmutowanego allelu (np. 2 zmutowane i jedna normalna kopia), albo innych mechanizmów. Mechanizmy te można wyjaśnić, wykorzystując macierzową porównawczą hybrydyzację genomową (aCGH¹⁹) i/lub macierz genotypowania SNP. ^{Lokal mieszkalny 20}.

Obecne metodologie wzbogacania celu opierają się na całodniowych procedurach albo nieefektywnego wychwytywania hybrydowego, albo technik multipleksowanego PCR, które skutkują potrzebą większego pokrycia sekwencjonowania pojedynczej próbki i większej liczby odczytów sekwencjonowania poza celem. Dodatkowe zastosowania onkologii molekularnej NGS, które spodziewane są w najbliższej przyszłości, będą obejmowały łatwiejsze metody przygotowywania bibliotek, które mogą być w pełni zautomatyzowane i być w stanie przetwarzać próbki z bardzo małą ilością wejściowego DNA (tj. mniej niż 1 ng), a także próbki z wysoce zdegradowanym DNA. Aby sprostać tym wyzwaniom, większość metod będzie prawdopodobnie oparta na PCR, albo będzie to wieloetapowe podejście PCR, albo masowo równoległe podejście singleplex PCR. Ponadto wykazano, że molekularne kodowanie kreskowe poszczególnych amplikonów radykalnie zmniejsza szum sekwencjonowania tła i umożliwi testowanie próbek z niższymi proporcjami komórek nowotworowych w celu osiągnięcia niższych częstości alleli i przejścia do wychwytywania krążących komórek nowotworowych.

Wykrywanie mutacji związanych z chorobą w próbkach nowotworowych jest standardem opieki od dziesięcioleci. Historycznie rzecz biorąc, geny były często testowane sekwencyjnie, po jednym genie/eksonie na raz, z identyfikacją mutacji prowadzącą do końca sekwencji testowej. Pojawienie się NGS pozwoliło na mniej stronnicze podejście do sekwencjonowania wielu genów związanych z wieloma nowotworami równolegle, co doprowadziło do identyfikacji wielu mutacji związanych z nowotworami. Kliniczna przydatność NGS w wykrywaniu mutacji somatycznych w nowotworach jest coraz bardziej widoczna. Rzeczywiście, analiza próbek nowotworów oparta na NGS stanowi nowy paradygmat, który rzuca wyzwanie tradycyjnym testom pojedynczych genów, ale użyteczność kliniczna jest bardzo jasna. Laboratoria kliniczne mają dziś ekscytującą okazję do połączenia starannej walidacji metod i interpretacji testów z zastosowaniem tej potężnej technologii.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Taśma ScreenTape Genomic DNA	Agilent Technology	5067-5365
Odczynniki do genomowego DNA	Agilent Technology	5067-5366
Taśma ekranowa D1000 o wysokiej czułości	Agilent Technology	5067-5584
Odczynniki D1000 o wysokiej czułości	Agilent Technology	5067-5585
TapeStation 2200	Technologia Agilent	G2965A
TapeStation	Agilent Technology	A.01.04 lub nowszy
96-dołkowe stojaki do przechowywania probówek	dowolny dostawca
Stojak na probówki 15/50 ml Dowolny	dostawca
Stojak na płytki 96-dołkowe	Dowolny dostawca
Pipeta jednokanałowa, 0,5– 2,5 μ l	Pipeta dowolnego dostawcy
, jednokanałowa, 1– 10 μ l	Pipeta dowolnego dostawcy
, jednokanałowa, 2– 20 μ l	Pipeta dowolnego dostawcy
, jednokanałowa, 10– 100 μ l	Pipeta dowolnego dostawcy
, jednokanałowa, 20-calowa; 200 μ l	Pipeta dowolnego dostawcy
, jednokanałowa, 100 – 1,000 μ l	Każdy sprzedawca
Pipetor serologiczny	Każdy sprzedawca
Vortexer	Każdy sprzedawca
Wiadro na lód	Dowolny sprzedawca
Mikrowirówka (do probówek i probówek paskowych)	Dowolny sprzedawca
Zamrażarka, -20 & deg; C	Dowolny sprzedawca
4 & stopnie; C Lodówka	Dowolny Woda
lub Kąpiel z koralikami	dla sprzedawców
(37 & Deg; c)	dowolnego dostawcy
, 1  ml	dowolnego dostawcy
, 5  ml	dowolnego dostawcy
, 10  ml	dowolnego dostawcy
, 25  ml	Dowolny sprzedawca
Rękawice	Każdy sprzedawca
Żyletki/Szpulki	Dowolny sprzedawca
KimWipes	Dowolny sprzedawca
Tuba stożkowa 15 ml	Dowolny sprzedawca
Tuba stożkowa 50 ml	Dowolny sprzedawca
Ręczniki papierowe	Dowolny sprzedawca
200-procentowy etanol	Każdy sprzedawca		Sklep w łatwopalnej szafce
2-Propanol (izopropanol)	Każdy sprzedawca		Sklep w łatwopalnej szafce
Zbiorniki 25 ml	Każdy sprzedawca
10 N NaOH	Dowolny sprzedawca
Pipeta, 8-kanałowa, 1 – 10 μ l	Pipeta dowolnego dostawcy
, 8-kanałowa, 10 i ndash; 100 i mu; l	Pipeta dowolnego dostawcy
, 8-kanałowa, 20 i ndash; 300 i mu; l	Dowolny sprzedawca
Wiadro na lód	Dowolna
butelka do spryskiwania wodą	sprzedawcy
Butelka do spryskiwania alkoholem	Dowolny papier do
czyszczenia soczewek	Dowolne talerze dostawcy
, 96-dołkowy PCR, częściowo przyszywkowy	dowolny sprzedawca
Paski probówek, 8-dołkowe, 0,2  ml	dowolny dostawca
Koraliki Agencourt AMPure XP	Beckman Coulter	A63881
BioShake IQ lub 3000-T wiąz	Bulldog Bio/Q.Instruments	1808-0506/ 1808-0517
DropPlate96 S - Suwmiarka LabChipDS		128876
DropPlate96 D - Suwmiarka LabChipDS		132848
Suwmiarka DropSense96	(Trinean)
DropQuant Software	Caliper (Trinean)
Płyta uszczelniająca	Denville	B1212-5S
Aluminiowa folia uszczelniająca	Denville	B1212-6S
Wolny od nukleaz, czysty system wodny	Wirówka EMD Millipore
5424	Wirówka Eppendorf	22621408
5804R	Eppendorf	22623508	zarówno rotatory do probówek, jak i płytek o pojemności 15 ml, najlepiej wirówkę, która może osiągnąć do 2 500 x g.
Probówka Safe-Lock 1,5 ml, naturalna	Eppendorf	22431021
5 ml, probówka DNA LoBind	Eppendorf	30108310
5430R Wirówka	Eppendorf	022620645	Będzie działać każda wirówka rotatorowa
Hybex Inkubator mikropróbek Fisher	Scientific	1057-30-0
Hybex 0,2 ml Blok probówek	Fisher Scientific	1057-31-0
TruSeq Amplicon – Panel Raka	Illumina	FC-130-1008	96 reakcji
TruSeq Custom Amplicon	Illumina	PE-940-1011	96 reakcji
TruSeq Custom Amplicon Index Kit	Illumina	FC-130-1003	96 indeksów, 384 próbki
MiSeq Reagent Kit v3, 500 cykli	Illumina	MS-102-3003
MiSeq Reagent Kit v2, 300 cykli	Illumina	MS-102-2002
Zestaw odczynników MiSeq v2, 500 cykli	Illumina	MS-102-2003
Kierownik eksperymentów	Illumina	1.3 lub nowszy
MiSeq Reporter	Illumina	2.0 lub nowszy
Przeglądarka analizy sekwencjonowania	Illumina	1.8 lub nowsza
Zestaw opraw i kołnierzy TruSeq Index Plate	Illumina	FC-130-1007
MiSeq v2	Illumina	SY-410-1003
TruSeq Niestandardowa płyta filtra Amplicon	Illumina	FC-130-1006
Wymienne nasadki adaptera indeksu	Illumina	11294657
Qubit 2.0	Invitrogen	Q32866
Qubit 0,5 ml	Probówki
Qubit dsDNA Zestaw do testów szerokiego zakresu	Stojak magnetyczny Invitrogen	Q32853
DynaMa6-96, listwy boczne	Invitrogen	120.27
GeneAmp PCR System 9700 (blok złoty/srebrny)	Life Technologies	N8050200
Gentra Puregene Blood Kit	Qiagen	158489
roztwór deparufinizacyjny (16 ml)	Qiagen	19093
Bufor ATL (4 x 50ml)	Qiagen	939011
Roztwór do wytrącania białek (50 ml)	Qiagen	158910
Roztwór hydratujący DNA (100 ml)	Qiagen	158914
roztwór glikogenu (500  μ l)	Qiagen	158930
Qiagen Proteinaza K	Qiagen	19133
Rnaza (5 ml)	Qiagen	158924
Woda bez nukleaz (10 x 50 ml)	Qiagen	129114
Pestles	USA Scientific	1415-5390
TipOne RPT 10 µ l Podłużne końcówki pipet filtracyjnych w wysterylizowanych stojakach, 10 stojaków na 96 końcówek (960 końcówek).	Stany Zjednoczone Naukowe	1180-3810
TipOne RPT 100 µ l naturalne, skośne końcówki do pipet filtracyjnych w sterylizowanych stojakach, 10 stojaków po 96 końcówek (960 końcówek)	USA Scientific	1180-1840
TipOne RPT 200 μ l naturalne, skośne końcówki do pipet filtracyjnych w stojakach, stojaki sterylizowane, 10 stojaków po 96 końcówek (960 końcówek)	USA Scientific	1180-8810
TipOne RPT 20 i mu; l naturalne, skośne końcówki do pipet filtracyjnych w stojakach, stojaki sterylizowane, 10 stojaków po 96 końcówek (960 końcówek)	USA Scientific	1180-1810
TipOne RPT 1,000 μ l naturalne, wyskalowane końcówki do pipet z filtrem XL w	USA Scientific	1182-1830